Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки
На правах рукописи
МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ 03.00.15 – генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2008 год
Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Мякоткин Валерий Андреевич доктор медицинских наук, профессор Шахтарин Владимир Васильевич
Ведущая организация: НИИ канцерогенеза Государственного учреждения Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН
Защита состоится « » 2008 г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.016.01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГНЦ РАМН.
Автореферат разослан « » _ 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.001.016.01, Зинченко Р.А.
доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс.
новых случаев рака почки и почти 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии.
В России диагностируют до 9 тыс. случаев опухолей почки в год, более 90% которых приходятся на почечно-клеточные карциномы – рак почки (РП). По темпам прироста заболеваемости РП уступает только новообразованиям предстательной и щитовидной желез [Алексеев Б.Я., 2007].
В настоящее время диагностика и прогноз РП основываются на данных инструментальных методов исследования и патоморфологических критериях, что далеко не всегда позволяет правильно оценить прогноз заболевания и возможности лечения [Yin-Goen Q., 2006]. Это обусловливает необходимость создания эффективных тест-систем для проведения своевременной лабораторной диагностики, мониторинга и определения прогноза течения РП.
Необходимым этапом создания системы маркеров РП является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных опухолях почки. В качестве таких повреждений генома опухолевых клеток могут выступать мутации, потеря гетерозиготности и аберрантное метилирование ряда генов-супрессоров.
Ген VHL инактивируется в большинстве случаев самого распространенного морфологического типа РП – светлоклеточного рака почки (СРП) вследствие соматических мутаций, метилирования промотора и потери гетерозиготности [Banks R.E., 2006]. Также при СРП выявляют аллельные делеции других генов супрессоров. Вопрос о влиянии мутаций и метилирования VHL и делеций генов-супрессоров в области 3р (VHL, RASSF1, FHIT) на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания остается открытым. Идентифицирован ряд генов-супрессоров, аберрантное метилирование которых наблюдается в различных морфологических типах опухолей [Lovisolo J.A., 2006]. Анализ наиболее часто метилируемых генов будет способствовать созданию системы диагностических и прогностических маркеров РП.
Опубликованы данные об исследованиях полиморфизмов различных генов при РП [Karami S., 2008]. Некоторые полиморфизмы могут представлять интерес как потенциальные маркеры предрасположенности к спорадическому РП в популяции европейской части России или влиять на течение заболевания.
РП практически не чувствителен к лучевой и химиотерапии, поэтому хирургическое удаление опухоли является основным методом лечения РП.
Определенные успехи связаны с внедрением в практику таргетных препаратов, механизм действия которых напрямую связан с генетическими нарушениями в опухолевых клетках [Costa L.J., 2007]. В связи с этим вопрос о лечении метастатического РП и местнораспространенных форм заболевания требует максимально точной оценки прогноза развития первичной опухоли, знания ее особенностей на молекулярно-генетическом уровне.
Таким образом, комплексное исследование соматических мутаций, потери гетерозиготности, метилирования 5’-регуляторных областей генов-супрессоров и полиморфных вариантов генов, задействованных в развитии РП, будет способствовать формированию системы новых молекулярно-генетических маркеров РП.
Целью исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при РП, направленный на выявление и характеристику диагностических и прогностических маркеров заболевания.
Задачи исследования:
Изучить мутации, аллельные делеции и метилирование промотора 1.
гена VHL и провести сравнительный анализ выявленных изменений относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.
Провести анализ потери гетерозиготности областей локализации 2.
генов VHL, RASSF1, FHIT и TP53 в парных образцах РП на различных стадиях заболевания и степенях дифференцировки первичной опухоли.
Оценить частоты аберрантного метилирования генов-супрессоров 3.
VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в образцах РП и провести сравнительный анализ метилирования этих генов относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.
Исследовать метилирование CpG-динуклеотидов в промоторной 4.
области гена HOXB13, построить карту аберрантного метилирования этого гена.
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов 5.
генов ABCB1, TGFBR1, IL10, VDR в норме и у больных РП. Провести сравнительный анализ полученных данных между группами пациентов и контроля, а также между различными клиническими группами больных РП.
Научная новизна. Идентифицированы 33 новые мутации в гене VHL.
Впервые исследованы сочетанные делеции генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР при СРП. Изучено метилирование 5’-регуляторных областей генов VHL, и с помощью мультилокусной RASSF1, FHIT, SFRP1 CDH метилчувствительной ПЦР. Впервые показана ассоциация аберрантного метилирования RASSF1 с прогрессией первичной опухоли на ранних стадиях РП (Р = 0.047). С помощью бисульфитного секвенирования построена карта метилирования промотора гена-кандидата HOXB13 в первичных опухолях почки. С помощью нового метода – минисеквенирования с детекцией в режиме фрагментного анализа – изучены полиморфные варианты генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP генов IL10 и TGFBR1, получены данные о возможном влиянии полиморфизмов в генах VDR и TGFBR1 на развитие опухолей почки.
