Свободнорадикальные процессы и их регуляция в тканях крыс при действии соединений ртути
На правах рукописи
Куксенко Марина Евгеньевна СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Краснодар – 2013 2
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России) и Федеральном государственном автономном учреждении высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (Южный федеральный университет).
доктор биологических наук, профессор
Научный консультант:
Внуков Валерий Валентинович
Официальные оппоненты:
Сторожук Александр Петрович, доктор медицинских наук, муниципальное учреждение здравоохранения «Родильный дом» г.
Краснодар, главный врач;
Островский Олег Владимирович, доктор медицинских наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России), кафедра теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, заведующий кафедрой.
Ведущая организация:
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита диссертации состоится «_»2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д208.038.02 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России) (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 262-73-75).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России
Автореферат разослан «» 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Скорикова Д208.038.02, профессор Людмила Анатольевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Применение ртути в различных отраслях деятельности человека является существенным фактором загрязнения экосистем, что оказывает выраженное воздействие на формирование популяционного здоровья населения [Онищенко Г.Г., 2003]. Использование ртутьорганических соединений ограничено или запрещено в ряде стран Европейского Союза [Осипова В.П., 2000;
Давыдова С.Л., 2001;
Davies B.E., 1999].
Ртуть относится к первому классу опасности (чрезвычайно опасное химическое вещество), а е соединения обладают присущими только им токсическими свойствами. Основным проявлением токсического эффекта считают образование координационной связи иона ртути с атомами серы, азота, кислорода, входящими в состав молекул, т.е. с тиольными группами и гистидиновыми звеньями белка, гемоглобином, цитохромом Р450, рецепторами и т.п. [Давыдова С.Л., 1999;
Stepanov A.A., 2002;
Taylor T.J., 2007]. В результате происходит повреждение клеточных структур, агглютинация белка, ингибирование ферментов, угнетение метаболической активности [Пенькова Г.А., 2012;
Hare M.F., 1992].
Органические соединения ртути обладают в целом бльшим токсическим действием, чем соответствующие неорганические соли [ВОЗ, 2012]. Причиной большей токсичности этих соединений по сравнению с неорганическими солями является наличие в молекуле липофильных органических групп. Этим обеспечивается их высокая степень всасывания в желудочно-кишечном тракте, распространение с током жидкости по всему организму и перенос через мембраны клеток за счет диффузии. Органические производные способны накапливаться в клетках, имеют больший период биологического полураспада. Наиболее токсичными производными ртути являются алкилпроизводные, имеющие короткую углеродную цепь, так как медленно разлагаются и медленно выводятся из организма [Deacon G.B., 2002].
Последние десятилетия привели исследователей к осознанию необходимости выделения в самостоятельную группу экотоксикантов – металлоорганических соединений тяжелых металлов [Deacon G.B., 2002]. Ряд авторов показывают, что металлоорганические соединения обладают ещ большим повреждающим действием по сравнению с органическими производными [Кирилова Л.Б., 2001;
ООН (ЮНЕП), 2011]. Их отличительной особенностью является то, что ионы металла ковалентно связаны непосредственно с атомами углерода, и их токсичность усугубляется протекающей реакцией дезалкилирования в организме, в результате чего происходит разрыв связи «металл-углерод», и это приводит к образованию свободных радикалов [Давыдова С.Л., 2001].
Несмотря на то, что известно большое количество эффектов, вызываемых ртутью и е соединениями, в доступной литературе нет достаточных сведений о действии органических солей и металлоорганических производных на процессы свободнорадикального окисления и его регуляцию в целом.
В связи с этим является актуальным исследование проявлений влияния органических и металлоорганических производных ртути в концентрациях, не вызывающих и вызывающих клинические признаки отравления ртутью.
Основная часть работ посвящена анализу дисбаланса функционирования ферментных систем и показателей метаболизма in vitro, реже – in vivo, причем основной путь введения исследуемых веществ – внутрибрюшинный. Практически отсутствуют экспериментальные работы, посвященные исследованию токсического действия соединений ртути при энтеральном пути поступления.
В соответствии с этим исследование действия соединений ртути на процессы свободнорадикального окисления и его регуляции является актуальным, а неизученные вопросы являются задачами, объединенными общей целью исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование влияние органического и металлоорганического производных ртути на свободнорадикальные процессы и их антиоксидантную регуляцию в эксперименте.
В соответствии с поставленной целью были определены и решены следующие задачи:
1. Исследовать влияние соединений ртути на интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) по параметрам хемилюминесценции и содержанию молекулярных продуктов ПОЛ в тканях животных.
2. Выявить изменение показателей нитрозильного стресса в крови животных под влиянием органического и металлоорганического производных ртути.
3. Исследовать влияние соединений ртути на стабильность и структурное состояние мембран эритроцитов по уровню внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и других форменных элементов крови и клеток печени по уровню суммарной пероксидазной активности (СПА).
4. Определить состояние антиоксидантной системы по активности ферментативных и содержанию неферментативных антиоксидантов в тканях животных при действии производных ртути.
