Изучение структуры и функции антисмысловых транскриптов генов afap1, ascl1, map3k13 человека
На правах рукописи
Марахонов Андрей Владимирович ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ АНТИСМЫСЛОВЫХ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНОВ AFAP1, ASCL1, MAP3K13 ЧЕЛОВЕКА 03.02.07 — генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва — 2010 2
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико генетическом научном центре РАМН кандидат биологических наук,
Научный консультант:
Скоблов Михаил Юрьевич доктор биологических наук,
Официальные оппоненты:
член-корр. РАМН, проф.
Киселев Федор Львович доктор биологических наук, доцент Голденкова-Павлова Ирина Васильевна ФГОУ ВПО «Московский государственный
Ведущая организация:
университет имени М. В. Ломоносова»
Защита состоится «06» декабря 2010 г. в « » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при МГНЦ РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д.
1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва, ул. Москворечье, д. 1.
Автореферат разослан « » ноября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016. по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Р. А. Зинченко Актуальность проблемы Определение первичной последовательности генома человека в 2001 году проявило парадокс, заключающийся в отсутствии пропорционального увеличения количества генов с усложнением организации организмов. Только отчасти данный феномен можно объяснить увеличением разнообразия протеома за счет альтернативного процессинга мРНК и посттрансляционной модификации белков. В настоящее время общепринято, что возрастающая сложность связана с усложнением регуляции экспрессии генов, в частности, за счет некодирующих РНК. По современным оценкам, порядка 30 % белок-кодирующих генов имеют эндогенные, или природные, антисмысловые транскрипты (ПАТ). Своей последовательностью АТ частично или полностью комплементарны другим, как правило, кодирующим, транскриптам. Исследования, проведенные на различных организмах, позволяют предполагать, что ПАТы могут участвовать в обширном ряде регуляторных событий, таких как РНК-интерференция, альтернативный сплайсинг, ДНК метилирование, геномный импринтинг и другие. Однако, каждая из этих регуляторных моделей была исследована лишь в единичных экспериментальных работах, поэтому общая биологическая функция и регуляторный механизм ПАТов являются до сих пор неясными.
Известно, что в процессе неопластической трансформации происходит изменение в транскриптоме, с активацией одних и репрессией других транскриптов.
Особый интерес представляют данные, подтверждающие вероятную связь между изменением экспрессии ПАТ и развитием онкологических заболеваний. Так, для смыслового транскрипта гена CIDEB кодирующего белок, способствующий апоптозу, увеличение доли антисмысловой РНК в опухолевой ткани негативно влияло на экспрессию этого потенциального противоопухолевого гена. Для полного понимания роли ПАТов в процессе развития опухолей необходим анализ большего количества примеров такого рода.
В последние годы было показано, что некоторые природные антисмысловые транскрипты играют важную роль в экспрессии смысловых генов, в том числе участвующих в патогенезе ряда социально-значимых заболеваний. Несмотря на частую встречаемость антисмысловых транскриптов, об их функции и механизмов действии известно пока немного. Так, до недавних пор считалось, что антисмысловые транскрипты должны подавлять экспрессию смысловых. Однако в последнее время появились работы, показывающие, что в некоторых случаях антисмысловые транскрипты стабилизируют смысловую РНК, тем самым, увеличивая уровень ее трансляции. На сегодняшний день не известно, в каких случаях реализуется негативный или позитивный механизм регуляции.
Таким образом, функциональная характеристика антисмысловых транскриптов является важной фундаментальной задачей.
Цель и задачи исследования Целью исследования явилось изучение антисмысловой регуляции генов AFAP1, MAP3K13 и ASCL1 человека, чьи антисмысловые транскрипты представлены на высоком уровне в опухолевых тканях Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. охарактеризовать функциональную роль смыслового транскрипта, 2. исследовать экзон-интронную структуру антисмысловых транскриптов, 3. изучить профиль экспрессии смыслового и антисмыслового транскриптов с количественной оценкой в нормальных и опухолевых тканях, 4. определить возможную роль антисмысловых транскриптов.
Научная новизна полученных результатов В работе впервые анализируется антисмысловая регуляция генов AFAP1, ASCL и MAP3K13 человека. В работе дано научное обоснование необходимости экспериментальной проверки результатов автоматического аннотирования и картирования экспрессирующихся последовательностей. Исследование дает возможность пересмотреть известные данные и проводит анализ нового механизма регуляции экспрессии изучаемых локусов в геноме человека.
Практическая значимость результатов исследования Практическая значимость исследования заключается, прежде всего, в том, что разработанные подходы могут являться основой для поиска диагностических маркеров некоторых заболеваний, в частности, онкологических.
Положения, выносимые на защиту Антисмысловой кластер транскриптов в локусе MAP3K13 человека 1.
представляет собой молчащий псевдоген и является ошибкой картирования данного кластера антисмысловых РНК.
Локус гена ASCL1 человека содержит новый антисмысловой 2.
некодирующий транскрипт ASCL1AS.
Антисмысловой транскрипт в локусе гена AFAP1 человека представляет 3.
собой двухэкзонный некодирующий трансрипт антисмыслового кластера транскриптов гена AFAP1 человека. Установлена экзон-интронная структура антисмыслового транскрипта AFAP1AS. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.
Смысловой AFAP1 и антисмысловой AFAP1AS гены человека 4.
дифференциально экспрессированы в различных тканях.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на 3-й и 4-й Московских международных конференциях по молекулярной и компьютерной биологии MCCMB’07 и ’09 (Москва, 2007 и 2009), на Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н. И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на Европейской конференции по генетике человека ESHG-2008 (Барселона, Испания, 2008), на Съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на VII Конференции по биохимии и молекулярной биологии им. Парнаса (Ялта, Украина, 2009). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 22 сентября 2010 г.
Личный вклад автора в проведение исследования. Автором лично определены задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведен биоинформатический анализ, выполнены молекулярно-генетические эксперименты, сделан анализ, обработка и обобщение полученных результатов, написание и оформление рукописи.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (2 статьи, 7 тезисов научных докладов), в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ.