Практическая значимость. Проведено комплексное молекулярно генетическое исследование 127 первичных опухолей почки (светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином). Оптимизирован метод комплексной оценки молекулярно-генетических нарушений VHL (соматических мутаций, аберрантного метилирования и потери гетерозиготности) при СРП. Выявлена высокая частота повреждений гена VHL при СРП. Разработаны системы из двух STR-маркеров для тестирования аллельных делеций в областях локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при РП. Определена ассоциация множественных аллельных делеций генов-супрессоров на 3р (Р = 0.036), а также метилирования генов RASSF1 и CDH1 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли (Р = 0.001), что позволит использовать анализ этих генов в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях РП. Результаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы в разработке системы молекулярно-генетических маркеров РП, в частности, определение мутаций и метилирования гена VHL – при оптимизации таргетной терапии.
Положения, выносимые на защиту:
Мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование гена VHL 1.
происходят на ранних стадиях СРП в большинстве случаев заболевания.
Потеря гетерозиготности двух и более генов-супрессоров, 2.
локализованных в области 3р, отражает прогрессию первичной опухоли.
Аберрантное метилирование является существенным механизмом 3.
инактивации генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и наблюдается в 85% первичных почечно-клеточных карцином. Построена карта метилирования промотора гена-кандидата HOXB13 при спорадическом РП.
Метилирование генов и ассоциировано с 4. RASSF1 CDH прогрессией и метастазированием первичной опухоли, соответственно, что позволяет рассматривать их как составную часть системы молекулярных маркеров РП.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все эксперименты и методики были разработаны и проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007-2008 гг., на конгрессах Российского общества онкоурологов в 2006-2007 гг., на Российском онкологическом конгрессе в 2007 г., конференции «Генетика в России и в мире» в 2006 г., конференции по биологии и генетике в 2007 г., конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 г., а также на межлабораторных семинарах ГУ МГНЦ РАМН. Прочитана лекция на кафедре генетики Факультета усовершенствования врачей Российского государственного медицинского университета Росздрава.
Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в печатных работах соискателя, в том числе, 6 статей опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.
Внедрение результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК технологии методика оценки прогрессии «Молекулярно-генетическая первичной опухоли при светлоклеточном раке почки» и «Молекулярно генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточном раке почки» (Разрешения на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/150 от 22.07.2008 и ФС № 2008/152 от 23.07.2008, соответственно).
Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: анализ герминальных мутаций в гене VHL при диагностики синдрома Хиппеля-Линдау, определение аллельных делеций генов-супрессоров в области 3р при спорадическом РП.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки. Диссертация иллюстрирована таблицами и 18 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Образцы опухолей почки предоставлены Урологической клиникой им.
Р.М. Фронштейна ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, ГУ МРНЦ РАМН и ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена (всего 127 образцов РП). Все случаи РП классифицированы по согласно требованиям Международного TNM противоракового союза (UICC, версия 1997 г.). Из них 53% (67/127) соответствовали I стадии заболевания, 12% (15/127) – II, 21% (27/127) – III и 14% (18/127) – IV. На момент постановки диагноза 17% (21/127) пациентов в изучаемой выборке имели метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы.
Геномную ДНК из замороженных образцов опухолей и соответствующих им участков гистологически не измененной ткани выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией.
Архивные образцы опухолей, заключенные в парафиновые блоки, предварительно депарафинизировали с помощью ксилола и этанола.
Мутации VHL выявляли с помощью ПЦР экзонов 1-3, SSCP-анализа ПЦР-продуктов и последующего секвенирования. При анализе ДНК, полученной из парафиновых блоков, амплифицировали 3’-часть 1-го экзона.
Для анализа потери гетерозиготности (ПГ) генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 была разработана оригинальная система из STR-маркеров (по два микросателлитных локуса на каждый ген): D3S1317 и D3S1038 (VHL), D3S и D3S966 (RASSF1), D3S1234 и D3S1300 (FHIT), D17S1353 и IVS1 (TP53).
Проводили ПЦР вариабельных локусов, затем ПЦР-продукты разделяли в 10% денатурирующем ПААГ (IVS1-TP53 – в 8% ПААГ).
Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 определяли с помощью метилчувствительной ПЦР Дизайн праймеров (МЧ-ПЦР).
осуществлен в настоящем исследовании с помощью программ PerlPrimer и Предварительно проводили обработку геномной ДНК Vector NTI.
метилчувствительной рестриктазой BstHHI («СибЭнзим», Новосибирск).
При подготовке к бисульфитному секвенированию геномную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который вызывает переход неметилированных остатков цитозина в урацил, но не изменяет метилированные цитозины. Дизайн метилспецифических праймеров был выполнен с помощью интерактивной программы MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/).
ПЦР-продукты, предназначенные для секвенирования, подвергали электрофорезу в 1%-ом агарозном геле, затем эллюировали с помощью колонок Quantum Prep® Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns («Bio-Rad Секвенирование проводили с использованием Laboratories»). BigDye® Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI3100 в соответствиями с протоколами фирмы «Applied Biosystems».
