Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных
На правах рукописи
ВОЛКОВА Наталья Александровна
ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ЭКСПРЕССИИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ
ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
03.00.23 – Биотехнология
03.00.13 – Физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
п. Дубровицы, Московская обл.
2008
1
Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения «Всероссийский научно исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук».
доктор сельскохозяйственных наук, Научные консультанты:
профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович;
доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна доктор биологических наук, профессор,
Официальные оппоненты:
Дьяконов Лев Петрович;
доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич;
доктор биологических наук, профессор, Фомичев Юрий Павлович Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.
Защита состоится 11 ноября 2008 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии».
Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ВНИИЖ, т/факс (4967) 65-11-
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИЖ.
Автореферат разослан «_» сентября 2008 года.
Ученый секретарь совета В.П. Губанова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Успехи в технологии получения рекомбинантных ДНК открыли возможность создания новых генотипов путем введения, удаления или изменения генома животного уже в первом поколении.
Значительный прогресс, достигнутый в этой области, связан, прежде всего, с разработкой новых более эффективных способов получения трансгенных организмов и созданием качественно новых генных конструкций, обеспечивающих более высокие уровни экспрессии трансгенов в организме животных [Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006]. Однако, несмотря на достигнутые успехи при получении трансгенных животных, все еще остается проблема, связанная с не прогнозируемостью физиологических последствий реализации внесённой генетической информации.
Данные последствия являются, с одной стороны, результатом изменений на уровне генотипа, обусловленных дестабилизацией генома трансгенных животных [Кленовицкий П.М. и др., 1999, Медведев С.Ю., 1992, Brem, 1993, Constantini et al., 1989, Gasaryan et al., 1987]. С другой стороны, нарушения в функционировании отдельных систем организма могут быть связаны с дополнительной экспрессией интегрированных рекомбинантных генов и проявляться на различных уровнях организации индивидуумов:
генетическом, цитологическом, тканевом, организменном [Nancarrow et al., 1991, Pursel et al., 1987, 1989, Эрнст Л.К. и др., 1993, Гольдман И.Л.и др., 1993, 1994]. И если влияние чужеродных генов на организм трансгенных животных достаточно полно изучено на макроуровне (организм в целом), то исследований на клеточном и тканевом уровнях (микроуровне) проводится мало. Хотя именно последнее в некоторых случаях может дать полный ответ на ряд вопросов, касающихся взаимодействия вырабатываемых в организме трансгенных животных рекомбинантных белков с собственными (эндогенными) белками организма и объяснить вызванные данным взаимодействием нарушения в нормальном развитии животного.
В связи с этим, для оценки влияния интеграции чужеродных генов на организм животных необходимо наряду с анализом генотипа проводить комплексные исследования трансгенных животных по фенотипическим признакам, затрагивая проявление экспрессии вырабатываемых рекомбинантных продуктов на уровне тканей и клеток.
Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных разных форм на различных уровнях организации индивидуумов: организменном, тканевом и клеточном.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать технологию получения соматических трансгенных сельскохозяйственных животных (коров, коз, свиней) посредством использования ретровирусных векторов.
2. Изучить молекулярные аспекты трансформации клеток молочной железы сельскохозяйственных животных при локальном трансгенезе и исследовать динамику синтеза рекомбинантных белков с молоком полученных соматических трансгенных животных.
3. Изучить наследование трансгенов в ряде поколений свиней, интегрировавших ген соматолиберина человека, и кроликов со встроенными генами кластера RCA и оценить влияние интеграции чужеродной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных животных.
4. Исследовать изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и тканей, динамики роста, показателей откормочной и мясной продуктивности у трансгенных свиней по сравнению с аналогами. Выполнить анализ корреляционных зависимостей в организме трансгенных и интактных свиней.
5. Исследовать экспрессию генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучить характер изменения фенотипа кроликов под влиянием трансгенеза.
6. Выполнить теоретическое и экспериментальное обоснование отдельных элементов технологии трансгенеза кур, направленное на повышение результативности создания трансгенной птицы.
7. Изучить характер интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в органах и тканях трансгенных кур.
8. Выполнить сравнительную оценку влияния интеграции и экспрессии рекомбинантных генов на фенотип и генотип трансгенных животных различных форм.
Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые исследованы механизмы создания соматических трансгенных животных (коров, коз, свиней) методом локального трансгенеза и изучены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток молочной железы in vivo. Выполнено исследование уровня синтеза рекомбинантных белков - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (ГКСФ) и эритропоэтина человека (ЭПО) в молоко полученных трансгенных животных в динамике и оценены изменения морфофункциональных характеристик ткани молочной железы опытных животных под воздействием экспрессии трансгенов.
Впервые выполнена комплексная оценка влияния интеграции и экспрессии трансгена на генотип и фенотип свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека в ряде генераций в сравнительном аспекте. Изучен характер изменения корреляционных связей в организме опытных животных.
Изучена возможность использования генных конструкций на основе искусственных хромосом дрожжей (YAC) для получения трансгенных кроликов, интегрировавших гены-ингибиторы комплемента кластера RCA, как моделей для ксенотрансплантации. Проведена оценка влияния интеграции больших фрагментов ДНК (700 тысяч пар оснований) на сохранение стабильности генома трансгенных животных. Исследована экспрессия генов кластера RCA в организме трансгенных кроликов и изучены особенности их фенотипа.
Оценена результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo с использованием ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность получения трансгенных кур. Исследован характер экспрессии репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.
На основании проведенных исследований дана оценка фенотипического эффекта экспрессии рекомбинантных белков в организме трансгенных животных разных форм.
Практическая значимость.
Разработана технология локального трансгенеза молочной железы сельскохозяйственных животных – коров, коз и свиней с целью создания соматических трансгенных животных – биореакторов. Установлены факторы, обуславливающие результативность генетической трансформации клеток вымени сельскохозяйственных животных in vivo. Получены соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и эритропоэтин (ЭПО) человека.
Изучены биологические и некоторые продуктивные особенности свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека, в сравнительном аспекте в ряде поколений. Выявлены изменения показателей биохимического статуса и морфофункциональных характеристик внутренних органов.
Установлено изменение характера корреляционных связей в организме трансгенных свиней.
Изучены биологические особенности кроликов, трансгенных по генам ингибиторам комплемента кластера RCA. Установлено, что интеграция больших фрагментов ДНК (длиной 700 тысяч п.о.) на основе YAC не оказывает существенного влияния на жизнеспособность трансгенных кроликов, что позволяет рассматривать этих животных в качестве функциональной модели для изучения проблем ксенотрансплантации.
Показана повышенная устойчивость клеток трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека, что указывает на потенциальную значимость генов-ингибиторов комплемента кластера RCA в разработке технологий клеточной терапии.
Усовершенствована технология получения трансгенных кур, основанная на использовании ретровирусных векторов. Разработан способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Установлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур.
Получена трансгенная птица с интеграцией и экспрессией репортерных генов lacZ и GFP (зеленый флюоресцирующий белок) в ряде внутренних органов:
сердце, печени, кишечнике, желудке, мышцах, репродуктивных органах.
Основные положения, выносимые на защиту.
• Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы животных и создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных – коров, коз и свиней.
• Тип генной конструкции и вектора, способ подготовки инъекционного препарата и стадия введения в организм животных как факторы, обуславливающие результативность локального трансгенеза молочной железы и создания соматических трансгенных животных продуцентов.
• Изменения биохимического статуса, морфофункциональных характеристик внутренних органов и некоторых продуктивных показателей у свиней, трансгенных по гену соматолиберина, разных генераций.
• Повышенная устойчивость различных типов клеток кроликов, трансгенных по генам-ингибиторам комплемента кластера RCA, к лизису сывороткой крови человека.
• Динамика уровня хромосомных нарушений у трансгенных животных – свиней и кроликов в ряде генераций.
• Усовершенствованная технология создания трансгенных кур и факторы, обуславливающие ее результативность.
• Сравнительный анализ проявления интеграции и экспрессии рекомбинантных генов в фенотипе трансгенных сельскохозяйственных животных различных форм.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях (Дубровицы, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006;
Быково, 2002;
Москва, 2004, 2005, 2006;
Бишкек, 2005;
Чимкент, 2005;
Боровск, 2006;
Санкт-Петербург, 2007).
По материалам диссертации опубликовано 45 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК – 12, книг – 1, методических рекомендаций – 2, патентов - 1.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 324 страницах, содержит 69 таблиц, 35 рисунков, 17 графиков, 10 схем. Библиографический список содержит 407 источников, в том числе 366 на иностранных языках.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа была выполнена в период с 2001 по 2008 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии»
(ГНУ ВНИИЖ), физиологическом дворе и экспериментальных хозяйствах ГНУ ВНИИЖ ОПХ «Дубровицы», ОНО э/х «Кленово-Чегодаево», а также агрофирме «Толмачево» Нижегородской области согласно схеме, представленной на рисунке 1.
ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ С ИЗМЕНЕННЫМИ ХОЗЯЙСТВЕННО- ДОНОРЫ ДЛЯ ПРОДУЦЕНТЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ПОЛЕЗНЫМИ ПРИЗНАКАМИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ Свиньи, трансгенные по гену Кролики, трансгенные по Соматические трансгенные коровы, Трансгенные соматолиберина (II, III, IV, VIII, генам кластера козы и свиноматки, продуцирующие с куры IX и X генерации) гистосовместимости RCA молоком ЭПО и Г-КСФ человека Разработка технологии Отработка ИФА Рост и развитие Анализ интеграции и Анализ экспрессии локального трансгенеза технологии наследования трансгена чужеродных генов молочной железы получения ИГХ животных трансгенных кур Мясная ПЦР продуктивность:
предубойная масса, Морфофункциональная Биохимический Цитогенетические убойный выход, Оптимизация отдельных характеристика органов и тканей статус исследования толщина шпика, элементов технологии масса внутреннего получения трансгенных жира и внутренних животных органов, % мяса, % окраска на общая анализ общий белок, сала, % костей, ДНК и РНК гистология кариотипа альбумины, метод и стадия выход отрубов глобулины, введения триглицериды, ретровирусных гипофиз, щитовидная железа, анализ фосфолипиды, векторов поджелудочная железа, активности холестерин, надпочечники, печень, желудок, Корреляционные ядрышковых глюкоза, Ca, P, кишечник, сердце, почки, зависимости в концентрация и способ организаторов Cl, Fe, Mg селезенка, мышечная ткань организме подготовки генных конструкций Рис.1. Схема исследований.
Объектом исследований служили различные трансгенные формы сельскохозяйственных животных:
1. Свиньи, трансгенные по гену соматолиберина (генная конструкция MT1-hGRF). Исследования проводили на свиньях II, III, IV, VIII, IX и X генераций. Животные II генерации были восстановлены посредством внутриутробного осеменения нетрансгенных маток глубоко замороженным семенем трансгенных хряков, хранившимся в криобанке более 10 лет [Багиров В.А., 2004]. Возобновление поколений трансгенных свиней позволило провести сравнительные исследования свиней генераций II – VIII, III – IX и IV – X.
2. Кролики, интегрировавшие гены-ингибиторы DAF и MCP кластера регуляторов активации комплемента (генная конструкция RCA-YAC размером 700 тыс. п.о.). При различных типах спаривания от двух трансгенных самцов первого поколения было получено и изучено три генерации трансгенных кроликов (n=71).
3. Куры, трансгенные по генам LacZ и GFP, полученные методом опосредованного ретровирусами переноса генов с использованной разработанной в ходе выполнения диссертационной работы технологии [Патент РФ, RU 2303068 C1, Волкова Н.А., 2006, 2007]. Для трансформации эмбрионов кур (n=780) использовали два ретровирусных вектора pBMN-lacZ и pLN-GFP, содержащих, соответственно, репортерные гены lacZ и GFP под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV). В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы и рекомбинантный вирусный препарат, представляющий собой среду культивирования клеток-упаковщиц [Новое в клонировании ДНК, 1989].
4. Соматические трансгенные коровы, козы и свиноматки, продуцирующие с молоком эритропоэтин (ЭПО) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) человека. Животные были получены методом локального трансгенеза молочной железы с использованием технологии, усовершенствованной в ходе выполнения диссертационной работы. Для трансгенеза были использованы векторные конструкции pLN-б, содержащая ген ЭПО человека (ген предоставлен д.б.н., профессором Рябых В.П., ВНИИФБиП, г. Боровск), и pLN-G-CSF, содержащая ген Г-КСФ человека. Конструкции были получены к.б.н.
Фоминым И.К., Институт цитологии и генетики НАН Беларуси. Введение ретровирусных векторов осуществляли на разных сроках беременности непосредственно в вымя коров (n=24), коз (n=13) и свиноматок (n=24).
Выделение ДНК из крови, спермы и ткани осуществляли с использованием солевого и перхлоратного методов [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Наличие генной конструкции в тканях и органах опытных животных определяли методом ПЦР по стандартной методике.
Для оценки экспрессии рекомбинантных белков в молоке и тканях опытных животных использовали методы иммуноферментного анализа и иммуногистохимии [Волкова Н.А., 2003;
Волкова Н.А. и др., 2004].
Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [Ромейс, 1953]. Для фиксации образцов органов и тканей использовали 10% раствор формалина и фиксатор Буэна (для эмбрионов). Срезы для гистологических препаратов готовили на ротационном микротоме (TermoShandon, Великобритания).
Получение и приготовление препаратов митотических хромосом трансгенных животных осуществляли согласно методике [Кленовицкий П.М.
и др., 2003]. Цитогенетический анализ полученных препаратов хромосом, а также микроскопирование гистопрепаратов осуществляли с помощью микроскопа «Opton», оборудованного цифровым фотоаппаратом, с использованием компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).
Динамику роста и развития трансгенных свиней оценивали путем проведения контрольного откорма с последующим убоем [Методические указания по изучению качества туш, мяса и подкожного жира убойных свиней, 1978]. Было проведено три сравнительных опыта на животных разных генераций: (1) II и VIII генераций, откорм с 30 до 120 кг, (2) III и IX генераций, откорм с 30 до 120 кг, (3) свиньи X генерации, откорм с 45 до кг.
Для оценки биохимического статуса трансгенных животных определяли концентрацию в сыворотке крови метаболитов белкового, углеводного, липидного и минерального обменов с использованием биохимического анализатора (ChemWell, США).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных методов [Меркурьева Е.А., 1991] с применением программного обеспечения MS Excel.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Получение и исследование соматических трансгенных животных - биореакторов 3.1.1. Трансформация клеток молочной железы животных в культуре in vitro С целью оценки тропности используемых генных конструкций были проведены эксперименты по трансформации первичной культуры клеток молочной железы коровы, козы и свиноматки рекомбинантными векторами in vitro. Проведенные исследования выявили различия в эффективности трансформации клеток-мишеней в зависимости от их видовой принадлежности, используемой генной конструкции и пакующей линии клеток. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при использовании вектора pLNб и пакующей линии клеток GP+envAm12: частота генетической трансформации достигала 2*10-3, что было в 2-9 раз выше по сравнению с использованием для этих целей ретровирусного вектора pLN-G-CSF и пакующей линии pg13. Данные, полученные в экспериментах in vitro, позволили прогнозировать более высокую экспрессию рекомбинантных белков в молоко коров, коз и свиней и при введении вектора pLNб в молочную железу опытных животных in vivo.
3.1.2. Создание соматических трансгенных животных и анализ факторов, влияющих на результативность локального трансгенеза клеток молочной железы животных in vivo В рамках выполнения диссертационной работы были выявлены и изучены факторы, влияющие на результативность переноса экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных in vivo.
Основываясь на полученных результатах, была выполнена оптимизация следующих элементов технологии локального трансгенеза клеток вымени животных: (1) метод введения рекомбинантных векторов в клетки-мишени, (2) способ подготовки конструкций для инъекций (клетки-упаковщицы, культуральная жидкость) и их концентрация, (3) стадия введения векторов в молочную железу животных и (4) тип пакующей линии клеток.
• Метод введения рекомбинантных векторов. Введение рекомбинатных векторов осуществляли внутривенно (n=2) и непосредственно в молочную железу (n=2) подопытных животных, в частности, свиноматок. Максимальная экспрессия рекомбинантного продукта (ЭПО) в молоко была установлена при введении векторов в молочную железу - 600 нг/мл (при средней концентрации за лактацию 153±52 нг/мл). При инъекции генных конструкций в кровяное русло содержание ЭПО в молоке свиноматок достигало лишь 70 нг/мл (при средней концентрации 11±4 нг/мл). Учитывая это, в своих дальнейших исследованиях введение векторов осуществляли непосредственно в молочную железу животных.
• Способ подготовки генных конструкций для инъекций и их концентрация. В качестве источника генных конструкций были использованы клетки-упаковщицы, предварительно блокированные митомицином С, и культуральная жидкость, содержащая рекомбинантные векторы. Препараты были введены в молочную железу коров (n=5) и свиноматок (n=6). Максимальный уровень экспрессии рекомбинантного ЭПО с молоком коров и свиноматок был установлен при введении клеток упаковщиц в концентрации, соответственно, 25-35 и 6-10 млн. клеток на долю вымени и достигал в среднем 200±39 нг/мл (при максимальной концентрации в молоке 450 нг/мл). При использовании в качестве источника генных конструкций культуральной жидкости содержание рекомбинантного продукта в молоке было на 40-66% ниже и варьировало от 24±3 до 71± нг/мл (при максимальной концентрации 150 нг/мл).