Внедрение результатов работы. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных EntrezGene под номером GeneID 84740.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации изложен на _ страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает источников отечественных и иностранных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали общедоступные программы пакета BLAST [Altschul S.F. et al., 1990].
При анализе EST использовали UniGene — экспериментальную систему автоматического подразделения последовательностей EST из GenBank на ген ориентированные кластеры [Schuler G.D. 1997]. Каждый кластер UniGene содержит последовательности, которые представляют уникальный ген, а так же содержит информацию о тканевой принадлежности соответствующих EST.
В работе были использованы штаммы клеток E. сoli NM522, JM109, XL1-Blue.
Штаммы E. coli с плазмидами сохраняли при –70 °С в жидкой среде 2YT с криопротектором (30 % глицерин). Клетки E. coli растили при температуре 37 °С в среде 2YT.
Выделение плазмидной ДНК из E. coli проводили методом щелочного лизиса [Lee S.Y., Rasheed S., 1990] с модификациями.
Электрофорез фрагментов ДНК проводили в присутствии 0,5 мкг/мл бромида этидия в горизонтальном 0,5—2 %-ном агарозном геле. В качестве электрофорезного буфера использовался 1 трис-ацетатный (ТАЕ) буфер.
Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили в соответствии с методикой [Wieslander A., 1979].
Рестрикцию, лигирование проводили в условиях рекомендованных производителем.
Для трасформации клеток E. сoli использовали методику с полиэтиленгликолем 3350 [Chung C.T. et al., 1989].
Выделение геномной ДНК из крови здоровых доноров производили по методу высаливания [Miller S.A. et al., 1988].
Выделение тотальной РНК из образцов нормальных и опухолевых тканей и линий клеток человека проводили фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987] с модификациями.
Для проведения реакции обратной транскрипции использовали систему ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega).
Праймеры для ПЦР подбирали с помощью программы OLIGO 4.0.
Реакционные смеси для проведения ПЦР готовили по стандартной схеме. В качестве флуоресцентной краски для ПЦР в реальном времени использовали интеркалирующий краситель 1 EvaGreen (Biotium, Inc.). Реакции проводили на приборе RotorGene3000 (CorpettResearch).
Относительную количественную оценку уровня экспрессии генов и статистический анализ данных проводили с использованием GED-формулы (gene expression’s CT difference) [Schefe J.H. et al., 2006] и программы LinRegPCR [Ramakers C. et al., 2003].
RACE-PCR. Реакционные смеси для проведения ПЦР готовили по стандартной схеме. В качестве основы для RACE-амплификации использовали протокол набора BD SMART™ RACE cDNA Amplification (Clontech).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование антисмысловой регуляции экспрессии гена MAP3K13 человека Ранее в нашей лаборатории был проведен полногеномный поиск цис антисмысловых кластеров транскриптов в геноме человека in silico, оценка профилей экспрессии смыслового и антисмыслового транскриптов каждой пары в различных тканях, и выявлен ряд пар, состоящих из смыслового и антисмыслового транскриптов, в которых антисмысловой транскрипт экспрессировался преимущественно в опухолях [Klimov D. et al., 2006]. Среди найденных кластеров антисмысловых транскриптов одним из интересных оказался кластер asLZK, который находится в первом интроне гена MAP3K13/LZK, расположенного на хромосоме 3 в локусе q27 и состоящего из 454 экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей (EST). Схема локуса генов MAP3K13/LZK и asLZK приведена на рис. 1. В базе данных UniGene транскрипт asLZK описан под названием LOC647276.
Проведнный анализ тканевого распределения клонотек кДНК показал, что только из 186 (32,3 %) EST, принадлежащих гену MAP3K13/LZK, происходят из образцов первичных опухолей или опухолевых клеточных линий человека, в то время как транскрипту asLZK соответствует 376 опухолеспецифичных EST (82,7 %) и лишь EST из нормальных тканей. Поскольку в базе данных dbEST только 43 % EST получены из образцов опухолевого происхождения, можно заключить, что asLZK преимущественно экспрессируется в опухолевых тканях.
Рис. 1. Схема геномного локуса MAP3K13/LZK и asLZK. Некодирующие экзоны выделены серым. Кодирующие экзоны смыслового транскрипта LZK показаны черным.
Цифры под экзонами и над интронами соответствуют их длине, измеренной в п.н.
In silico анализ нуклеотидной последовательности asLZK выявил девять локусов в геноме человека, сходных с asLZK. Эти локусы находятся в восьми разных хромосомах человека (табл. 1). Наиболее вероятно, что все найденные локусы, сходные с asLZK, представляют собой молчащие псевдогены гена RPL4, кодирующего рибосомный белок L4, и расположенного на хромосоме 15. Степень сходства asLZK с «родительским» транскриптом RPL4 составляет 98 %.
Таблица 1. Локусы генома человека, имеющие высокое сходство с RPL4 и asLZK Название или Расположение Уровень ближайший Сходство с RPL4, % на хромосоме экспрессии * аннотированный ген 100 (составил основу для 7179 (68,6% мРНК RPL4 выравнивания 15q опухолевых) последовательностей) asLZK (первый интрон 454 (82,7% 3q27 опухолевых) MAP3K13/LZK) Нет 9q24.1 LOC158345 Нет 1q24.1 LOC646688 Нет 1q24.1 LOC391135 Интрон TRA (локус T Нет 14q11.2 клеточного рецептора ) Интрон MKL Нет 22q13 (мегакариобластный лейкоз (транслокация) 1) Интрон ANKRD44 85 + инверсия Нет 2q33. Интрон гена Cubilin (внутренний фактор 77 (254 п. н.) Нет 10p12. рецептор B12) * Уровень экспрессии определяли путем анализа картированных EST.
