Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода
На правах рукописи
ЗАХАРЕНКОВА Татьяна Сергеевна
Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения
в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода
03.01.05 – физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в группе биофизики Учреждения Российской академии сельскохозяйственных наук Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии, с. Большие Вяземы Московской области.
Научный руководитель:
доктор биологических наук Аверьянов Андрей Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович кандидат биологических наук Бабоша Александр Валентинович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт био химии им А.Н. Баха РАН
Защита состоится «22» февраля 2011 г. в 13 часов на заседании совета по защи те докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.Д. Тимирязева РАН по адресу:
127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.
Факс: (495) 977 8018, электронная почта: [email protected], [email protected] HTU TH HTU TH
С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Учреждения Российской ака демии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Автореферат разослан « 15 » января 2011 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук М.И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.U Антагонистические взаимодействия растения с воз U T T будителями болезней надземной части начинаются на его поверхности в инфекцион ной капле, то есть капле воды, содержащей инфекционное началоT. Эта стадия зараже T ния во многом определяет его дальнейшее течение и исход. Здесь микроорганизмы T вступают в разнообразные отношения между собой и с растением-хозяином, в том числе и в биохимические, в которых важную роль играют противостоящие друг другу активные формы кислорода (АФК) и антиоксиданты. Некоторые аспекты взаимодей T T T ствия в инфекционной капле, в том числе, связанные с этими веществами, заслужи вают более подробного изучения. T Это, например, влияние самой воды инфекционной капли на взаимоотношения растений с патогенами. Хорошо известно, что капельно-жидкая влага необходима для T заражения надземной части (Тарр, 1975). Однако не исключено, что растения при час том поверхностном увлажнении могут адаптироваться, становясь, напротив, более ус тойчивыми. В литературе есть лишь косвенные указания на такую возможность. Если устойчивость, индуцированная водой, действительно, существует, то представляет интерес ее механизм, в том числе, участие в нем АФК. T Противоинфекционная роль АФК опосредована, в частности, элиситорами, ин дуцирующими окислительный взрыв и другие защитные реакции. Возможна и проти воположная ситуация, когда АФК хозяина стимулируют выделение элиситоров пара зитом. Эта способность может быть проявлениемT болезнеустойчивости, поскольку T диффундирующие элиситоры, по-видимому, раньше, чем связанные, индуцируют за T щитные реакции (Метлицкий и др., 1973).T Ранее показано, что спорыT гриба Mag T naporthe griseaT, возбудителя пирикуляриоза риса, под действием экзогенной перекиси водорода выделяют вещества, индуцирующие противоинфекционные реакции каллу сов риса устойчивого сорта (Лапикова и др., 2000). Представляло интерес выяснить, происходит ли это с интактными растениями и как связано с их болезнеустойчиво стью. Кроме того, поскольку споры и сами образуют АФК (Aver’yanov et al., 2007), следовало выяснить, как это явление влияет на выделение споровых элиситоров.
Антиоксиданты патогенных микроорганизмов, снижая концентрацию АФК, T ослабляют АФК-зависимые защитные реакции растений и потому являются факто рами патогенности. Со своей стороны, растения способны ингибировать некоторые другие факторы патогенности, например, литические ферменты (Дьяков и др., 2001)T.
Не исключено, что такой антагонизм затрагивает и чужеродные антиоксиданты. Дей T ствительно, супероксиддисмутаза (СОД) после контакта с листьями риса перестает ослаблять супероксидзависимую фунгитоксичность их диффузата (Аверьянов, Лапи кова, 1989). Это явление следовало изучить подробнее.
Цель и задачи работы.U ЦельюT было выяснение роли АФКT, антиокислительных U T T T ферментов и элиситоров на ранней стадии взаимодействия растений и патогенных грибов, а именно в инфекционной капле в связи с болезнеустойчивостью. Задачи включали:T 1. Оценку влияния длительного поверхностного увлажнения листьев на ло кальную и системную болезнеустойчивость растений. Выяснение воз можного участия АФК в этом явлении;
2. Выяснение возможности выделения элиситоров из грибных спор под действием АФК, добавленных извне или образованных самими спорами;
3. Исследование возможного влияния растения на чужеродные антиокси T данты в связи с болезнеустойчивостью.
Научная новизна работы. Впервые описана болезнеустойчивость растений, U U двудольного (огурец) и однодольного (рис), индуцированная поверхностным увлаж нением их надземной части до заражения. В первом случае устойчивость проявлялась и локально, и системно, а во втором – только локально. На рисе возникновению ус тойчивости предшествовало и могло быть ее причиной увеличение образования су пероксидного радикала (ОB2- листьями.P) PB Обнаружена элиситорная активность экзометаболитов спор M. grisea, проявляв шаяся на интактных растениях риса устойчивого, но не восприимчивого сорта. Она была следствием образования АФК спорами и усиливалась в присутствии экзогенных АФК. Для элиситорной активности был необходим одновременный контакт листьев с низко- и высокомолекулярными экзометаболитами спор.
