Гетеротрофные бактерии техногенных субстратов как основа биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводородов и поверхностно-активных веществ
На правах рукописи
Нгуен Виет Тиен
ГЕТЕРОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ТЕХНОГЕННЫХ СУБСТРАТОВ
КАК ОСНОВА БИОПРЕПАРАТОВ-ДЕСТРУКТОРОВ
НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ульяновск - 2013
Работа выполнена на кафедре «Прикладная биология и микробиология» и в на учно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»
Научный руководитель СОПРУНОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: РОМАНОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская государствен ная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразито логии и экологии МОРОЗОВ НИКОЛАЙ ВАСИЛЬЕВИЧ доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Федеральный центр токсикологиче ской, радиационной и биологической безо пасности» ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», заве дующий лабораторией биотехнологии с ос новами микробиологии Учреждение Российской академии наук
Ведущая организация:
«Институт биологии Уфимского научного центра РАН»
Защита состоится «24» мая 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационно го совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сель скохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» по адресу: 432017, г. Уль яновск, бульвар Новый Венец, 1;
тел. 8(8422) 44-30-58, е-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульянов ская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», а с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства обра зования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru и на сайте академии www.ugsha.ru
Автореферат разослан « 22 » апреля 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Острой экологической проблемой в совре менных условиях является сложность и многокомпонентность состава обра зующихся промышленных и бытовых сточных вод и отходов. Среди основ ных приоритетных загрязнителей окружающей среды можно выделить (Eurosoil 2008,….2008): 1) нефтяные углеводороды, добыча которых во всем мире неуклонно растет;
2) поверхностно-активные вещества, которые в силу своих специфичных свойств, все больше находят применение в различных отраслях народного хозяйства (при добыче и обогащении полезных ископае мых, производстве цемента и моющих средств, текстильной, бумажной, ко жевенной, фармацевтической, парфюмерной, пищевой промышленности), в т.ч. нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей. Обе эти группы поллю тантов представляют серьезную проблему при очистке сточных вод и про мышленных отходов.
Перспективными направлениями экологической биотехнологии являют ся как совершенствование технологий очистки производственных сточных вод и твердых отходов, так и разработка биоремедиационных мероприятий по восстановлению загрязненных объектов, основанных на применении микроб ных технологий с использованием потенциала гетеротрофных микроорганиз мов, которые обладают разнообразием ферментативных систем и лабильно стью метаболизма, обуславливая их высокий биодеградационный потенциал (Вельков, 1995, 2001). Известно, что высокую активность по отношению к за грязняющим веществам проявляют выделенные из техногенных сред и адап тированные комплексы микроорганизмов за счет приобретенных резистент ных свойств и способные индуцировать изменения в антропогенных биоце нозах, интенсифицируя процессы самоочищения (Дзержинская, 1993;
Сопру нова и др., 1997;
Янкевич, 2000).
Исследования, посвященные скринингу микроорганизмов, способных деструктировать и нефтяные углеводороды, и ПАВ, немногочисленны (Пле шакова, 1998;
Турковская, 2000).
В связи с этим, поиск новых штаммов бактерий, выделяемых из техно генных мест обитания и обладающих повышенной устойчивостью к широко му кругу загрязняющих веществ, способностью к деструкции наиболее опас ных и сложных органических соединений является одним из перспективных направлений совершенствования технологий очистки промышленных отхо дов и восстановления природных экосистем.
Целью диссертационного исследования являлось выделение из техно генных субстратов гетеротрофных микроорганизмов и изучение возможности их использования в экологической биотехнологии для разработки биопрепа ратов и в практике биоремедиации от нефтяных углеводородов и ПАВ.
Задачи исследования.
1. Выделить из техногенных субстратов изоляты гетеротрофных микро организмов и определить спектр их деструкционной активности.
2. Выделить чистые бактериальные культуры и изучить их культураль но-морфологические и физиолого-биохимические свойства, провести их идентификацию.
3. Оценить эффективность использования исследуемых бактериальных штаммов для деструкции углеводородов нефти и ПАВ.
Научная новизна. Выделены и изучены изоляты бактерий, способные образовывать эмульгирующий агент, деструктировать углеводороды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные).
Выделены и идентифицированы штаммы бактерий (Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri, Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac. licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis), образующие на средах с органическими источниками угле рода и азота слизистые колонии, и развивающиеся в диапазоне температур 20-45 оС и содержании NaCl 0,0-5,0 %.
