Влияние внеклеточной днк на функциональную активность клеток эндотелия
На правах рукописи
Алексеева Анна Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.07 – Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013 2
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук.
Научный консультант:
Вейко Наталья Николаевна доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
Тарасова Ольга Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Писарев Владимир Митрофанович, доктор медицинcких наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение “НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского” Российской Академии медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов критических состояний.
Ведущая организация:
Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»).
Защита состоится «07» октября 2013 г. в _ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.
Автореферат разослан «_» сентября 2013 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016. по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Циркулирующая внеклеточная ДНК (вкДНК) присутствует в кровотоке и других биологических жидкостях как здоровых, так и больных людей.
ВкДНК активно взаимодействует с клетками организма (Gahan P. et al., 2010). В настоящее время неясно, какие именно внутриклеточные процессы протекают под действием фрагментов вкДНК в эндотелии, и как состав этой ДНК влияет на активацию того или иного внутриклеточного каскада в клетке.
Исследования в этой области проводятся на различных культурах клеток, оцениваются характеристики вкДНК, циркулирующей в крови здоровых людей, больных сердечно-сосудистыми и аутоиммунными заболеваниями, больных раком (Pisetsky D.S. et al., 2011). В области механизмов действия вкДНК в клетках эндотелия известно немногое. Показано, что ДНК влияет на эндотелиоциты путем взаимодействия с двумя типами рецепторов (известные TLR9 и гипотетические, Х), которые для передачи сигнала используют один и тот же белок – адаптер MyD88 (Костюк С.В. и др., 2010). Имеются данные о том, что ДНК и гистоны, входящие в состав циркулирующей ДНК, активируют другие рецепторы группы TLR, вызывая продукцию интерлейкинов и иммунный ответ (Cherepanova A.V. et al., 2011).Однако все эти данные не дают ясного понимания механизма взаимодействия клеток эндотелия с вкДНК и необходимо дальнейшее изучение вопроса. Эти исследования важны для понимания механизмов системного повреждения сердечнососудистой системы у пациентов с различными заболеваниями, в развитие которых может быть вовлечена вкДНК.
В настоящей работе впервые оценено, какие именно характеристики вкДНК стимулируют стрессовый ответ и адаптивную реакцию в клетках эндотелия.
Цель исследования. Охарактеризовать ответ эндотелиальной клетки на изменение таких свойств внеклеточной ДНК, как концентрация, GC- состав и уровень окислительной модификации.
Задачи исследования.
1. Сформировать рабочую выборку образцов ДНК из различных источников.
Охарактеризовать их свойства (GC-состав и уровень окисления оснований);
2. Определить локализацию в клетках эндотелия культуры HUVEC образцов экзогенной ДНК с различными свойствами;
3. Исследовать влияние образцов ДНК с различными свойствами на следующие показатели состояния эндотелиальной клетки (HUVEC): уровень активных форм кислорода (АФК) и NO;
разрывы в ДНК хроматина;
пролиферативная активность клеток;
показатели гибели клеток;
изменения цитоскелета;
активация транскрипционного фактора NF-kB.
Научная новизна. Впервые обнаружено, что клетки эндотелия быстро реагируют на изменение свойств вкДНК. Ранний ответ клеток заключается в синтезе большого количества АФК и возникновении одно- и двунитевых разрывов ДНК хроматина ядер, что приводит к остановке клеточного деления. Впервые показано, что окисленная и CG-богатая ДНК, так же как и ДНК людей с сердечно-сосудистыми заболеваниями, действует на клетки эндотелия через TLR9-рецепторы, и, возможно, через другие ДНК-узнающие сенсоры. Действие вкДНК на эндотелиальные клетки сопровождается активацией стрессового сигнального каскада с вовлечением транскрипционного фактора NF-kB. Впервые обнаружено, что при изменении свойств вкДНК в клетках эндотелия наблюдается формирование стресс-фибрилл актина.
Впервые высказано предположение, что свойства циркулирующей ДНК могут являться мишенью для терапии при профилактике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные позволяют по новому осознать роль циркулирующей ДНК в развитии некоторых заболеваний и в адаптивном ответе организма на неблагоприятные условия. Представляется возможным разработать направления ранней диагностики заболеваний, основываясь на описанных в данной работе эффектах, проявляющихся в клетках эндотелия в ответ на действие различных фрагментов вкДНК. Окисленные фрагменты ДНК, циркулирующие в большой концентрации в кровотоке людей с сердечно-сосудистыми, аутоиммунными, раковыми заболеваниями, могут послужить в качестве мишени для терапии.
Положения, выносимые на защиту 1. Изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия HUVEC увеличение экспрессии гена NOX4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Это сопровождается блокированием деления клеток в G1-, S- и G2/M – фазах клеточного цикла.
2. Окислительный стресс, вызванный действием внеклеточной ДНК, стимулирует в клетках эндотелия образование одно- и двунитевых разрывов ДНК HUVEC, что приводит к нестабильности генома, признаками которой являются образование микроядер, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны. На фоне деструктивных процессов включаются репаративные механизмы, направленные на снижение апоптотической активности.
3. В ответ на изменение концентрации, GC-состава и уровень окисления внеклеточной ДНК в клетках эндотелия происходит стимуляция транскрипционного фактора NF-kB. Способность образцов вкДНК активировать NF-kB уменьшается в ряду:
GC-ДНК геномная ДНК окисленная геномная ДНК.
4. Внеклеточная ДНК влияет на экспрессию гена eNOS на уровне мРНК eNOS, белка eNOS и продукта NO в клетках эндотелия. Кроме того, GC-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в HUVEC структурные изменения клеточного матрикса:
наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и меняется экспрессия мРНК генов молекул адгезии (ICAM1, PECAM1, SELE и VCAM1).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VII международной конференции «Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum» (Мадрид, 2010);
на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010);
на XIII международной конференции «The Leiden International Medical Student Conference» (Лейден, 2011);
на XIX и XX международных конференциях «International Student Congress of (Bio)Medical Sciences» (Гронинген, 2012, 2013). Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, протокол № 9 от 26.07.2013.
Личный вклад автора. Соискателем проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Соискатель лично принимал участие в планировании экспериментов, самостоятельно осуществлял выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, а также из клеток культуры эндотелия. Подбор необходимых условий в методиках, осуществление подготовки и выполнения основных экспериментов автором выполнены самостоятельно. Соискатель провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.
Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из источников, из них 7 отечественных и 300 зарубежных авторов. Работа изложена на листах машинописи. Текст содержит 50 рисунков и 4 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В исследовании использованы культуры клеток эндотелия, выделенные из образцов нормальной пуповины здоровых рожениц. Взятие биоматериала осуществлено с соблюдением необходимых правил асептики и антисептики. Выделение клеток проведено в стерильных условиях согласно адаптированной стандартной методике (Crampton S.P. et al., 2007). Далее клетки культивировали в CO2-инкубаторе (5% СО2, 95% воздуха) при 370С в стерильных условиях. Эксперименты проведены на нормальных эндотелиальных клетках 2-4 пассажей.