5. Сравнить действие органической соли и металлоорганического производного ртути на процессы свободнорадикального окисления и его регуляцию.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное систематическое исследование in vivo влияния органической соли и металлоорганического производного ртути на свободнорадикальные процессы и их регуляцию в крови и печени лабораторных животных (крыс).
Впервые обнаружено развитие нитрозильного стресса при действии соединений ртути, что подтверждается увеличением продукции пероксинитрита и его производных в плазме крови лабораторных животных.
Впервые показано нарушение стабильности мембран клеток исследованных тканей, что подтверждено возрастанием уровня суммарной пероксидазной активности и внеэритроцитарного гемоглобина.
При действии металлоорганического производного ртути впервые показаны более резкие изменения свободнорадикальных процессов и нарушение их антиоксидантной регуляции в крови и ткани печени по сравнению с действием органической соли ртути.
Впервые выявлено, что концентрация ртутьорганических производных, не вызывающая признаки ртутного отравления (атаксию, анорексию), достоверно приводит к выраженным изменениям свободнорадикальных процессов и их регуляции.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные подтверждают имеющиеся сведения об общей направленности токсического действия органических производных ртути.
Показано участие всех исследованных звеньев свободнорадикальных процессов на действие ртутьорганических производных (ацетата ртути и нитрата метилртути).
Определены основные сходства и различия в действии органической соли и металлоорганического производного ртути на СРП и их антиоксидантную регуляцию.
Получено экспериментальное подтверждение влияния органических производных ртути в концентрациях, не вызывающих симптомы ртутного отравления, на свободнорадикальные процессы и их антиоксидантную регуляцию.
Проведнные исследования способствовали установлению степени воздействия производных ртути на процессы свободнорадикального окисления и его антиоксидантную регуляцию в исследованных тканях. Это может позволить экстраполировать полученные данные на организм человека.
Продемонстрировано участие органического и металлоорганического производных ртути в процессах свободнорадикального окисления и их регуляции. Следствием этого является развитие оксидативно-нитрозильного стресса, приводящее к нарушению структурно-функционального состояния мембран клеток исследованных тканей, ингибированию ферментов антиоксидантной защиты, что лежит в основе развития как обратимых, так и необратимых патобиохимических процессов в организме животных.
Результаты диссертационной работы могут быть использованы для организации медико-биологического мониторинга контингента лиц, связанных с производством или использованием производных ртути, а также для ранней верификации, профилактики и лечения отравлений органическими производными ртути.
Основные положения, выносимые на защиту.
Действие как органического, так и металлоорганического производного ртути сопровождается усилением свободнорадикальных процессов и повышением образования продуктов перекисного окисления липидов в крови и ткани печени животных.
В крови крыс при действии как органического, так и металлоорганического производного ртути наблюдается индукция процессов нитрозильного стресса.
У животных при действии как органического, так и металлоорганического производного ртути выявлено нарушение стабильности и структурного состояния мембран эритроцитов и клеток печени.
В исследованных тканях животных действие как органического, так и металлоорганического производных ртути приводит к разнонаправленному изменению активности ферментов антиоксидантной защиты и снижению содержания низкомолекулярных антиоксидантов.
Металлоорганическое производное ртути, в сравнении с органическим, приводит к более выраженным изменениям СРП и нарушению их регуляции. Выявлено, что концентрация производных ртути, не вызывающая признаки ртутного отравления, достоверно приводит к выраженным изменениям свободнорадикальных процессов и нарушению их регуляции.
Апробация диссертационной работы. Основные положения и материалы диссертационной работы представлены на следующих научных конференциях: IV научной конференции «Мониторинг окружающей среды» (Римини, Италия, 9 – 16 сентября 2006 г.);
III конференции «Природопользование и охрана окружающей среды» (Лутраки, Греция, 1 – октября 2006 г.);
научной конференции с международным участием (Дубай, ОАЭ, 15 – 22 октября 2006 г.);
III конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Лутраки, Греция, 1 – 8 октября г.);
XI межвузовской биохимической научно-практической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, Россия, 28 февраля 2012 г.) Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ общим объемом 1,5 п.л., из них 4 – в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых журналов, рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 215 наименований, в том числе 101 зарубежный источник. Работа содержит 10 таблиц, иллюстрирована 3 схемами и 17 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для реализации поставленной цели было проведено биохимическое исследование на белых беспородных крысах. Опыты проводили в соответствии с правилами, предусмотренными Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов (International guiding…, 1985).
В эксперименте использовали соединения ртути: органическая соль – ацетат ртути и металлоорганическое соединение – нитрат метилртути. Для выполнения поставленной цели были определены дозы исследуемых веществ и время взятия материала. Для эксперимента были взяты две концентрации исследуемых соединений: 0,3 мг/кг – доза, не вызывающая клинические признаки отравления (концентрация «А»), и 0,75 мг/кг – доза, вызывающая клинические признаки отравления, такие как атаксия, анорексия (концентрация «Б»), что подтверждается данными ВОЗ (1993). Животным проводили однократное внутрижелудочное введение водных растворов исследуемых веществ с помощью желудочного зонда [Западнюк И.П., 1983], вещества растворяли в дистиллированной воде. Взятие материала производили точно через 24 часа (первые сутки), от момента введения, что соответствует первому ответу организма на действие соединений ртути, и через 120 часов (пятые сутки), когда происходит практически полное перераспределение ртути в органах и тканях организма [ВОЗ, 1993].