Среди исследованных микроорганизмов штамм Stenotrophomonas maltophilia способен развиваться в широком диапазоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%).
Установлено, что все исследуемые бактериальные штаммы способны де структировать углеводороды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные).
Среди неспорообразующих бактерий наиболее устойчивым и активным явля ется Sphingobacterium canadense, спорообразующих - Bac. licheniformis и Bac.
cereus.
Впервые показано, что бактерии Sphingobacterium canadense способны образовывать эмульгирующий агент, деструктировать углеводороды сырой нефти, анионные и катионные ПАВ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Выделенные из техногенных нефтезагрязненных субстратов бактери альные изоляты обладают способностью к слизеобразованию, липолитиче ской и деструкционной активностями по отношению к нефтяным углеводо родам, анионным и катионным ПАВ.
2. Выделены и идентифицированы бактериальные штаммы, для кото рых установлены оптимальный диапазон температур и концентрации хлорида натрия.
3. Бактериальные штаммы, выделенные из нефтезагрязненных техно генных сред, способны деструктировать углеводороды сырой нефти и ПАВ.
Практическая значимость. Предложены новые штаммы Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri, Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac. licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis, которые могут быть использованы в качест ве деструкторов нефтяных углеводородов и ПАВ в интервале температур 20 45 оС и концентрации хлорида натрия 0,0-5,0%.
Штамм Sphingobacterium canadense, образующий эмульгирующий агент, может быть использован для получения биосурфактантов.
Штамм Stenotrophomonas maltophilia, развивающийся в широком диапа зоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%), может использо ваться для разработки приемов биоремедиации экосистем, формирующихся в условиях повышенных температур и солености.
Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Тема диссер тации связана с тематикой госбюджетных исследований кафедры «Приклад ная биология и микробиология» ФГБОУ ВПО «АГТУ»: «Особенности функ ционирования сообществ микроорганизмов экосистем аридной зоны» (№ гос.
регистрации 01201051041) и плановой темой НИР научно-исследовательской лаборатории микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «АГТУ»:
«Скрининг микроорганизмов с полезными свойствами для использования в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии» (№ гос. регистрации 01201051559).
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийских и Международных конференциях: 1-й научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводород ного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа»
(Астрахань, 2010), 55-й научно-практической конференции ППС АГТУ (Аст рахань, 2011)», Всероссийской конференции с международным участием «ЭКОБИОТЕХ-2011» (Уфа, 2011), 56-й Всероссийской конференции ППС АГТУ (Астрахань, 2012), 57-й Международной научной конференции ППС АГТУ, (Астрахань, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных ра бот, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 15 рисунков и 12 таблиц. Диссертация со стоит из введения;
обзора литературы;
описания объектов и методов исследо ваний;
результатов экспериментальных исследований, представленных в главах;
заключения, выводов;
библиографического списка, включающего источников, в том числе 85 зарубежных авторов;
4-х приложений.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе приводятся сведения о микроорганизмах и приемах их примене ния в биологической очистке от нефтяных углеводородов и поверхностно активных веществ. Рассматриваются данные о способности микроорганизмов продуцировать поверхностно-активные вещества и экологических функциях биоПАВ, перспективных для использования в нефтяной отрасли.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований. Объектами исследований являлись изоляты и штаммы микроорганизмов, выделенные из производственных отходов (неф тешламы, сточные воды), обладающие деструкционной активностью по от ношению к нефти и ПАВ (анионным и катионным) и способностью к слизе образованию.
Скрининг и изучение микроорганизмов проводили в условиях лабора торных опытов в течение 2009-2012 г.г. Лабораторные исследования осуще ствлены в Научно-исследовательской лаборатории микробиологического мо ниторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета. Анализ выделенных штаммов путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК проведен под руково дством в.н.с., д.б.н. Плотниковой Е.Г. в Институте экологии и генетики мик роорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН). Для хранения и поддержания бактерий использовали плотные пита тельные среды: ПА (Практикум по микробиологии, 1976) и CPYGG (Сохань, 2008).
Выделение углеводородокисляющих и слизеобразующих бактерий из техногенных субстратов осуществляли методом жидких накопительных мик робных культур на питательных средах с добавлением 1% нефти: углеводо родокисляющих – Чапека, слизеобразующих – СРYGG (Руководство к прак тическим занятиями по микробиологии, 1983, Сохань, 2008).
Культивирование проводили при температуре 28 °С в стационарной культуре и на качалке при 190-300 об/мин.