Следующим этапом исследования стала проверка гепотезы о том, действительно ли локус asLZK транскрибируется в клетках человека или является молчащим псевдогеном. Как правило, функциональные элементы генома человека изучают с использованием высокопроизводительных экспериментальных систем [The ENCODE Project Consortium. 2004]. Однако первоначальное предсказание псевдогенов, которые составляют один из классов таких элементов, основано почти исключительно на компьютерном анализе [Zheng D. et al., 2007]. Зачастую псевдогены, картированные in silico, так и остаются функционально неподтвержденными. Некодирующие РНК, возникшие в результате ретропозиции, представляют собой своего рода переходную область между экспрессирующимися белоккодирующими генами и нетранскрибируемыми псевдогенами. Ошибки автоматической функциональной аннотации, в том числе ошибки секвенирования, неправильные и неоднозначные выравнивания, а также присутствие химерных и неверно кластеризованых EST приводят к появлению неверных аннотаций, которые копируются в базах данных из версии в версию [Wang J.P. et al., 2004;
Lindlf A., 2003]. Единственный способ устранить такие ошибки — экспериментальное изучение аннотированных последовательностей.
Для экспериментальной проверки были разработаны праймеры, способные специфично амплифицировать транскрипт asLZK. С этой целью было проведено множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей мРНК гена RPL4, asLZK и остальных псевдогенов с использованием программы ClustalW 1. [Jeanmougin F. et al., 1998] (рис. 2). С помощтю внешней пары праймеров амплифицируется как кДНК гена RPL4, так и кДНК, которая может быть получена на матрице любого из его псевдогенов: RPL4-f, 5-CAGAGTAATTCCAGGGATGTT-3;
RPL4-r, 5-CATGTCTAAAGGTCATCGTAT-3. Внутренняя пара праймеров позволяет провести локус-специфичную амплификацию asLZK. Специфичность отжига внутренней пары ПЦР праймеров была повышена путем введения в позицию, соседнюю с 3-положением каждого праймера, некомплементарные матрице нуклеотиды: 5-TCCTCATTATAGATGATGCATA-3;
asLZK-r, 5 asLZK-f, GTTCCTGAACTTCCTTTGGTTT-3.
Рис. 2. Множественное выравнивание локусов-паралогов гена RPL4 человека, и положение праймеров для ПЦР. Универсальные праймеры показаны пунктирной стрелкой. asLZK специфичные праймеры — сплошной стрелкой. Дополнительные нуклеотидные замены, введенные в прилегающие к 3-концу позиции asLZK-специфичных праймеров, подчеркнуты.
С целью оптимизации локус-специфичной ПЦР, была разработана тестовая система на основе плазмид, полученных путем клонирования ПЦР-фрагментов локусов RPL4 и asLZK в pGEM-Т-вектор (pGEM-asLZK и pGEM-RPL4). Скрининг кДНК, полученной из образцов нормальных и опухолевых тканей человека не выявил asLZK-специфичного фрагмента (рис. 3а,б) при корректном прочтении контролей.
Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа ДНК образцов опухолей человека. а – Нормальная шейка матки, образец 1 (1);
рак шейки матки, образец 1 (2);
Нормальная шейка матки, образец 2 (3);
рак шейки матки, образец 2 (4);
нормальная шейка матки, образец 3 (5);
рак шейки матки, образец 3(6);
pGEM-RPL4 (7);
pGEM-asLZK (8);
геномная ДНК человека (9);
отрицательный контроль (10);
маркер молекулярных масс (M). Контрольную ПЦР с праймерами на GAPDH проводили на образцах нормальной шейки матки, рака шейки матки и отрицательного контроля. На нижней трети геля с контрольной GAPDH-ПЦР отрицательному контролю соответствует дорожка 7, маркер молекулярных масс нанесен на дорожку 8. б – Рак матки (1);
рак поджелудочной железы (2);
почечноклеточный рак (3);
рак яичника (4);
рак прямой кишки (5);
нормальный головной мозг (6);
нормальная скелетная мышца (7);
отрицательный контроль (8);
маркер молекулярных масс (M). На данном геле отрицательному контролю соответствует дорожка 7, маркер молекулярных масс нанесен на дорожку 8.
Несмотря на то, что эти ткани представлены в базе данных EST как ткани с относительно высоким уровнем asLZK (табл. 2), ни в одной из них не обнаружено экспрессии asLZK. На основании полученных результатов было сделано заключение о том, что антисмысловой локус asLZK не экспрессируется в геноме человека, а EST, принадлежащие данному локусу, картированы неправильно вследствие ошибки аннотации.
Правильность данного заключения была подтверждена с помощью скрининга участка размером 1 т. п. н., расположенного непосредственно перед локусом asLZK, с использованием пяти различных алгоритмов, предсказывающих промоторные элементы. Три из пяти алгоритмов (McPromoter MM:II [Ohler U. et al., 2000], Promoter 2.0 [Knudsen S., 1999] и PROSCAN v.1.7 [Prestridge D.S. et al., 1995]) не обнаружили в изученной области никаких промоторных структур. Программный инструмент CorePromoter [Zhang M.Q., 1998] выдал относительно слабое предсказание для позиции 240 (score 0.746), а алгоритм NNPP 2.2 [Reese M.G., 2001] предсказал промотор в позиции 180 (score 0.94).
Таблица 2. EST, полученные из нормальных и опухолевых тканей и аннотированные, как asLZK Количество EST Ткань Нормальная ткань Опухоль Шейка матки 0 Тело матки 1 Поджелудочная железа 0 Почка 2 Яичник 2 Прямая кишка 2 Головной мозг 12 Скелетная мышца 4 Таким образом, попытки обнаружения промотора asLZK с помощью данных алгоритмов не увенчались успехом, показав противоречивые результаты или отсутствие таковых, в то время как контрольное предсказание промоторных элементов в районе, прилегающем к гену RPL4, достоверно указало на присутствие сайта инициации транскрипции (TSS) в области от –100 до 0: McPromoter MM:II предсказал позицию –8;
CorePromoter указал ряд TSS, расположенных между 59 и 48;
инструмент NNPP выделил позицию 13;
Promoter 2.0 идентифицировал элемент в позиции 99. В дополнение к этому как Proscan 1.7, так и NNPP обнаружили дополнительный промотор-подобный элемент в положении от 600 до относительно 5 конца гена RPL4.