Получение модельных фрагментов ДНК: в качестве источника CpG-богатой ДНК использованы CpG – богатый фрагмент транскрибируемой области рибосомного повтора человека (ТОрДНК, участок от –515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank), встроенный в вектор pBR322 (р(rDNA)), длина пробы около 11 т.п.н. В качестве АТ – обогащенной ДНК человека использован фрагмент 1,77 сателлита III (p(satIII)) (участок 1q12, хромосомы 1) в векторе рBR322, длина пробы 5485 п.н. ДНК E.
coli выделены из штамма MG 1655 методом фенольной экстракции и гидролизованы эндонуклеазой до фрагментов 5-10 т.п.н., сопоставимых по длине с двумя другими пробами. Для получения вкДНК облученных клеток, клетки облучены на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия), доза облучения составляла 10 сГр. ВкДНК облученных и интактных клеток выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Образцы окисленной ДНК (геномной и р(rDNA)) получены следующим образом: к раствору ДНК (100нг/мл) добавляли 2% Н2О2 в присутствии мкМ Fe2+ и 10 мкМ ЭДТА («ПанЭко», Россия) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте (модель слабо окисленной ДНК) или при УФ облучении (312 нм, модель сильно окисленной ДНК). Образцы ДНК осаждали объемами этанола в присутствии 2М ацетата аммония, промывали 2 раза 75% этанолом и растворяли в воде. Концентрацию определяли, регистрируя УФ–спектры.
Пробы вкДНК для опытов на клетках HUVEC 30 здоровых молодых людей (25 35 лет) и 24 пациентов (55-75 лет) с сердечно-сосудистыми заболеваниями (острый инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия в острой стадии) обоих полов выделяли из плазмы крови стандартным методом экстракции органическими растворителями.
Для анализа содержания рибосомного повтора в составе вкДНК применили метод нерадиоактивной количественной гибридизации, ранее разработанный в лаборатории ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Вейко Н.Н. и др., 2003).
Все модельные пробы ДНК подвергали одинаковой дополнительной очистке от липополисахаридов: последовательно проводили обработку тритоном Х-114 и гельфильтрацию на носителе HW-85. Концентрацию вкДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) c использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen («Invitrogen», США). Для анализа действия вкДНК на интактные клетки эндотелия в среду культивирования последних добавляли различные фрагменты вкДНК в концентрации 50-250 нг/мл и инкубировали в течение 0,5-72 ч при 370С.
Для анализа взаимодействия различных образцов ДНК с эндотелиальными клетками использованы зонды, содержащие флуоресцентную метку Spectrum Green или Red: (1) меченая геномная ДНК (гДНКGreen/Red);
(2) плазмиды p(rDNA)Green и pBR322Green;
(3) окисленная ДНК (гДНКGreen/Red-OX). Этот образец получили путем отжига смеси денатурированных образцов гДНКOX и гДНКGreen/Red (зонды синтезированы сотрудниками лаборатории пренатальной диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН).
Количество активных форм кислорода в пробе определено цитофлуориметрически при помощи красителя: 2’,7’- дихлордигидрофлуо-ресцеина диацетат DCFH-DA («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) в концентрации 5 мМ, (LeBel C.P. et al., 1992). Клетки анализированы в пробирках FACS CyFlow Cube («Partec», Германия) на проточном цитофлуориметре Partec CyFlow® ML («Partec», Германия). Локализация мест выработки АФК определена с помощью того же красителя на флуоресцентном микроскопе.
Количество окиси азота (II) определено с помощью флуоресцентного красителя CuFl («Strem», США) (Lim M.H., 2007) методом проточной цитофлуориметрии согласно стандартной методике (Lim M.H. et al., 2006), локализация и интенсивность синтеза окиси азота в культуре клеток эндотелия HUVEC определена с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме того, велась количественная детекция окиси азота в среде культивирования с использованием флуориметра «Perkin Elmer LS55» (США), при возб =495нм, с эмиссией =526, в режиме «time-drive». Количество нитритов и нитратов, как показателя интенсивности окисления окиси азота, определено методом Грисса.
Цитохимическое окрашивание F-актина цитоскелета произведено с помощью окраски родамином-фаллоидином по стандартной методике (Wieland Т. et al., 1983).
После фиксации клеток к последним добавлен комплекс родамин-фаллоидина («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) в концентрации 0.4 U/ml (в растворе фосфатно-солевого буфера («ПанЭко», Россия), 0,02% тритон X-100 («Sigma», США).
Для определения наличия и локализации белков TLR9, AIM2, iNOS, eNOS, peNOS, NOX4, Ki-67, PCNA, р65(NF-kB) в клетках эндотелия использован непрямой иммуноцитохимичесий метод. После добавления фрагментов вкДНК среда культивирования удаляли, клетки фиксировали раствором формальдегида. Затем проводили последовательную инкубацию с первичными и вторичными антителами («Santa Cruz Biotechnology», США), меченными ФИТЦем /фикоэритрином («Sigma», США) согласно стандартной методике (Larsson L.I., 1993). После окраски клеток на покровные стекла добавлен 20% раствор глицерина и 20 мкМ DAВCO (1,4-диазо бицикло (2,2,2) - октан) («Sigma», США) для предотвращения выцветания красителя.
Препараты накрывали покровными стеклами и анализировали под микроскопом.
Определение содержания одно- и двунитевых разрывов осуществлено с использованием методики ДНК комет (single cell gel electrophoresis) по стандартному протоколу (Collins A.R. et al., 2008). После 2 часовой обработки в лизирующем буфере [2,5 моль/л NaCl, 0,1 моль/л EDTA (pH 10,0), 10 ммоль/л Tris (pH 9,6), 1% N лаурилсаркозинат, 10% DMSO, 1% Triton X-100] при 250C препараты помещены в электрофорезную камеру в щелочной буфер [0,3 моль/л NaOH, 1 ммоль/л EDTA (pH 10,0)] на 20 мин при 150C, а затем подвергнуты электрофорезу при 300 mA на 20 мин при той же температуре. Дале препараты зафиксированы, окрашены 10% раствором бромистого этидия («ПанЭко», Россия) и анализированы при помощи флуоресцентного микроскопа (на увеличении 40 раз) и программного оборудования CASPlab.
Детекция двуцепочечных разрывов ядерной ДНК методом иммунофлуоресценции заключалась в окраске клеток специфичными антителами к гистону -Н2АХ согласно стандартной методике (Kuo L.J., Yang L.X., 2008) с выявлением гамма-фокусов и последующем получении и анализе изображений с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Vert и ПО к нему («Carl Zeiss Microscopy», Германия). Количество и особенности гиподиплоидных клеток, наличие микроядер и апоптотических телец в популяции клеток эндотелия определены методом проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии (окраска клеток пропидий йодидом), обработка проведена с использованием программного обеспечения PhotoShop CS3.