Рост накопительных микробных культур оценивали визуально по по мутнению среды и микроскопированием фиксированных и окрашенных по Граму препаратов, количественный состав оценивали методом высева на плотные питательные среды (Теппер, 2004;
Практикум по микробиологии, 2005).
Выделение и получение чистых культур бактерий из накопительных микробных культур осуществляли методом Коха с предварительным после довательным разведением на средах Чапека с добавлением 20 г/л агар-агара и СРУGG с добавлением 1,7% агар-агара. Посев осуществляли через 3, 10, 14, 21 суток экспозиции накопительных микробных культур.
Чистые культуры доминирующих бактерий, выросших на чашках Петри, выделяли по методу Коха из отдельных колоний. Чистоту выделенных куль тур устанавливали визуально и микрокопированием препаратов окрашенных фиксированных клеток (Руководство к практическим занятиям по микробио логии,1983).
Изучение фенотипических признаков выделенных культур Определение культуральных и физиолого-биохимических признаков культур проводили по стандартным методикам (Практикум по микробиоло гии, 1976;
Определитель бактерий Берджи, 1997). Морфологию клеток иссле довали на препаратах 3, 10, 14, 21 суточных культур, выращенных на чашках Петри с плотными средами Чапека и СРУGG, и в жидкой культуре с исполь зованием световой микроскопии.
Определение оптимальных условий роста бактерий. Изучение по требностей штаммов бактерий в различных источниках углерода и азота про водили путем высева на питательные среды (Руководство к практическим за нятиям по микробиологии, 1983;
Теппер 2004;
Практикум по микробиологии, 2005): углерода - ПА и разбавленный ПА/10, молекулярного азота - Чапека с 20 г/л глюкозы, Чапека с 20 г/л сахарозы, агар Эшби.
Изучение отношения штаммов бактерий к температуре проводили при температурах 4;
10;
20;
37 и 45 оС;
к содержанию солей – при концентрациях NaCl 0,0;
5,0;
10,0 и 20,0%.
Определение и анализ нуклеотидных последовательностей фрагмен та гена 16S рРНК. Видовую идентификацию бактериальных штаммов про водили методом полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирова ния ПЦР. Определение нуклеотидной последовательности амплифицирован ных фрагментов гена 16S рРНК проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Ananlyzer 3500 xl (Applied Biosystems, США). Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили, используя пакет программ Eztaxon server 2. (http://147.47.212.3580/index.jsp). Сравнительный анализ нуклеотидных по следовательностей гена 16S рРНК с таковыми типовых штаммов близкород ственных видов проводили с помощью программы Clustal W (Thompson et al., 1994). Построение бескорневых филогенетических деревьев производили с помощью методов, реализованных в пакете MM TREECON (Thompson et all., 1994;
Pavlicek et all., 1999;
http: www.cme.msu.edu).
Определение эмульгирующей активности бактерий осуществляли с помощью метода Купера (Соорег, Goldenberg, 1987;
Ившина и др., 2004).
Исследование липолитической активности бактериальных изолятов осуществляли качественным методом на агаре Селибера с добавлением раз личных жиров в качестве единственного источника углерода и энергии: рас тительных (подсолнечное рафинированное и нерафинированное, оливковое масла) и животных (сливочное масло, свиной и бараний жир) в присутствии индикатора бромтимолблау (Методы общей бактериологии, 1984).
Изучение способности исследуемых изолятов и бактериальных штаммов деструктировать нефтяные углеводороды осуществляли количе ственным методом измерения массовой доли нефтепродуктов на анализаторе жидкости «Флюорат-02» (ПНД Ф 14.1:2:4.128-98, 2000;
Другов, Родин, 2000).
Культивирование микроорганизмов проводили в колбах, содержащих по мл жидкой питательной среды CPYGG с добавлением 2,0% стерильной сырой нефти. Контролем служили чистые колбы с добавлением микроорганизмов без нефти. Инкубирование осуществляли на магнитной мешалке при об/мин и температуре 25 °С в течение 7 суток.
Способности исследуемых изолятов и бактериальных штаммов де структировать поверхностно-активные вещества (АПАВ и КПАВ) оце нивали флуориметрическим методом с использованием анализатора жидко сти "Флюорат-02" (ПНД Ф 14.1:2:4.39-95;
ПНД Ф 14.1:2:4.158-2000;
Другов, Родин, 2000). Экстракцию ионных пар ПАВ (анионных и катионных) осуще ствляли хлороформом с последующим измерением концентрации ПАВ в по лученных экстрактах.