Наиболее правдоподобно объяснение, согласно которому asLZK представляет собой молчащий процессированный псевдоген гена Анализ RPL4.
последовательностей, фланкирующих локус позволил выявить asLZK, дуплицированный участок-мишень размером 9 п. н. (AAGAACATG;
выделен рамкой на рис. 4а). Подобные дупликации часто сопутствуют ретропозиции [Weiner A.M. et al., 1986]. Однонуклеотидную замену (A G) в одном из дуплицированных участков можно объяснить мутацией, произошедшей после ретропозиции. Олиго(А)-участок в составе 3-концевой последовательности локуса asLZK/RPL4 также указывает на его происхождение от транскрипта, подвергнутого обратной транскрипции.
Рис. 4. Структура участка ретропозиции в гене MAP3K13 (а) и филогенетическое дерево псевдогенов, сходных с RPL4, построенное с помощью метода объединения соседних пар (neighbor-joining method) (б). Нуклеотидная последовательность 5- и 3-концов встроенной мРНК RPL4 и фланкирующие ее участки генома указывают на факт ретропозиции. Дуплицированный участок встраивания обведен рамкой.
Филогенетическое древо сходных с RPL4 псевдогенов построено с помощью метода объединения соседних пар (neighbor-joining method) (рис. 4б). Как видно из рис. 4, нуклеотидная последовательность asLZK наиболее сходна с исходным геном RPL4. Последовательности, родственные asLZK/RPL4, найдены также в гене MAP3K13/LZK шимпанзе, в то время как геномы грызунов этого псевдогена не содержат. Следовательно, ретропозиция RPL4 в локус MAP3K13/LZK произошла уже после дивергенции предков грызунов и приматов. Несмотря на то, что ретропозиция произошла относительно недавно, в открытой рамке считывания asLZK уже возникли два стоп-кодона.
Таким образом, было показано, что asLZK не участвует в регуляции экспрессии гена MAP3K13, поскольку представляет собой молчащий псевдоген гена RPL4, возникший путем ретропозиции его мРНК в первый интрон гена MAP3K13.
2. Анализ антисмыслового кластера к гену ASCL1.
Вторым среди найденных кластеров антисмысловых транскриптов был выбран кластер с геном ASCL1 (Achaete-Scute Complex-Like homolog 1 [Drosophila]). Анализ кДНК библиотек показал, что всего в смысловом кластере ASCL1 было транскриптов, 96 % из которых получены из опухолевых клонотек. Антисмысловой кластер содержал 144 транскрипта, из которых 74 % являются опухолевыми (рис. 5).
Рис. 5. На рисунке показано расположение EST (зелным) и мРНК (синим) на основной (справа) и комплементраной (слева) цепях генома человека в локусе гена ASCL человека.
Известно, что ASCL1 является членом содержащих домен bHLH (basic helix loop-helix) семейства транскрипционных факторов, гомологичным Achaete-Scute комплексу дрозофилы [Ball D.W. et al., 1993]. Данный белок играет роль в нейрональном коммитировании и дифференцировке [Letinic K. et al., 2002;
Kim E.J. et al., 2008]. Он высоко экспрессируется в различных опухолях: медуллярном раке щитовидной железы [Chen H. et al., 2005], нейроэндокринных опухолях легкого [Osada H. et al., 2008] и желудочно-кишечного тракта [Shida T. et al., 2005], мелкоклеточном раке легкого [Jiang T. et al., 2009], астроцитоме [Somasundaram K. et al., 2005] и др.
Однако детальный анализ антисмысловых транскриптов кластера ASCL показал, что большинство EST получены из библиотек созданных по одному следующему принципу. С выделенной мРНК ставили реакцию обратной транскрипции используя праймер олиго-dT на 5-конце которого находился также сайт эндонуклеазы рестрикции NotI. Полученную кДНК переводят в двухцепочечную форму и лигируют к ней адапторы содержащие сайт эндонуклеазы рестрикции EcoRI.
Далее кДНК клонируется по сайтам NotI и EcoRI и осуществляют секвенирование клона с векторных праймеров, фланкирующих заклонированную ставку.
При анализе последовательности локуса ASCL1 был найден сайт рестрикции NotI (рис. 5) на границе 3-конца антисмыслового кластера. Была выдвинута гипотеза, что из-за специфики методики создания кДНК библиотеки и расположения сайта NotI в локусе ASCL1, произошло неверное картирование части EST, принадлежащих смысловому кластеру.
Для проверки высказанной гипотезы была разработана система для количественной оценки экспрессии локуса ASCL1, чтобы определить существует ли антисмысловая транскрипция или нет. Для этого были подобраны три пары праймеров, последовательности которых указаны в Табл. 3. Первая и третья располагалась слева и справа от антисмылового кластера, вторая отжигалась в области перекрывания смыслового и антисмыслового кластеров и, таким образом, измеряла овокупный уровень экспрессии (рис. 6).
Табл. 3. Последовательности праймеров для амплификации локусов гена ASCL1.
Наименование Последовательность праймера Размер ампликона, п. н.
праймера 5-GCGTGCAGGGAGGAGAAAA- ASCL1-1f 5-AGAGAACTTGGGTGCAGGAA- ASCL1-1r 5-GCCCAAGCAAGTCAAGCGA- ASCL1-2f 5-CCAAAGCCGCTGAAGTTGA- ASCL1-2r 5-GCTTTCTTGTCAGTGGCGTT- ASCL1-3f 5-CGTGAATGATTGGAGTGCAAA- ACSL1-3r Рис. 6. Схема расположения праймеров в локусе ASCL1.
Рис. 7. Электорофорограмма продуктов ПЦР локусов в гене ASCL1.
Отработав условия прохождения ПЦР на геномной ДНК (Рис. 7), была поставлена количественная ОТ-ПЦР на панели 11 кДНК, полученных из нормальных и опухолевых тканей. Анализ данных показал, что в трх тканях — мозге, легких и раке груди — присутствует экспрессия всех трех исследуемых локусов. При нормализации данных экспрессии в тканях на данные амплификации на матрице геномной ДНК была обнаружена разница в представленности амплификатов друг относительно друга (рис. 8).