• Стадия введения векторов. Введение клеток-упаковщиц в молочную железу коров (n=10), коз (n=4) и свиноматок (n=7) осуществляли на разных сроках беременности. Максимальная экспрессия рекомбинантного продукта с молоком соматических трансгенных животных была установлена при введении генных конструкций во второй половине беременности: у коров – на 4-6-м месяцах стельности, свиноматок – на 3-м месяце супоростности, коз – на 4-5-м месяцах сукозности. Средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке коров, свиноматок и коз за лактацию достигала, соответственно, 147±28, 177±39 и 204±23 нг/мл при максимальной концентрации, соответственно, 800, 500 и 400 нг/мл. Данные иммуноферментного анализа были подтверждены результатами ДНК-анализа результативности генетической трансформации клеток молочной железы. Высокая эффективность трансформации секреторных клеток вымени отмечалась при введении генных конструкций в молочную железу во второй половине беременности: рекомбинантная ДНК диагностировалась в 57-73% проб соматических клеток, выделенных из молока.
• Тип пакующей линии клеток. Высокая результативность переноса рекомбинантной ДНК в секреторные клетки молочной железы опытных животных была установлена при использовании пакующей линии GP+envAm12. При введении векторов, помещенных в пакующую линию pg13, в молочную железу коров (n=4), коз (n=4) и свиноматок (n=4) уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком животных был ниже в 1,5- раза: средняя концентрация рекомбинантного ЭПО в молоке коз и свиноматок за лактацию достигала, соответственно, 92±28 и 137±32 нг/мл при максимальной концентрации 350 и 400 нг/мл, Г-КСФ – соответственно, 29±7 и 20±5 нг/мл при максимальной концентрации 100 и 65 нг/мл. У коров при использовании пакующей линии pg13 экспрессия рекомбинантных белков в молоко наблюдалась только первые три месяца лактации: среднее содержание ЭПО в молоке за данный период достигало 198±79 нг/мл, Г-КСФ - 25±9 нг/мл, максимальный уровень ЭПО - 1000 нг/мл, Г-КСФ – 150 нг/мл. В то же время при использовании клеточной линии GP+envAm рекомбинантный продукт с молоком опытных коров экспрессировался в течение всей лактации.
С целью апробации разработанной технологии локального трансгенеза было осуществлено введение векторов pLNб и pLN-G-CSF, содержащих, соответственно, гены ЭПО и Г-КСФ человека, в молочную железу коров (n=4), свиноматок (n=3) и коз (n=5) с учетом установленных ранее оптимальных факторов. В качестве источника генных конструкций использовали клетки-упаковщицы в концентрации 25-30 (для коров) и 6- (для коз и свиноматок) млн. клеток на долю вымени. Для упаковки рекомбинантных векторов использовали пакующую линию GP+envAm12.
Наличие ДНК генной конструкции в соматических клетках молока было установлено у всех подопытных животных. Следует отметить, что положительные сигналы наблюдались также в пробах молока, взятых из долей вымени, инъекцию клеток-упаковщиц в которые не осуществляли, что, возможно, связано с распространением генной конструкции в соседние доли вымени через кровь. Наличие ДНК генной конструкции pLNб было выявлено у коров - в 62-85%, у коз - в 43-85%, у свиноматок - в 62-66% исследованных проб, отобранных в различные периоды лактации. При введении вектора pLN-G-CSF данные показатели составили, соответственно, 34-58, 28-56 и 51 57%.
Экспрессия рекомбинантных белков в молоко была установлена у всех опытных животных и наблюдалась в течение всей лактации. Содержание рекомбинантного ЭПО в молоке свиноматок достигало 600 нг/мл, коров и коз – 400 нг/мл. Г-КСФ экспрессировался в количестве до 60, 200 и 125 нг/мл, соответственно (табл. 1).
Таблица Уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных животных Вид Рекомби- № Стадия Введено Уровень живот- нантный живот введения, клеток, млн. экспрессии, нг/мл ного белок ного мес.* на долю все M±m Макс вымени го коровы ЭПО 3180 4-6 25-30 115 138± ЭПО 3284 6,5 30 120 118± Г-КСФ 3204 4-6 25-30 115 34±10 Г-КСФ 3340 6,5 30 120 20±5 козы ЭПО 10 4 10 10 137± ЭПО 14 4,5 10 10 192± Г-КСФ 5 4 10 10 37± Г-КСФ 6 4 10 10 39± Г-КСФ 8 4,5 10 10 46± свиньи ЭПО 5183 3 6 12 185± ЭПО 3973 3 6 60 153± Г-КСФ 1397 3 10 100 25±7 Примечание: * месяц беременности.
Анализ уровня синтеза рекомбинантных белков в течение лактации показал, что периоды активного синтеза сменялись периодами, когда экспрессия рекомбинантных продуктов была низкая или вообще отсутствовала (рис. 3). При этом вне зависимости от используемой генной конструкции наибольшее число пиков активного синтеза белка отмечалось в первую треть лактации (табл. 2). Средняя концентрация ЭПО в молоке в первую треть лактации по сравнению со второй и последней третями лактации была выше, соответственно, в 1,2-1,9 и 1,7-2,6 раз. Аналогичная тенденция наблюдалась и при введении генной конструкции pLN-G-CSF:
среднее содержание Г-КСФ в молоке опытных животных в первую треть лактации достигало 34-58 нг/мл, что было на 11-88% выше уровня экспрессии во вторую и последнюю трети лактации. Данные ИФА были подтверждены иммуногистохимическими исследованиями: наличие рекомбинантного продукта в секреторных клетках молочной железы было установлено у всех исследованных животных (коров, коз и свиноматок).
Рис. 2 Динамика экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коз (верхний график) и коров (нижний график) в течение лактации.
Черным цветом показано изменение концентрации рекомбинантного ЭПО в молоке опытных животных, серым цветом – Г-КСФ.
Таблица Средние показатели уровня экспрессии рекомбинантных белков с молоком опытных животных в течение лактации, нг/мл (M±m) Вид Рекомбинан- Период лактации живот- тный белок первая треть вторая треть последняя треть ного Коровы ЭПО 134±9 72±13 77± Г-КСФ 34±5 30±7 11± Свиньи ЭПО 160±15 141±6 121± Козы ЭПО 222±30 197±25 84± Г-КСФ 7± 58±16 24± 3.1.3. Влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на организм опытных животных.
• Распространение ретровирусных векторов в организме опытных животных. Принимая во внимание выявленную у опытных животных неспецифическую экспрессию рекомбинантных продуктов в интактных долях вымени, нами было изучено распространение вводимых конструкций в организме животных после инъекций ретровирусных векторов в молочную железу и кровь. Проведенный ДНК-анализ показал наличие рекомбинантных последовательностей не только в молочной железе, но и в ряде других органов и тканей опытных животных. При этом характер локализации трансгенов и степень генетической трансформации зависели от метода введения векторов. При инъекции векторов в молочную железу наличие ДНК генной конструкции идентифицировалось так же в клетках надпочечников, поджелудочной, слюнной железах и спинном мозге. При введении генных конструкций в кровь рекомбинантная ДНК распространялась в большее число органов: почки, селезёнку, щитовидную и слюнную железы, головной мозг. Исследование образцов, отобранных из различных участков внутренних органов, показало очаговый характер интеграции рекомбинантной ДНК.
• Сравнительное исследование гистоструктуры вымени и других органов опытных животных. Изучение морфогистологических особенностей вымени опытных коров, коз и свиноматок, подвергшихся локальному трансгенезу молочной железы, не выявило значительных изменений в гистологической структуре органа-мишени. Различий в структуре молочной железы опытных и контрольных животных установлено не было. Гистологическое исследование других органов опытных животных так же не выявило каких-либо структурных изменений.
3.2. Изучение трансгенных животных с измененными хозяйственно полезными признаками Введение в геном сельскохозяйственных животных генов каскада гормона роста предполагает повышение интенсивности роста и улучшение качества животноводческой продукции. С целью проверки данной гипотезы были изучены особенности генотипа и фенотипа свиней, трансгенных по гену соматолиберина ранних (II, III и IV) и поздних (VIII, IX и X) генераций в сравнительном аспекте.