Оценка уровня экспрессии генов TLR9, AIM2, RIG1, STING1, NOX4, SOD1, CCND1, CDKN2A, CDKN1A, RB1, TP53, MDM2, BRCA1, BCL2, BCL2A1(Bfl-1/A1), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2(c-IAP1), BIRC3 (c-IAP2), ICAM1, PECAM1, SELE, VCAM1, eNOS, iNOS, NFKB1,IL-6, TNF-a, M4K4F, TIR, MyD88 и ACTB методом ПЦР в реальном времени. РНК, выделена из клеток при помощи набора YellowSolve («Клоноген», Россия) и RNАeasy mini kit («Qiagen Sciences», США), по инструкциям производителей. Концентрация РНК определена флуориметрически с использованием РНК-связывающего красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия), возб=487 нм, флу=524 нм. Обратная транскрипция осуществлена с помощью реактивов фирмы «Силекс» (Россия) по стандартной методике. Амплификация проведена при помощи прибора с програмным обеспечением StepOnePlus («Applied Byosystems», США). Использованы праймеры фирмы «Силекс» (Россия), последовательности взяты из PrimerBank, предварительно проверенные на способность образовывать димеры и шпильковые структуры. Экспрессия анализирована в нескольких независимых опытах с помощью программного обеспечения прибора;
ошибка составляла 2%.
Статистическую обработку результатов проведена с использованием стандартного пакета программ MS Excel, Statgraphics и Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика циркулирующей ДНК плазмы человека в норме, при патологии и внешнем воздействии (ионизирующее излучение) В составе вкДНК плазмы крови здоровых людей накапливается маркерная последовательность – транскрибируемая область рибосомного повтора, которая значительно обогащена GC – парами (Рис. 1). Ее содержание на 1 нг вкДНК в несколько раз выше, чем содержание в геноме (1,72 ± 0,2 пг/нг гДНК, N=256). Образцы вкДНК больных атеросклерозом и артериальной гипертензией содержат увеличенное в несколько раз, по сравнению с вкДНК здоровых людей, содержание рДНК. В циркулирующей ДНК облученных по роду работы людей также увеличено содержание маркера GC-ДНК.
Таким образом, в норме, при сосудистой патологии и при повреждающем внешнем воздействии в составе циркулирующей ДНК накапливаются GC-ДНК.
Особенно много GC-ДНК накапливается в составе вкДНК при хроническом воздействии источника внутреннего излучения трития, которое индуцирует повышенную гибель клеток. Одновременно с увеличением GC-пар в составе вкДНК увеличивается содержание окисленных последовательностей, и, прежде всего, содержание окисленного гуанозина (8-окси-дезоксирибогуанозина), поскольку гуанозин наиболее легко окисляется. Имеются многочисленные свидетельства того, что уровень окисления клеточной ДНК, а значит и циркулирующей ДНК, намного выше при сердечно-сосудистых и онкологических заболеваниях (Kostuyk S.V. et al., 2013).
Рис.1. Содержание маркерной GC- богатой последовательности (рибосомный повтор, транскрибируемая область) в составе циркулирующей ДНК в норме, при сосудистой патологии и при внешнем воздействии (ионизирующее излучение).
Примечание: Источники ДНК: (1) геномная ДНК клеток крови, проанализирована ранее (Вейко Н.Н. и др., 2003);
(3,4) вкДНК больных артериальной гипертензией и атеросклерозом получена из коллекции Коноровой И.Л., Центр Неврологии РАМН;
(2,5,6) вкДНК соответственно здоровых людей, работающих с источниками бета излучения трития и гамма-излучения. ДНК получены из коллекции образцов вкДНК Саровского ядерного центра от Корзеневой И.Б. в рамках выполнения государственного контракта № 14.512.11.0090 (МОН РФ, 2013 г.).
2. Локализация образцов вкДНК с различными характеристиками в HUVEC Известно, что нормальные клетки в клеточной культуре и в организме связывают значительные количества внеклеточной/циркулирующей ДНК (Rykova E.Ju. et al., 2012). Для оценки локализации фрагментов вкДНК, взаимодействующих с клетками HUVEC, использованы флуоресцентные зонды, содержащие флуоресцентную метку Spectrum Green (Рис.2).
Рис. 2. Локализация неокисленных (а, б) и окисленных (в, г) меченых образцов гДНК в клетках HUVEC.
Примечание: (а, в) – видимый свет;
(б) – окраска ядер клеток DAPI и локализация зонда гДНКGreen (возб 495 нм);
(г) - локализация зонда гДНКGreen-ОХ в клетках. Условия: концентрация зондов 50 нг/мл;
время культивирования в присутствии зондов – 30 мин. Увеличение 100.
(гДНКGreen, p(rDNA)Green pBR322Green) Неокисленные образцы ДНК и взаимодействуют преимущественно с клеточной поверхностью, лишь в 3% клеток ДНК проникает вглубь цитоплазмы. Окисленный образец гДНКGreen-ОX, наряду с локализацией на клеточной поверхности, гораздо чаще проникает внутрь клетки (~30% клеток). Увеличение концентрации вкДНК в 2-10 раз сопровождается значительным увеличением связывания ДНК с клеткой.
3. Экспрессия ДНК-сенсоров TLR9, AIM2 и RIG1 в HUVEC При действии на HUVEC фрагментов ДНК в клетках активируются, как TLR зависимый, так и TLR-независимый сигнальные пути. Высокие концентрации большинства фрагментов ДНК, а в случае вкДНК больных ССЗ, и низкие концентрации, активируют экспрессию мРНК TLR9 рецепторов (Рис. 2).
Бактериальная ДНК увеличивает экспрессию TLR9 в HUVEC в 1,3-2,8 раза.
Модельные образцы p(rDNA) и p(satIII) в концентрации 50 нг/мл стимулируют увеличение количества мРНКTLR9 в 2 раза. Образец вкДНК, выделенный из плазмы крови больного ОИМ (1) с низким содержанием GC-ДНК не влияет на количество мРНКTLR9, но образцы 2-6 с высоким содержанием маркерных GC-ДНК (Булычева Т.И. и др., 2008) стимулируют увеличение количества мРНКTLR9 в 2-2,5 раза. Геномная ДНК в меньшей степени влияет на количество мРНКTLR9;
p(rDNA) и p(satIII) в концентрации 5 нг/мл снижают уровень мРНКTLR9 более чем в 2 раза.
Рис. 3. Экспрессия мРНК TLR9 в HUVEC при действии на клетки проб вкДНК по отношению к контролю (К).
Примечание: Обозначение модельных проб: 5 нг/мл (серые столбики);
10 нг/мл – темно серые;
50 нг/мл – черные. Образцы вкДНК больных ССЗ, 5 нг/мл (красные столбики) Время инкубации с вкДНК - 3часа. Ось У: количество мРНК TLR9 относительно контрольного гена (TBP). Данные 4-х опытов (SD), (*) – p0,05.
Для подтверждения результатов ПЦР-анализа мРНКTLR9 оценена экспрессия белка TLR9 в HUVEC (Рис. 4). Метод флуоресцентной микроскопии позволил выявить в контрольных HUVEC немногочисленные клетки, экспрессирующие много TLR9.