Относительный уровень экспрессии, % ASCL1. ASCL1. 20 ASCL1. мозг рак груди легкое Ткани человека Рис. 8. Представленность трех локусов ASCL1 в тканях: мозг, легкое и рак груди. За 100 % принят относительный уровень экспрессии гена домашнего хозяйства HPRT1.
Таким образом, видно, что антисмысловой кластер реально существует и дифференциально экспрессируется в тканях. Судя по тому что в одних тканях преобладает экспрессия антисмыслового транскрипта, и в то же время в других тканях преобладает экспрессия смысловго транскрипта, можно сказать, что в данном случае возможно реализуется негативная антисмысловая регуляция.
Для установления точных границ антисмыслового транскрипта ASCL1 были выравнены экспрессирующиеся последовательности EST на геноме и отобраныи самые удаленные друг относительно друга концы. Полученная последовательность составила 596 нуклеотидов.
Таким образом, последовательность антисмыслового транскрипта ASCL1AS представляет собой:
1 AGAACCAGTT GGTGAAGTCG AGAAGCTCCT GCTCCTCGGG GCTGAGCGGG TCGTAAGAGC 61 CCTCGTCCGA CGAGTAGGAT GAGACCGGCG AGCCGGCCAT GGAGTTCAAG TCGTTGGAGT 121 AGTTGGGGGA GATGGTGGGC GACAGGACGC CTGCCTGGAA GGCGGCGCTC ACCGCGTCAT 181 GCTCGTCCAG CAGCTGCTGC AGCGCGCGGA TGTACTCGAC CGCCGAGCGC AGTGTCTCCA 241 CCTTACTCAT CTTCTTGTTG GCCGCGCCGT TGGGGACGTG CTCCCGAAGG GTGGCAAAGC 301 CCAGGTTGAC CAACTTGACG CGGTTGCGCT CGCGCTCGTT GCGGCGCGCC ACGGCGGCCG 361 GCTGCTGCTG CGGCAGGCTG TAGCCAAAGC CGCTGAAGTT GAGCCGGCGT TTGCAGCGCA 421 TCAGTTCGGG CGAAGACGAG CGCTGTCGCT TGACTTGCTT GGGCGCTGAC TTGTGACCGC 481 CCCCTGAGGG CTGGCCGTCG GCCGCCGGTC TCAGCTGCGG CGCCTGCTGC TGCTGCTGCT 541 GCTGCTGCTG CTGCTGCTGC GCGCTCTGCG CTGCCGCTGC GGCGGCTGCG GCCGCC Полученную последовательность ASCL1AS была проанализирована на содержание открытых рамок считывания (ОРС). Было найдено 7 ОРС разной длинны, но ни одна из них не показала какой-либо гомологии с известными белками. В таких случаях, подобные транскрипты считаются некодирующими.
При проведении сравнительно-геномного анализа у млекопитающих не было обнаружено в ортологичных локусах антисмысловых транскриптов. Не смотря на то, что сам ген ASCL1 является высоко консервативным.
Из особенностей локуса стоит также отметить наличие протяженных CpG островков, около 3,3 т. п. н. на смысловой цепи и 2,9 т. п. н. на антисмысловой цепи.
Возможно, что метилирование данных CpG-островков оказывает влияние как на наблюдаемую редкую экспрессию в нормальных тканях, а также и в процессах озлокачествления.
Таким образом, было показано существование гена ASCL1AS, экспрессирующего антисмысловой некодирующий транскрипт, участвующий в негативной регуляции по отношению гена ASCL1.
3. Исследование антисмысловой регуляции экспрессии гена AFAP1 человека.
Третьим интересным случаем пар смысловой — антисмысловой транскрипт оказались транскрипты из локуса гена AFAP1. Ассоциированный с актиновыми филаментами белок AFAP1, имеющий молекулярную массу 110 кДа (а потому получивший известность под названием AFAP-110), был открыт в начале 1990-х как один из главных субстратов онкогенной тирозинкиназы v-Src [Kanner S.B. et al., 1990;
Flynn D.C. et al., 1993]. Дальнейшие работы показали, что С-концевой актин связывающий домен белка AFAP1 образует поперечные сшивки (cross-linking) между актиновыми филаментами [Qian Y. et al., 2000] и играет важную роль в их перестройках [Baisden J.M. et al., 2001а,б]. В зависимости от своей концентрации и статуса фосфорилирования AFAP1 собирает актиновые филаменты либо в рыхлую ячеистую структуру, либо в плотные пучки [Qian Y. et al., 2004]. Другие партнеры белка AFAP1 включают протеинкиназу С (PKC), способную фосфорилировать этот белок и значительно усиливать его способность к образованию актиновых сшивок [Qian Y. et al., 2002], онкогенную форму протеинкиназы Src [Guappone A.C. et al., 1997], белки, содержащие повтор WD40, например, рецептор активированной протеикиназы С (RACK1), а также фосфолипиды плазматической мембраны [Baisden J.M. et al., 2001б]. Таким образом, AFAP1 функционирует как адаптерный белок, который отвечает за привлечение сигнальных молекул к специализированным сигнальным комплексам и/или внутриклеточным компартментам, изменяя локализацию и взаимодействие этих молекул, подвижность которых ограничена процессами формирования и разрушения актиновых структур.