3.2.1. Анализ наследования генной конструкции соматолиберина человека в ряде генераций трансгенных свиней Наследование трансгена у свиней определялось типом спаривания и происхождением. При спаривании по типу «трансген» – «нетрансген» доля трансгенных животных в потомстве варьировала в среднем от 28,4 до 40,0%.
При спаривании трансгенных родителей данный показатель достигал 50,0 62,5%. Характер наследования генной конструкции у животных разных генераций существенно не различался.
Вместе с тем, было установлено индивидуальное влияние отдельных особей на степень наследования трансгена: так, методом анализирующего спаривания трансгенных хряков с нетрансгенными самками была установлена высокая степень наследования рекомбинантной ДНК в потомстве хряка №831 – 51% и, напротив, низкая степень наследования трансгена в потомстве хряка №046 - 10%.
3.2.2. Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных свиней Цитогенетический анализ трансгенных свиней не выявил отклонений в хромосомной формуле пола: кариотип у свиней всех исследованных генераций в большинстве клеток соответствовал видовой норме и содержал 38 хромосом. Однако в части клеток встречались различные хромосомные аберрации. Подавляющее число нарушений, обнаруженных у трансгенных свиней, было представлено разрывами хромосом (рис. 3а) и более сложными хромосомными перестройками, в основном, дицентриками (рис. 3б).
Наличие дицентрических хромосом было установлено у трансгенных свиней только II и III генераций в 2,4 и 2,6% случаев, соответственно. У животных II генерации в 3,6% исследованных клеток наблюдалась так же пульверизация хромосом (рис. 3в). У животных IV, VI, IX и Х генераций аберрации хромосом были представлены только разрывами.
а) б) в) Рис. 3. Хромосомные аберрации, выявленные у трансгенных по гену соматолиберина свиней: а) хроматидный разрыв в коротком плече хромосомы 1-й пары (показано стрелкой);
б) дицентрическая хромосома (показано стрелкой);
в) пульверизация хромосом.
Изучение стабильности кариотипов трансгенных свиней разных генераций выявило уменьшение доли аберрантных клеток с увеличением числа генераций. Высокий процент хромосомных аномалий был установлен у свиней II и III генераций - 38,8 и 24,0%, соответственно. У животных последующих генераций доля аберрантных клеток составляла лишь 4,8 13,0%. Количество аберраций в контроле варьировало от 3,1 до 4,0%.
Наряду с оценкой уровня спонтанной хромосомной изменчивости кариотипа трансгенных животных была изучена активность ядрышковых организаторов (ЯО). Проведенные исследования выявили достоверное увеличение числа активных ЯО (p0,001) у трансгенных животных: у трансгенных свиней данный показатель достигал 2,88±0,12, в то время как у их аналогов - только 2,00±0,07.
3.2.3. Особенности фенотипа трансгенных свиней Оценку фенотипа трансгенных животных проводили в разные периоды онтогенеза. Были изучены следующие показатели: уровень синтеза собственного гормона роста как одного из ключевых показателей, характеризующих экспрессию интегрированного гена соматолиберина в организме трансгенных свиней, показатели мясной и откормочной продуктивности, биохимический статус, гистоструктура внутренних органов и тканей.
• Гормональный статус. Трансгенные животные превосходили своих нетрансгенных сверстников по содержанию гормона роста в крови в среднем в 1,5-2 раза (табл. 3). При этом животные ранних генераций (II и III) характеризовались более высоким содержанием соматотропина в крови по сравнению с животными поздних генераций (VIII, IX и X).
Таблица Экспрессия гормона роста в организме трансгенных свиней и их нетрансгенных аналогов Генера- ИФА, нг/мл (Cv,%) ИГХ, усл.ед (Cv,%) ции опыт контроль опыт контроль II 6,20±1,11 (54) 3,31±0,44 (56) 106,7±5,1 (45) 98,3±2,9 (28) III 7,15±1,34 (56) 3,11±0,37 (51) 91,4±4,2 (44) 82,8±3,7 (42) VIII 4,60±1,10 (72) 3,31±0,44 (56) 100,5±4,7 (44) 98,3±2,9 (28) IX 6,16±1,12 (54) 3,11±0,37 (51) 99,3±4,2 (33) 82,8±3,7 (42) X 4,88±0,56 (44) 3,40±0,42 (43) 96,0±3,2 (41) 88,0±3,2 (35) Примечание: ИФА – иммуноферментный анализ, ИГХ – иммуногистохимия.
Данные, полученные методом иммуноферментного анализа, были подтверждены и иммуногистохимическими исследованиями: относительное содержание соматотропина в клетках гипофиза трансгенных животных было до 20% выше аналогичных показателей контрольных животных (табл. 3).
• Особенности роста и развития. Изучение динамики роста трансгенных свиней и их аналогов в различные периоды онтогенеза выявило тенденцию к увеличению скорости роста у трансгенных свиней в конце эмбриогенеза и в постнатальный период развития. Трансгенные животные практически во всех изучаемых возрастах превосходили своих нетрансгенных сверстников по живой массе и среднесуточному приросту:
максимальная разница между экспериментальными группами по данным показателям достигала, соответственно, 11,9 и 35,7%. При этом животные ранних генераций характеризовались повышенной скоростью роста по сравнению с животными последующих генераций (рис. 4).
Анализ результатов двух независимых опытов по контрольному откорму свиней генераций II, VIII (опыт №1) и III, IX (опыт №2) показал, что животные ранних генераций (II и III) превосходили животных более поздних генераций (VIII и IX) по живой массе и среднесуточному приросту в среднем на 1,8-12,4% и 3,0-14,5%, соответственно.
Рис. 4. Динамика роста трансгенных свиней разных генераций.
Генерации II, VIII (левый график) и III, IX (правый график).
Анализ весовых показателей внутренних органов показал, что трансгенные животные в ряде генераций превосходили своих аналогов по весу печени, желудка, кишечника, почек, матки, яичников, щитовидной железы и гипофиза. Причем преимущество трансгенных животных по массе органов желудочно-кишечного тракта и репродуктивных органов сохранялось во всех исследованных генерациях (различия до +65,2%).
• Мясная продуктивность и качество туш. Анализ морфологического состава и качества туш трансгенных и контрольных свиней выявил различия по длине туши, процентному содержанию мяса и сала, толщине шпика (табл.
4).
Таблица Морфологический состав и качество туш трансгенных свиней и их аналогов Группа Длина по- Выход Состав туши, % Толщина Опыт лутуши, см туши, % мясо сало кости шпика,см* 1 II генерация 97,3±3,6 66,4 54,0 34,3 11,9 3,81±0, VIII генерация 108,7±3,9 65,1 55,9 32,2 11,6 3,46±0, контроль 96,0±0,7 66,1 56,3 31,3 12,3 3,26±0, 2 III генерация 100,7±2,9 64,5 52,8 37,8 9,6 3,54±0, IX генерация 98,5±5,0 67,3 55,6 34,1 10,4 3,13±0, контроль 97,0±0,8 65,2 54,1 36,4 9,7 3,03±0, 3 Х генерация 107,4±0,8 72,9 52,4 37,2 10,3 4,55±0, контроль 111,0±1,5 73,5 51,1 39,2 9,7 4,56±0, Примечание: * - средняя толщина шпика по 4 точкам - на холке, над 6- грудными позвонками, на пояснице и на крестце.
При этом у трансгенных животных поздних генераций (IX и Х) по сравнению с контролем отмечалось увеличение процентного содержания мяса (+1,5%) и уменьшение доли сала (-1,9%) в туше. С увеличением числа генераций наблюдалось уменьшение толщины шпика у трансгенных животных. Если животные ранних генераций превосходили аналогов по данному показателю на 16,9%, то животные более поздних генераций - на 3,3-6,1%.
• Биохимический статус. Сравнительный анализ метаболического профиля трансгенных свиней и их аналогов выявил некоторые отличия в интенсивности протекания процессов метаболизма. Причем выявленные отличия наблюдались практически во всех изученных генерациях. Так, в возрасте 3,5-4,5 месяцев у трансгенных животных по сравнению с контролем отмечалось снижение в крови уровня общего белка на 1,5-8,2%. Липидный обмен характеризовался, преимущественно, повышением концентрации в крови триглицеридов (до +32,1%) и снижением уровня холестерина (до 13,8%).
При снятии с откорма в возрасте 8-9 месяцев у трансгенных животных, наоборот, наблюдалось повышение уровня общего белка в крови по сравнению с контролем до 13,9%. Углеводно-липидный обмен при этом характеризовался повышением в крови концентрации глюкозы (до +39,2%) и триглицеридов (до +31,5%). Снижение уровня холестерина в крови (на 6,4 8,1%) было установлено только у животных поздних генераций при откорме до 120 кг. Из метаболитов минерального обмена повторяющиеся в ряде генераций различия были установлены по уровню в крови магния и хлоридов: у трансгенных животных наблюдалось повышение в крови концентрации магния до 11,6% и снижение уровня хлоридов до 4,3%.