Описанная ранее (Аверьянов, Лапикова, 1989) потеря способности медь T T цинковой СОД после контакта с листьями риса детоксицировать ОB2- подтверждена на P PB том же и выявлена на других устойчивых сортах, а также в искусственной ОB2- - P PB генерирующей системе. Представлены данные, согласно которым экзогенный фер мент, а именно ион меди его активного центра, может индуцировать выделение лис том соответствующего ингибитора, и что этим ингибитором может быть салициловая кислота.
Практическая ценность работы.U Работа является фундаментальной, но ука U зывает возможные направления прикладных разработок. Так, при опрыскивании над земных частей растений следует учитывать, что вода, содержащаяся в агрохимиче ских препаратах, может повышать фоновую продукцию АФК растениями и этим вли ять на эффект действующего вещества, которое, в свою очередь, может влиять на эф фект воды.
Выявленная способность АФК вызывать выход грибных элиситоров может стать основой для поиска маркеров и индукторов устойчивости.
В качестве средств защиты растений, вероятно, могут применяться также экзо генные ингибиторы антиоксидантов патогена или вещества, активирующие синтез или выделение аналогичных ингибиторов растением.
Экспериментальные данные и теоретические обобщения диссертации могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов.
Апробация работы.U Материалы диссертации были представлены: на 15-м U FESPB (Federation of European Societies of Plant Biology) Конгрессе 17-21 июля 2006, Лион, Франция;
на Международном симпозиуме «Non-specific innate and acquired plant resistance», 31 августа – 3 сентября 2006, Будапешт, Венгрия;
на 15-м Interna tional Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifunmgal Compounds», 6 10 мая 2007, Фридрихрода, Германия;
на SFFR Plant Oxygen Group Meeting «ROS in Plants. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants», Гент, Бельгия, 12-14 сентября, 2007;
на 9ом International Congress of Plant Pathology, 24-29 августа, 2008;
на SFFR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009», 8-10 июля, 2009, Хельсинки, Финляндия;
на Всероссийском симпозиуме «Рас тение и стресс», 9-12 ноября 2010, Москва.
Публикации результатов исследований.U По материалам диссертации опуб U ликовано 11 печатных работ.
Работа была частью российско-американского проектаT № 2682рT «Прооксидант T T T ное/антиоксидантное состояние инфекционной капли в связи с болезнеустойчивостью растений» Международного научно-технического центра. Основные положения дис сертации изложены в квартальных и годовых отчетах по проекту и обсуждались с американским коллаборатором К. Дж. Бейкером (лаборатория молекулярной патоло гии растений, служба сельскохозяйственных исследований Департамент сельского хозяйства США, Белтсвилл, Мериленд, США).
Структура и объем работы.U Диссертация состоит из введения, обзора литера U T туры, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и ре зультатов исследований, выводов, заключения и списка литературы. Материал изло жен на 146 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 41 рисунок. Спи сок использованной литературы включает 188 работ, из которых 115 на английском языке.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ T Объекты исследований. Растения огурца (Cucumis sativus L.) восприимчивого T T сорта Феникс выращивали до стадии семядолей (7 дней) или первого настоящего лис та (14 дней). Растения риса восприимчивого сорта Sha-tiao-tsao и устойчивого Zenith T выращивали до стадии четырех полностью развернутых листьев (21-33 суток). Пер-T вичные каллусы риса сорта Zenith были выращены из зрелых семян риса (Belyanskaya, Shamina, 1993) на агаризованной среде Мурасиге-Скуга. Использовали первый пассаж (20-25 дней).
Возбудителя оливковой пятнистости огурца, гриб Cladosporium cucumerinumT T T Ell. et Arth. изолят C5, культивировали при 25С на картофельно-глюкозном агаре.
Для опытов брали 10-дневную культуру гриба. Возбудителя пирикуляриоза риса, T гриб Magnaporthe grisea (Hebert) Barr изолят H5-3 (раса 007), поддерживали при 28C на агаризованном морковном отваре c кусочками листьев риса восприимчивого сорта.
Для опытов брали 6-16 суточную культуру.
Споры смывали дистиллированной водой, промывали и концентрировали на мембранном фильтре 8 мкм (C. cucumerinum)T или центрифугированием 10 мин при T 8000 g (M. grisea).
Предобработка растений огурца водой, их инокуляция и оценка симпто мов болезни. Наносили 10 капель воды (по 10 мкл) на первый лист до появления ос тальных или по 5 капель на каждую семядолю до появления листьев или опрыскива ли все растение водой (0.5 мл). Обработанные растения помещали в увлажненный бокс на 24 ч. Затем заражали каплями суспензии C. cucumerinum (10P5 спор/мл) пер P T T вый лист (сразу или через 7 дней) или второй (через 7 дней) или третий (через T дней) листья. Зараженные растения оставляли на 24 ч в темноте при 18T°C в том же T T боксе.
Визуальные симптомы болезни оценивали через 5-11 дней после заражения.
Некоторые капли инокулюма не оставляли видимых симптомов, другие вызывали хлорозы – симптомы слабой восприимчивости или некрозы – сильной восприимчиво сти. Подсчитывали соотношение этих признаков.