Для эксперимента использовали стандартные растворы АПАВ (додецил сульфат натрия) и КПАВ (цитилпиридиний хлористый) с концентрацией 1, 2, 10, 20 мг/дм3.
Определение фитотоксичности исследуемых бактериальных штам мов проводили в эксперименте с семенами горчицы белой (Sinapis alba). Для определения токсичности подсчитывали количество проросших семян, для определения фитостимуляции измеряли длину стеблей и корней. Оценива лась способность исследуемых штаммов к стимуляции роста тест–растения в % к контролю. Токсичными считали культуры, вызывающие снижение всхо жести семян или снижение роста проростков и корней не менее чем на 30% по сравнению с контролем (Зенова, 2002).
Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами математической статистики, выра жали в виде графиков и таблиц с помощью пакета программы Мicrosoft Excel 2010, использовали текстовый реактор Мicrosoft Word 2010.
СКРИНИНГ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ И СЛИЗЕОБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ Для выделения углеводородокисляющих и слизеобразующих микроор ганизмов методом накопительных микробных культур использовали пробы из техногенных экосистем, длительное время являющиеся накопителями ток сичных отходов: нефтешламы очистных сооружений Астраханского газопе рерабатывающего завода и замазученных сточных вод резервуара-накопителя одной из нефтебаз, расположенной в пригороде г. Астрахани.
Анализ численности ассоциаций микроорганизмов, сформировавшихся в накопительных культурах, показывает (табл. 1), что количество микроорга низмов, выявляемых на среде для слизеобразующих бактерий в сравнении с углеводородокисляющими выше на 2 порядка в нефтешламе (3,1х105 4,23х107КОЕ /г) и на 1 порядок - в замазученных сточных водах (5,1х105 7,2x106 КОЕ/мл).
Таблица 1. Численность микроорганизмов в накопительных куль турах техногенных субстратов Титр микроорганизмов накопительных Среды для выделения культур микроорганизмов нефтешлама, замазученных сточ КОЕ/г ных вод, КОЕ/мл 3 3,1х105- 4,23х Чапека (углеводородокисляю- 2,3х10 - 5,18х щие) 3,1х105- 4,23х107 5,1х105 - 7,2х СРУGG (слизеобразубщие) Из накопительных микробных культур первоначально выделены бакте риальные изоляты: 31 - из нефтешлама (12 – на Чапека, 19 – на СРУGG), 20 из замазученных сточных вод (6 – на Чапека, 14 – на СРУGG), представлен ные как палочковидными, так и кокковидными клетками, некоторые палоч ковидные изоляты имели бациллярные эндоспоры, размеры клеток варьиру ют. При окраске по Граму отмечены как грамположительные, так и грамот рицательные формы.
Для дальнейших исследований в серии последовательных пересевов отобрано девять изолятов (3 - из сточных вод нефтебазы, 6 - из нефтешла мов), наиболее устойчивых и образующих более слизистые колонии.
Определение липолитической активности на основании качественных реакций показало, что все выделенные изоляты обладают достаточно высо кой липолитической активностью, изменяя цвет всей массы окрашенного жи ра.
Исследование эмульгирующих свойств культуральных жидкостей бакте риальных изолятов показало, что индекс эмульгирования выше для 8-ми изо лятов, выращенных на среде CPYGG (рис. 1).
Рисунок 1. Эмульгирующая активность изолятов бактерий В экспериментальных условиях установлено, что все бактериальные изоляты способны деструктировать углеводороды нефти (рис. 2): в течение первых суток убыль суммарных нефтяных углеводородов составила 23,7-47, %, 7-ми суток – 66,5-82,6 %. При этом, активность бактериальных штаммов деструктировать углеводороды нефти (исключая абиотические факторы) со ставляет в течение первых суток эксперимента 14,9-38,6%;
7-ми суток – 31,0 47,1%. Динамика численности изолятов в эксперименте свидетельствует об их устойчивости к компонентам сырой нефти: в течение экспозиции отмече но увеличение титра клеток на 1-2 порядка (105-106 КОЕ/мл) как в сравнении с титром вносимых культур (104 КОЕ/мл), так и в модельных системах с неф тью в сравнении с контролем (при экспозиции сред без нефти).