• Гистологические исследования внутренних органов. Анализ гистоструктуры внутренних органов и тканей трансгенных животных не выявил каких-либо изменений, связанных с воспалительными или патологическими процессами. Вместе с тем, были установлены некоторые морфометрические изменения в структуре большинства исследованных органов трансгенных свиней. В частности, увеличение по сравнению с контролем практически во всех исследованных поколениях толщины печеночных балок (до +22,7%, Р0,01), толщины железистого слоя донной части желудка (до +11,2%, Р0,01) и высоты ворсинок 12-перстной кишки (до +24,3%, Р0,05), что свидетельствует о более интенсивном темпе развития пищеварительных функций у трансгенных свиней. У трансгенных животных ранних генераций наблюдалось увеличение диаметра ацинусов поджелудочной железы и фолликулов щитовидной железы, соответственно, на 7,3 (Р0,05) и 6,5-19,1%, в более поздних генерациях трансгенные животные, наоборот, уступали своим аналогам по данном показателям, соответственно, на 6,4-8,8 (Р0,01) и 2,6-21,8% (Р0,001).
Значительные изменения были выявлены и в структуре органов сердечнососудистой и выделительной систем организма, а также в мышечной ткани. Однако данные различия варьировали в ряде поколений (табл. 5).
Практически во всех изученных генерациях трансгенных свиней было установлено увеличение размеров клеток большинства исследованных органов, что было связано, преимущественно, с увеличением цитоплазмы клеток. Изучение характера накопления нуклеиновых кислот в клетках таких органов выявило более высокое содержание РНК у трансгенных животных по сравнению с контролем (до +34,6%, Р0,001), что свидетельствует о более интенсивном синтезе белков в организме трансгенных животных.
Таблица Морфометрические показатели внутренних органов и тканей трансгенных свиней и их аналогов Группа Толщина, µ Диаметр Опыт фолликулов печеночных мышечных миоцитов щит. железы,µ балок волокон 1 II генерация 25,2±0,6 47,9±1,3 25,1±0,5 185±8, VIII генерация 21,9±0,6 48,9±1,5 24,8±0,6 197±8, контроль 26,7±0,7 52,4±1,5 24,6±0,7 176±7, 2 III генерация 20,7±0,2 69,6±2,0 22,5±0,3 188±9, IX генерация 25,4±0,6 68,6±1,8 23,2±0,5 224±16, контроль 24,9±0,6 55,6±1,2 20,9±0,5 183±12, 3 Х генерация 19,3±0,3 75,1±1,2 19,1±0,4 181±5, контроль 19,6±0,3 71,4±1,1 27,6±0,6 141±4, 3.2.4. Анализ корреляций в организме трансгенных свиней и их аналогов Анализ корреляционных зависимостей выявил изменение у трансгенных свиней характера связей по ряду признаков. В частности, было установлено изменение корреляций между уровнем соматотропина в крови и некоторыми показателями биохимического статуса и хозяйственно-полезными признаками. У трансгенных животных с увеличением числа генераций наблюдалась некоторая стабилизация значений коэффициента корреляции между уровнем соматотропина и показателями белкового обмена и их приближение к аналогичным показателям контрольной группы. Вместе с тем, между уровнем соматотропина и большинством показателей липидно минерального обмена аналогичная тенденция отмечалась только в раннем возрасте. В более позднем возрасте (8-9 месяцев) с увеличением числа генераций наблюдалось установление новых корреляционных зависимостей, связанных не только с изменением значения коэффициента корреляции, но и его знака. Изменение знака коэффициента корреляции между уровнем соматотропина и большинством хозяйственно-полезных признаков установлено при откорме свиней до 120 кг. При откорме до более тяжелых кондиций таких изменений в характере корреляций не наблюдалось. Однако была выявлена высокая корреляционная зависимость между уровнем соматотропина и рядом селекционных признаков (табл. 6).
Изучение характера корреляций между биохимическими показателями крови выявило стабилизацию у трансгенных животных с увеличением числа генераций корреляционных зависимостей между большинством биохимических показателей за исключением показателей липидного обмена.
Между показателями мясной и откормочной продуктивности у трансгенных животных наблюдалось установление корреляционных зависимостей иного характера (табл. 6).
Таблица Корреляционные связи в организме трансгенных свиней и их аналогов Признаки Коэффициент корреляции Откорм до 120 кг Откорм до 150 кг опыт контроль опыт контроль СТГ – с/сут. прирост -0,25 0,93 0,81 0, СТГ – выход мяса -0,42 0,61 0,89 0, СТГ- выход сала 0,06 -0,02 0,33 0, СТГ - вес внутреннего жира 0,44 0,83 -0,92 -0, с/сут. прирост – выход мяса 0,97 0,44 0,83 0, с/сут. прирост – выход сала -0,94 0,13 0,76 0, с/сут. прирост – масса костей 0,38 -0,36 0,73 -0, Мясо – сало -0,84 -0,30 -0,18 -0, Мясо - кости 0,43 -0,91 0,59 -0, Предубойная живая масса – -0,47 0,89 -0,60 0, вес внутреннего жира 3.3. Изучение трансгенных животных - доноров для ксенотрансплантации При создании трансгенных животных с целью их использования в клеточной терапии, а также как доноров для ксенотрансплантации в качестве перспективного подхода рассматривают введение в геном данных животных одновременно нескольких генов – ингибиторов комплемента человека.
Однако стандартные плазмидные, космидные или фаговые векторы в большинстве случаев не пригодны для этой цели вследствие их ограниченной емкости. В качестве альтернативы рассматриваются векторные системы на основе искусственных хромосом дрожжей - YAC. В этой связи, нами была изучена результативность использования вектора RCA-YAC для получения трансгенных кроликов с интегрированными генами ингибиторами комплемента MCP и DAF. Было исследовано влияние интеграции и экспрессии трансгенов на генотип и фенотип трансгенных кроликов.
3.3.1. Анализ наследования трансгена в ряде генераций.
Характер наследования генной конструкции RCA-YAC зависел от типа спаривания. При спаривании по типу «трансген» х «нетрансген» степень наследования трансгена оставалось практически одинаковой в течение всех исследованных генераций и составила от 31,7 до 36,7%. При спаривании кроликов по типу «трансген» х «трансген» доля трансгенных потомков возрастала с генерациями и составила во втором поколении - 50,0%, в третьем - 71,4%, в четвертом - 72,7%. Была выявлена зависимость характера наследования трансгена от происхождения животных. Анализирующим скрещиванием трансгенных самцов первой генерации с нетрансгенными самками был установлен более высокий процент трансгенного потомства у самца №025 – 40,9%. Доля трансгенных потомков, полученных от самца №074, была меньше на 11,3% и составила 29,6%.
3.3.2. Анализ экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных кроликов Экспрессию генной конструкции RCA-YAC оценивали посредством анализа устойчивости клеток органов и тканей трансгенных кроликов к лизису сывороткой крови человека. Цитотоксическое действие сыворотки крови человека на клетки изучали in vitro на полученных первичных культурах клеток органов трансгенных кроликов: сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез.
Инкубация культивируемых клеток тканей трансгенных и контрольных кроликов с сывороткой человека не выявила сильно выраженного лизирующего действия на клетки трансгенного происхождения в присутствии аллогенного (человеческого) комплемента. У трансгенных кроликов цитотоксическое действие сыворотки крови человека было установлено только в отношении клеток сердца: лизис клеток наблюдался в из 14 проведенных опытов. При инкубации сыворотки крови человека с клетками кишечника и почек, полученных от трансгенных животных, выраженного лизиса клеток не отмечалось.
Изучение цитотоксического действия сыворотки крови человека на культуру клеток сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез трансгенных и контрольных кроликов при их культивировании in vitro в среде, содержащей 10 и 50% сыворотки человека, показало устойчивость клеток трансгенного происхождения к иммуноглобулинам сыворотки крови человека. Выраженное цитотоксическое действие иммуноглобулинов сыворотки крови человека было установлено при культивировании клеток в среде с добавлением 50% сыворотки человека. Через несколько суток культивирования в контрольной культуре наблюдался лизис большей части клеток. В культуре клеток трансгенного происхождения на 3-4 сутки культивирования наблюдалось повышение пролиферации клеток в среднем на 16-22% по сравнению с контролем, что можно рассматривать как подтверждение устойчивости клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека.