Большинство клеток не окрашено или слабо окрашено, часть клеток не содержит TLR9.
В присутствии р(rDNA) количество сильноокрашенных клеток возрастает.
Рис. 4. Экспрессия белка TLR9 в HUVEC в контроле (а) и при действии р(rDNA),концентрация вкДНК 50 нг/мкл, время инкубации 3 часа (б, в).
Примечание: Для визуализации белка TLR9 клетки обработаны антителами, к TLR9, меченными фикоэритрином. (в) Средние значения интенсивности флуоресценции одной клетки (приводится среднее для 100 клеток и стандартное отклонение). Увеличение 48 раз.
Фрагменты вкДНК, действующие на клетки эндотелия, также активируют в них TLR-независимый путь, о чем свидетельствует изменение экспрессии мРНК таких ДНК-сенсоров, как AIM2 и RIG1 (Рис. 5).
Рис. 5. Относительные изменения содержания мРНКAIM2 и мРНК RIG-1 в HUVEC при действии модельных образцов ДНК (50 нг / мл).
Примечание: Время действия указано по оси Х. Экспрессию определяли относительно контрольного гена (TBP). Приводятся данные 4-х опытов, указано SD, (*) p0,05. Контрольный уровень – зеленая линия.
Экспрессия мРНКAIM2 под действием всех образцов ДНК увеличивается в 1,5 2,5 раза в первые 24 часа после инкубации клеток с фрагментами ДНК. К 48 часам эффект практически не наблюдается. Увеличение количества мРНКRIG1 в 1,5-2 раза в течение 24 часов имеет место только в случае гДНК. Окисление гДНК уменьшает длительность периода увеличения уровня мРНКRIG1 до 3-х часов. Образцы GC-ДНК не влияют на уровень экспрессии мРНКRIG1.
4. Увеличение экспрессии генов NF-kB пути При действии на клетку бактериальной ДНК активируются рецепторы TLR9, что приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB и транслокации его активной формы в ядро клетки (Hiramatsu Y., 2013). NF-kB регулирует транскрипцию генов провоспалительных цитокинов и других белков клеточного стресса (Рис. 6).
Образцы вкДНК вызывают в HUVEC увеличение экспрессии генов основных молекул сигнального каскада, связанного с NF-KB, а также генов провоспалительных цитокинов TNF-a и IL6, которые контролируются NF-KB.
Все неокисленные образцы ДНК стимулируют увеличение количества РНК перечисленных генов. Наиболее сильным стимулятором является образец ДНК, содержащий фрагмент рибосомного повтора человека – через 3 часа уровень мРНК генов возрастает в 3 и более раза. Далее происходит снижение количества мРНК. Два других образца (гДНК и pBR322) действуют медленнее – максимум экспрессии мРНК генов наблюдается через 24 часа культивирования.
Рис. 6. Изменение экспрессии мРНК NFKB1, M4K4F, TIR, MyD88 (верхний ряд столбиков), TNFa и IL6 (нижний ряд) в клетках в присутствии проб ДНК (50 нг/мл, время инкубации с ДНК 3-72 часа).
Примечание: По оси У: количество мРНК относительно контрольного образца клеток (без ДНК). Приводятся данные 4-х опытов, указано SD, (*) –p0,05. Контрольный уровень (принятый за 1) - зеленая линия).
Окисленный образец гДНК слабо стимулирует экспрессию лишь некоторых из анализируемых генов в течение непродолжительного времени. Количество мРНК двух цитокинов TNFa и IL6 возрастает в 1,5 – 2,7 раза в присутствии всех образцов ДНК, что подтверждает активацию NF-kB.
5. Изменение количества белка р65 (NF-kB) и его локализации в HUVEC Конечным этапом активации транскрипционного фактора NF-kB является его диссоциация с белком ингибитором I-kappa-B и транслокация активной формы, в состав которой входит субъединица р65, из цитоплазмы в ядро клеток (Adli M. et al., 2010).
Метод флуоресцентной микроскопии позволил оценить количество и локализацию белка р65 в клетках эндотелия, при инкубации их с фрагментами вкДНК (Рис.7) В контрольных клетках содержится немного белка р65, и он локализован в цитоплазме. Геномная ДНК и бактериальный вектор стимулируют увеличение количества р65 в цитоплазме клеток, где он находится в составе отдельных гранул.
Плазмида p(rDNA) вызывает увеличение количества р65 в клетках, причем практически весь белок локализован в клеточном ядре.
Количество р65 значительно увеличивается при культивировании HUVEC с образцами окисленной ДНК. Р65 накапливается преимущественно в цитоплазме клеток, что говорит о его неактивном состоянии.
Рис.7. Анализ локализации фактора NF-kB в HUVEC, которые инкубировали 2 часа в присутствии 50 нг/мл модельных образцов ДНК и образцов циркулирующей ДНК, выделенных из плазмы крови больных ОИМ (нижний ряд).
Примечание: Использовали антитела к белку р65, меченые флуоресцеином. Увеличение раза.
Образец вкДНКОИМ1 вызывает в клетках такое же распределение р65, как и неокисленный образец гДНК: слабое увеличение окрашивания цитоплазмы клеток.
Образцы вкДНКОИМ2 и вкДНКОИМ3 действуют, как окисленная гДНК, т.к. содержат высокий процент окисленных оснований (примерно 400 на миллион нуклеозидов, по данным анализа, выполненного Глебовой К.В.). ВкДНКОИМ2 и вкДНКОИМ3 увеличивают уровень р65 и стимулируют его накопление в цитоплазме и ядрышке.
6. ВкДНК стимулирует синтез АФК в HUVEC Активация NF-kB в клетках, как правило, связана с индукцией в клетке окислительного стресса. В связи с этим оценен уровень АФК в HUVEC при действии образцов вкДНК на клетки. Для этой цели применили реагент H2DCFH-DA, который в клетках взаимодействует с АФК в форме деацетилированного производного DCF.
Проанализировано 26 различных модельных образцов ДНК, содержащих GC-богатые и/или окисленные фрагменты ДНК, и образцы циркулирующей ДНК, выделенных из плазмы крови здоровых доноров (ЗД) и больных острым инфарктом миокарда (ОИМ).
Для детекции АФК использовали планшетный (96-луночный) ридер (Рис.8).
Рис.8. Анализ изменения количества АФК в HUVEC с использованием реагента H2DCFH-DA и планшетного флуоресцентного ридера.
Примечание: Каждый образец ДНК наносили в 8 лунок планшета. Приводятся средние значения сигнала относительно контрольных клеток. Условия: концентрация указанных на рис.
образцов ДНК - 20 нг/мл, время инкубации 1 час.
Образцы p(rDNA), p(SatIII) и e.coli ДНК стимулируют увеличение сигнала DCF в культуре клеток на 40-70%. гДНК, вкДНК среды культивирования нормальных HUVEC и циркулирующая вкДНК здоровых людей в наименьшей степени стимулируют увеличение количества АФК (не более чем на 20%). Из 10 образцов циркулирующей вкДНК больных ОИМ 7 образцов вызывали увеличение количества АФК на 25 – 150%.