Мультилокусную ПЦР полиморфизмов ABCB1, TGFBR1, IL10, VDR проводили с использованием праймеров, фланкирующих исследуемые SNP в каждом из генов (методика разработана в ходе настоящей работы). Не вошедшие в реакцию праймеры и dNTP инактивировали экзонуклеазой I из E.coli и щелочной фосфатазой (“Fermentas”, Литва). Далее к ПЦР-продуктам добавляли внутренние праймеры для каждого SNP и проводили реакцию с использованием ABI Prism® SNaPshot™ Multiplex Kit (“Applied Biosystems”), затем проводили обработку продуктов реакции щелочной фосфатазой.
Детекцию проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (“Applied Biosystems”).
Статистический анализ частот аллелей и генотипов полиморфизмов, метилирования и ПГ проводили с помощью точного двустороннего критерия Фишера. Комплексный анализ встречаемости генетических нарушений в нескольких группах осуществляли при использовании критерия 2.
Программное обеспечение для секвенированных последовательностей:
Sequencing Analysis v 5.1. (“Applied Biosystems”), Chromas v.2.31. Анализ мутаций сплайсинга осуществляли с помощью программы, доступной на сайте http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html. При сравнении выявленных мутаций с уже известными мутациями использовали интерактивные базы данных UMD (http://www.umd.be:2020/) и HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php).
Сравнительный анализ выявленных генетических изменений в различных группах пациентов проводили с помощью программы GraphPadInStat v.3.05 и STATISTICA v. 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки Инактивация гена VHL вследствие молекулярно-генетических нарушений выявляется в большинстве светлоклеточных карцином почки, при этом влияние инактивирующих событий на развитие опухоли неоднозначно. В настоящей работе определяли мутации (рис. 1), аллельные делеции и метилирование как причины инактивации VHL. Мутации VHL были определены в 31.7% (39/123) СРП. Все выявленные мутации соматические, что, наряду с клиническими данными, позволило исключить синдром Хиппеля-Линдау и рассматривать имеющиеся образцы как выборку спорадического СРП. Среди мутаций 69.2% (27/39) составляли делеции, протяженность которых варьировала от 1 до п.н., 18.0% (6/39) – инсерции, дупликации и комплексная мутация, оставшиеся приходятся на однонуклеотидные замены. Впервые 12.8% (5/39) идентифицированные мутации определены в 84.6% (33/39) образцов СРП.
Большинство делеций и инсерций, а также дупликации и комплексная мутация, составляющие 56.4% (22/39), приводили к сдвигу рамки считывания и формированию новых стоп-кодонов.
Рисунок 1. Определение мутации c.472CG. Вверху – результат SSCP-анализа экзона 3 гена VHL (N и Т – нормальная и опухолевая ткани, соответственно), ПЦР-продукт с аномальной подвижностью в образце 5Т;
секвенирование ПЦР-продукта 5Т с обратного праймера, идентификация мутации.
Аллельные делеции VHL при СРП определяли по STR-маркерам D3S1317 и D3S1038. Проанализированы 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов нормальной почечной паренхимы, взятых на расстоянии не менее 1.5 см от края новообразования. Информативность используемых микросателлитных локусов составила 47.9% (45/94) для D3S и 77.7% (73/94) – для D3S1038. Система из двух STR-маркеров позволяла определять аллельные делеции в 91.5% (86/94) случаев. ПГ обнаружена в 27.9% (24/86) информативных образцов СРП.
Метилирование промотора VHL исследовали с помощью МЧ-ПЦР (рис. 2).
Исследовали 94 парных образца тканей опухолей и почечной паренхимы, а также 29 парафиновых блоков с архивными образцами СРП (всего опухоли). Метилирование промотора гена определено только в образцах СРП и не выявлено в гистологически нормальной ткани. Частота аберрантного метилирования составила 14.6% (18/123) выборки СРП.
Рисунок 2. Анализ метилирования VHL. М – маркер молекулярной массы (pUC19/MspI, размеры фрагментов в п.н. указаны слева), ОК – отрицательный контроль амплификации, ПК – положительный контроль амплификации, К+ – внутренний контроль ПЦР (экзон 2 гена VHL), МЕТ – анализируемый участок промотора VHL, 1-12 – анализируемые образцы опухолей. Аберрантное метилирование выявлено в образцах 5 и 10.
Сопоставлены участки CpG-островка, анализируемого в представленной работе и у других авторов. Показано, что все праймеры для метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР) в других исследованиях локализованы внутри участка, изученного в настоящей работе. Один из праймеров всегда содержал CpG-динуклеотиды в позициях -162, -164 и -168, два из которых (- и -168) входят в сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы BstHHI.
Методом МС-ПЦР изучали метилирование 8 остатков цитозина в области с. 24_-168. В настоящей работе проведен анализ метилирования с помощью МЧ ПЦР семи CpG-динуклеотидов на том же участке. Таким образом, МЧ- и МС ПЦР могут служить альтернативными методами определения метилирования промотора VHL.