3.3.3. Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение стабильности генома трансгенных кроликов Цитогенетические исследования трансгенных кроликов не выявили конституциональных нарушений кариотипа, а также отклонений в хромосомной формуле пола. Хромосомный набор всех обследованных животных соответствовал видовой норме и содержал 44 хромосомы. Вместе с тем, у трансгенных животных по сравнению с нетрансгенными сибсами и полусибсами был установлен более высокий уровень хромосомной изменчивости. Хромосомные аномалии были представлены, главным образом, хроматидными, изохроматидными пробелами и разрывами. Были установлены также множественные перестройки. Около 3% выявленных аберраций составляли дицентрики. Максимальный уровень хромосомной изменчивости был установлен у трансгенных кроликов второй генерации 13,9% (n=17). У особей третьей генерации число клеток с аберрациями было почти в 2 раза меньше и составило 6,4% (n=6). У нетрансгенных животных этот показатель оставался приблизительно на аналогичном уровне (4,9-5,1%), что позволяет предположить некоторую стабилизацию уровня хромосомной изменчивости у трансгенных особей с увеличением числа генераций.
3.3.4. Особенности фенотипа трансгенных кроликов • Биохимический статус. Биохимический анализ параметров крови трансгенных и нетрансгенных кроликов не выявил значительных различий в интенсивности протекания процессов метаболизма. Наиболее существенные различия были установлены по содержанию в крови глюкозы и холестерина (соответственно, 6,7 и 6,2% в пользу нетрансгенных животных), а также по активности АЛТ (7,1% в пользу трансгенных животных). Однако данные различия были недостоверными. Содержание белковых фракций у животных исследуемых групп практически не различалось. В качестве тенденции, следует отметить, незначительное снижение в крови трансгенных животных уровня общего белка на 2,1%, которое происходило, главным образом, за счет альбуминовой фракции.
• Морфофункциональная характеристика внутренних органов. С целью оценки влияния трансгена на гистоструктуру внутренних органов были проведены гистологические исследования органов (печень, почки, селезенка и сердце), с которыми связывают активность RCA как в организме хозяина, так и в случае его трансгенной природы. Сравнительный анализ не выявил каких-либо значительных изменений в общей архитектонике данных органов у трансгенных кроликов и их аналогов. Анализ морфометрических показателей изучаемых органов также не выявил существенных различий между экспериментальными группами. Трансгенные животные по размеру клеток и величине структурных единиц исследованных органов практически не отличались от аналогичных показателей контрольной группы.
3.4. Разработка технологии создания трансгенной птицы.
3.4.1. Эффективность трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре in vitro С целью оценки тропности используемых ретровирусных генных конструкций был проведен ряд экспериментов по переносу экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур в культуре in vitro. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала в зависимости от типа используемого подготовки генной конструкции. Максимальное число генетически трансформированных клонов было получено при совместном культивировании клеток-мишеней с клетками-упаковщицами: было получено от 3 до 5 трансформированных клонов, экспрессирующих репортерные гены lacZ и GFP, на каждые 1000 клеток. При использовании в качестве источника генных конструкций среды для культивирования клеток-упаковщиц, эффективность генетической трансформации клеток-мишеней была ниже более чем в 3 раза и составила от 0,9-1 трансформированных клонов на каждые 1000 клеток.
3.4.2. Создание трансгенных кур и изучение факторов, влияющих на результативность трансгенеза эмбрионов кур in vivo С целью повышения эффективности трансгенеза было изучено влияние рада факторов, в частности (1) метода и стадии введения рекомбинантных векторов, (2) концентрации генных конструкций и способа их подготовки для инъекции.
• Метод и стадия введения рекомбинантных векторов в эмбрионы кур. Введение рекомбинантных векторов в эмбрионы кур осуществляли на разных стадиях эмбриогенеза: до инкубации яиц вблизи зародышевого диска (n=70), на первый день инкубации непосредственно в эмбрион (n=66) и на третий день инкубации в дорсальную аорту (n=70). В качестве источника генных конструкций использовали культуральную жидкость.
Максимальная частота интеграции трансгена (процент трансгенных эмбрионов от общего числа развившихся эмбрионов) была установлена при проведении генноинженерных манипуляций с эмбрионами на более поздних стадиях развития (1- и 3-й дни инкубации) - 70-75%, что было почти в 2 раза выше по сравнению с введением векторов в зародышевый диск яиц до инкубации. Общая эффективность трансгенеза (процент полученных трансгенных цыплят от числа проинъецированных эмбрионов) была так же выше при проведении манипуляций на 1- и 3-й дни инкубации и составила 6,7% против 3,3% при введении в зародышевый диск яиц до инкубации.
Введение векторов в эмбрионы кур обуславливало получение трансгенных кур-мозаиков. У 5-дневных эмбрионов экспрессия маркерного гена GFP наблюдалась преимущественно в первичной почке, печени и гонадах. На более поздних стадиях развития эмбриона, а также у трансгенных цыплят экспрессия GFP выявлялась в клетках печени, сердца, желудка, кишечника, мышечной ткани и репродуктивных органах.
Трансформация гонад наблюдалась преимущественно при введении генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации, что можно объяснить миграцией в кровь в данный период эмбриогенеза примордиальных зародышевых клеток, являющихся предшественниками половых клеток. Учитывая этот факт, а также высокую результативность переноса рекомбинантной ДНК в данный период эмбриогенеза, введение генных конструкций в дальнейших исследованиях проводилось в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации.
• Концентрация генных конструкций и способ их подготовки для инъекций. Введение векторов в эмбрионы кур осуществляли в дорсальную аорту. В качестве источника генных конструкций использовали концентрированную (в 20 и 100 раз) культуральную жидкость или суспензию клеток-упаковщиц (500, 1000 и 2000 клеток/эмбрион), предварительно блокированных митомицином С. В каждом случае было проинъецировано от 68 до 98 эмбрионов.
Высокая результативность получения трансгенных кур была установлена при использовании в качестве источника генных конструкций клеток-упаковщиц в концентрации 1000 клеток/эмбрион: наличие и экспрессия гена GFP наблюдались у 20,0% инъецированных эмбрионов при общей эффективности трансгенеза до 8%. При использовании концентрированной культуральной жидкости (в 20 и 100 раз) и клеток упаковщиц в количестве 500 и 2000 клеток/эмбрион данный показатель составил, соответственно, 3,6, 3,3, 7,5 и 0%.
Базируясь на оптимизированных отдельных элементах технологии получения трансгенных кур, нами была проведена трансформация эмбрионов кур (n=80-100) рекомбинантными векторами pBMN-lacZ и pLN-GFP, содержащими маркерные гены lacZ и GFP, соответственно. Частота интеграции составила, соответственно, 69,4 и 67,9%, общая эффективность трансгенеза - 8,0 и 8,7% (табл.7).
Таблица Введение рекомбинантных векторов в эмбрионы кур in vivo Показатель Опыт Контроль Генная конструкция pBMN-lacZ pLN-GFP Заложено на инкубацию яиц, шт 100 80 Введено клеток-упаковщиц:
объем, мкл (концентрация, кл./мкл) 1 (1000) 1 (1000) Развилось эмбрионов, n (%) 62 (62,0) 56 (70,0) 36 (91,0) в т.ч. трансгенных, n 43 38 Вылупилось цыплят, n (%) 12 (12,0) 15 (18,8) 30 (75,0) в т.ч. трансгенных, n 8 7 * Частота интеграции, % 69,4 67,9 Эффективность получения трансгенных 43,0 47,5 ** кур, % Общая эффективность трансгенеза***, % 8,0 8,7 Примечание: *отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов к числу развившихся эмбрионов, выраженное в %;
**отношение числа полученных трансгенных цыплят и эмбрионов, к числу инъецированных яиц, выраженное в %;
***отношение числа вылупившихся трансгенных цыплят к числу инъецированных яиц, выраженное в %.
Интеграция рекомбинантной ДНК была установлена, преимущественно, в клетках печени, сердца, кишечника, желудка, репродуктивных органах, а также мышечной ткани (рис. 5). При этом характер экспрессии рекомбинантных белков в данных органах при использовании двух типов векторов был практически идентичным.
Рис. 5. ПЦР-анализ органов и тканей петуха №2673.
12 3 4 5 6 7 8 9 1 – селезенка, 2 - мышцы, 3 легкие, 4 – сердце, 5 – почки, 6 печень, 7 - кишечник, 8 - семенник, 9 – «-» контроль (ДНК интактной курицы), 10 – «+» контроль (ДНК генной конструкции).
