Биотехнологические аспекты разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий рода providencia
На правах рукописи
Барт Наталья Геннадьевна
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ФАГОВОГО
ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
РОДА PROVIDENCIA
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ульяновск – 2013
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»
Научные руководители: ЗОЛОТУХИН СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ доктор биологических наук, профессор ВАСИЛЬЕВ ДМИТРИЙ АРКАДЬЕВИЧ доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: ЕЖКОВА ГАЛИНА ОЛЕГОВНА доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», кафедра технологии пищевых производств института пищевых производств и биотехнологии, профессор ЛЕНЁВ СЕРГЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ кандидат биологических наук, ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ВГНКИ), отдел биотехнологии, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
(«ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань)
Защита диссертации состоится «29» марта 2013 года в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина», по адресу: 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1;
тел.(8-8422)44-30-58, факс 44-30-72, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина», а с авторефератом в сети интернет на официальном сайте Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru и на сайте академии www.ugsha.ru
Автореферат разослан «_» февраля 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Известно, что заболеваемость острыми кишечными инфекциями в нашей стране в настоящее время остается довольно высокой, но лабораторное подтверждение кишечных заболеваний в среднем не превышает 50-60% и значителен удельный вес кишечных инфекций с невыясненной этиологией. В то же время данные литературы последних лет свидетельствуют, что этиологическим фактором при кишечных заболеваниях могут быть многие малоизученные родовые группы семейства кишечных бактерий, к которым относятся и бактерии рода Providencia. Интерес, проявляемый в последние годы к малоизученным группам семейства Enterobacteriaceae, в том числе и к бактериям рода Providencia вызван тем, что эти бактерии рассматриваются как возможный этиологический фактор в возникновении кишечных заболеваний (Львов, 1968;
Sedlak, Rische, 1968;
Авдеева и соавт., 1970 и др.). Представители рода Providencia широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека. Бактерии рода Providencia патогенны для разных видов лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, кроликов, хомяков). Имеются литературные данные о заболеваниях людей: диареи, гастроэнтероколиты у детей, урологические заболевания, вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции вызванные бактериями рода Providencia (Батуро 1988;
Романенко, 1989;
Venieri D.,Vantarakis A., Komninou G., Papapetropoulou M., 2006). Бактерии рода Providencia способны вызывать у животных и людей самостоятельные или в ассоциации с другими микроорганизмами заболевания. Известно о случаях обнаружения вида Providencia rettgeri в фекалиях больных диареей поросят сосунов и новорожденных телят в период массовых желудочно-кишечных заболеваний молодняка (Кононенко, Бритова, Каврук, 1994;
Золотухин с соавт., 1999, 2004).
Выделение и идентификация бактерий рода Providencia в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Providencia. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов недоступны для большинства лабораторий. В связи с выше изложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Providencia.
Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961;
Ганюшкин, 1988;
Габрилович, 1981;
1983;
Русалеев, 1990;
Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990;
1992;
Натидзе с соавт., 2005;
Золотухин, 2005, 2007) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.
Выделением и изучением бактериофагов рода Providencia занимались (Габрилович с соавт., 1998). Однако в арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют бактериофаги рода Поэтому получение Providencia.
специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Providencia и их применение с целью индикации и идентификации, является актуальным.
Целью исследований является выделение бактериофагов, активных в отношении штаммов бактерий рода Providencia и разработка на их основе диагностического биопрепарата для индикации и идентификации гомологичных энтеробактерий.
Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить ареал распространения бактерий рода Providencia.
2. Выделить и селекционировать из патологического материала и объектов ветеринарного надзора бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Providencia.
3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу) выделенных бактериофагов.
4. Разработать технологические параметры изготовления фагового биопрепарата и сконструировать на основе выделенных штаммов новый биопрепарат – диагностикум.
5. Разработать схему идентификации бактерий рода Providencia с помощью бактериофагов.
6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.
Научная новизна. Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Providencia, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.
Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации Providencia в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.
Практическая значимость работы. Селекционированы два изолята бактерий рода Providencia F – 67 УГСХА и F – 87 УГСХА, обладающие выраженными биологическими свойствами, соответствующие требованиям, предъявляемым к производственным штаммам фагов, которые можно использовать для изготовления диагностических фаговых препаратов.