Предобработка растений риса водой, их инокуляция и оценка симптомов болезни. Четвертые листья полностью интактных проростков фиксировали горизон тально в инокуляционных камерах (Лапикова и др., 1995). На верхнюю поверхность листьев наносили по 6 капель дистиллированной воды (по 20 мкл) с помощью капле держателей (Аверьянов, Лапикова, 1989) и для локального увлажнения воздуха за крывали камеры крышками. В других случаях листья опрыскивали или погружали в пробирки с водой. Через 17-22 часа капли собирали каплесборником (Аверьянов, Ла пикова, 1989) или извлекали листья из пробирок, давали листьям высохнуть и зара жали их каплями суспензии (10P5 спор/мл) M. grisea, используя ту же технику. Затем P растения инкубировали 24 ч в темноте.
Визуальные симптомы оценивали (Latterell et al., 1965) через 7-13 дней после заражения. Симптомы совместимости – это большие (длиной 4 мм и более) желтова то-серые пятна, симптомы несовместимости – мелкие (до 2–3 мм) бурые точки или отсутствие симптомов. Подсчитывали соотношение этих признаков.
Получение диффузатов листьев риса и анализ в них супероксидного ради кала. Капли инокулюма или воду после инкубации на листьях собирали и центрифу гировали (17 000 g, 10 мин). Продукцию ОB2- оценивали по СОД-чувствительному P PB окислению экзогенного адреналина (Bors et. al., 1987). В лунки 384-ячеистой пласти ны вносили по 35 мкл диффузата, 5 мкл 20 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7.8) и мкл воды или 50 мкг/мл СОД. Реакцию начинали добавлением 5 мкл 1 мМ адренали на и оценивали при АB480 на спектрофотометре Biorad Benchmark Plus.
B Оценка фунгитоксичности диффузатов листьев риса. В лунки 96-луночной пластины вносили по 40 мкл воды или диффузатов листьев, 5 мкл воды и 5 мкл сус пензии (3.5 x 10P4 спор/мл) спор M. grisea. Пластину инкубировали 5 ч в темноте при P 23P о Затем споры фиксировали этанолом. Их прорастание считали под инвертиро PС.
ванным микроскопом в 4 повторностях по 100 спор.
Получение диффузатов спор M. grisea и предобработка ими растений риса.
Споры (10P5 спор/мл) инкубировали 5 ч в воде или 50 мкМ НB2О2 в темноте при 23Po P PC.
B B B Затем добавляли 20 мкг/мл каталазы для разрушения перекиси и еще через 1 час сус пензию центрифугировали (10 мин при 17000 g и 4Pо и кипятили супернатант для PC) инактивации каталазы. В других случаях споры проращивали в воде или в растворе 20 мкг/мл СОД или каталазы. Затем диффузаты спор центрифугировали, кипятили и помещали каплями на листья риса.
В ряде случаев диффузаты спор после кипячения разделяли центрифугирова нием (17000 g, 30 мин) в фильтрующих мембранных патронах с порами 3 кД.
Оценка прорастания спор C. cucumerinum и анализ ОB2- в их диффузатах. P PB Споры C. cucumerinum в разных концентрациях (5 10P3 10P4 10P5 5 10P5 спор/мл) P, P, Pили P 20 ч проращивали в 96-луночных пластинах (по 100 мкл суспензии в лунке) при или 25С. Часть спор фиксировали этанолом и считали их прорастание.
Образование ОB2- в диффузатах спор анализировали по окислению экзогенного P PB адреналина, чувствительному к СОД, как описано выше.
Оценка влияния листьев риса на способность экзогенных антиоксидантов ослаблять фунгитоксичность диффузатов листьев. На листья наносили в смеси с суспензией спор (10P5 спор/мл) M. grisea различные растворы: 50 мкг/мл CuZn-СОД, P Fe-СОД, Mn-СОД или БСА или по 3.2 мкМ CuClB2, ZnClB2 или MnSOB4, или 1 мМ тайро B B B на, или 10 мМ маннита, или 30 мМ 1,3-диметил-2-тиомочевины. В полученные таким образом диффузаты перед анализом их фунгитоксичности добавляли (или нет) вто рую порцию вышеназванных веществ в тех же концентрациях.
Оценка влияния листьев риса на способность экзогенной СОД ослаблять фунгитоксичность ОB2- -генерирующей системы. Модельную фотохимическую сис P PB тему рибофлавин-метионин (Аверьянов и др., 2000) добавляли в лунки 96-ячеистой пластины вместе со спорами (3.5 x 10P4 спор/мл) M. grisea. Туда же добавляли (или P нет) свежерастворенную или проинкубированную на листьях СОД. Пластины осве щали 0.5 ч при 4-5 клк, затем выдерживали 4.5 ч в темноте и фиксировали споры.
Оценка химической активности СОД. Измеряли активность фермента по торможению восстановления нитросинего тетразолия (NBT) в ксантиноксидазной системе (Beauchamp, Fridovich, 1971) при АB560 на спектрофотометре Biorad Benchmark B Plus.