Введение веществ производили в утренние часы, натощак. Пищу и воду животным давали не ранее, чем через 1,5-2 часа после введения препарата [Токсикометрия химических веществ …, 1986].
Для проведения эксперимента животные были разделены на контрольную и четыре опытные группы. Опытные группы, в свою очередь, были разделены на две подгруппы (табл. 1). Контрольной группе животных вводили дистиллированную воду, а опытным группам – исследуемые вещества, растворнные в дистиллированной воде из расчта 1 мл на граммов веса животного. Растворы готовили непосредственно перед введением.
Таблица Распределение животных по группам Опытная группа 1 Опытная группа 2 Опытная группа 3 Опытная группа n=20 n=20 n=20 n= Контрольная ацетат ртути нитрат метилртути группа концентрация «А» концентрация «Б» концентрация «А» концентрация «Б» n= подгруппа 1 – взятие материала через 24 часа (1-е сутки) n=10;
подгруппа 2 – взятие материала через 120 часов (5-е сутки) n=10.
Животных всех исследуемых групп декапитировали. Для биохимических исследований использовали плазму крови, гемолизат эритроцитов и гомогенат тканей печени.
Методы определения активности процессов свободнорадикального окисления (СРО). Уровень СРП оценивали по интенсивности Н2О2– люминол-зависимой хемилюминесценции [В.А. Шестаков 1979]. Содержание белка в гомогенате печени определяли по методу Lowry O.H. (1951) в модификации Schaterle J. (1973)..
Методы определения активности процессов ПОЛ. Интенсивность ПОЛ определяли по содержанию его молекулярных продуктов: первичных – диеновых конъюгатов (ДК) [Стальная И.Д., 1977], вторичных – малонового диальдегида (МДА) [Стальная И.Д., 1977] и конечных – шиффовых оснований (ШО) [Bidlack, 1973]. Общие липиды экстрагировали по методу Bligh Е., Dyer W.J. (1959). Определение гемоглобина в гемолизате эритроцитов осуществляли с помощью стандартного набора реактивов производства ЗАО «ЭКОлаб» (Россия) [Меньшиков В.В., 1987].
Методы определения показателей нитрозильного стресса.
Определяли содержание пероксинитрита (ONOOH), нитроглутатиона (ГлSNO) и нитротирозина (NOТир) [Лобышева И.И., 1999].
Для определения состояния мембран и уровня прооксидантов в исследуемых тканях определяли суммарную пероксидазную активность [Покровский А.А., 1969 в модификации Лукаша А.И., 1996] и содержание внеэритроцитарного гемоглобина [Каракашов А.В., 1973].
Методы определения состояния системы антиоксидантной защиты. О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД) [Fried R., 1975], каталазы [Королюк М.А., 1988], оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) [Колб В.Г., 1982], а также по содержанию неферментативных антиоксидантов: мочевой кислоты (с помощью стандартного клинического набора реактивов для ферментативного определения «Вектор БЕСТ» (Россия)), и мочевины (с помощью стандартного клинического набора реактивов для ферментативного определения уреазным методом «ЭКОлаб» (Россия)).
Полученные в ходе эксперимента данные подвергали статистической обработке [Лакин Г.Ф., 1980;
Владимирский Б.М., 1983]. Сравнение величин проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Отклонения между рядами считали достоверными при вероятности различий, превышающих 95% (p0,05) и 99% (р0,01), при 0,05р0,1 говорили о тенденции к изменению, при р0,1 различия считали недостоверными.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В возникновении проявлений ртутной интоксикации на сегодняшний день большая роль отводится активации СРП, которая приводит к дисбалансу между прооксидантными и антиоксидантными системами [Давыдова С.Л., 2001], что проявляется развитием окислительного стресса. При этом отмечается снижение продукции энергии в митохондриях, развивается метаболический ацидоз, активируется ПОЛ, повреждаются мембраны, и нарушается морфофункциональная целостность клетки [Осипова В.П., 2000;
Мовчан Н.О., 2001].
В эксперименте действие исследуемых соединений в концентрации, не вызывающей и вызывающей признаки ртутного отравления, вызывало развитие окислительного стресса, который проявлялся в увеличении интенсивности Н2О2–люминол-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) в плазме крови и гомогенате печени крыс (рис. 1). В первые сутки эксперимента в плазме крови во всех опытных группах наблюдали достоверное повышение высоты быстрой вспышки (Н) и светосуммы свечения (Sm) относительно контроля, причем достоверных различий между группами выявлено не было. На пятые сутки эксперимента в плазме крови в группах 1 и 2 произошла нормализация параметров Н2О2–люминол индуцированной хемилюминесценции (Н и Sm), так что показатели достоверно не отличались от контрольных значений. В группе 4 высота быстрой вспышки снизилась и имела лишь тенденцию к увеличению относительно контроля на 14% (0,05p0,1), а в группе 3 осталась достоверно выше контрольных значений на 42% и была на 24% достоверно выше, чем в группе 4. Показатель светосуммы свечения в плазме крови животных в группах 3 и 4 уменьшился и достоверно не отличался от контрольных значений.