ВЫВОДЫ 1. Разработана технология локального трансгенеза клеток молочной железы сельскохозяйственных животных на основе использования рекомбинантных ретровирусных векторов. Установлено, что результативность генетической трансформации клеток-мишеней зависит от (1) метода введения рекомбинантных векторов, (2) способа подготовки конструкций для инъекций (клетки-упаковщицы, культуральная жидкость) и их концентрации, (3) стадии введения векторов в вымя животных и (4) типа пакующей линии клеток. Показано, что оптимальным с точки зрения результативности трансгенеза является введение векторов в молочную железу коров на 4-6 месяцах стельности, коз – на 4-5 месяцах сукозности, свиноматок - на 3-ем месяце супоростности.
2. Получены соматические трансгенные коровы (n=24), козы (n=14) и свиноматки (n=24), продуцирующие с молоком эритропоэтин в концентрации до 138±18, 192±16, 185±35 нг/мл, соответственно, и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в концентрации до 34±10, 46±7, 25±7 нг/мл, соответственно. Показано, что уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком варьирует в течение лактации и зависит от вида животного, периода лактации, используемой генной конструкции и способа ее подготовки для инъекции. Уровень синтеза рекомбинантных белков в молоко животных в первую треть лактации превышает аналогичные показатели во вторую и последнюю треть лактации в среднем в 2-3 раза.
3. Установлено, что интеграция рекомбинантных генов в геном трансгенных животных (кроликов и свиней) оказывает дестабилизующее влияние на кариотип и модифицирует активность ядрышковых организаторов (ЯОР). У трансгенных животных наблюдается повышение уровня хромосомных аберраций до 38,8% (против 3,1% в контроле) и происходит достоверное увеличение активности ЯОР (у трансгенных свиней) до 2,88±0,12 (Р0,001). С увеличением числа генераций у трансгенных животных отмечается уменьшение частоты аберраций.
4. Показано, что характер наследования чужеродных генов у трансгенных животных (кроликов и свиней) зависит от типа спаривания и происхождения животных. При скрещивании по типу «трансген» х «нетрансген» доля трансгенных потомков составила 28,4-40,0% у свиней и 31,7-36,7% у кроликов, по типу «трансген» х «трансген» - 50,0-62,5% и 50,0 72,7%, соответственно.
5. Установлено, что интеграция в геном свиней гена соматолиберина оказывает влияние на продуктивные признаки свиней разных генераций. У трансгенных свиней по сравнению с аналогами отмечается тенденция увеличения среднесуточных приростов до 35,7%, которая более заметно проявляется у трансгенных свиней ранних (II и III) генераций. У трансгенных свиней поздних генераций (IХ и Х), а также при откорме животных до более тяжелых кондиций (150 кг) установлена тенденция увеличения содержания мяса в тушах (+1,5%) и снижения доли сала (-1,9%).
Отмечено снижение толщины шпика у трансгенных свиней с увеличением числа генераций.
6. Выявлено изменение гормонального и биохимического статуса трансгенных свиней. У трансгенных животных по сравнению с аналогами практически всех исследованных генераций усиливается синтез соматотропина в среднем в 1,5-2 раза, повышается содержание в крови общего белка (до +13,9%), глюкозы (до +39,2%), триглицеридов (до +31,5%), магния (до +11,6%) и снижается уровень хлоридов (до -4,3%).
7. Выявлен ряд морфометрических изменений в структуре органов пищеварительной, сердечнососудистой, выделительной систем организма, мышечной ткани и желез внутренней секреции. У трансгенных животных практически всех исследованных генераций по сравнению с контролем наблюдается увеличение толщины печеночных балок до +22,7%. У трансгенных животных поздних генераций (VIII, IХ и Х) обнаружено уменьшение диаметра ацинусов поджелудочной железы (до 8,8%, Р0,01) и фолликулов щитовидной железы (до 21,8%, Р0,001). Установлены изменения ряда морфологических корреляций в организме трансгенных свиней по сравнению с контрольными животными.
8. Показана перспективность использования генов-ингибиторов комплемента генного кластера RCA для генетической модификации животных, в частности кроликов, с целью использования их в клеточной терапии. На модели in vitro показана устойчивость клеток трансгенного происхождения к лизису сывороткой крови человека по сравнению с контрольными культурами. Доказано, что продукты экспрессии чужеродных генов не оказывают влияния на гистоструктуру внутренних органов трансгенных кроликов.
9. Усовершенствована технология получения трансгенных кур, позволяющая получать трансгенную птицу с эффективностью 8,0-8,7%.
Установлено влияние на результативность трансформации эмбрионов кур in vivo метода и стадии введения рекомбинантных векторов, концентрации генных конструкций и способа их подготовки для инъекции. Максимальная результативность трансгенеза установлена при введении клеток-упаковщиц (в концентрации 1000 клеток/эмбрион) в дорсальную аорту 3-дневных эмбрионов кур.
10. Установлен мозаичный характер интеграции генных конструкций в эмбрионах кур. Наличие ДНК генной конструкции выявлено, преимущественно, в клетках сердца, печени, желудка, кишечника, репродуктивных органах, а также мышечной ткани.
11. Показано, что степень влияния рекомбинантных генов на фенотипические особенности трансгенных животных зависит от целей эксперимента. Наибольшие изменения наблюдаются у трансгенных животных с измененными хозяйственно-полезными признаками: отмечены изменения характера обмена веществ, ряда биохимических, физиологических и морфологических показателей. При локальном переносе чужеродной ДНК влияние трансгенов на организм животных является минимальным:
экспрессия рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных животных не оказывает заметного влияния на гистоструктуру вымени опытных животных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Лабораториям, занимающимся созданием и изучением трансгенных форм животных, рекомендуем:
1. Для результативного проведения локального трансгенеза вымени сельскохозяйственных животных использовать векторные конструкции на основе модифицированных ретровирусов и осуществлять их введение в паренхиму молочной железы на 4-6 месяцы стельности у коров, 4-5 месяцы сукозности - у коз и 3-й месяц супоросности - у свиней.
2. С целью повышения результативности получения трансгенных кур на основе использования ретровирусных векторов проводить введение генных конструкций в дорсальную аорту эмбрионов на 3-й день инкубации.
3. Использовать гены-ингибиторы комплемента генного кластера RCA для генетической модификации животных с целью их последующего применения в клеточной терапии.
4. Учитывать уровень хромосомных аберраций при отборе трансгенных животных для дальнейшего воспроизводства.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ 1) Титова, В.А. Использование ретровирусных векторных систем для получения рекомбинантных белков в молоке сельскохозяйственных животных / В.А. Титова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, В.Н. Шатайло, Л.К. Эрнст // Сельскохозяйственная биология – 2002 - № 6 - С. 53-58.
2) Волкова, Н.А. Локальная инфекция молочной железы как альтернатива получения сельскохозяйственных животных – продуцентов рекомбинантных белков / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова // Достижения науки и техники АПК - №10 2003 - С. 11-14.
3) Волкова, Н.А. Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и получения трансгенной птицы / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева // Генетика - №1 - том 42 – 2006 - С.83-88.
4) Волкова, Н.А. Изучение факторов, влияющих на эффективность создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных - продуцентов рекомбинантных белков человека с молоком / Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.А.
Волкова, Л.К. Эрнст // Биотехнология – 2006 - № 4 - С. 36-44.
5) Эрнст, Л.К. Хозяйственно-ценные признаки трансгенных и дитрансгенных свиней / Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, И.А. Ралков, Г. Брем // Достижения науки и техники АПК – 2006 - N 12. - С. 34- 6) Волкова, Н.А. Эффективность переноса экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов / Н.А.
Волкова, А.О. Тулякова, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Е.К.
Томгорова, Н.С. Лоцманова // Доклады РАСХН – 2007 - № 3 - С. 37-39.
7) Волкова, Н.А. Цитогенетические профили свиней, трансгенных по генной конструкции соматолиберина человека / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, П.М.Кленовицкий, И.В. Гусев, В.А. Багиров, Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Г. Брем // Доклады РАСХН – 2007 - №5 - С. 37-39.
8) Волкова, Н.А. Фенотипические особенности свиней в период эмбриогенеза при интеграции гена рилизинг-фактора гормона роста человека / Н.А.
Волкова, И.Я. Шихов, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст, Е.К. Томгорова, Г. Брем // Сельскохозяйственная биология – 2007 - № 2 - С. 37-41.
9) Зиновьева, Н.А. Влияние интеграции и экспрессии чужеродных генов на стабильность генома трансгенных кроликов в ряде поколений / Н.А. Зиновьева, П.М. Кленовицкий, Н.А. Волкова, А.В. Доцев, Л.К. Эрнст, Г. Брем // Биотехнология – 2007 - №1 - С.52-57.
10) Эрнст, Л.К. Влияние интеграции гена рилизинг-фактора гормона роста на некоторые хозяйственно-ценные признаки свиней / Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, Е.Г. Пархоменко, В.Н. Шатайло, Г. Брем // Зоотехния - 2007 - № 5 С. 2-4.