При изучении деструкции АПАВ (модельные растворы додецилсульфата натрия концентрациями 1, 2, 10 и 20 мг/дм3) установлено (рис. 3), что все изоляты обладают способностью деструктировать АПАВ: при концентрации 1 мг/дм3 убыль в течение трех суток достигает 84,4-98,6%, при 2 мг/дм3 - че тырех суток 90,3-94,5%;
10 и 20 мг/дм3 - шести суток 96,0-98,8% и 89,0-99,6% соответственно.
Рисунок 2. Деструкция нефти изолятами бактерий Вклад бактериальных изолятов в деструкцию АПАВ, исключая абиоти ческие факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 17,4-31,8%;
2,0 мг/дм3 – 12,3 16,9%;
10,0 мг/дм3 – 27,9-30,7%;
20,0 мг/дм3 -57,5-68,1%. Таким образом, биодеградационный потенциал бактериальных изолятов повышается при по вышении концентрации АПАВ.
Рисунок 3. Деструкция АПАВ изолятами бактерий (на примере концентрации АПАВ 20,0 мг/дм3) При изучении деструкции катионных ПАВ (модельные растворы цитил пиридиний хлористого концентрациями 1, 2, 10 и 20 мг/дм 3) установлено (рис. 4), что все изоляты обладают способностью деструктировать КПАВ:
при концентрации 1 мг/дм3 изолятами И-2 и И-4 - 100% в течение четырех су ток, остальными изолятами 89,7-98,0% в течение 6-ти суток;
2 мг/дм3 в тече ние шести суток – 73,8-96,1%;
10 и 20 мг/дм3 в течение шести суток - 86,4 94,2% и 61,8-78,6% соответственно.
Вклад бактериальных изолятов в деструкцию КПАВ, исключая абиоти ческие факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 63,7-80,0% в течение 4-6 суток;
2,0 мг/дм3 – максимально 30,2-61,5% в течение четырех суток, 9,6-29,5% шести суток;
10,0 мг/дм3 – 62,9-70,3% и 20,0 мг/дм3 -46,3-71,1% в течение шести суток. В целом, вклад бактериальных изолятов в деструкцию КПАВ увеличивается при повышении концентрации, и он выше в сравнении с ани онными ПАВ.
Динамика численности микроорганизмов при деструкции АПАВ и КПАВ показала, что все бактериальные изоляты в ходе эксперимента в целом сохраняют достаточно стабильную и постоянную численность.
Таким образом, в результате исследований установлено, что все предва рительно отобранные изоляты обладают липолитической активностью, спо собностью к образованию эмульгирующего агента, деструктируют углеводо роды сырой нефти и ПАВ (анионные и катионные).
Рисунок 4. Деструкция КПАВ изолятами бактерий (на примере концентрации КПАВ 20,0 мг/дм3) На основании совокупности результатов исследований, в т.ч. генетиче ского анализа путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК и анализа нуклеотидных последовательностей с последующим сравнительным анали зом нуклеотидных последовательностей с таковыми типовых штаммов близ кородственных видов, для дальнейших исследований отобраны 9 штаммов:
Bacillus safensis FO-036b T (AF234854) (сходство 100 %);
Staphylococcus warneri ATCC 27836 T (L37603) (сходство 100 %);
Bacillus tequilensis 10bT (HQ223107) (сходство 100 %);
Bacillus vallismortis DSM 11031T (AB021198) (сходство 100 %);
Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637T (AB008509) (сходство 99,424 %);
Sphingobacterium canadense CR11T (AY787820) (сходст во 99,880 %);
Bacillus licheniformis ATCC 14580T (AE017333) (сходство 99,552%);
Bacillus cereus ATCC 14579 T(AE016877) (сходство 100 %);
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42T CP000560 (сходство 99,889).
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ Экспериментально установлено, что оптимальными средами для получе ния слизистых культур бактерий являются СPYGG и ПА, содержащие угле род и азот в органической форме;
оптимальными условиями культивирования является интервал температур 20-45 оС и концентрация хлорида натрия 0-5 %.
Для Stenotrophomonas maltophilia отмечен рост в более широком диапазоне температур (4-45 оС) и солености (0-10 % NaCl).
Оценивая убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, установлено, что все бактериальные штаммы способны усваивать углеводо роды нефти. При этом, для спорообразующих бактерий характерно более интенсивная деструкция нефти в течение 7 суток (70,3-91,1 %), для неспоро образующих - 64,4-79,7 % (рис.5).