По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Providencia из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением специфических бактериофагов F- УГСХА и F-87 УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
«Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энтеробактерий рода Providencia в патологическом материале, кормах, пищевых продуктах и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов F-67 УГСХА и F- УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором-проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных фагов бактерий рода Providencia F – УГСХА и F – 87 УГСХА» (рассмотрены на заседании НТС ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина и утверждены первым проректором проректором по науке В.А. Исайчевым 29.11.2012г.).
На базе ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория»
проведены производственные испытания с положительным результатом по оценке эффективности реакции нарастания титра фага проб фекалий, полученных от поросят свинокомплекса «Поволжский» Чердаклинского района Ульяновской области на наличие бактерий вида Providencia с помощью специфических бактериофагов F – 67 и F – 87 серии УГСХА. Исследования проводились с 18 ноября по 23 ноября 2012 года (акт производственных испытаний утвержден директором ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» Р.М. Юсуповым 23.11.2012г).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. В хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйственных животных, бактерии рода Providencia распространены в 44% случаев.
2. Из общего количества исследуемых проб (120) патологического материала и объектов ветеринарного надзора выделены 14 изолятов бактериофагов бактерий рода Providencia, соответствующих требованиям для изготовления диагностического фагового биопрепарата.
3. Выделенные бактериофаги имеют литическую активность по Аппельману от 10-5 до 10-10, по Грациа – от 4,2 х 107 ± 0,1 х 107 до 8,3 х 109 ± 0, х 109;
спектр литической активности варьирует от 14,3 до 85,7%;
строго специфичны по отношению к Providencia rettgeri;
устойчивы к температуре до 67 С;
обработка бактериофагов F-87 УГСХА, F-67 УГСХА хлороформом, выявила выраженную устойчивость к воздействию данного агента в течение минут.
4. Разработанные технологические параметры изготовленного фагового биопрепарата позволяют получить специфический биопрепарат с высокой литической активностью.
5. Разработана схема фагоидентификации бактерий рода Providencia, которая позволяет выделить и идентифицировать эти микроорганизмы за часов.
6. Разработанная схема ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ позволяет обнаружить бактерии рода Providencia в концентрации 103 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18-22 часа.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А.
Столыпина».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Международной научно практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006), II ой открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь XXI века» (Ульяновск, 2007), Международной научно практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), Всероссийском совете молодых ученых аграрных образовательных и научных учреждений (Москва, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных (Покров,2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования (Ульяновск, 2009), III Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), IV Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития:
опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объекта, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 146 страницах (в том числе приложения на 7 страницах), включают 30 таблиц и 13 рисунков. Список использованных литературных источников включает наименования, в том числе 97 зарубежных авторов.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнялась в период с 2005-2012 год на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А.
Столыпина» с соблюдением правил безопасности при работе в бактериологической лаборатории с микроорганизмами 3 – 4 группы патогенности.
Питательные среды и реактивы: мясо-пептонный бульон (НПО «Питательные среды», г. Махачкала);
мясо-пептонный агар (0,3 %, 0,7 %, 1, %);
среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск);
среда Плоскирева («Биотехновация», г. Москва);
среда Левина (НПО «Питательные среды», г. Махачкала);
висмут-сульфит агар («Pronadisa», Madrid);
среда Симмонса (НИИ питательных сред, г. Махачкала);
среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала);
ацетатный агар (АО «Биомед» им. И.И.
Мечникова Московская обл.);
среды Гисса с индикатором ВР (НПО «Питательные среды» г. Махачкала);
реактив Ковача (Basle, Switzerland);
физиологический раствор, рН 7,2 – 7,6;
0,04 % спиртовой раствор метилового красного;
водный раствор КОН;
раствор -нафтола;
трихлорметан ТУ 6-09 4263-76 (СКТБ «Технолог»);
0,04 % спиртовой раствор генцианвиолета.
Штаммы бактерий. В работе были использованы как гомологичные, так и гетерологичные штаммы бактерий, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии и выделенные из объектов внешней среды и патологического материала.
В качестве гомологичных бактерий использовали 28 штаммов бактерий рода Providencia, из них:
- 2 референс штамма Providencia rettgeri 104а и 175, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, - 26 полевых штаммов Providencia rettgeri: А 101, Н 20, М 45, С 17, Н 5, Н 11, Н 15, Н 10, Н 3, Н 4, Д 1, Н 12, Д 73, Н 2, Н 87, Н 8, Н 6, К 1, Н 14, Д 102, Н 13, Н 9, Н 7, Н 67, Н 16, Н 17, выделенных нами из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Все штаммы бактерий рода Providencia обладали типичными для данного рода морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.