В ткани печени в первые сутки эксперимента в группах 2, 3 и 4 высота быстрой вспышки была достоверно выше показателей в контроле на 94%, 114% и 76% соответственно, а в группе 1 – на 22% ниже контроля. На пятые сутки эксперимента в группах 2, 3 и 4 высота быстрой вспышки снизилась относительно первых суток эксперимента, но в группах 2 и 3 осталась достоверно выше контрольных значений, а в группе 4 не отличалась от показателей в контроле (p0,05);
в группе 1 достоверно увеличилась на 78% относительно контроля и на 43% относительно группы 2. Необходимо отметить, что в группе 3, в сравнении с группой 4, высота быстрой вспышки в первые и пятые сутки эксперимента была достоверно выше на 22% и 27% соответственно. Светосумма свечения в гомогенате печени во всех опытных группах была достоверно ниже контрольных значений как в первые, так и в пятые сутки эксперимента.
Таким образом, производные ртути приводили к увеличению параметров Н2О2-люминол-индуцированной хемилюминесценции в плазме крови и ткани печени крыс независимо от концентрации, более того, нитрат метилртути в дозе, не вызывающей клинические признаки ртутного отравления, вызывал достоверно бльшие изменения в сравнении с действием этого металлоорганического соединения в концентрации «Б».
94* 76• 50 40 40• 25 22 25* % 14,• - - - -70* -83 - -84 -84# -90* - - 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е ХЛ (Н мм) ХЛ (Sm) ХЛ (Н мм) ХЛ (Sm) ПЛАЗМА ПЕЧЕНЬ опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Примечание: здесь и на рисунках 2 – 8:
- тенденция к изменению относительно контроля (0,05p0,1);
статистически значимые отличия между опытными группами (p 0,05):
* – 1 и 2;
• – 3 и 4;
– 2 и 3;
# – 2 и 4.
Рис. 1. Изменение показателей Н2О2–люминол-индуцированной хемилюминесценции относительно контроля Действие исследуемых соединений вызывало достоверное увеличение интенсивности процессов ПОЛ (рис. 2).
Содержание ДК и МДА в плазме крови во всех исследуемых группах было достоверно выше контрольных значений в течение всего эксперимента.
Необходимо отметить, что действие нитрата метилртути в концентрации «А» было сравнимо с действием того же вещества в концентрации «Б». На пятые сутки эксперимента содержания ДК было достоверно выше при действии нитрата метилртути в сравнении с действием ацетата ртути, что подтверждает данные о большей токсичности металлоорганических соединений ртути [Давыдова С.Л., 2001;
Deacon G.B., 2002]. Содержание ШО в первые сутки также было выше контрольных значений, а на пятые сутки наблюдали достоверное снижение этого показателя в сравнении с первыми, но в группах 1 и 4 он остался выше контрольных значений, а в группах 2 и достоверно от контроля не отличался.
242# 124* % 60* 100 55 49 47# 43 44 43* 27 24* 19 19 15,# 18# 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки ДК МДА ШО опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 2. Изменение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в плазме крови относительно контроля В эритроцитах (рис. 3) в первые сутки эксперимента наблюдали увеличение содержания ДК в группах 2, 3 и 4, а на пятые сутки у животных группы 2 произошло достоверное снижение этого показателя ниже контроля на 26%, а в группах 3 и 4 – резкое увеличение до 343% и 288% соответственно относительно контрольных показателей. Обращает на себя внимание, что, как и в плазме крови, содержание ДК при действии нитрата метилртути в концентрации «А» и «Б» достоверно не отличалось между группами, а в сравнении с действием ацетата ртути было достоверно выше на пятые сутки эксперимента.
В группе 1 достоверных изменений уровня ДК в течение эксперимента не отмечено. Содержание МДА в группах 1 и 2 было выше контрольных показателей в течение всего эксперимента, а группах 3 и 4 в первые сутки не отличалось от контроля, а на пятые было достоверно ниже на 19% и 22% соответственно. Уровень ШО в первые сутки эксперимента был достоверно выше контроля во всех опытных группах, а к пятым суткам снизился и в группах 3 и 4 достоверно не отличался от показателей в контроле, а в группах 1 и 2 был достоверно ниже контрольных значений на 22% и 20% соответственно.
350 288# % 67* 48 69 62• 47* 32 26 23, -22 -20#, -26* -19 -22# - 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки ДК МДА ШО опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 3. Изменение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в эритроцитах относительно контроля В гомогенате печени (рис. 4), содержание ДК было выше контрольных значений в течение всего эксперимента практически во всех опытных группах. Уровень МДА в группе 1 в первые сутки был на 28% достоверно выше, а на пятые – не отличался от показателей в контроле, а в группах 2, 3 и 4 был ниже контрольных значений в течение всего эксперимента.