Неспорообразующие бактерии по активности деструктировать нефть (в течение 7 суток) располагаются в следующей последовательности (исключая абиотические факторы): Sphingobacterium canadense (42,4%) Stenotrophomonas maltophilia (33%)Staphylococcus warneri (27,1%);
споро образующие - Bacillus licheniformis (53,8%)Bac. amyloliquefaciens (49,5%)Bac. safensis (48,2)Bac. tequilensis (44,6%)Bac. vallismortis (43,2%)Bac. cereus (40,5%).
а б Рисунок 5. Убыль нефти в эксперименте с бактериальными штаммами:
а) спорообразующими, б) неспорообразующими Среди спорообразующих бактерий наиболее активным (53,8%) оказался штамм Bacillus licheniformis, неспорообразующих - Sphingobacterium canadense (42,4%).
Для всех бактериальных штаммов в течение эксперимента отмечен рост численности в модельных растворах с нефтью и ее превышение в сравнении с контролем на 1-2 порядка.
Изучение эмульгирующей активности показало (рис. 6), что максималь ный индекс эмульгирования (46,55%-36,8%) как с бензином, так и керосином в качестве гидрофобной фазы отмечен для неспорообразующих бактерий:
Sphingobacterium canadense на питательном бульоне, Stenotrophomonas maltophilia - среде CPYGG (32,7 %) при использовании в качестве гидрофоб ной фазы керосина;
спорообразующих - Bac. safensis на питательном бульоне с бензином (36,4%).
а б Рисунок 6. Эмульгирующая активность бактериальных штаммов:
а) на питательном бульоне;
б) на среде CPYGG При исследовании деструкции АПАВ бактериальными штаммами уста новлено, что все они обладают достаточно высокой активностью (рис. 7): при концентрации 1 мг/дм3 в течение первых 3-х суток происходит полное разру шение АПАВ, 2 мг/дм3 – в течение 4-х суток 88,3-95,4%;
10 и 20 мг/дм3 - 6-ти суток 96,3-98,9 % и 92,3-99,9 % соответственно. При этом, вклад бактериаль ных штаммов в деструкцию АПАВ (додецилсульфат натрия), исключая абио тические факторы, составляет максимально: при 1,0 мг/дм3 – 46,1-57,5% в первые сутки;
2,0 мг/дм3 – 43,0-60,0% (2-е суток);
10,0 мг/дм3 – 44,3-55,4% (2 е суток);
20,0 мг/дм3 -60,6-68,4% (6-ть суток).
В целом, наиболее активными деструкторами АПАВ оказались штаммы спорообразующих бактерий, и по активности деструктировать АПАВ все изучаемые штаммы располагаются в следующей последовательности: Bac.
cereusStenotrophomonas maltophiliaBac. vallismortisBac.
amyloliquefaciensBac. safensisSphingobacterium canadenseBac.
tequilensisBac. licheniformisStaphylococcus warneri.
Установлено, что практически во всех экспериментальных вариантах при деструкции АПАВ в целом по окончании эксперимента все бактериаль ные штаммы свою численность сохраняют на уровне вносимой или умень шают в сравнении с первоначальной на порядок.
При исследовании деструкции КПАВ бактериальными штаммами уста новлено, что все они также обладают достаточно высокой активностью (рис.
8): при концентрации 1 мг/дм3 полное разрушение КПАВ в течение первых 4 х суток осуществляют неспорообразующие бактерии Stenotrophomonas maltophilia, 5-ти суток - Staphylococcus warneri;
спорообразующие бактерии рода Bacillus - 90,2-97,5% в течение 6-ти суток эксперимента. В модельных растворах с концентрацией 2 мг/дм3 убыль КПАВ в течение 6-ти суток соста вила в целом 72,3-94,9 5%;
10 мг/дм3 – 84,8-94,0%;
20 мг/дм3 52,3-84,8%.
Вклад бактериальных штаммов в деструкцию КПАВ (цитилпиридиний хлористый), исключая абиотические факторы, составляет: при 1,0 мг/дм3 64, 80,0% (4-6 суток);
2,0 мг/дм3 – максимально 32,3-60,3% (4 суток), 23,6-54,1% (пяти суток);
10,0 мг/дм3 – 62,0-71,8% (шести суток);
20,0 мг/дм3 -47,0-59,8% (пяти суток) и 44,4-77,2% (шести суток).
Среди спорообразующих бактерий наиболее активным деструкторами КПАВ является штамм Bac. cereus, неспорообразующих - Staphylococcus warneri.