Окисленные образцы ДНК (модельные гДНКОХ1 и гДНКОХ2, вкДНК среды облученных клеток) стимулировали накопление АФК в клетках в гораздо большей степени, чем неокисленные (соответственно гДНК или вкДНК среды контрольных клеток). Уровень АФК, наблюдаемый при действии GC-ДНК и циркулирующей вкДНК больных ОИМ, сопоставим с уровнем АФК, который индуцируют в клетках HUVEC малые дозы (10сГр) ионизирующего излучения. Некоторые образцы окисленной ДНК и образцы циркулирующей вкДНК больных ОИМ вызывают эффект, сравнимый с действием Н2О2 в концентрации 40мкМ.
Таким образом, практически все изученные образцы ДНК при введении в среду культивирования HUVEC в концентрации, примерно в 2 раза превышающей концентрацию собственной ДНК, стимулируют увеличение уровня АФК. Наибольшей активностью обладают модельные GC-ДНК и окисленные ДНК. Для образца вкДНК №24, который вызывал наибольший эффект определено содержание маркера окисления, которое составило 410 8-oxodG на миллион нуклеозидов ДНК. Этот образец вызывал такое же увеличение уровня АФК (более, чем в 2 раза), что и модельный образец гДНКОХ1, окисленной in vitro с использованием Н2О2 до уровня 400 8 oxodG/106 нуклеозидов.
Одним из основных продуцентов АФК в эндотелиальной клетке является изоформа фермента НАДФН-оксидазы (NOX4). На рис.9 приведены данные изменения количества мРНКNOX4 в клетках при изменении свойств вкДНК среды культивирования.
Рис.9. Изменение количества мРНКNOX4 в клетках при изменении свойств вкДНК.
Примечание: Условия – 3 часа, тип и концентрации образцов ДНК указаны на рисунке. Для сравнения брали клетки, облученные ионизирующим излучением в дозе 10 сГр (через 1 час после облучения – красный столбик). Приводятся данные 4-х опытов, указано SD, (*) p0,05.
Контрольный уровень относительной экспрессии (принятый за 1) – зеленая линия.
Геномная ДНК, вкДНК HUVEC и циркулирующая вкДНК здорового донора достоверно не изменяют количество мРНКNOX4. Плазмида p(rDNA), окисленные гДНК и p(rDNA), вкДНК среды облученных клеток и циркулирующая вкДНК больного ОИМ увеличивают уровень мРНКNOX4, примерно, в той же степени, что и стандартный индуктор окислительного стресса – малая доза ионизирующего излучения.
Интересно отметить, что малые концентрации окисленной гДНК действуют намного эффективнее, чем большие концентрации. Обнаружена высокая положительная корреляция между увеличением количества мРНКNOX4 и количеством детектируемых в клетках активных форм кислорода (линейная регрессия, k=0,92;
p0.001). Этот факт говорит в пользу того, что GC-ДНК и окисленные фрагменты ДНК индуцируют образование АФК, в первую очередь, стимулируя экспрессию гена NOX4.
Данные об увеличении экспрессии NOX4 на уровне белкового продукта гена при изменении уровня окисления ДНК подтверждены методом иммунофлуоресценции (Рис.10).
Рис.10. Локализация белка NOX4 (антитела - ФИТЦ) в HUVEC.
Примечание: Ядра дополнительно окрашены DAPI (голубой). Клетки культивировали в присутствии указанных образцов ДНК, введенных на 1 час в среду культивирования в концентрации 50 нг/мл. (увеличение100).
Белок локализован в HUVEC в цитоплазме и вблизи клеточной мембраны. В присутствии вкДНКОХ наблюдается увеличение числа клеток с высоким содержанием NOX4. Экспрессия белка усиливается как на поверхности клеток, так и в участках цитоплазмы, сближенных с ядром, где происходит увеличение количества АФК, детектируемое окраской DCF.
Для оценки характера клеточного ответа на действие GC-богатых и окисленных ДНК и вызванный ими окислительный стресс измерена экспрессия гена SOD1. GC богатая р(rDNA), а также окисленная гДНК в концентрации 50 нг/мл, через 1 час инкубации вызывают увеличение количества мРНК SOD1 в 1,5 – 2,5 раза. Неокисленная гДНК не влияет на уровень мРНКSOD1. Через 3 часа инкубации с неокисленными фрагментами ДНК количество мРНКSOD1 снижается в 3 раза. Окисленная гДНК стимулирует дальнейшее увеличение количества мРНКSOD1. Полученные данные говорят об активации не только окислительных процессов, связанных с выработкой АФК, но и с включением механизмов защиты от чрезмерного окисления.
7.Образование разрывов ядерной ДНК в клетках HUVEC при изменении свойств циркулирующей вкДНК Резкое увеличение количества АФК в клетках, особенно вблизи ядра, может приводить к повреждению ДНК в ядре клетки. Мы исследовали эту возможность методом ДНК-комет (рис.11-1,2). В течение 30 мин с момента добавления 5 или нг/мл ДНК в среду культивирования количество разрывов хроматина значительно увеличивается, причем не обнаруживается существенной разницы между образцами гДНК, GC- ДНК и гДНКОХ (Рис. 11- 2). Уже через час количество разрывов в ядерной ДНК в присутствии пробы гДНК значительно снижается и приближается к контрольному уровню, в то время как в присутствии GC- ДНК (кривые 2) и гДНКОХ (кривые 3) количество разрывов продолжает увеличиваться по сравнению с контролем.
Через 3 часа культивирования количество разрывов хроматина в присутствии всех образцов ДНК практически совпадает с контрольным уровнем.
Рис.11 (1) Примеры анализа разрывов хроматина HUVEC методом комет в щелочном варианте.
Ядерная ДНК окрашена бромистым этидием. Время инкубации с перекисью водорода и фрагментами ДНК – 30 мин. Увеличение 100.
(2) Кумулятивные гистограммы характеристик комет (% ДНК в хвосте кометы). Условия: нг/мл гДНК (кривые 1), p(rDNA) (кривые 2) и гДНКОХ (кривые 3), время действия указано на рис. Для сравнения на верхних рисунках приведены данные, отражающие действие ДНК в концентрации 5 нг/мл (кривые коричневого цвета).
Для визуализации двуцепочечных разрывов (ДР) применили метод, основанный на флуоресцентной детекции фосфорилированного белка Н2АХ в сайте образования разрыва. В культуре HUVEC можно выделить несколько субпопуляций клеток с различным уровнем ДР в ядерной ДНК (Рис. 12).
При добавлении в среду культивирования окисленных или GC- богатых фрагментов вкДНК, мы наблюдали признаки нестабильности генома (образование микроядер, выпячивание ядерной мембраны), которые являются следствием увеличения количества разрывов ДНК. Максимальный эффект наблюдался в случае действия на клетки окисленных образцов гДНК и GC-ДНК.