У больных на I стадии СРП соматические мутации в гене VHL выявлены в 35.4% (23/65) случаев, ПГ – в 28.2% (11/39) информативных случаев и аберрантное метилирование – в 20.0% (13/65) образцов. В целом, хотя бы одно из нарушений гена VHL обнаружено у 53.8% (35/65) больных с I стадией заболевания, что свидетельствует в пользу инактивации VHL на ранних стадиях СРП.
Следует отметить, что инактивация VHL влияет не только на развитие первичной опухоли, но и может определять тактику лечения СРП. В последние 3 года в лечении метастатического СРП произошли существенные изменения, и в настоящее время это заболевание можно считать одним из наиболее удачных примеров применения таргетных препаратов. Эти препараты представляют собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста, которые взаимодействуют лишь с определенными молекулами, играющими ключевую роль в развитии РП. Наиболее эффективные из них – Сутент и Нексавар, ключевые мишени которых и типов, (VEGFR 1-го 2-го PDGFR) гиперэкспрессируются в ответ на инактивацию VHL. Следовательно, СРП, несущий молекулярно-генетические нарушения VHL, может представлять собой наиболее оптимальный случай для терапии одним из этих препаратов.
Выдвинутое предположение нашло подтверждение в первом исследовании, показавшем более выраженный эффект применения Сутента у пациентов с соматическими мутациями VHL, чем у пациентов без мутаций [Личиницер М.Р., 2007].
Таким образом, соматические мутации, ПГ и аберрантное метилирование промотора VHL могут рассматриваться как перспективные маркеры СРП.
Указанные молекулярно-генетические нарушения присутствуют в первичной опухоли на ранних стадиях заболевания и влияют на чувствительность опухоли к таргетным препаратам.
Исследование аллельных делеций генов VHL, RASSF1, FHIT и TP Помимо VHL, для СРП характерны аллельные делеции других генов супрессоров, которые могут оказывать влияние на развитие злокачественного новообразования. Для определения прогностической значимости аллельных делеций в настоящем исследовании определена ПГ областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT (гены-супрессоры в области 3p) и ТР53 (рис. 3).
Рисунок 3. Выявление ПГ. А – результат электрофореза в 8% ПААГ пентануклеотидного повтора IVS1 гена ТР53 (T и N – опухолевая и нормальная ткани, соответственно), 1 – гомозигота, 2 – ПГ в опухолевой ткани, 3 – нормальная гетерозигота;
В – результат денатурирующего электрофореза в ПААГ микросателлита D3S1568 (образцы нанесены на гель в обратном порядке), 4 – гомозигота, 5 – ПГ в опухолевой ткани (область гена RASSF1), 6 – нормальная гетерозигота.
Информативность STR-локуса D3S1568 составила 58.5% (55/94), D3S966 – 62.8% (59/94), D3S1300 – 67.0% (63/94), D3S1234 – 85.1% (80/94), D17S1353 – 67.0% (63/94) и IVS1 – 61.7% (58/94), информативность и характеристики систем из двух STR-маркеров для VHL указаны в предыдущем разделе.
Системы из двух вариабельных локусов позволяли определять ПГ гена RASSF в 85.1% (80/94), FHIT – 95.7% (90/94) и TP53 – 89.4% (84/94) случаев.
ПГ гена RASSF1 обнаружена в 27.5% (22/80), FHIT – 35.6% (32/90), TP53 – 17.9% (15/84) и, как упоминалось ранее, VHL – 27.9% (24/86) информативных образцов СРП. Аллельные делеции хотя бы одного гена на 3р наблюдали в 56.4% (53/94), а в совокупности из четырех исследованных генов – в 60.6% (57/94) информативных случаев.
2 гена на 3p RASSF1 FHIT TP N = 94 (N* = 80) (N* = 90) (N* = 84) (N* = 91) частота Р частота Р частота Р частота Р 21.3% 30.2% 18.0% 14.8% SI-II (10/47) (16/53) (9/50) (8/54) 0.203 0.264 0.999 0. 36.4% 43.2% 17.6% 29.7% SIII-IV (12/33) (16/37) (6/34) (11/37) 23.6% 34.4% 16.4% 16.4% G1- (13/55) (21/61) (9/55) (10/61) 0.287 0.815 0.766 0. 36.0% 37.9% 20.7% 30.0% G3- (9/25) (11/29) (6/29) (9/30) 22.9% 30.9% 17.6% 16.1% T1- (11/48) (17/55) (9/51) (9/56) 0.311 0.267 0.999 0. 34.4% 42.9% 18.2% 28.6% T3- (11/32) (15/35) (6/33) (10/35) 24.2% 31.5% 18.6% 16.0% ТхN0M (16/66) (23/73) (13/70) (12/75) 0.192 0.158 0.999 0. N и/или М 42.9% 52.9% 14.3% 43.8% полож. (6/14) (9/17) (2/14) (7/16) Таблица 1. ПГ генов-супрессоров в различных клинических группах (результаты по VHL приведены в тексте ранее). N – объем выборки СРП, N* - количество информативных случаев для каждого из исследуемых генов, S – стадия заболевания, G – степень дифференцировки первичной опухоли, T – размер первичной опухоли по TNM классификации, N – метастазы в регионарных лимфоузлах, М – отдаленные метастазы.