Рисунок 7. Убыль АПАВ в эксперименте с бактериальными штаммами (на примере концентраций АПАВ 20,0 мг/дм3) Рисунок 8. Убыль КПАВ в эксперименте с бактериальными штаммами (на примере концентрации КПАВ 20,0 мг/дм3) В целом, наиболее активными деструкторами КПАВ также оказались штаммы спорообразующих бактерий, и по активности деструктировать КПАВ все изучаемые штаммы располагаются в следующей последовательно сти: Bac. cereus Bac. safensis Bac. tequilensisBac.
vallismortisStaphylococcus warneriBacillus licheniformis и Sphingobacterium canadens, Stenotrophomonas maltophiliaBac. amyloliquefaciens.
При отслеживании динамики численности бактериальных культур в процессе деструкции КПАВ установлено, что среди неспорообразующих бак терий максимальную и стабильную численность в ходе эксперимента (105- КОЕ/мл) во всех вариантах проявляет Sphingobacterium canadense, спорооб разующих - Bac. tequilensis.
Изучение фитотоксичности бактериальных штаммов Известно, что штаммы микроорганизмов, являющиеся перспективными для разработки приемов биоремедиации должны быть нетоксичными для жи вых организмов (Вельков, 2001). Изучение токсичности исследуемых штам мов бактерий с использованием в качестве тест-культуры семен горчицы бе лой (Sinapis alba) показало (рис. 9), что ни один из исследуемых штаммов не обладает фитотоксичностью, о чем свидетельствуют как данные по количест ву проросших семян, так и морфометрические показатели проросших семян.
а) б) Рисунок 9. Оценка фитотоксичности бактериальных штаммов (%):
а) количество проросших семян;
б) стимуляция роста растения ЗАКЛЮЧЕНИЕ При выполнении диссертационных исследований использовали бактери альные изоляты и штаммы бактерий, выделенные их техногенных сред, дли тельное время находящиеся под влиянием разнообразных органических за грязнителей, в том числе нефти и нефтепродуктов, ПАВ и др.
При этом, с целью определения эффективности использования бактери альных штаммов для разработки биопрепаратов для деструкции нефтяных углеводородов, определяли дополнительно спектр свойств: способность об разовывать эмульгирующий агент, деструктировать ПАВ (анионные и кати онные).
Совокупность положительных результатов по изучению эмульгирующей и деструкционной активности, фитотоксичности исследуемых штаммов пока зывает, что они проявляют достаточно высокую активность в отношении уг леводородов сырой нефти и ПАВ (анионных и катионных), что позволяет рассматривать возможность их использования в экологической биотехноло гии.
В целом, наиболее активными деструкторами, как нефти, так и ПАВ (анионных и катионных) оказались спорообразующие бактерии рода Bacillus:
нефти – Bac. licheniformis, АПАВ и КПАВ - Bac. cereus.
В то же время, следует отметить, что способность образовывать эмуль гирующий агент максимально проявилась у Sphingobacterium canadense (ин декс эмульгирования до 46,6%) и Stenotrophomonas maltophilia (37,2%). При этом, для Stenotrophomonas maltophilia отмечена способность развиваться в широком диапазоне температур (4-45 оС) и концентрации NaCl (0,0-10,0%), что значительно расширяет спектр перспектив его использования, в том чис ле и для биоремедиации экосистем, формирующихся в условиях повышенных температур и солености.
Среди выделенных бактериальных штаммов следует отметить Sphingobacterium canadense. В последнее время имеется достаточно много работ зарубежных авторов, связанных с выделением из различных экологиче ских ниш (почвы лесные, бамбуковых плантаций, корневой зоны кукурузы, активного ила) представителей этого рода и их молекулярно-генетической идентификации (Mehnaz et all, 2007;
Wei et all, 2008;
Duan et all, 2009;
He et all, 2010;
Marqus et all, 2012;
Zhang et all, 2012). Установлено, что среди бак терий рода Sphingobacterium есть представители, такие как Sphingobacterium detergens sp. nov., выделенный из почвы, образующий биосурфактант (Marqus et all, 2012).
Полученные в данной диссертационной работе результаты по изучению свойств бактерий показали, что именно Sphingobacterium canadense обладает не только способностью деструктировать углеводороды нефти, анионные и катионные ПАВ, но и имеет максимальный индекс эмульгирования. Таким образом, изученные свойства (потребность в источниках углерода и энергии;
оптимум температур и содержания хлорида натрия;
способность образовы вать эмульгирующий агент;
деструкционные свойства по отношению к нефти и ПАВ) выделенного штамма Sphingobacterium canadense позволяют рас сматривать его перспективным объектом, как в научном, так и практическом аспектах.