Участие AFAP1 в канцерогенезе подтверждают следующие данные. Во-первых, экспрессия мутантного варианта AFAP1 с делецией домена лейциновой застежки в фибробластах приводит к появлению фенотипического сходства с клетками, трансформированными v-Src. Во-вторых, было показано, что AFAP1 играет важную роль в формировании специализированных актиновых структур, необходимых для миграции и инвазии злокачественных клеток, таких как подосомы, индуцируемые PKC [Qian Y. et al., 2000;
Gatesman A. et al., 2004]. В-третьих, AFAP1 обладает способностью активировать киназу Src, и эта способность регулируется его фосфорилированием протеинкиназой PKC [Baisden J.M. et al., 2001б;
Gatesman A. et al., 2004]. Как Src, так и PKC при аберрантной экспрессии или активации вызывают широкий спектр изменений во внутриклеточных путях передачи сигнала и влияют на процессы клеточной адгезии, миграции, пролиферации и апоптоза [O’Brian C.A., 1998;
Summy J.M., Gallick G.E., 2003]. Пока не известно, влияют ли изменения экспрессии AFAP1, также приводящие к нарушению целостности актинового цитоскелета и нарушению регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, на развитие опухолей и их метастазирование. Однако показано, что экспрессия гена AFAP1 увеличена в клетках карциномы простаты и ускоряет ее прогрессию путем PKC-зависимой регуляции процесса образования фокальных контактов [Zhang J. et al., 2007]. Показано также, что полиморфный вариант AFAP1 избыточно экспрессирован совсестно с cSrc киназой в карциноме яичника [Clump D.A. et al., 2010].
Нами было проведено детальное биоинформатическое и экспериментальное исследование экспрессии гена AFAP1, а также антисмысловых транскриптов, перекрывающих некоторые экзоны этого гена.
1. Анализ локуса AFAP1 и cis-антисмыслового транскрипта Ген AFAP1 расположен на хромосоме 4 в районе p16.1. Этот ген кодирует две изоформы белка. Основная изоформа, AFAP-110 (NP_940997), соответствует 17 экзоному транскрипту NM_198595 длиной 7534 нуклеотидов. Более длинная изоформа AFAP-120 (NP_001128119), также известная как 18-экзонный транскрипционный вариант «а» (NM_001134647, 7786 нуклеотидов), содержит удержанную интронную последовательность, описанную под названием NINS (novel insert) [Qian Y. et al., 1998].
Анализ нуклеотидной последовательности локуса AFAP1 выявил, что в 3 области гена AFAP1 на противоположной цепи расположены 2 антисмысловых кластера EST. Дистальный по отношению к смысловому гену кластер имеет двухэкзонную структуру, при этом четкую 3-границу этого кластера определить не удается: все EST обрываются в разных точках и не содержат последовательностей полиА. Проксимальный кластер имеет один экзон, с четкой 3-границей, при этом многие EST содержат полиА последовательности (Рисунок 9).
Рис. 9. На рисунке показано расположение EST (зелным) и мРНК (синим) на основной (сверху) и комплементарной (снизу) цепях генома человека в локусе гена AFAP человека.
При сравнении профиля экспрессии антисмысловых кластеров и смыслового гена AFAP1 было выявлено, что антисмысловые транскрипты более представлены в опухолеых образцах: из 54 антисмысловых транскриптов 89 % были получены на материале клонотек опухолевого происхождения, в то время как из 102 EST, соответствующих смысловому траснкрипту AFAP1, только 33 % были получены из опухолей. Цис-антисмысловые кластеры к гену AFAP1 имели схожие профили экспрессии.
2. Установление экзон-интронной структуры цис-антисмыслового транскрипта AFAP1.
Поскольку структура дистального кластера антисмысловых EST в локусе AFAP1 указывает на его незавершенность, было выдвинуто предположение о том, что проксимальный кластер является продолжением дистального, и, таким образом, эти два кластера представляют собой единую транскрипционную единицу, возможно, содержащую (второй) интрон. Анализ с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих этот гипотетический интрон, выявил образование одного ампликона, длина которого соответствует теоретически рассчитанной для безынтронного фрагмента (Рис. 10).
Рис. 10. Электорофограмма агарозного геля продуктов ПЦР с геномной матрицы (слева) и с матрицы кДНК, полученной из миомы (справа). По краям геля нанесены отрицательные контроли.
Таким образом, два ранее описанных цис-антисмысловых кластера к гену AFAP1 были объединены в единый двухэкзонный транскрипт asAFAP1 длиной 6, т. п. н. Область перекрывания между данными цис-антисмысловыми транскриптами и геном AFAP1 составляет 471 нуклеотидов и охватывает 3 экзона мРНК, кодирующей изоформу AFAP-110 (экзоны 14—16 в последовательности NR_026892) (рис. 11).
Рис. 11. Схема локуса AFAP1. Указаны экзон-интронная стурктура смыслового AFAP и антисмыслового AFAP1AS генов.
3. Установление границ антисмыслового транскрипта гена AFAP Для полной характеристики антисмысловго транскрипта необходимо было установить его границы. Известно, что многие транскрипты в клетках эукариот являются неполиаденилированными. Первоначально, последовательность антисмылового транскрипта была проанализирована на наличие сигналов полиаденилирования. Для этого примелялся онлайн алгоритм polyadq [Tabaska J.E., Zhang M.Q., 1999], который проводит поиск мажорных сигналов полиаденилирования AATAAA и ATTAAA в геноме человека. В качестве анализируемой последовательности выступил фланкирующий антисмысловой кластер фрагмент геномной ДНК размером 30 т. п. н., имеющий геномные координаты 7,805K–7,835K на хромосоме 4, с отступлением от предполагаемых границ гена на 1,5 т. п. н.
Результаты биоинформатического предсказания приведены в таблице 4.
Таблица Результаты биоинформатического предсказания сигналов 4.
полиаденилирования на антисмысловой цепи локуса AFAP1.
Prediction Site Sequence Score POS 3567 AATAAA 0. POS 10793 AATAAA 0. POS 21322 ATTAAA 0. POS 22258 AATAAA 0. POS 26535 AATAAA 0. 5 sites found out of 31 considered Total sites found = Total sites considered = В результате проведенного биоинформатического анализа было предсказано сигналов полиаденилирования, коллинеарных антисмысловому гену. Что интересно, все из найденных сайтов имели высокий балл при оценке алгоритмом.
Далее все пять потенциальных сайтов полиаденилирования были проанализированы по базе данных dbEST с целью выявления экспрессирующихся последовательностей, содержащих поли(А)-хвосты. Первые два сайта локализованы в последовательности интрона антисмыслового гена. Третий и четвертый сайты не имели подтверждения в виде экспрессирующихся последовательностей. Последний сайт имел явное подтверждение в виде нескольких EST, имеющих на своем 3-конце поли(А)-хвост (рис. 12). Таким образом, 3-граница гена была установлена с помощью биоинформатического анализа.
polyA-сигнал Рис. 12. На рисунке показаны стрелкой расположение предсказанного сигнала полиаденилирования и картированные на геноме экспрессирующиеся последовательности EST антисмыслового кластера AFAP1AS.