Получение диффузатов каллусов риса и оценка их фунгитоксичности. В пластмассовые чашки Петри помещали 100 мг каллусов риса и 2 мл суспензии спор M. grisea (10P5 спор/мл), содержащей (или нет) 50 мкг/мл CuZn-СОД или воды. Через P 8 ч жидкую фазу центрифугировали и добавляли в нее СОД в той же концентрации или воду и оценивали фунгитоксичность.
Статистическая обработка данных. Вычисляли средние значения для всех повторностей одного или нескольких опытов, а также стандартное отклонение (SD) (рис.3, 4, 5, 6, 9 и табл. 1, 3, 4), или стандартную ошибку (SE) (рис.1 и табл. 2), или доверительный интервал. Последний считали по критерию Стьюдента для вероятно сти 0.99 (P=0.01) (рис.8). Звездочками на рис.1 отмечены значения, достоверно отли T T T чающиеся от необработанного контроля при 0.95 (P=0.05)T. T T РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ T 1. Влияние длительного увлажнения листьев огурца на его устойчивость U к оливковой пятнистости U Если капли воды инкубировали одни сутки на первом настоящем листе, а затем T его заражалиT, то болезнь проявлялась слабее, чем в неувлажненном варианте (рис. T 1а)T. Это же наблюдалось, если заражали второй (рис. 1б) или третий лист (соответст T венно, через 7 или 12 дней после обработки первого листа водой) или же обрабаты вали семядоли, а заражали первый лист.T * а б без обработки без обработки Исход заражения (%) Исход заражения (%) 60 капли воды капли воды 50 40 * 30 * без симптомов хлорозы некрозы без симптомов хлорозы некрозы Тип симптомов Тип симптомов Рис.1. Влияние 24-часовой инкубации капель воды на первом листе огурца воспри T имчивого сорта на симптомы последующего заражения того же (а) или второго листа (б) оливковой пятнистостью. T Следовательно, предобработка водой способствовала как локальной, так и сис T темной болезнеустойчивости, которая развивалась во вновь образованном листе. Ин тересно было выяснить, наблюдается ли это явление в других патосистемах.
2. Влияние предобработки водой на визуальные симптомы U пирикуляриоза риса U Инкубация крупных капель воды на четвертом листе риса до его заражения ос лабляла тяжесть болезни (рис. 2). Эффективно было также опрыскивание листа и вы падение на нем конденсата из влажного воздуха, но не погружение листа в пробирку с водой.
необработанные капли воды опрыскивание конденсат погружение в пробирку погружение T Рис. 2. Влияние разных спосо T бов поверхностного увлажне ния листьев риса восприимчи вого сорта на симптомы их по следующего заражения пири куляриозом.
Следовательно, поверхностное увлажнение листа риса, но только небольшим объемом воды, вызывало локальную устойчивость к пирикуляриозу. Мы предполага ем, что вода при длительном контакте освобождает из клеточных стенок раститель ные элиситоры, индуцирующие в таком состоянии защитные реакции. Возможно, что элиситоры из погруженного листа не были эффективны из-за их чрезмерного разбав ления. Предобработка водой не вызывала системной болезнеустойчивости риса.
Таким образом, поверхностное увлажнение надземной части индуцировало ло кальную болезнеустойчивость как однодольного, так и двудольного растения, и сис темную – двудольного. Мы попытались выявить возможное участие АФК в механиз ме этой устойчивости.
3. Влияние предобработки водой на образование супероксидного радикала U в диффузатах листьев риса и их фунгитоксичность Предобработка водой стимулировала окисление экзогенного адреналина в диффузате незараженных листьев восприимчивого сорта по сравнению с необрабо танным контролем (рис. 3). Реакция подавлялась экзогенной СОД, свидетельствуя об образовании ОB2- У устойчивого сорта предобработка водой увеличивала этот показа P.
PB тель только в диффузатах зараженных листьев.
T Рис. 3. Генерация су 0, пероксидного радика 0, ла (по окислению эк обработанный водой 0,1 зогенного адреналина) в диффузатах незара 0, A необработанный водой женных листьев риса 0, восприимчивого сорта, обработанный водой + СОД 0,04 необработанных и об необработанный водой + СОД работанных водой.
0, 0 10 20 30 40 50 Время, мин Предобработка листьев водой не увеличивала токсичности их диффузатов для спор возбудителя. Следовательно, если АФК участвуют в индуцированной водой бо лезнеустойчивости, то, вероятно, как сигнальные молекулы, а не токсиканты.
Итак, длительный поверхностный контакт листьев риса с водой увеличивает фоновую продукцию OB2- в инфекционной капле, что предшествует возникновению P PB болезнеустойчивости и, возможно, является ее причиной. Различные реакции воспри имчивого и устойчивого сортов, вероятно, связаны с их чувствительностью к собст венным и грибным элиситорам. Интересно было выяснить, может ли повышенный уровень АФК вызывать выход элиситоров из спор.