Выявлена ассоциация аллельных делеций по двум и более генам супрессорам, локализованным на коротком плече хромосомы 3, с наличием метастазов на момент постановки диагноза: Р = 0.036, OR = 1.49 (95% CI: 1.01 2.33). Можно предположить, что ПГ нескольких генов-супрессоров на 3р связана с опухолевой прогрессией, в отличие от аллельных делеций одного из исследованных генов в области 3р или гена ТР53 (табл. 1).
Следует отметить, что в последнее время много внимания уделяют комплексным исследованиям аллельного дисбаланса (ПГ и амплификации), экспрессионному профилю генов в зонах аллельного дисбаланса и соотнесению выявленных изменений с клинико-патологическими характеристиками опухоли. Выявленная в настоящей работе ассоциация множественных аллельных делеций с метастазированием первичной опухоли может быть учтена при выборе прогностических критериев спорадического СРП.
Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки В настоящем исследовании изучено метилирование 5’-регуляторных областей генов-супрессоров, локализованных в области 3р (VHL, RASSF1 и FHIT), а также генов SFRP1 и CDH1. Метилирование определено МЧ-ПЦР (рис. 3). Исследованы 98 парных образцов светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином, парафиновых блоков СРП. В образцах гистологически не измененной почечной парнехимы гиперметилирование генов-супрессоров не выявлено.
Рисунок 3. Определение метилирования генов-супрессоров (на примере FHIT). М – маркер молекулярной массы (pUC19/MspI), ОК – отрицательный контроль амплификации, ПК – положительный контроль амплификации, К+ – внутренний контроль ПЦР, N и Т – нормальная и опухолевая ткани соответственно, 1-3 – анализируемые образцы. Аберрантное метилирование выявлено в образцах опухолей 1 и 2.
В опухолях аберрантное метилирование VHL определено в 14.2% (18/127), RASSF1 – 52.8% (67/127), FHIT – 54.3% (69/127), SFRP1 – 33.1% (42/127) и CDH1 – 41.7% (53/127) случаев. Результаты, полученные методом МЧ-ПЦР, подтверждены бисульфитным секвенированием гиперметилированных образцов. В более редких, чем СРП, типах РП были метилированы гены:
RASSF1 – в 1 из 2 папиллярных карцином, FHIT – в 1 из 2 папиллярных и в 1 из 2 хромофобных карцином. Метилирование двух указанных генов можно рассматривать как распространенное событие в канцерогенезе опухолей почки.
В настоящем исследовании наблюдаемая частота метилирования гена SFRP1 отличалась от данных, опубликованных ранее (33% против 68%) [Dahl E., 2007]. Это может быть объяснено различными методическими подходами в анализе CpG-островка и репрезентативностью выборок (123 светлоклеточных карциномы в настоящем исследовании и 38 – у других авторов). Частота метилирования другого исследованного в этой работе гена – CDH1 – близка к данным литературы [Costa V.L., 2007]. Проведен сравнительный анализ частот метилирования в парных клинических группах в зависимости от стадии заболевания, степени дифференцировки первичной опухоли и метастазирования (табл. 2). Показана ассоциация метилирования CDH1 с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024, OR = 2.40 95% CI: 1.13-5.08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001, OR = 5. 95% CI: 2.03-17.59). Продукт гена CDH1, Е-кадгерин, участвует в обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе, в эпителии почечных канальцев. Инактивацию гена вследствие CDH метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли. Анализ аберрантного метилирования CDH1 на сегодняшний день представляется одним из перспективных прогностических маркеров РП, чему соответствуют результаты настоящего исследования.
Помимо молекулярно-генетических изменений, характеризующих инвазию и метастазирование, не меньший интерес вызывают потенциальные маркеры прогрессии опухоли, которые могут быть выявлены на ранних стадиях заболевания. В работе выбраны гены-кандидаты с наибольшей абсолютной частотой метилирования (40 образцов) на ранних стадиях РП – гены RASSF1 и FHIT. Показано, что метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047, OR = 2.58, 95% CI: 1.04-6.35). Можно предположить, что метилирование VHL, RASSF1, FHIT и SFRP1 встречается в значительной доле случаев РП уже на первой стадии, тогда как с прогрессией первичной опухоли ассоциировано аберрантное метилирование которое может считаться потенциальным RASSF1, неблагоприятным маркером на ранних стадиях РП.