Содержание ШО в первые сутки эксперимента было достоверно выше контрольных значений, а на пятые сутки в группах 1 и 2 остался выше контроля на 147% и 86% соответственно, а в группах 3 и 4 снизился и достоверно не отличался от показателей в контроле.
Таким образом, в результате действия производных ртути, в концентрации, не вызывающей и вызывающей клинические признаки ртутного отравления, в исследованных тканях происходит увеличение интенсивности процессов ПОЛ, что отражает изменения молекулярных продуктов. Наиболее выраженные изменения содержания ДК отмечены в крови крыс (плазме и эритроцитах) на пятые сутки эксперимента при действии нитрата метилртути.
229* 147* 83# 86,# 76 73# 39* % 36• - -50 -60 -65# -69* -76 -75# - 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки ДК МДА ШО опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 4. Изменение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в печени относительно контроля Влияние исследуемых производных ртути на развитие нитрозильного стресса в плазме крови лабораторных животных определяли по содержанию пероксинитрита (ONOOH), нитроглутатиона (ГлSNO) и нитротирозина (NOTир) (рис. 5) [Ивашкин В.Т., 2001]. В группах 2, 3 и 4 в течение всего эксперимента наблюдали достоверное увеличение содержания вышеперечисленных показателей, а в группе 1 только к пятым суткам произошло достоверное увеличение уровня нитроглутатиона и нитротирозина на 18% и 53% соответственно. Необходимо отметить, что в группе 3 содержание исследуемых веществ в первые сутки эксперимента было достоверно выше, в сравнении с группой 4, на 18%, 44% и 48% соответственно.
176* 180 154• 123* 125* 102• 120 90 100 72# % 57* 80 45* 39• 40# 22• 27# 20* 18# 40 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки ONOOH ГлSNO NOТир опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 5. Изменение показателей нитрозильного стресса относительно контроля Таким образом, соединения ртути вызывают повышение уровня нитропроизводных оксида азота в плазме крови, что свидетельствует о развитии нитрозильного стресса, это вносит вклад в развитие окислительного стресса в целом. Изменения, вызванные нитратом метилртути в концентрации, не вызывающей клинические признаки отравления ртутью, носят достоверно более выраженный характер, по сравнению с действием этого же вещества в большей концентрации.
Обнаруженная в наших исследованиях активация процессов СРО в крови животных может приводить к изменению структурной организации мембран эритроцитов и, как следствие, к их дестабилизации и нарушению барьерных функций [Прокопьева В.Д., 2005]. Результаты экспериментальных материалов, полученные в ходе исследования структурного состояния мембран форменных элементов крови и клеток печени животных под действием соединений ртути представлены на рис. 6.
В плазме крови в первые сутки эксперимента наблюдали тенденцию к увеличению уровня СПА в группе 1 на 32% и достоверное увеличение в группах 2, 3 и 4 на 123%, 134% и 123% соответственно. На пятые сутки в группе 2 произошло снижение уровня СПА относительно первых суток эксперимента на 37%, но этот показатель остался выше контроля на 41%;
а в группе 1 достоверных отличий от контрольных показателей не отмечено.
При действии нитрата метилртути, в отличие от ацетата ртути, на пятые сутки эксперимента уровень СПА, в сравнении с первыми, не изменился и остался выше показателей в контроле на 159% и 142% соответственно, причем показатели в группе 3 были сравнимы с уровнем изменений в группе 4. Содержание ВЭГ в течение всего эксперимента во всех опытных группах было достоверно выше контрольных значений, только в группе 1 на пятые сутки эксперимента имел лишь тенденцию к повышению относительно контроля.
142# 160 123* 120 98* 79• 5658 59• % 47* 47* 60 32 29# 28# 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки СПА ВЭГ СПА ПЛАЗМА ПЕЧЕНЬ опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 6. Изменение уровня СПА и содержания ВЭГ относительно контроля В гомогенате печени в первые сутки эксперимента уровень СПА животных групп 2, 3 и 4 был достоверно выше значений в контроле на 98%, 90% и 96% соответственно. На пятые сутки эксперимента произошло достоверное снижение этого показателя в сравнении с первыми сутками эксперимента, но в группах 3 и 4 он остался достоверно выше показателей в контроле на 41% и 28% соответственно, а у животных опытной группы достоверных отличий в сравнении с контролем не обнаружено. В опытной группе 1 достоверное увеличение уровня СПА на 47% в сравнении с контролем произошло только на пятые сутки эксперимента.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о дестабилизации мембран эритроцитов и увеличении уровня соединений, обладающих прооксидантной активностью в тканях животных под действием органических производных ртути. Причм нитрат метилртути вызывал достоверное повышение уровня СПА в течение всего эксперимента, в сравнении с действием ацетата ртути, и эти изменения не зависели от дозы металлоорганического соединения.
СРП поддерживаются на стационарном уровне благодаря действию антиоксидантной системы, которая реализуется в слаженной работе ферментативных и неферментативных АО. По данным литературы, стимулирование процессов СРО при попадании в организм соединений ртути происходит за счет инактивации антиоксидантных ферментов: [Anuradha B., 1998]. Обнаруженные нами изменения состояния АОС в тканях лабораторных животных согласуются с этим.