4. Визуальные эффекты обработки листьев риса диффузатами грибных спор U Чтобы выявить возможное элиситорное действие споровых диффузатов на ин тактные растения, споры проращивали в воде или 50 мкМ НB2О2, которая, как выясне B B B но, не ингибировала прорастания. Действительно, в обоих случаях диффузаты вызы вали мелкие некротические пятна (признак устойчивости) на листьях устойчивого, но не восприимчивого сорта риса. Если обработанные листья заражали, то на устойчи вом сорте симптомов не было, как и без обработки. На восприимчивом сорте диффу заты спор достоверно не изменяли тяжесть болезни по сравнению с обработанными водой. Следовательно, если элиситорные свойства споровых диффузатов четко про являлись, то только на устойчивом сорте.
5. Влияние диффузатов спор на образование супероксидного радикала U в диффузатах листьев риса U Мы попытались выявить еще одну защитную реакцию – генерацию OB2- Резуль- P.
PB таты согласуются с полученными ранее. Инкубация на листьях диффузата спор, про росших в воде, стимулировала окисление адреналина на устойчивом (R), но не вос приимчивом (S) сорте (рис. 4).
Рис. 4. Генерация OB2- (по окисле 0,04 P PB нию экзогенного адреналина) в T диффузатах незараженных листьев 0,03 риса разных сортов после нанесе ния на них воды (1-Zenith, 2 Shatiaotsao) или диффузатов спор, 0, A 4 проросших в воде (3-Zenith (R), 4 Shatiaotsao (S))T или в 50 мкМ НB2О 0,01 B B B (T5-Zenith (R), 6-Shatiaotsao (S))T. От рицательные величины означают 0 окисление в диффузате, более мед ленное, чем в воде.
Если споры прорастали в НB2О2, то окисление было еще сильнее. Во всех случа -0,01 B B B ях эта реакция значительно подавлялась 0 10 20 30 40 50 60 экзогенной СОД, что свидетельствует об об разовании OB2- в диффузатах.
Время,мин P PB Полученные факты подтверждают предположение, что экзогенные АФК, в том числе образованные растением, могут стимулировать выделение грибных элиситоров, которые индуцируют защитные реакции в несовместимой комбинации.
6. Изучение природы предполагаемого элиситора U Очевидно, что это вещество термостабильно, так как процедура его получения включает кипячение. Поэтому, возможно, что оно низкомолекулярно.
Действительно, удаление низкомолекулярных (менее 3 кД) компонентов лиша ло диффузат активности (рис. 5). Однако взятая отдельно низкомолекулярная фрак ция тоже не стимулировала генерации OB2- листьями или стимулировала существенно P PB слабее, чем неразделенный диффузат. Если же фракции смешивали, элиситорная ак тивность восстанавливалась полностью. Следовательно, она не была потеряна при разделении, а требовала одновременного присутствия и крупных, и мелких молекул.
0,07 Рис. 5. Генерация ОB2- (по P T T PB окислению экзогенного смесь фракций адреналина)T в диффузатах 0, неразделенный диффузат незараженных листьев A риса устойчивого сорта 0,03 высокомолекулярная фракция Zenith после нанесения на них воды или диффузата низкомолекулярная фракция 0, спор, проросших в мкМ Н2О2, неразделенно вода T B B B B -0,01 0 10 20 30 40 50 60 го или разделенного на фракции.
Время, мин 7. Оценка влияния эндогенных АФК прорастающих спор U на их элиситорную активность U Ранее была обнаружена генерация АФК спорами M. grisea (Aver’yanov et. al., 2007). Поэтому возможно, что споры выделяют элиситоры под действием собствен ных АФК. Для проверки споры проращивали не в НB2О2, а в воде или в растворах ка B B B талазы или СОД. Обнаружено, что диффузаты спор, проросших в растворах антиок сидантов, не стимулировали окисления адреналина листьями устойчивого сорта (рис.
6). Очевидно, это происходило из-за подавления генерации спорами OB2- или НB2О2. Та- P PB B B B ким образом, прорастающие споры способны выделять элиситоры под действием не только экзогенных, но и собственных АФК.
0, Рис. 6. Генерация ОB2- (по диффузаты спор в воде P T T PB окислению экзогенного ад 0, реналина)T в диффузатах не вода зараженных листьев риса ус 0, A тойчивого сорта Zenith, по диффузаты спор в каталазе сле нанесения на них воды 0, или диффузата спор, про диффузаты спор в СОД росших в воде, или растворе 0,01 T 20 мкг/мл каталазы, или рас -0,01 0 10 20 30 40 50 60 творе 20 мкг/мл СОД.
Время, мин Известно, что эндогенные АФК ингибируют прорастание спор M. grisea в не благоприятных условиях, в частности в слишком плотной или, напротив, в слишком разбавленной суспензии (Аверьянов, Лапикова, 1990). Мы получили аналогичные данные с тем же грибом (табл. 1) и с C. cucumerinum. В последнем случае в суспензи ях экстремальных концентраций споры не только хуже прорастали и интенсивнее ге нерировали радикал ОB2- (рис. 7), но и вызывали гораздо более слабые симптомы на P PB листьях (табл.2), чем при оптимальной концентрации.
Таблица 1.