ВЫВОДЫ 1. Из техногенных нефтезагрязненных субстратов выделено 9 изолятов, обладающих липолитической и эмульгирующей (максимально до 25,0-66,6%) активностями, деструктирующих нефть (на 31,0-47,1%) и ПАВ: анионные (максимально на 57,5-68,1% при концентрации 20 мг/дм3) и катионные (46,3 80,0% в диапазоне концентраций 1,0-20,0 мг/дм3).
2. Выделены и идентифицированы штаммы неспорообразующих (Sphingobacterium canadense, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus warneri) и спорообразующих (Bacillus amyloliquefaciens, Bac. cereus, Bac.
licheniformis, Bac. safensis, Bac. tequilensis, Bac. vallismortis) бактерий, обра зующие на средах с органическими источниками углерода и азота слизистые колонии, развивающиеся в диапазоне температур 20-45 оС и содержании NaCl 0,0-5,0 %.
3. Установлено, что все изучаемые штаммы бактерий не являются фи тотоксичными, способны деструктировать нефть (на 42,4-53,8%), анионные (43,0-68,4%) и катионные (32,3-80,0%) ПАВ.
4. Установлено, что штамм Sphingobacterium canadense обладает мак симальной эмульгирующей активностью (36,8-46,6%), способен деструктиро вать нефть (42,4%), анионные (47,8-71,1%) и катионные (46,8-66,2%) ПАВ в диапазоне концентраций 1,0-20,0 мг/дм3.
Практические рекомендации 1. Для получения биопрепаратов-деструкторов нефтяных углеводоро дов и при разработке биоремедиационных мероприятий при ликвидации неф тяных загрязнений рекомендуется использовать штамм неспообразующих бактерий Sphingobacterium canadense, который способен продуцировать эмульгирующий агент, что значительно повышает эффективность деструкции углеродородов нефти.
2. Для получения биопрепаратов-деструкторов ПАВ (анионных и като инных) рекомендуется использовать Bacillus cereus.
3. Для использования в широком диапазоне температур (40-45 оС) и концентрации хлорида натрия (0-10%) рекомендуется штамм Stenotrophomonas maltophilia СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В изданиях, рекомендованных ВАК 1. Сопрунова О.Б., Нгуен Виет Тиен. Перспективы использования сли зеобразующих бактерий в нефтяной отрасли // Юг России: экология, разви тие, Махачкала, 2010. - No4. – С. 91-93.
2. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Поиск и выявление новых бакте риальных штаммов с полифункциональными свойствами в техногенных суб стратах // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011. Т. 13, № 5(3) - С. 167-170.
3. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Studying of properties and strains identification of the muciparous bacteria allocated from the petropolluted wastage (Astrakhan – Russia) // Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология», 2013. №02/2 (120). - С. 137-142.
4. Сопрунова О.Б., Утепешева А.А., Нгуен Виет Тиен. Микроорганизмы – деструкторы ПАВ в водных средах // Вестник АГТУ. Серия «Рыбное хозяй ство». 2013, №1. – с. 83-90.
В других изданиях 5. Сопрунова О.Б., Гальперина А.Р., Нгуен Виет Тиен. Перспективы ис пользования аборигенной микрофлоры в детоксикации и очистке нефтесо держащих отходов // Материалы 1-й научно-практической конференции «Но вейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обес печение безопасности экосистем Каспийского шельфа», Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010 – С. 103-106.
6. Нгуен Виет Тиен., Сопрунова О.Б. Скрининг микроорганизмов, об ладающих эмульгирующими свойствами // Тезисы Всероссийской научной конференции профессорско-преподавательского состава Астраханского госу дарственного технического университета (55-й НПК ППС АГТУ), Астрахань, 2011. – С. 40.
7. Нгуен Виет Тиен. Отбор перспективных бактериальных культур для разработки биологических способов очистки от нефти // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции профессорско-преподавательского со става Астраханского государственного технического университета (56-й НПК ППС АГТУ) (электронный ресурс), Астрахань, 2012.– С. 47.
Подписано в печать «20» апреля 2013 г.
Формат 60х84/16. Гарнитура «Times New Roman».
Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 247.
Типография ФГБОУ ВПО «АГТУ», тел. (8512) 61-45- 414056, г. Астрахань, Татищева 16 ж