В плазме крови (рис. 7) в первые сутки эксперимента во всех опытных группах наблюдали достоверное угнетение активности каталазы, на пятые сутки произошло восстановление е активности, достоверно в сравнении с первыми сутками эксперимента. В плазме крови было замечено угнетение оксидазной активности церулоплазмина на 17% в группе 1 в пятые сутки эксперимента, а в группе 2 – на первые и пятые сутки на 18% и 12% соответственно. Изменение оксидазной активности ЦП при действии нитрата метилртути было следующим: в группе 3 в первые сутки эксперимента отмечали достоверное снижение активности на 20%, а в пятые – достоверное увеличение на 17% относительно контрольных показателей;
в группе 4 в первые сутки эксперимента наблюдали достоверное увеличение оксидазной активности ЦП на 23% относительно контроля, а на пятые сутки этот показатель достоверно не отличался от показателей в контроле.
Содержание мочевой кислоты в течение всего эксперимента во всех группах животных было ниже контрольных значений, но на пятые сутки при действии ацетата ртути имело место увеличение содержания МК, а при действии нитрата метилртути – дальнейшее снижение относительно первых суток эксперимента. Содержание мочевины в первые сутки эксперимента во всех опытных группах было достоверно ниже контрольных показателей, к пятым суткам произошло достоверное восстановление е содержания.
23# -8 - -10 - -12# - % - - -18 -19•,# -20• - -24•,# - - - - - - - -40 - -44 -44•,# -48• - -55* -56# - 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки сутки Каталаза ЦП МК Мочевина опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 7. Изменение показателей системы антиоксидантной защиты в плазме крови относительно контроля Активность СОД в гемолизате эритроцитов (рис. 8) в течение всего эксперимента во всех опытных группах была угнетена и не имела существенных различий. Активность каталазы при действии ацетата ртути была повышена как в первые, так и в пятые сутки, тогда как при действии нитрата метилртути увеличение активности имело место только в первые сутки эксперимента.
В гомогенате печени (рис. 8) изменение активности СОД имело разнонаправленный характер: при действии ацетата ртути в концентрации «Б» в первые сутки эксперимента наблюдали достоверное увеличение активности на 49% относительно контроля, а на пятые произошло резкое угнетение е активности до 82% ниже контрольных показателей. В группе достоверное изменение (увеличение) активности СОД было отмечено только на пятые сутки эксперимента. При действии нитрата метилртути в гомогенате печени животных группы 3, в течение всего эксперимента активности СОД увеличивалась на 61% и 219% в первые и пятые сутки соответственно, тогда как в группе 4 в первые сутки активность СОД имела тенденцию к снижению активности на 19%, а на пятые сутки резко возросла до 204% относительно контроля. На пятые сутки эксперимента показатели в группе 3 были сравнимы с уровнем изменений в группе 4 Активность каталазы в гомогенате печени группы 1 в первые сутки эксперимента была достоверно ниже контрольных значений на 21%, а на пятые сутки был отмечен рост е активности до 76% относительно контроля, в то время как у животных группы 2 в первые сутки активность каталазы была выше показателей в контроле на 88%, а на пятые сутки достоверно снизилась на 35% относительно первых суток, но осталась на 23% выше показателей в контроле. При действии нитрата метилртути в обеих группах наблюдали увеличение активности каталазы в первые сутки эксперимента на 100% и 56% в 3 и 4 группе соответственно, а на пятые сутки произошло достоверное снижение активности на 41% и 29% относительно первых суток эксперимента, но активность осталась достоверно выше контрольных значений на 18% и 12% соответственно. Необходимо отметить, что в группе 3 активность каталазы в первые сутки эксперимента была на 28% достоверно выше показателей в группе 4.
204# 100• 88* 100 61• 56# 52 49* % 3128,# 31 23* 22# 50 0 - -19,# - -31 - -31 - - -47* - - - - 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е 1-е 5-е сутки сутки сутки сутки СОД Каталаза СОД Каталаза ЭРИТРОЦИТЫ ПЕЧЕНЬ опытная группа 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Рис. 8. Изменение показателей системы антиоксидантной защиты в эритроцитах и печени относительно контроля Таким образом, можно сделать вывод, что исследуемые соединения ртути, независимо от концентрации, оказывают существенное влияние на регуляцию СРО и провоцируют развитие окислительного стресса, что проявляется в разнонаправленном изменении активности ферментативных и снижении содержания неферментативных АО, что может свидетельствовать о срыве реакций адаптации при действии производных ртути.
Таким образом, как показывают данные, полученные при проведении экспериментальной части работы, как ацетат ртути, так и нитрат метилртути оказывают существенное влияние на уровень СРО, интенсивность ПОЛ, структурно-функциональное состояние мембран клеток исследованных тканей, а также антиоксидантный статус тканей организма. Однако, как следует из доступной нам литературы, металлоорганические соединения обладают большим повреждающим действием по сравнению с органическими производными [Осипова В.П., 2000, Кирилова Л.Б., 2001].