Прорастание спор M. grisea в суспензиях разной концентрации.
Влияние 20 мкг/мл каталазы, добавленной в среду прорастания Прорастание спор, % Концентрация спор (спор/мл) без каталазы с каталазой 3 х 10P3 31 ± 3 76 ± P 10P 70 ± 4 77 ± P 3 х 10P 31 ± 2 69 ± P Возможно, что при неблагоприятных для прорастания концентрациях спор за ражению препятствует не только их плохое развитие, но и выделяемые ими элисито ры.
Итак, АФК могут стимулировать выход элиситоров из спор патогена, что, ве роятно, является еще одной защитной реакцией растения. Очевидно, что антиокси данты, подавляющие любые АФК-зависимые защитные реакции, являются фактора ми восприимчивости. Не исключено, что устойчивый хозяин подавляет антиоксидан ты паразита. Для проверки такой возможности изучали взаимодействие листьев риса с чужеродными антиоксидантами.
Рис. 7. Взаимосвязь между прорастанием спор C. cucu 18o/ 1400 merinum и генерацией супер оксидного радикала в их 1200 o 18 /5 x диффузатах. Температура A480 х o (P / концентрация (спор/ 25o/5 x PC) 800 мл) указаны около каждой 25o/5 x 103 18o/ точки.
600 o 18 /5 x 400 25o/ 25o/ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Прорастание спор (%) Таблица 2.
Зависимость визуальных симптомов оливковой пятнистости на листьях огурца от концентрации инокулюма C. cucumerinum Частота симптомов (%) Концентрация указанного типа спор (спор/мл) без хлороз некроз симптомов 10P4 48 ± 11 52 ± 11 0± P 10P5 3±2 39 ± 6 58 ± P 510P5 46 ± 14 54 ± 14 0± P 8. Фунгитоксичность диффузатов листьев риса и влияние СОД на это свойство U в зависимости от ее контакта с листьями U Участие ОB2- в механизме фунгитоксичности листьев риса многократно под P PB тверждено ее устранением при добавлении бычьей CuZn-СОД в диффузат. Если же фермент был добавлен в инокулюм (и контактировал с листом), то он не ослаблял фунгитоксичности диффузатов. Более того, вторая порция СОД, добавленная в диф фузат, тоже была неэффективна, несмотря на удвоение концентрации. Эти данные, ранее полученные на отрезках листьев (Аверьянов, Лапикова, 1989), подтверждены на интактных растениях нескольких сортов с той же концентрацией фермента (рис. 8).
Ингибирование прорастания спор (%) Рис. 8. Влияние 50 мкг/мл Добавки в диффузат:
CuZn-СОД, добавленной в 70 без добавок инокулюм и/или диффузат за СОД раженных листьев риса устой чивого сорта, на токсичность их диффузатов для спор M.
grisea. Для контроля в иноку люм добавляли 50 мкг/мл БСА или СОД, инактивированную кипячением.
без добавок СОД кипяченая БСА СОД Добавки в инокулюм Судя по анализу белка, концентрация СОД после контакта с листьями снижа лась, но недостаточно для ослабления ее детоксицирующих свойств. Тем более, это не объясняет неэффективности второй порции. Очевидно, уменьшалась удельная ак тивность СОД. Этого, однако, не удалось показать химическим методом (в системе ксантиноксидаза – NBT). Мы предполагаем, что СОД все же инактивировалась в диффузатах, но ревосстанавливалась в химической тест-системе. Антитоксическая активность СОД, которая проявлялась в диффузатах и терялась при контакте с листь ями, была направлена именно против ОB2- что подтверждается в искусственной ОB2- P, P PB PB генерирующей системе (табл.3).
Таблица 3.
Влияние СОД, проинкубированной на нейтральной поверхности или на незараженных листьях риса устойчивого сорта, на токсичность рибофлавин-метиониновой системы для спор M. grisea Ингибирование Добавки в систему прорастания спор (%) Без добавок 50 ± 50 мкг/мл CuZn-СОД, проинкубированная на пластике 11 ± То же, проинкубированная на листьях 51 ± Чтобы проверить, характерно ли обнаруженное явление для других суперок сиддисмутаз, помимо CuZn-СОД испытали Fe-СОД и Mn-СОД из E.coli. Бактериаль ные СОД, добавленные в инокулюм, не теряли своих детоксицирующих свойств. Но они были неэффективны в диффузате листа, контактировавшего с CuZn-СОД.
Низкомолекулярные антиоксиданты (тайрон, маннит и диметилтиомочевина), испытанные по той же схеме, не теряли защитных свойств.
По-видимому, CuZn-СОД (но не другие СОД), соприкасаясь с листьями, инду цировала выход ингибитора, действующего и на нее, и на фермент, добавленный за тем в диффузат. При этом Fe-СОД и Mn-СОД, но не низкомолекулярные антиокси данты были чувствительны к этому ингибитору.