Рис. 12. (а) Основные типы ДР ДНК, которые встречаются в HUVEC. Фиксированные клетки окрашены мечеными флуоресцеином антителами к фосфорилированной форме гистона Н2АХ.
Примечание: Ядра окрашены DAPI. (а) - большинство ядер не содержат ДР(0);
ядро содержит 1-2 ДР(1);
ядро содержит несколько ДР (3);
(ядра с множественными ДР(3) (100). (б) Анализ ДР ДНК в HUVEC методом проточной цитометрии. Условия: 50 нг/мл ДНК, 1 час;
(б) медиана интенсивности сигнала клеток основной фракции, включающей типы ядер (0) и (1). Под действием различных фрагментов вкДНК в первые полчаса увеличивается количество ДР, однако, через 3 часа инкубации количество разрывов не отличается от контрольного уровня или снижается.
Синтез АФК и образование ДР в клетках при изменении свойств вкДНК стимулируют в HUVEC ответ, который включает признаки адаптивного ответа (Рис.
13).
Наблюдалось увеличение экспрессии генов, отвечающих за репарацию ДНК (BRCA1 и PCNA) и генов, активность которых направлена на снижение уровня апоптоза клеток.
Рис. 13. Изменение экспрессии генов, отвечающих за выживаемость клеток. Приводятся значения относительно внутреннего контроля (ген TBP). Концентрация вкДНК – 50 нг/мл.
Примечания: Красным цветом выделены значения, достоверно отличающиеся от контроля (p0,05, критерий Мана-Уитни). 1 - pBR322;
2 - p(rDNA);
3 - гДНК;
4 - гДНКОХ.
Данные для антиапоптотических генов приведены на рис.13. Количество мРНК BCL2 и BIRC3 достоверно увеличивается под действием p(rDNA), гДНК и гДНКОХ в 1, – 3,2 и 1,7 – 2,3 раза соответственно в первые 3-48 часов. Количество мРНК BCL2A1, BCL2L1, BIRC2 увеличивается при действии всех использованных в опыте модельных проб.
8.Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию клеток HUVEC.
Окислительный стресс, вызывающий образование разрывов ДНК, например, при действии радиации, сопровождается остановкой клеточного деления на всех стадиях клеточного цикла. Мы исследовали влияние различных образцов ДНК на количество пролиферирующих клеток в культуре. Для анализа методом проточной цитометрии использованы меченные флуоресцеином антитела к маркеру пролиферации белку Ki- (Рис. 14).
При действии модельных образцов ДНК в концентрации 50 нг/мл на клетки уровень экспрессии Ki-67 снижается уже через 30 минут в 1,7-2,5 раза и продолжает снижаться с течением времени. При длительной культивации эффект сохраняется.
Рис. 14. Анализ изменений количества маркера пролиферации Ki-67 в клетках, культивируемых в присутствии различных образцов ДНК (50 нг/мл). Метод проточной цитометрии.
Примечание: Приводятся средние значения интенсивности сигнала клеток. Время культивирования указано на рисунке. (*) –p0,05.
9.ВкДНК влияет на уровень NO в HUVEC Одной из основных функции эндотелия для регуляции сосудистого кровотока является выработка им окиси азота. С помощью нового флуоресцентного красителя CuFL (Lim M. et al., 2007), связывающегося преимущественно с NO, оценили уровень NO в клетках эндотелия при действии различных образцов вкДНК (Рис. 15). GC-ДНК в низких концентрациях стимулируют синтез NO в HUVEC. Из трех образцов GC-ДНК наибольшим эффектом обладает образец, содержащий фрагмент рибосомного повтора.
Увеличение концентрации GC-ДНК сопровождается уменьшением эффекта. Образцы окисленной ДНК (гДНКОХ1, гДНКОХ2, вкДНК среды облученных клеток (вкДНК10сГр)) снижают количество NO в клетках в 2-3 раза, в отличие от неокисленных образцов гДНК или вкДНКК. Аналогично действуют малые дозы рентгеновского излучения (10сГр).
Образцы вкДНК ЗД (здоровых молодых доноров) стимулирует в различной степени увеличение количества NO. ВкДНК больных артериальной гипертензией и ИБС (вкДНК ССЗ) снижает уровень NO в клетках HUVEC.
В эндотелиальных клетках основной фермент, отвечающий за синтез NO при нормальных условиях – эндотелиальная NO-синтаза (eNOS). В работе проведен анализ экспрессии eNOS на уровне мРНК и белка в клетках при действии на них различных фрагментов вкДНК (рис.16).
GC-ДНК увеличивает количество мРНКeNOS, окисленные образцы (гДНКОХ1, гДНКОХ2, вкДНК10сГр) снижают уровень мРНКeNOS (рис.16а). Изменения в количестве NO положительно коррелируют с изменениями в количестве мРНКeNOS. По-видимому, eNOS – это основная NO-синтаза, на которую влияет изменение свойств вкДНК.
Рис. 15. Флуоресцентное определение количества NO в HUVEC с использованием планшетного ридера.
Примечание: Клетки культивировали в присутствии образцов ДНК, указанных в таблице на рисунке. Время: 2 часа. Концентрации указаны в таблице.
При длительном культивировании эндотелиальных клеток с окисленными образцами ДНК мы наблюдали стабильное снижение количества белка eNOS в клетках.
Неокисленная гДНК в этих же условиях стимулировала увеличение количества белка (рис.16б). Как показал метод проточной цитометрии, в HUVEC 15 % клеток содержат малые количества белка eNOS. Культивирование с неокисленной ДНК практически не влияет на содержание клеток с низким уровнем экспрессии eNOS. Культивирование же с окисленными формами ДНК в 1,5-2 раза увеличивает количество клеток этой фракции.
Рис. 16. (а) Зависимость количества NO в HUVEC от количества мРНК eNOS и (б) влияние гДНК и гДНКОХ на количество еNOS (данные проточной цитометрии).
Примечание: время инкубации с фрагментами 3 часа (а) и 48 часов (б), концентрация добавленных фрагментов вкДНК 50 нг/мл.
10. ВкДНК влияет на экспрессию актина и F-актина в HUVEC Активность eNOS, которая в клетке непосредственно связана с различными формами актина, зависит в большой степени от цитоскелета. Одним из компонентов цитоскелета, отвечающих на стрессовый сигнал, является актиновый цитоскелет.
Образцы GC-ДНК, вкДНК10сГр, вкДНКOX и вкДНК больных ОИМ в 2,2-7,9 раза увеличивают экспрессию актина на уровне транскрипции (рис.17В). В случае действия на клетки GC-ДНК и окисленных форм гДНК наблюдается образование стресс волокон F-актина (рис.17Б). GC-ДНК, вкДНК10сГр, вкДНКOX, наряду с облучением, в 1,5-2 раза увеличивают количество полимерного актина в клетках.
ВкДНК необработанных клеток (ДНКК) и гДНК не изменяют состояние F-актина.