М- : М+ SI-II : SIII-IV G1-2 : G3-4 T1-2 : T3- Ген РS РG РM PT 82 : 45 89 : 38 84 : 43 106 : 14 : 4 0.289 14 : 4 0.582 15 : 3 0.113 16 : 2 0. VHL 38 : 29 0.064 45 : 22 0.561 41 : 26 0.261 52 : 15 0. RASSF 46 : 23 0.710 47 : 22 0.698 47 : 22 0.707 55 : 14 0. FHIT 22 : 20 0.051 25 : 17 0.100 23 : 19 0.073 32 : 10 0. SFRP 29 : 24 0.061 33 : 20 0.119 29 : 24 37 : CDH1 0.024 0. Таблица 2. Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в парных клинических группах (указаны абсолютные частоты нарушений в каждой из групп). S – стадии заболевания, G – степень дифференцировки первичной опухоли, Т – размер первичной опухоли по TNM-классификации, М – метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп). РS, РG, РТ, РM, – вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп.
Несмотря на то, что у большинства пациентов РП выявляют на стадии локализованного опухолевого процесса, в случаев заболевание 20% характеризуется как местнораспространенное. Основной метод лечения локализованного РП хирургический, который может дополняться – адьювантной неспецифической иммунотерапией препаратами ИЛ-2 и ИФН- в случае местнораспространенного СРП с учетом соматического статуса пациента, в связи с чем особенно актуальным вопросом является оценка прогрессии первичной опухоли [Wood C.G., 2007]. Можно предположить, что исследование ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT, и метилирования гена CDH1 может быть использовано вместе с другими необходимыми тестами при назначении адьювантной иммунотерапии после удаления первичной опухоли при местнораспространенном СРП.
В настоящее время анализ метилирования становится особенно актуальным в связи с поиском маркеров РП, выявляемых в биологических жидкостях пациента. Фрагменты ДНК опухолевых клеток попадают в кровоток, и аберрантное метилирование, специфичное для опухоли, может быть выявлено с помощью ПЦР в плазме (сыворотке) крови. Также описаны успешные примеры обнаружения аберрантного метилирования генов-супрессоров в моче пациентов. Однако применяемые методологические подходы нуждаются в повышении диагностической и аналитической чувствительности, а панели тестируемых генов – в пополнении новыми генами-кандидатами. Частота аберрантного метилирования исследованных в настоящей работе генов вариьровала от 14.2 до 54.3%. Метилирование как минимум одного из исследованных генов обнаружено в образцов. При 85.0% (108/127) объединении генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1, изученных в настоящей работе, с такими генами как CDKN2A, RARB2, PTGS2, CTNNB1, представляется возможным сформировать систему маркеров метилирования с чувствительностью более Это будет способствовать развитию 95%.
неинвазивной высокоинформативной диагностики РП.
Метилирование гена HOXB13 при спорадическом раке почки Среди новых генов-супрессоров, которые могут быть метилированы при РП, привлекает внимание ген HOXB13, участвующий в развитии и дифференцировке органов мочеполовой системы [Okuda H., 2006]. В настоящей работе проведено бисульфитное секвенирование промотора гена HOXB13 в образцах СРП и соответствующих им образцах гистологически не измененной ткани (рис. 4).
Показано, что в опухолях подвергаются аберрантному гиперметилированию цитозины в составе CpG-динуклеотидов, преимущественно, в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG. Можно предположить, что анализ этих четырех CpG-динуклеотидов позволит достоверно оценивать метилирование промотора HOXB13 в опухолях почки.
Рисунок 4. Бисульфитное секвенирование промотора гена HOXB13 (N – позиции аберрантно метилированных цитозинов, указаны стрелками).
Анализ полиморфных вариантов генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR Предрасположенность к РП может быть обусловлена аллельными вариантами ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, метаболизме ксенобиотиков и противоопухолевом иммунитете. Для настоящего исследования предрасположенности к РП были выбраны SNP в четырех генах – ABCB1 (C3435T), TGFBR1 (int7G24A), IL10 (G-1082A) и VDR (Taq1).
Сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах контроля и больных РП, а также в различных клинических группах пациентов, в том числе, в многофакторном анализе. Полиморфизмы анализировали с помощью минисеквенирования (рис. 5).
Рисунок 5. Определение полиморфизмов в генах ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR методом минисеквенирования. Показаны три образца, позиции аллелей обозначены внизу. Генотипы ABCB1-TGFBR1-IL10-VDR: 1 (TC-GA-AG-TC), 2 (TC-GG-AG-CC), 3 (TC-GA-AA-TC).
В качестве популяционного контроля исследовали 151 образец ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови здоровых индивидуумов.
Выборка пациентов с РП составила 98 человек, исследовали ДНК, выделенную из участков нормальной почечной паренхимы. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1: 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А);
IL10: 51% (A/G), 32% (A/A) и 17% (G/G).