9. Свойства молекулы СОД, индуцирующие выход U предполагаемого ингибитора U Мы попытались выяснить, какая часть молекулы CuZn-СОД индуцирует выход ингибитора. Установлено, что если на листья наносили бычий сывороточный альбу мин, Fe-СОД или Mn-СОД в той же концентрации (рис. 8), то они не влияли на де токсицирующие свойства CuZn-СОД, добавленной затем в диффузат. Однако кипяче ная CuZn-СОД и хлорид меди (в эквивалентной концентрации), но не цинка индуци ровали потерю защитных свойств СОД (табл. 4). Следовательно, выход предполагае мого ингибитора был реакцией не на белок фермента, а на его активный центр, в ча стности, на ионы меди.
Таблица 4.
Влияние CuZn-СОД или солей металлов ее активного центра, добавленных в инокулюм, на способность СОД, добавленной в диффузат зараженных листьев риса устойчивого сорта, ослаблять его токсичность для спор M. grisea Ингибирование прорастания спор (%) Добавки в диффузат Добавки в инокулюм без добавок CuZn-СОД + + 7 55 Без добавок U U U U + + 5 45 50 мкг/мл CuZn-СОД U U U U + + 9 65 3.2 мкМ CuClB2 U U U U B + + 9 64 3.2 мкМ ZnClB2 U U U U B + + 9 52 3.2 мкМ CuClB2 + 3.2 мкМ ZnClB2 U U U U B B + 7 + 58 3.2 мк М MnSOB4 U U U U B 10. Изучение природы предполагаемого ингибитора U Известно, что каталаза (Chen et al., 1993), а также некоторые другие Fe- и Cu содержащие ферменты (Ruffer et al., 1995;
Чуб, 2007) ингибируются салициловой ки слотой (СК). В листьях риса ее содержится в несколько раз больше, чем в других рас тениях (Yang Y. et al., 2004;
Chen et al., 1997). Поэтому не исключено, что она может ингибировать и СОД.
Действительно, в диффузатах листьев, которые инокулировали без СОД, экзо генная СК (10 мкМ) значительно ослабляла защитные свойства фермента, добавлен ного в диффузат (рис.9). При этом СК в отдельности не влияла на токсичность диф фузата. Так же это вещество действовало на СОД в рибофлавин-метиониновой сис теме.
Добавки в диффузат:
без добавок Ингибирование прорастания спор (%) Рис. 9. Влияние CuZn-СОД, СОД добавленной в инокулюм СК и/или диффузат зараженных СОД + СК листьев риса устойчивого сорта, на токсичность диф фузата для спор M. grisea. Эффект 10 мкМ салициловой кислоты. T без добавок СОД Добавки в инокулюм Следует отметить, что химические методы не выявили инактивации СОД сали циловой кислотой, как и диффузатами листьев. Значит, СК и искомый ингибитор вели себя сходно.
Косвенное подтверждение участия СК в ингибировании фермента дают опыты, выполненные по той же схеме, но на каллусах риса. Известно, что клеточные культу ры риса содержат СК на несколько порядков меньше, чем его листья (Chen et al., 1997). Возможно, поэтому мы не обнаружили такой четкой потери защитных свойств СОД в диффузатах каллусов, но это происходило, если вместе с ней добавляли СК.
Таким образом, чужеродная СОД, по-видимому, вызывает выход ингибитора из листьев риса, и этим ингибитором может быть СК или родственное ей соединение.
Возможно, что аналогичные изменения на листьях могут происходить и с антиокис лительными ферментами патогена, снижая его жизнеспособность на хозяине. Обна руженный эффект, возможно, ограничивает применение СОД животного происхож дения как инструмента исследования растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе рассмотрены некоторые новые аспекты химических антагонистиче ских взаимодействий патогенного гриба и растения на ранней стадии заражения (рис.
10). Чтобы воспроизвести естественные условия, опыты проводили на полностью ин тактных растениях без применения раневой инокуляции и смачивателей.
Установлено, что во взаимодействиях хозяина и патогена помимо их экзомета болитов участвует вода инфекционной капли. Она, благоприятствуя развитию пато гена, одновременно может индуцировать болезнеустойчивость, предположительно, с участием АФК. Возможно, это связано с эндогенными элиситорами растений, осво бождаемыми водой.
Увеличение продукции АФК в инфекционной капле как растением, так и пато геном, по-видимому, способно активировать выход элиситоров из его спор, что сти мулирует образование АФК еще сильнее. Это, в свою очередь, приводит к подавле нию развития паразита активными формами кислорода и другим защитным реакциям.
При любом участии АФК в противоинфекционных реакциях растения анти окислители паразита, очевидно, являются факторами патогенности. Не исключено, что антагонизм со стороны растения выражается в ингибировании антиокислитель ных ферментов патогена, и это является одним из проявлений болезнеустойчивости.
Существенно, что вышеописанные процессы происходят на самой ранней ста дии болезни и могут быть критичны для ее дальнейшего развития.
Таким образом, антагонизм растения и патогена в инфекционной капле, осуществля ется, в частности, через взаимодействия АФК, элиситоров и антиоксидантов, а также, воз можно, и других веществ, влияющих на эти взаимодействия.
Рис.10. Проокислительные/ элиситоры антиокислительные взаи модействия растения и па тогена в инфекционной ка АФК пле.