Для поиска 5-границы гена была использована особенность конструирования библиотеки тотальной кДНК с использованием ImProm-II обратной транскриптазы, — SMART (Switching Mechanism at 5 End of RNA Template, механизм переключения на 5-конце матрицы РНК) — нематричное добавление некоторыми обратными транскриптазами (в частности, ревертазой MMLV вируса лейкемии Молони мышей, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) нескольких дезоксинуклеотидов (преимущественно, цитозина) на 3-конце вновь синтезированной цепи кДНК с последующей гибридизацией на них олигонуклеотида с комплементарными олиго-G нуклеотидами и «переключением» матрицы ревертазы с матрицы РНК на матрицу этого олигонуклеотида. Далее использование технологии RACE (rapid amplification of cDNA ends, RACE, быстрая амплификация концов кДНК) на матрице, подготовленной с использованием SMART синтеза, позволяет довольно специфично амплифицировать концы кДНК.
Были разработаны праймеры для проведения 5-RACE амплификации антисмыслового транскрипта AFAP1 (рис. 13). Для контроля насыщения амплификата интересующими последовательностями были использован метод ПЦР с внутренними праймерами (nested PCR): 2F2 + 2R3 — 308 п. н. для первого раунда 5-RACE и 2F2 + 2R6 — 201 п. н. на втором раунде.
Рис. 13. Схема расположения праймеров для 5-RACE антисмыслового транскрипта AFAP1.
В результате работы были подобраны оптимальные условия амплификации, и после второго раунда ПЦР был получен один фрагмент длиной 363 п. н., которая соответствовала теоретически рассчитанной (рис. 14).
Рис. 14. Электорофограмма агарозного геля второго раунда 5-RACE ПЦР антисмыслового транскрипта AFAP1AS.
Фрагмент был переамплифицирован и отсеквенирован. Анализ последовательности отсеквенированного фрагмента показал, что он представляет собой фрагмент последовательности повторяющегося элемента L1MA3 семейства L класса длинных десперегированных повторов и имеет наибольшую гомологию с таким повтором, локализованным в предпоследнем интроне гена GBE1. По всей вероятности, наличие повтора в первом экзоне антисмыслового транскрипта значительно усложняет амплификацию 5-конца гена, что привело к невозможности получить амплификат с него.
Анализ экспрессирующихся последовательностей в области потенциального начала антисмыслового гена позволяет предположить наличие нескольких сайтов инициации транскрипции, разнесенных на 35 п. о. (Рис. 15) По общепринятым правилам за 5-конец был принят вариант с самым ранним стартом транскрипции.
Рис. 15. На рисунке показано расположение EST (зелным) и мРНК (синим) 5-конца антисмыслового кластера AFAP1AS человека.
Анализ полученой полной последовательности антисмыслового транскрипта показал, что она содержит несколько открытых рамок считывания. Максимальная рамка имеет длину 519 нуклеотидов. Но ни одна из однаруженных рабомк не имеет какой-либо значимой гомологии с последовательностями других белков зарегистрированных в базе данных SwissProt. На сегодняшний день принято считать такие транскрипты некодирующими. Также полногеномный анализ последовательности показала, что она уникальна, и не имеет паралогов.
Таким образом, полученная последовательность была приоритетно зарегистрирована в виде нового некодирующего гена AFAP1AS в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.
4. Анализ транс-антисмысловых взаимодействий с геном AFAP1AS.
Полученная последовательность гена AFAP1AS была проанализирована на предмет способности некодирующиего транскрипта взаимодействовать с другими РНК-партнрами.
Проведенный анализ показал, что последовательность AFAP1AS содержит ряд повторяющихся элементов (Рис. 16). Так, первый экзон asAFAP1 длиной нуклеотидов расположен внутри THE1A ретроэлемента класса LTR семейства MaLR.
Более того, область asAFAP1, расположенная 3-дистальнее районов его перекрывания с 15-м и 16-м экзонами AFAP1, содержит короткий дисперегированный повтор семейства AluJb.
RepeatMasker Web Server (www.repeatmasker.org) Рис. 16. Положение повторяющихся элементов в составе антисмыслового транскрипта к гену AFAP1.
Наличие нескольких повторяющихся элементов в составе последовательности антисмыслового транскрипта asAFAP1 позволяет предположить его транс взаимодействия с другими смысловыми и антисмысловыми транскриптами, составляющими сеть взаимодействующих и регулирующих друг друга транскриптов.
Был проведн анализ антисмыслового транскрипта AFAP1AS с целью поиска транс антисмысловых взаимодействий. Для этого была использована специально созданая база данных транс-антисмысловых транскриптов Trans-SAMap [Li J.T. et al., 2008].
Поиск выявил несколько потенциальных партнров транс-антисмысловых взаимодействий (табл. 5).
Таблица 5. Результаты биоинформатического предсказания транс-антисмысловых партнеров гена AFAP1AS.
Смысловой Область Область Score транскрипт гомологии в гомологии в целевом гене asAFAP1, локализация в повторе MCFD2 110 3—71, LTR 853— 96 12—70, LTR 2721— LOC440570 83.6 1—58, LTR 1225— NBPF family — 6 NFBP family — 105 Alu regions genes genes RPL7L1 101 2848—2985, Alu 37— Помимо использования общедоступной базы данный антисмысловых транскриптов Trans-SAMap, был проведен собственный биоинформатический анализ с использованием пакета программ BLAST. При введении низкого порога поиска и отключив фильтры, игнорирующие повторы было обнаружено, что антисмысловой транскрипт AFAP1AS также перекрывается как минимум с 50 последовательностями других генов за счет повтора AluJb.