Можно было бы предположить, что действие нитрата метилртути – металлоорганического соединения – в сравнении с ацетатом ртути – органическим производным – будет оказывать более выраженное воздействие на уровень СРП и показателей нитрозильного стресса, структурно-функциональное состояние мембран клеток исследованных тканей, а также АОС тканей. Однако наши результаты показывают, что в ряде случаев менее токсичное соединение – ацетат ртути при одинаковых концентрациях и времени введения данных соединений оказывает более выраженное влияние на исследуемые показатели по сравнению с более токсичным соединением – нитратом метилртути.
Так, при одной и той же концентрации (0,75 мг/кг) действие ацетата ртути по сравнению с влиянием нитрата метилртути приводило к достоверному увеличению содержания МДА на 21% и ШО на 52% в первые сутки эксперимента в плазме крови, а на пятые сутки – в эритроцитах на 60% и 25% соответственно. В гомогенате печени в течение всего эксперимента (первые и пятые сутки) при действии ацетата ртути уровень ШО был достоверно выше, чем при действии нитрата метилртути на 80% и 70% соответственно. При исследовании показателей нитрозильного стресса в группе 2, в сравнении с группой 4, практически в течение всего эксперимента также наблюдали достоверное увеличение содержания: пероксинитрита на 23% в первые сутки, нитроглутатиона на 59% и 23% и нитротирозина на 61% и 19% в первые и пятые сутки эксперимента соответственно. Уровень ВЭГ в плазме на пятые сутки эксперимента при действии ацетата ртути был достоверно выше на 13%, чем при действии нитрата метилртути.
При исследовании показателей антиоксидантного статуса в плазме крови действие ацетата ртути приводило к достоверным изменениям по сравнению с действием нитрата метилртути как ферментативных, так и неферментативных АО. Так, в первые сутки эксперимента достоверно снижались активность каталазы на 26%, содержание МК на 28% и мочевины на 12% при действии ацетата ртути по сравнению с нитратом метилртути.
Оксидазная активность ЦП в течение всего эксперимента была ниже при действии ацетата ртути на 51% и 23% в первые и пятые сутки соответственно в сравнении с влиянием нитрата метилртути. В эритроцитах и гомогенате печени активность каталазы при действии ацетата ртути в первые сутки эксперимента была на 25% и 84% достоверно выше, по сравнению с влиянием нитрата метилртути. Активность СОД имела разнонаправленные изменения: в первые сутки при действии ацетата ртути активность фермента была на 84% выше, а на пятые на – 1597% ниже, по сравнению с действием нитрата метилртути.
В процессе сравнения действия органического и металлоорганичекого соединений в концентрации 0,3 мг/кг при исследовании показателей антиоксидантной защиты были обнаружены достоверные различия при действии ацетата ртути по сравнению с нитратом метилртути. Так, в плазме крови в первые сутки эксперимента достоверно снижены: активность каталазы – на 31%, содержание МК – на 39% и мочевины – на 16%, а на пятые сутки – оксидазная активность ЦП снизилась на 41% при действии ацетата ртути по сравнению с влиянием нитрата метилртути. В гомогенате печени в первые сутки эксперимента активность каталазы была на 154% достоверно ниже при действии ацетата ртути по сравнению с влиянием нитрата метилртути.
Как следует из вышеизложенного, мы получили экспериментальные данные, показывающие, что менее токсичное органическое соединение (ацетат ртути) производит более существенные изменения в процессах ПОЛ, уровне нитрозильного стресса, структурно-функциональном состоянии мембран эритроцитов, антиоксидантном статусе клеток исследуемых тканей животных, по сравнению с действием металлоорганического соединения (нитрат метилртути).
Таким образом, выясняя действие различных групп соединений, содержащих в своем составе ртуть, независимо от их химической природы и структуры, необходимо более внимательно исследовать все стороны метаболизма для оценки состояния и определения границ их действия на живые организмы.
ВЫВОДЫ 1. Действие органического (ацетата ртути) и металлоорганического (нитрата метилртути) производных приводят к усилению процессов свободнорадикального окисления и повышению образования продуктов ПОЛ в крови и ткани печени животных, что подтверждается увеличением интенсивности Н2О2-люминол-индуцируемой ХЛ и содержанием продуктов ПОЛ в крови и ткани печени.
При действии исследованных соединений ртути обнаружена значительная 2.
продукция пероксинитрита и индукция нитрозильного стресса, верифицированная по увеличению содержания нитротирозина и нитроглутатиона,.
При действии как органического, так и металлоорганического 3.
производных ртути выявлено нарушение стабильности и структурного состояния мембран эритроцитов и клеток печени, проявляющееся в увеличении содержания внеэритроцитарного гемоглобина в плазме и суммарной пероксидазной активности в плазме и ткани печени.
В крови и ткани печени животных действие как органического, так и 4.
металлоорганического производных ртути приводит к разнонаправленному изменению активности ферментов антиоксидантной защиты и снижению содержания низкомолекулярных антиоксидантов.