антиоксиданты ингибитор ВЫВОДЫ 1. Однодневный поверхностный контакт листьев с небольшим объемом воды до заражения индуцирует локальную и системную устойчивость огурца к оливко вой пятнистости и локальную устойчивость риса к пирикуляриозу. Это может быть адаптацией к условиям повышенного увлажнения, благоприятным для инфекции.
2. У риса этой реакции предшествует и является возможной ее причиной увели чение продукции ОB2- листьями. Вероятно, оно является следствием вымывания P PB элиситоров из контактирующих с водой тканей растения.
3. Диффузат спор M. grisea стимулирует продукцию ОB2- и некротизацию листьев P PB устойчивого сорта риса. Этой элиситорной активности нет, если споры прорас тали в растворах СОД или каталазы. Нетоксичная концентрация НB2О2, напро B B B тив, стимулирует ее. В элиситорной активности диффузата спор участвуют как его высоко-, так и низкомолекулярные компоненты. Следовательно, собствен ные АФК прорастающих спор, а, возможно, и АФК хозяина способствуют вы ходу грибных элиситоров. Предполагается, что это один из механизмов несо вместимости.
4. Чужеродная CuZn-СОД теряет детоксицирующие свойства на листьях риса или в диффузатах таких листьев, ранее контактировавших с ферментом. Предпола гается, что растения выделяют ингибитор СОД и, возможно, других антиокис лительных ферментов патогена.
5. Салициловая кислота подавляет детоксицирующие свойства СОД в диффузатах листьев и каллусов риса. Не исключено, что она (или родственное соединение) является ингибитором СОД, выходящим из листьев. Индуктором его выхода могут быть ионы меди активного центра фермента.
6. Таким образом, антагонизм растения и патогена в инфекционной капле осуще ствляется, в частности, через взаимодействия АФК, элиситоров и антиоксидан тов, а также, возможно, и других веществ, влияющих на эти взаимодействия.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S.U, Gaivoron U skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov V.V., Baker J.C. (2006) Prooxi dant/antioxidant early interactions of rice plant with blast fungus. In: XV FESPB Congress. July 17-21. Lyon-France, Lyon, p. 141.
2. Aver’yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Romanova T.S.U, Gaivoron U skaya L.M., Abramova O.S., Baker J.C. (2006) ROS and antioxidants in the in fection droplet as related to rice blast resistance. In: Non-specific innate and acquired plant resistance. August 31- September 3, 2006. Budapest, Hungary, Budapest, p. 17.
3. Aver’yanov A.A., Romanova T.S.,U Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker J.C.
U (2007) Water droplets on rice leaves induce resistance to blast. In: 15Pth International P Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds. May 06-10, 2007. Friedrichroda – Germany», Friedrichroda, р. 122.
4. Aver’yanov A.A., Romanova T.S.U, Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivoron U skaya L.M., Baker C.J. (2007) Alien enzymatic antioxidants can lose their protec tive potential in contact with rice leaves. In: International Symposium “ROS in Plants. Signalling & Metabolism, Oxidative stress, Antioxidants”. September 12-14, 2007, Ghent, Belgium, Ghent, p.57.
5. Aver’yanov A.A., Romanova T.S.U, Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.
U (2008) How could water droplets on rice leaves reduce severity of rice blast infec tion? In: Modern Fungicides and Antifungal Compounds V., Dehne H.W., Deising H., Gisi U., Kuck K.H., Russell P.E., Lyr H. (eds.) Alton, UK: BCPC, р. 52.
6. Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S.U, Gaivoron U skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov Vl.V., Baker C.J. (2008) Early pro- / an tioxidative interplay between host and parasite. In: 9Pth International Congress of P Plant Pathology (ICPP 2008). August 24-29, 2008. Torino, Italy, Pisa: EDIZIONI ETS, S2.211-212.
7. Романова Т.С.U, Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер U К.Дж. (2009) Устойчивость риса к пирикуляриозу, вызванная поверхностным увлажнением листьев перед заражением. Физиология растений, 56, 431–436.
8. Romanova T.S.U, Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.
U (2009) Contact of blast spores to ROS and rice leaves to water may elicit ROS dependent plant defense responses. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Re active Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, 2009. Finland, Helsinki, p. 114.
9. Aver’yanov A.A., Romanova T.S.U, Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Abramova U O.S., Gaivoronskaya L.M., Baker C.J. (2009) Pro- and antioxidant activiting fun gal spores as related to plant disease resistance. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8-10, 2009. Finland, Helsinki, p. 97.
10. Захаренкова Т.С.U, Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер U К.Дж. (2010) Выделение элиситоров спорами возбудителя пирикуляриоза риса под влиянием активных форм кислорода. Физиология растений, 57, 615-619.
11. Захаренкова Т.С.U, Аверьянов А.А., Пасечник Т.Д., Лапикова В.П., Бейкер U К.Дж. (2010) Капли влаги на листьях как фактор устойчивости к инфекциям. В сб.: Всероссийский симпозиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС». 9-12 ноября, Москва, Москва, с 155-156.