Известно, что LTR-повторы содержат промоторные элементы, способные в системах in vitro инициировать транскрипцию [Kovalskaya E. et al., 2006]. Как минимум 50 % всех LTR-элементов служат функциональными промоторами для транскрипции уникальной геномной ДНК человека [Buzdin A. et al., 2006]. К тому же, LTR часто локализуются в геноме в ориентации, противоположной направлению транскрипции близлежащего гена. Однако в целом, корреляция между промоторной активностью LTR, расположенных в антисмысловой ориентации, и соседних генов отсутствует [Buzdin A. et al., 2006]. Одним из немногих описанных случаев, когда LTR-элементы приводят к образованию антисмысловой РНК, описан в [Gogvadze E.
et al., 2009]: так, LTR в интроне генов IFT172 (selective LIM binding factor, rat homolog) и SLC4A8 (sodium bicarbonate cotransporter) служат промоторами для антисмысловых транскриптов, перекрывающихся с экзоном. По всей видимости, подобная ситуация может иметь место и в данном случае.
5. Сравнительно геномный анализ гена AFAP1AS.
Сравнительный анализ локусов гена AFAP1 в геномах млекопитающих показал, что антисмысловой транскрипт asAFAP1 является видоспецифичным для человека.
При этом смысловые гены AFAP1 обладают высокой степенью сходства и синтенией, хотя у мыши имеется только один 17-экзонный транскрипционный вариант мРНК, кодирующий изоформу AFAP-110.
6. Экспрессионный анализ локуса AFAP1 и cis-антисмыслового транскрипта Для сравнения профилей экспрессии была выбрана панель нормальных и опухолевых тканей человека, а также ряд линий клеток человека. Результаты количественной оценки экспрессии приведены на рис. 17.
sAFAP asAFAP 0, 0, Рис. 17. Относительная представленность локусов AFAP1 в тканях человека в логарифмической шкале. За 100 % принят относительный уровень экспрессии гена домашнего хозяйства HPRT1.
Как видно из представленной диаграммы, является AFAP1AS низкопредставленным транстриптом.
Нарушение пропорциональности экспрессии перекрывающихся кластеров транскриптов, по всей видимости, говорит о возможной позитивной регуляции смыслового гена AFAP1 с помощью антисмысловой транскрипционной единицы.
Однако для подтверждения данного предположения требуется проведение дополнительных экспериментов.
ВЫВОДЫ В локусе MAP3K13 человека выявлены молчащий псевдоген и ошибка 1.
картирования данного кластера антисмысловых РНК.
Экспериментально установлено существование нового некодирующего гена 2.
ASCL1AS и исследованы спектры его экспрессии в тканях человека.
Установлена экзон-интронная структура антисмыслового транскрипта 3.
Полученная последовательность приоритетно AFAP1AS. AFAP1AS зарегистрирована в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.
При исследовании тканевых спектров экспрессии смыслового гена AFAP1 и 4.
антисмыслового гена AFAP1AS человека можно сделать вывод о наличии позитивной регуляции.
Часть работы выполнена в рамках плановых работ МГНЦ РАМН по теме «Выявление пар антисмысловых транскриптов человека и изучение принципов их взаимной регуляции» (номер государственной регистрации № 01200951485), гранта РФФИ № 07-04 00379-а «Aнтисмысловые РНК в опухолевых клетках человека» и Государственного контракта от 18.05.2009 г. № 02.512.12.2060 «Разработка эффективных способов доставки генетической информации в клетки-мишени in vivo для генотерапии социально значимых заболеваний».
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2007) Antisense regulation of human gene MAP3K13: true phenomenon or artifact?
Proceedings of the 3rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB’07, pp. 197—199, Moscow, Russia, July 27—31 2007.
2) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2007) Study of antisense regulation of human gene MAP3K13,
Abstract
book of the Conference for Young Scientists, PhD Students and students on Molecular Biology and Genetics, dedicated to 120th anniversary of M. I. Vavilov, p. 77, Kyiv, Ukraine, September 20— 22, 2007.
3) A. V. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Y. Skoblov (2008) Study of the antisense transcript to AFAP1 himan gene. European Human Genetics Conference 2008, Barcelona, Spain, May 31 — June 3, 2008 / European Journal of Human Genetics, Vol. 16 Supplement 2, May 2008, p. 395—396.
4) Марахонов А. В., Баранова А. В., Казубская Т. П., Шигеев С. В., Скоблов М. Ю.
(2008) Анализ антисмыслового транскрипта к гену AFAP1 человека, IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11—15 мая года / Новосибирск: изд-во «Арта», 2008. — с. 267.
5) А. В. Марахонов, А. В. Баранова, М. Ю. Скоблов (2008) РНК-интерференция:
фундаментальные и прикладные аспекты. // Медицинская генетика. 2008. Т. 7. № 10 (76). С. 44—56.
6) А. В. Марахонов, А. В. Баранова, М. Ю. Скоблов (2008) Антисмысловая регуляция экспрессии гена MAP3K13 человека: факт или артефакт? // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С. 581—587.
7) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2009) In search of antisense to AFAP1 human gene. The Ukrainian Biochemical Journal, Vol. 84, № (special issue) p. 104 / VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, Crimea, Ukraine, October 3—7, 2009.
8) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2009) In search of antisense to AFAP1 human gene. Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB’09, pp. 229, Moscow, Russia, July 20—23 2009.
9) Марахонов А. В., Баранова А. В., Казубская Т. П., Шигеев С. В., Скоблов М. Ю.
Изучение антисмысловой регуляции локуса AFAP1 человека. Материалы Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Часть II, Москва, 21—28 июня 2009 г. / Изд-во РГАУ — МСХА им. К. А. Тимирязева, 2009. — Ч. II. — с. 379.
СИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПАТ — природный антисмысловой транскрипт;
мРНК — матричная РНК;
РНК — рибонуклеиновая кислота;
кДНК — комплементарная ДНК;
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;
ОТ-ПЦР — ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией;
ПЦР — полимеразная цепная реакция;
т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов;
п. н. — пара нуклеотидов;
ОРС — открытая рамка считывания;
EST — expressed sequenced tag (экспрессирующаяся последовательность);
LTR — long terminal repeat (длинный концевой повтор).