М- : М+ SI-II : SIII-IV G1-2 : G3- Генотип РS РG РM 59 : 39 66 : 32 83 : ABCB1-TC 27 : 23 36 : 14 43 : 0.360 0.338 0. Т: 0.999 Т: 0.768 Т: 0. ABCB1-TT 23 : 10 19 : 14 27 : С: 0.196 С: 0.174 С: 0. ABCB1-CC 9:6 11 : 4 13 : TGFBR1-GG 34 : 30 39 : 25 50 : 0.086 0.115 0. G: 0.999 G: 0.300 G: 0. TGFBR1-GA 23 : 7 23 : 7 29 : A: 0.055 A: 0.074 A: 0. TGFBR1-AA 2:2 4:0 4: IL10-AG 28 : 19 32 : 15 37 : 0.427 0.474 0. A: 0.317 A: 0.299 A: 0. IL10-AA 16 : 14 22 : 8 26 : G: 0.379 G: 0.487 G: 0. IL10-GG 15 : 6 12 : 9 20 : VDR-TT 22 : 15 24 : 13 30 : 0.945 0.537 0. VDR-TC 33 : 22 39 : 16 48 : Т: 0.999 Т: 0.389 Т: 0. С: 0.999 С: 0.825 С: 0. VDR-CC 4:2 3:3 5: Таблица 3. Полиморфные варианты генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR в различных клинических группах. Обозначения: S – стадии заболевания, G – степень дифференцировки первичной опухоли, М – метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп).
РS, РG, РM, – вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп, в ячейках сверху указана Р при сравнении частот генотипов, ниже – Р при сравнении частот встречаемости определенных аллелей.
Выявлены достоверные различия частот генотипов VDR при РП относительно контроля (Р = 0.025). В группе РП наблюдалась тенденция к увеличению частоты встречаемости аллеля Т и снижению – аллеля С (генотипа С/С – почти в 1.85 раза). Возможно, снижение частоты протективного аллеля С и/или генотипа С/С связано с предрасположенностью к развитию РП в исследуемой популяции. Недавно опубликованы данные, подтверждающие протективную роль аллеля С в популяциях центральной и восточной Европы при наличии фактора риска – онкологических заболеваний у родственников [Karami S., 2008]. Показано, что частота аллеля А гена TGFBR1 снижена у пациентов с регионарными и/или отдаленными метастазами Р = 0.012, OR = 0.804 (95% CI: 0.724-0.893). Достоверно уменьшена в группе больных с метастазами и частота встречаемости этого аллеля в составе гомо- и гетерозиготных носителей (табл. 3). Полученные результаты способствуют формированию системы прогностических маркеров для спорадического РП.
Настоящая работа представляет собой комплексное исследование инактивации гена VHL, ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53, аберрантного метилирования генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и HOXB13, а также полиморфизмов в генах ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR при РП. Проведен сравнительный анализ выявленных в первичных опухолях молекулярно генетических нарушений между группами пациентов, которые были сформированы в зависимости от стадии заболевания, наличия метастазов, степени дифференцировки первичной опухоли. Нарушения в гене VHL выявлены у 54% пациентов на I стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Следует отметить, что определение мутаций и метилирования VHL целесообразно использовать при оптимизации таргетной терапии у больных метастатическим СРП. Получены результаты, указывающие на возможность использования метилирования CDH1 и ПГ генов-супрессоров на 3р в качестве прогностических маркеров спорадического РП. Построена карта метилирования нового гена-супрессора HOXB13.
Выявлена ассоциация полиморфных вариантов VDR и TGFBR1 с развитием заболевания.
Поиск и характеристика молекулярно-генетических маркеров, выполненные в настоящем исследовании, вместе с изучением потенциальных иммуногистохимических и биохимических особенностей почечно-клеточных карцином, позволят сформировать систему диагностических и прогностических маркеров РП. На сегодняшний день, проведение молекулярно-генетических исследований, направленных на поиск маркеров злокачественных новообразований, представляет собой одну из приоритетных задач молекулярной медицины.
ВЫВОДЫ 1. Соматические мутации, потеря гетерозиготности и метилирование гена VHL выявлены у 54% пациентов на первой стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Впервые идентифицированы новые мутации VHL.
2. Аллельные делеции двух и более генов-супрессоров (VHL, RASSF1, FHIT), локализованных на коротком плече хромосомы 3, ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.036), что может отражать прогрессию первичной опухоли.
3. Аберрантное метилирование 5’-регуляторных областей гена VHL составляет 14%, RASSF1 – 53%, FHIT – 54%, SFRP1 – 33% и CDH1 – 42% случаев РП.
Метилирование хотя бы одного из исследованных генов происходит в 85% случаев рака почки. Метилирование CDH1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001). Метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047). Метилирование RASSF1 и CDH1 может служить в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях РП.
4. Построена карта метилирования CpG-островка гена HOXB13 при СРП.
Аберрантному метилированию, преимущественно, подвергаются цитозины в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG, что может быть использовано при определении частоты метилирования HOXB13 в опухолях почки.
5. Частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1 в норме составляют 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А);
IL10 – 51% (A/G), 32% (A/A) и 17% (G/G).