Так как образование стресс-волокон актина коррелирует с уменьшением активности eNOS (Su Y. et al., 2007), оно может являться второй (после снижения уровня мРНК eNOS) причиной уменьшения количества NO при действии окисленных образцов ДНК.
В работе также проанализированы изменения в количестве РНК генов молекул адгезии (ICAM1, PECAM1, SELE и VCAM1), которые влияют на состояние цитоскелета.
Практически все исследуемые образцы ДНК в той или иной степени стимулируют увеличение количества мРНК молекул адгезии. Наибольшей активностью обладают образцы окисленной ДНК.
Рис. 17. Анализ изменения экспрессии и уровня полимеризации актина.
Примечание: (А) – определение полимерного актина (фаллоидин-родамин).
(Б) - определение уровня окраски F-актина с использованием планшетного ридера.
(В) - определение количества мРНК ACTB методом реал ПЦР.
Концентрация добавленной вкДНК 50 нг/мл ДНК, время инкубации с фрагментами 3 часа.
11. Заключение Изменение свойств циркулирующей ДНК крови, в частности, при сердечнососудистых заболеваниях описано в литературе (Arnalich F. et al., 2010). В первые часы после развития ОИМ, в несколько раз увеличивается концентрация вкДНК (Veiko N. et al., 2008). Показано, что чем выше концентрация вкДНК у больного, тем хуже прогноз выживаемости (Huanga C. et al., 2012). У больных ОИМ и ИБС повышено содержание маркерных GC-ДНК (Булычева Н. и др., 2008). Содержание GC-ДНК увеличено в вкДНК больных артериальной гипертензией и атеросклерозом, а также у лиц, работающих с источниками ионизирующей радиации (рис.1). Поскольку при ССЗ в организме имеет место окислительный стресс, который увеличивает уровень окисления клеточной ДНК, то и уровень окисления вкДНК значительно возрастает (Kostuyk S. et al., 2013). Таким образом, к основным свойствам вкДНК, которые изменяются при патологии, можно отнести: (1) концентрацию вкДНК, (2) содержание в вкДНК GC-ДНК и (3) окислительную модификацию оснований вкДНК.
Для анализа ответа клеток эндотелия на изменение перечисленных свойств вкДНК использована модель: в среду культивируемых эндотелиальных клеток HUVEC добавляли различные количества образцов ДНК, которые имели различный GC-состав и отличались по содержанию маркера окисления – 8-oxodG. Эта схема моделирует процессы в организме, при которых очень резко изменяются свойства циркулирующей внеклеточной ДНК.
В ответ на изменение свойств вкДНК в клетках возрастает активность транскрипционного фактора NF-kB, который, как известно, играет негативную роль в эндотелии, активируя синтез провоспалительных цитокинов, например TNFa и IL (Zhang X. et al., 2011). Наличие в составе вкДНК окисленных оснований снижает уровень активации NF-kB, который стимулируется изменением общей концентрации вкДНК и увеличением содержания GC-ДНК.
Изменение свойств вкДНК в среде культивирования в эндотелии повышает уровень экспрессии гена NOX4, который кодирует фермент, ответственный в эндотелии за синтез супероксиданиона. В результате в клетке в областях цитоплазмы, сближенных с ядерной мембраной, значительно возрастает концентрация активных форм кислорода.
Сильнее всего уровень АФК возрастает в присутствии окисленных и GC-богатых фрагментов вкДНК. Таким образом, циркулирующая вкДНК больных ОИМ, которая содержит много GC-ДНК и 8-oxodG, может стимулировать дополнительный окислительный стресс в эндотелии. Циркулирующая вкДНК может являться одной из причин окислительного стресса, который длительно поддерживается в организме больных ОИМ. Полученные данные позволяют рассмотреть окисленную циркулирующую ДНК в качестве возможного объекта для терапии острых состояний, которые сопровождаются высоким уровнем окислительного стресса.
Высокий уровень АФК, индуцируемый изменением свойств вкДНК, вызывает блокирование пролиферации и транзиторное появление в ядре эндотелиальной клетки заметного количества одно - и двунитевых разрывов ДНК, в основном, в областях, близких к ядерной мембране. Разрывам хроматина сопутствуют признаки нестабильности генома – образование микроядер и фрагментация хроматина в некоторых клетках.
Изменение свойств вкДНК стимулирует в эндотелиальных клетках развитие адаптивного ответа, который защищает их от негативных последствий резкого увеличения уровня АФК и возникновения большого числа разрывов ДНК. Длительное культивирование клеток в присутствии различных образцов ДНК стимулирует репарацию, за счет которой в 2-3 раза снижается количество разрывов в ДНК хроматина. Значительно увеличивается экспрессия мРНК генов, ответственных за репарацию одно- и двунитевых разрывов ДНК (PCNA, BRCA1) и антиапоптотических генов (BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BIRC2, BIRC3), что приводит к повышению выживаемости и снижению уровня апоптоза клеток.
Свойства внеклеточной ДНК, контактирующей с эндотелием, существенно влияют на количество молекул оксида азота (NO) в эндотелиальной клетке, основной синтез которого осуществляется ферментом eNOS. В низких концентрациях GC богатые последовательности генома увеличивают уровень NO, в то время как окисление внеклеточной ДНК сопровождается блокированием синтеза NO. Этот факт обусловлен значительным снижением экспрессии гена eNOS на уровне мРНК и белка.
Молекула окиси азота – это один из основных факторов эндотелия, который регулирует тонус сосудов. Снижение уровня NO в присутствии окисленной ДНК потенциально может приводить к развитию артериальной гипертензии.
При изменении свойств вкДНК значительно изменяется состояние клеточного матрикса. GC- богатые и окисленные образцы ДНК стимулируют в эндотелиальных клетках синтез стресс-волокон полимерного актина и увеличение экспрессии мРНК генов молекул адгезии (ICAM1, PECAM1, SELE и VCAM1). Изменение адгезивных свойств эндотелиальных клеток, характеризующееся увеличением экспрессии молекул адгезии говорит о включении иммунного ответа эндотелия на внешнее воздействие. В данном случае, можно предположить следующий порядок событий: фрагменты вкДНК активируют NF-kB зависимый путь, приводящий к выбросу провоспалительных цитокинов. Они, в свою очередь, активируют экспрессию молекул адгезии, направленную на развитие воспалительной реакции. Подобный механизм характерен для воспалительных процессов при атеросклерозе и других ССЗ, а также при действии на сосуды малых и средних доз радиации (Galkina E., Ley K., 2007;
Halle M. et al., 2010).
Если учитывать блокирование пролиферативных процессов в клетках эндотелия, с одной стороны, и репаративные процессы с другой стороны, то при совмещении этих факторов можно построить модель хронического воспалительного процесса, сопровождающегося выделением цитокинов и экспрессией молекул адгезии, привлекающих и активирующих в сосудах клетки иммунной системы. Ключевую роль в этом процессе играет взаимодействие эндотелия с фрагментами циркулирующей ДНК, которая вызывает в клетках вторичные системные процессы, усугубляющие первопричину патологии. Для иллюстрации этого механизма можно предложить схему, приведенную на рис. 18. Таким образом, внеклеточная ДНК, свойства которой изменяются при патологии, может значительно изменять физиологическую активность клеток эндотелия, и должна рассматриваться в качестве потенциальной мишени для терапии заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией.