Нитрат метилртути, в сравнении с ацетатом ртути, приводит к более 5.
выраженным изменениям свободнорадикальных процессов и нарушению функционирования основных звеньев антиоксидантных систем защиты.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ 1. Увеличение уровня СПА, ONOOH, ГлSNO, NOТир в плазме крови позволяет выявлять лиц, подвергшихся действию соединений ртути до клинических проявлений ртутной интоксикации (атаксия, анорексия) и своевременному проведению антидотной терапии.
2. При проведении профилактических осмотров на производствах, лиц связанных с использованием соединений ртути, рекомендовано определять СПА, ONOOH, ГлSNO, NOТир в плазме крови. При повышении уровня СПА, ГлSNO, NOТир в плазме крови по сравнению с донорами (на 30 – 50%) верифицируют отравление органическими производными ртути.
Более резкие изменения вышеуказанных показателей в плазме крови по сравнению с донорами (40 – 130%), свидетельствуют об отравлении металлоорганическими производными ртути.
3. Материалы диссертационной работы используются на кафедре биохимии и микробиологии факультета биологических наук Южного федерального университета при чтении лекций по спецкурсам: «Свободнорадикальные процессы и их регуляция», «Основы патобиохимии».
Список работ, опубликованных по теме диссертации Пустовалова, Л.М. Свободнорадикальные процессы в организме под 1.
действием соединений ртути / Л.М. Пустовалова, Е.Р. Милаева, М.Е.
Кубракова (М.Е.Куесенко) // Фундаментальные исследования. – 2006. – №8. – С. 38-39. Материалы IV научной конференции «Мониторинг окружающей среды», 9-16 сентября 2006, г. Римини (Италия).
Пустовалова, Л.М. Изменение свободнорадикальных процессов в 2.
организме под действием соединений ртути / Л.М. Пустовалова, Е.Р.
Милаева, М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Фундаментальные исследования. – 2006. – №8. – С. 39. Материалы IV научной конференции «Мониторинг окружающей среды», 9-16 сентября 2006 г., Римини (Италия).
Кубракова, М.Е. Влияние соединений ртути на состояние мембран клеток 3.
/ М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Фундаментальные исследования. 2006. – №9.– С. 43-44. Материалы III конференции «Природопользование и охрана окружающей среды», 1-8 октября 2006 г., Лутраки (Греция).
Кубракова, М.Е. Изменение скорости метаболизма оксида азота под 4.
действием соединений ртути / М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Фундаментальные исследования. – 2006. – №9. – С. 52-53. Материалы III конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 1-8 октября 2006 г., Лутраки (Греция).
Кубракова, М.Е. Влияние металлоорганических соединений ртути на 5.
состояние мембран клеток / М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Фундаментальные исследования. – 2006. – №9. – С. 103. Материалы научной конференции с международным участием, 15-22 октября 2006 г., Дубай (ОАЭ).
Кубракова, М.Е. Влияние соединений ртути на скорость метаболизма 6.
оксида азота / М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Фундаментальные исследования. – 2006. – №9. – С. 111-112. Материалы научной конференции с международным участием, 15-22 октября 2006 г., Дубай (ОАЭ), Кубракова, М.Е. Влияние соединений ртути на уровень *7.
свободнорадикального окисления / М.Е. Кубракова (М.Е.Куксенко) // Здоровье населения и окружающая среда. – 2007. – № 9 (174). – С. 28 31.
Куксенко, М.Е. Активность и содержание антиоксидантов при действии 8.
органических соединений ртути / М.Е. Куксенко // Материалы XI региональной конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». – Ростов-на-Дону, 2012. – С.31-33.
*9. Куксенко, М.Е. Антиоксидантная система в тканях животных при действии ацетата ртути / М.Е. Куксенко, В.В. Внуков // Валеология, 2012. – №3. – С. 57-61.
*10. Внуков, В.В. Исследование антиоксидантной системы в тканях животных при действии металлоорганического производного ртути / В.В. Внуков, М.Е. Куксенко // Кубанский научный медицинский вестник, - 2012. - № 3 (132). – С.36-38.
*11. Куксенко, М.Е. Влияние нитрата метилртути на изменение антиоксидантной защиты организма / М.Е. Куксенко, В.В. Внуков // Здоровье населения и среда обитания, - 2012. - №11. – С. 45-46.
* – работа опубликована в журнале, включенном Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.
Список условных сокращений:
АО антиоксиданты;
АОЗ антиоксидантная защита;
АОС антиоксидантная система;
ВЭГ внеэритроцитарный гемолобин;
ДК диеновы коньюгаты;
МДА малоновый диальдегид;
МК мочевая кислота;
ПОЛ перекисное окисление липидов;
СОД супероксиддисмутаза;
СПА суммарная пероксидазная активность:
СРО свободнорадикальное окисление;
СРП свободнорадикальные процессы;
ХЛ хемилюминесценция;
ЦП церулоплазмин;
ШО шиффовы основания;
ГлSNO нитроглутатион;
ОNООН пероксинитрит;
нитротирозин.
NOTир