Частоты генотипов VDR при РП достоверно отличаются от контроля (Р = 0.025). У больных РП с метастазами уменьшена частота встречаемости аллеля А гена TGFBR1 (Р = 0.016).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе получены данные об инактивации гена VHL на различных стадиях рака почки, выявлены ассоциации множественных аллельных делеций генов-супрессоров в области 3р и метилирования генов RASSF1 и CDH1 с прогрессией первичной опухоли, причем аберрантное метилирование как минимум одного из исследованных генов наблюдалось в 85% случаев рака почки. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными из литературных источников позволили предложить практические рекомендации по использованию некоторых результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике:
Определение потери гетерозиготности генов VHL, RASSF1 и FHIT вместе с 1.
исследованием метилирования промоторной области CDH1 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием при оценке прогноза РП.
Исследование соматических мутаций и метилирования гена VHL как 2.
комбинированный молекулярно-генетический анализ рекомендуется осуществлять для оптимизации таргетной терапии СРП при использовании мультикиназных ингибиторов, связанных с патогенетическим путем инактивации VHL.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Д.С. Михайленко, М.В. Немцова. Молекулярно-генетические маркеры 1.
рака почки // Российский онкологический журнал. – 2007. – № 4. – С.48 51.
Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, О.Б. Карякин, М.Э.
2.
Еникеев, Ю.Г. Аляев, М.В. Немцова, Д.В. Залетаев. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки // Молекулярная биология. – 2008. – Т.42. – №1. – С.71-77.
Михайленко Д.С., Попов А.М., Курынин Р.В., Аляев Ю.Г., Завалишина 3.
Л.Э., Залетаев Д.В. Анализ молекулярно-генетических нарушений в генах VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при светлоклеточном раке почки // Медицинская генетика. – 2008. – № 4. – С. 9-14.
Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Пальцева 4.
Е.М., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Манохина И.К. Эпигенетические маркеры в диагностике онкозаболеваний // Молекулярная медицина. – 2008. – №4. – С.46-51.
Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Залетаев Д.В., Аляев Ю.Г.
5.
Молекулярные маркеры в диагностике и лечении рака почки // Молекулярная медицина. – 2008. – №4. – С.24-28.
М.В. Немцова, Д.С. Михайленко, Т.В. Кекеева, О.А. Кузнецова, С.В.
6.
Башкатов, Р.В. Курынин, А.М. Попов, О.П. Попова, П.В. Шегай, Ю.Ю.
Андреева, Б.Я. Алексеев, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, О.Б. Карякин, И.Г.
Русаков, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии // Молекулярная медицина. – 2007. – №3. – С.43-54.
Д.С. Михайленко, А.М. Попов, Р.В. Курынин, О.Б. Карякин, К.Н.
7.
Сафиуллин, Е.Ф. Лушников, С.Д. Фомин, Ю.Г. Аляев, В.А. Григорян, М.Э.
Еникеев, Д.В. Залетаев. Структурно-функциональные изменения генов супрессоров короткого плеча хромосомы при спорадическом светлоклеточном раке почки // Тезисы I-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, Россия. – 2006. – С.150.
Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов А.М., Еникеев М.Э., Григорян 8.
В.А., Аляев Ю.Г., Карякин О.Б., Залетаев Д.В. Изучение потерь гетерозиготности в областях локализаций генов VHL, RASSF1 и FHIT при светлоклеточном раке почки Сборник тезисов международной // конференции «Генетика в России и в мире», Москва, Россия. – 2006. – С.126.
Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, 9.
О.Б. Карякин, Л.Э. Завалишина, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Поиск молекулярно-генетических маркеров светлоклеточного рака почки // Тезисы II-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, Россия. – 2007. – С.133.
10. Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, О.Б. Карякин, Л.Э. Завалишина, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Молекулярно генетический анализ инактивации гена при спорадическом VHL светлоклеточном раке почки // Тезисы XI-го Российского онкологического конгресса, Москва, Россия. – 2007. – С.226.
11. Михайленко Д.С. Поиск молекулярно-генетических маркеров прогрессии светлоклеточного рака почки. Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2008. - №6. – С.297.
12. D. Mikhaylenko, R. Kurynin, A. Popov, O. Karyakin, M. Enikeev, Y. Alayev, M. Nemtsova, D. Zaletayev. Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer.
Abstract
of European Human Genetics Conference, Nice, France // European Journal of Human Genetics. – 2007. – Vol.15. – Suppl.1. – P.173.
13. D.S. Mikhaylenko, R.V. Kurynin, A.M. Popov, D.V. Zaletayev. Molecular genetic aberrations of the genes VHL, RASSF1, FHIT in patients with renal cancer. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine // Abstract book. – 2007. – P.177.
14. D.S. Mikhaylenko, A.M. Popov, R.V. Kurynin, D.V. Zaletayev. Analysis of the molecular-genetic alterations in the genes VHL, RASSF1, and FHIT in clear cell renal carcinomas. Abstract of European Human Genetics Conference, Barcelona, Spain // European Journal of Human Genetics. – 2008. – Vol. 16. – Suppl.2. – P.235.