11) Эрнст, Л.К. Мясные и откормочные качества трансгенных свиней / Л.К.
Эрнст, Н.А. Зиновьева, В.А. Багиров, Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Е.Г.
Пархоменко, И.А. Ралков // Свиноводство – 2007 - №3 - С. 2-5.
12) Эрнст, Л.К. Цитогенетическая характеристика свиней, трансгенных по гену релизинг-фактора гормона роста человека / Л.К. Эрнст, Н.А. Волкова, П.М.Кленовицкий, Н.А.Зиновьева, В.А. Багиров, С.С. Данч, Г. Брем // Сельскохозяйственная биология – 2008 - №2 – С.40-47.
Монографии 13) Эрнст, Л.К. Некоторые аспекты использования ретровирусных векторов для переноса чужеродной ДНК in vivo и in vitro / Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева, Н.А.Волкова, В.А. Титова // М.: РАСХН, 2003, 84 с.
Методические рекомендации 14) Волкова, Н.А. Методические рекомендации по использованию ретровирусных векторов для доставки ДНК в клетки сельскохозяйственных животных in vitro и in vivo / Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.А.Волкова, Л.К.Эрнст // Дубровицы – 2004 – 52 с.
15) Волкова, Л.А. Методические вопросы цитогенетики птицы / Л.А. Волкова, П.В. Ларионова, П.М. Кленовицкий, Н.А. Волкова, Н.А.Зиновьева // Дубровицы – 2004 - 21с.
В сборниках трудов международных конгрессов, конференций 16) Волкова, Н.А. Динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина в молоке соматических трансгенных животных / Н.А. Волкова, Б.С. Иолчиев, В.А.
Титова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, С.58-61.
17) Титова, В.А. Использование ретровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени сельскохозяйственных животных / В.А. Титова, Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, И.П. Савченкова, Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст // Материалы международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2001, С.90-93.
18) Волкова, Н.А. Ретровирусные векторные системы для получения животных – продуцентов рекомбинантных белков / Н.А. Волкова, В.А. Титова, Н.А. Зиновьева, И.М. Чабан, Н.В. Костерева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, С.61- 19) Волкова, Н.А. Уровень и динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина человека в молочной железе животных / Н.А. Волкова, В.А. Титова, Н.В. Соломенцева, Н.А. Зиновьева // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 103-105.
20) Волкова, Н.А. Экспрессия рекомбинантного Г-КСФ в молоко соматических трансгенных животных / Н.А. Волкова, В.А. Титова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 171-173.
21) Титова, В.А. Влияние различных факторов на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко соматических трансгенных животных / В.А.
Титова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, С.59-60.
22) Титова, В.А. Использование ретровирусных векторных систем для трансформации клеток молочной железы животных in vivo / В.А. Титова, Н.А.
Волкова // Материалы международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С.
78-83.
23) Волкова, Н.А. Иммуногистохимическое определение соматотропина и соматостатина в гипофизе трансгенных по МТ-hGRF хряков / Н.А. Волкова, И.Я.
Шихов, Н.А. Зиновьева, В.Н. Шатайло, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2003, С.88-90.
24) Волкова, Л.А. Успехи соматического переноса генов в молочную железу сельскохозяйственных животных / Л.А. Волкова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», научные труды ВИЖ, 2004, вып. 62, Т. 3, с. 215-220.
25) Волкова, Н.А. Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Н.А.
Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы третьей международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004, С.124-127.
26) Волкова, Н.А. Некоторые аспекты генетической трансформации эмбриональных линий кур in vitro и in vivo в рамках разработки технологии создания трансгенной птицы / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст, Н.А.
Зиновьева // Материалы международной научной конференции «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов – к инновационным разработкам», Москва, 2005, С. 122-125.
27) Волкова, Н.А. Использование ретровирусных векторов для генетической трансформации эмбриональных клеток кур / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Н.А.
Зиновьева, Н.С. Лоцманова, А.О. Килыбаева, Л.К. Эрнст // Материалы III международной научно-практической конференции «Современные технологические и селекционные аспекты развития животноводства России», научные труды ВИЖ, 2005, вып. 63, Т. 2, с. С.247- 28) Volkova, N.A. Retrovirus-mediated gene transfer as a perspective method of the transgenic chicken production / N.A. Volkova, L.A. Volkova, L.K. Ernst, N.A.
Zinovieva // Proceedings of II Moscow international congress “Biotechnology: state of the art and prospects of development”, 2005, Part 1, p. 239.
29) Zinovieva, N.A. Perspective technologies in transgenic animal production / N.A. Zinovieva, N.A. Volkova, L.A. Volkova, L.K. Ernst // Proceedings of II Moscow international congress “Biotechnology: state of the art and prospects of development”, 2005, Part 1, p. 247.
30) Волкова, Н.А. Особенности фенотипа эмбрионов свиней, трансгенных по гену релизинг-фактору гормона роста человека / Н.А. Волкова, И.Я. Шихов, Е.К.
Томгорова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научной конференции «Перспективы развития животноводства в аридной зоне Казахстана», г. Чимкент, Казахстан, 2005, С. 126-127.
31) Волкова Н.А. Изучение эффективности переноса рекомбинантной ДНК в молочную железу сельскохозяйственных животных с использованием ретровирусных векторов // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, С.171-174.
32) Волкова, Л.А. Ретровирусный перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo / Л.А. Волкова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, А.О. Килыбаева, Н.С. Лоцманова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100 летию со дня рождения акад. М.Н. Лущихина «Биотехнология в мире животных и растений», 2005, Бишкек, Киргизия, С.157-159.
33) Волкова, Н.А. Гистогенез железистых органов у эмбрионов свиней, трансгенных по гену релизинг-фактора гормона роста человека / Н.А. Волкова, И.Я. Шихов, Е.К. Томгорова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст // Материалы международной научно-практической конференции «Новые методы генодиагностики и генотерапии: современное состояние и перспективы использования в сохранении генофонда сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2005, С.42-45.
34) Volkova, N.A. Using of the retroviral vectors to develop the technology for production of genetically modified chicken / N.A. Volkova, L.A. Volkova, N.A.
Zinovieva, L.K. Ernst // Proceedings of the Moscow international conference “Biotechnology and medicine”, 2006, p. 71.
35) Волкова, Н.А. Динамика роста трансгенных свиней в эмбриональный и постнатальный периоды развития / Н.А. Волкова, Е.Г. Пархоменко, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева // Материалы научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006, С.
179-180.
36) Пархоменко, Е.Г. Особенности иммунного статуса трансгенных свиней / Е.Г. Пархоменко, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.А. Волкова // Материалы научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем современной науки», Чебоксары, 2006, С. 217-218.
37) Волкова, Н.А. Морфофункциональная характеристика железистых органов трансгенных свиней / Н.А. Волкова, И.Я. Шихов, Н.А. Зиновьева, Л.А.
Волкова, Л.К. Эрнст, Г. Брем // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, С. 228-229.
38) Волкова, Л.А. Оптимизация отдельных элементов технологии создания трансгенной птицы / Л.А. Волкова, А.О. Тулякова, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы IV международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, С. 229-230.
39) Кленовицкий, П.М. Цитогенетическая характеристика свиней, трансгенных по генам каскада гормона роста / П.М. Кленовицкий, Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, В.А. Багиров, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, Г. Брем // Материалы VI международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, С. 79-82.
40) Волкова, Н.А. Эффективность использования ретровирусных векторов для трансформации эмбриональных клеток кур in vivo / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, А.О. Тулякова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы VI международной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, С.52-53.
41) Волкова, Н.А. Эффективность создания трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов / Н.А. Волкова, Е.К. Томгорова, Л.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы IV международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007, с. 176-177.
Патенты 42) Волкова, Н.А. Способ введения ретровирусных векторов в клетки бластодермы при получении трансгенных кур / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова, Н.А.
Зиновьева, Л.К. Эрнст // Патент РФ, RU 2303068 C1.
Прочие издания 43) Волкова, Н.А. Иммуноферментный анализ определения концентрации рекомбинантного эритропоэтина в молоке сельскохозяйственных животных / Н.А.
Волкова, В.А. Титова // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2002, С. 12-17.
44) Волкова, Н.А. Иммуногистохимическое определение рекомбинантных белков в тканях трансгенных животных // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, Выпуск 2, 2003, с. 7-11.
45) Волкова, Н.А. Получение трансгенной птицы методом опосредованного ретровирусами переноса генов / Н.А. Волкова, Л.А. Волкова // Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, выпуск 4, 2005, с. 7-10.