Рис.18. Схема, иллюстрирующая механизм возникновения ответа эндотелиальных клеток на воздействие окисленных и/или GC- богатых фрагментов циркулирующей вкДНК.
ВЫВОДЫ 1. Изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления внеклеточной ДНК индуцирует в клетках эндотелия HUVEC увеличение экспрессии гена NOX4 и синтез активных форм кислорода (АФК). Способность модельных образцов ДНК стимулировать синтез АФК в клетках эндотелия изменяется в ряду: Окисленная геномная ДНК GC-ДНК геномная ДНК. Циркулирующая ДНК больных сердечно сосудистыми заболеваниями стимулирует синтез АФК в гораздо большей степени, чем циркулирующая ДНК здоровых людей.
2. Повышенный уровень АФК вызывает образование одно- и двунитевых разрывов ДНК HUVEC, что сопровождается блокированием деления клеток в G1-, S- и G2/M – фазах клеточного цикла. Возрастает экспрессия генов CCND1, CDKN2A, CDKN1A, RB1, TP53, MDM2, контролирующих переход G1S. Разрывы ДНК индуцируют нестабильность генома, признаками которой являются микроядра, фрагментация хроматина и выпячивание ядерной мембраны.
3. Образование разрывов ДНК стимулирует увеличение экспрессии генов, ответственных за репарацию одно- и двунитевых разрывов ДНК (PCNA, BRCA1) и антиапоптотических генов (BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BIRC2, BIRC3), что приводит к повышению выживаемости клеток и снижению уровня апоптоза.
4. Клеточный ответ на изменение концентрации, GC-состава и уровня окисления вкДНК включает активацию транскрипционного фактора NF-kB. Способность образцов вкДНК активировать NF-kB уменьшается в ряду: GC-ДНК геномная ДНК окисленная геномная ДНК 5. Свойства внеклеточной ДНК влияют на экспрессию гена eNOS на уровне мРНКeNOS, белка eNOS и продукта NO. В низких концентрациях GC-ДНК значительно увеличивает уровень NO, окисленная ДНК блокирует синтез NO.
6. GC-ДНК и окисленная ДНК стимулируют в эндотелиальных клетках изменения клеточного матрикса. Наблюдается синтез стресс-волокон полимерного актина и увеличение экспрессии генов молекул адгезии (ICAM1, PECAM1, SELE и VCAM1).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:
Костюк С.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Ермаков А.В., 1.
Ефремова Л.В., Конорова И.Л., Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК влияет на функциональную активность клеток эндотелия // Медицинская генетика, 2010. Вып. 1.
С. 38-46.
Баскова И.П., Алексеева А.Ю., Костюк С.В., Неверова М.Е., Смирнова Т.Д., 2.
Вейко Н.Н. Применение нового реагента Cu-FL для анализа стимуляции синтеза NO секретом слюнных клеток медицинской пиявки в эндотелии человека (HUVEC) и кардиомиоцитах крысы // Биомедицинская химия, 2012. Т. 58. Вып. 1. С. 65-76.
Костюк С.В., Смирнова Т.Д., Ефремова Л.В., Конькова М.С., Алексеева А.Ю., 3.
Каменева Л.В., Вейко Н.Н. Увеличение экспрессии iNOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2010. Т. 149. №9. С. 151-156.
Ефремова Л.В., Алексеева А.Ю., Конькова М.С., Костюк С.В., Ершова Е.С., 4.
Смирнова Т.Д., Конорова И.Л., Вейко Н.Н.. Внеклеточная ДНК влияет на количество окиси азота в эндотелиальных клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т.149 №9. С. 156-162.
Публикации в других изданиях:
Алексеева А.Ю., Ермаков А.В., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Еголина Н.А., 5.
Вейко Н.Н. Внеклеточная ДНК облученных клеток – фактор стресс-сигнализации, изменяющий функциональную активность эндотелия // Сборник материалов VI съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 2010. С.6.
6. Malinovskaya E.M., Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Kon'kova M.S., Smirnova T.D., Kameneva L.V., Efremova L.V., Alekseeva A.Yu., Lyubchenko L.N., Veiko N.N. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V., 2011. Сhapter 27.
P. 199-205.
Alekseeva A.Yu., Bulicheva N.V., Kostyuk S.V., Smirnova T.D., Veiko N.N. Cell 7.
Free DNA (cfDNA) Influences Nitric Oxide and ros Levels in Human Endothelial Cells // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V., 2011. Сhapter 30. P. 219- Alekseeva A.Yu., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Possible Role of Extracellular Human 8.
DNA in Development of Vascular Endothelial Dysfunction //
Abstract
book of Leiden International Medical Student Conference (LIMSC), Leiden, 2011. P. 269.
Alekseeva A.Yu., Kostyuk S.V., Smirnova T.D., Baranova A., Roginko O.A., Kuzmin 9.
V. A., Veiko N.N. Role of extracellular DNA oxydative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes // CNAPS VII. Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Abstracts, Madrid, 2011. P.20.
10. Kostyuk S.V., Ermakov A.V., Alekseeva A.Y., Smirnova T.D., Glebova K.V., Efremova L.V., Baranova A.V., Veiko N.N. Role of extracellular DNA oxidative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes // Mutation Research, 2012.
V. 3(729). P. 52-60.
11. Alekseeva A.Yu., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Influence of cfDNA fragments on cellular pathways in endothelium and their significance in patients with myocardial infarction // Book of abstracts 19th International Student Congress of (Bio)Medical Sciences (ISCOMS), Groningen, 2012. P. 308.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
вкДНК – внеклеточная ДНК;
вкДНКК – фрагменты вкДНК, выделенные из среды интактных клеток;
вкДНКR (10сГр) – фрагменты вкДНК, выделенные из среды облучённых клеток;
гДНК – геномная ДНК;
вкДНКох– окисленная in vitro ДНК;
GC-ДНК – ДНК, обогащенная GC парами азотистых оснований;
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота;
ЭС – эффект свидетеля;
ДР – двуцепочечные разрывы;
ЗД – здоровые испытуемые;
ОИМ – острый инфаркт миокарда;
ЯОР – ядрышковый организатор;
MyD88 – миелоидный фактор дифференцировки;
TLR9 – "toll-like" receptor 9;
TNF- – фактор некроза опухоли альфа;
eNOS – эндотелиальная NO-синтаза;
iNOS – индуцибельная NO-синтаза;
SOD – супероксиддисмутаза;
NOX – НАДФН-оксидаза.
Данное исследование поддержано грантом РФФИ для молодых ученых (№12-04 32211 мол_а ) и Госконтрактом МОН РФ № 14.512.11.0090 (27 июня, 2013), зарегистрированным под № 2013-1.2-14-512-0042.