В качестве гетерологичных бактерий использовали 96 штаммов, из них:
21 штамм Proteus mirabilis, 15 штаммов Morganella morganii, 11 штаммов бактерий рода Citrobacter, 7 штаммов Enterococcus faecalis, 14 штаммов Proteus vulgaris, 5 штаммов Shigella sonnei, 7 штаммов Salmonella typhimurium, штамма бактерий рода Serratia, 3 штамма Pseudomonas aeruginosa, 2 штамма Pseudomonas putida, по 1 штаммы бактерий следующих родов и видов:
Pseudomonas fluorescens, Klebssiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., E. coli, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica. Все названные штаммы бактерий обладали типичными для них биологическими свойствами.
Исследуемые объекты: сточные воды, водопроводная вода, фекалии животных, комбикорм, патологический материал от больных и погибших животных.
14 штаммов бактериофагов рода Providencia, выделенные из объектов внешней среды.
Оборудование и лабораторная посуда: холодильники бытовые, термостат ТС – 80М-2, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80П, автоклав ГК-100-3, дистиллятор, центрифуга лабораторная ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3, водяная баня, прибор «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1, микроскопы: МБИ-3, M ХSZ-104, электронный микроскоп JЕМ-100В (г.
Москва), термометры ртутные;
колбы, мерные цилиндры, пипетки мерные (1,0;
2,0;
5,0;
10 см3);
флаконы емкостью 50, 100 см3;
стекла покровные, стекла предметные;
чашки Петри;
пробирки, штативы, груша.
Методы: Выделение и идентификацию бактерий рода Providencia проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года, использовали схему Б.С. Киселевой, В.И. Покровского, О.К. Поздеева (1999).
Выделение бактериофагов проводили по методам, предложенным Л.И.
Адельсон (1962), С. Лурия, Д. Дарнел (1970), И.П. Ревенко (1978), В.Я.
Ганюшкиным (1988), С.В. Леневым (1991), Золотухиным С.Н. (2004), Молофеевой Н.И. (2005), Пульчеровской Л.П. (2005), Феоктистовой Н.А.
(2006) Ковалевой Е.Н. (2009), Шестаковым А.Г. (2010), Журавской Н.П.
(2010), Викторовым Д.А. (2011), Семаниной Е.Н. (2011).
Биологические свойства фагов изучали по методам М. Адамса (1961), Гольдфарба (1961), Тихоненко (1968), Габрилович (1973), Ганюшкина (1988), H.-W. Ackermann (1997), Золотухиным С.Н. (2004).
Индикацию бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале проводили с помощью реакции нарастания титра фага по методике описанной В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я.
Ганюшкиным (1988), Золотухиным С.Н. (2004).
Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Бейли, 1970;
Ашмарин, Воробьев, 1987). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Выделение бактерий рода Providencia из объектов ветеринарного надзора и патологического материала Исследуемый материал высевали на дифференциально-диагностические среды (ДДС): Эндо, Плоскирева, Левина и инкубировали при температуре °С в течение 18-24 часов. На среде Эндо отбирали пышные лактозоположительные колонии серо-белого цвета диаметром 2-4 мм, или бледно-розовые, мелкие (1-1,5 мм в диаметре). На агаре Плоскирева – бледно желтые или бежевые колонии. На висмут-сульфит агаре – темно-зеленые колонии размером от 4 до 8 мм. Для дальнейшей идентификации по 4- колоний пересевали с чашек Петри на МПБ. Культуры микроорганизмов инкубировали при 37 °С 6-18 часов до появления выраженного помутнения среды.
Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с ДДС, окрашивали по Граму и микроскопировали. В случае обнаружения в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, располагающихся одиночно, парами или короткими цепочками, идентифицировали культуру по ферментативным свойствам.
Идентификацию бактерий проводили по следующим тестам (в скобках указаны результаты тестов, характерные для бактерий рода Providencia):
образование сероводорода (–), расщепление мочевины (+/–), определение подвижности (–), усвоение цитрата ( на среде Симмонса) (+), реакция с метиленовым красным (–/+), Фогес-Проскауэра (+/–). Указанные тесты позволяли нам дифференцировать бактерии рода Providencia от других родов семейства Enterobacteriaceae. При получении соответствующих результатов продолжали изучение ферментативных свойств на средах с углеводами:
глюкозой (+), лактозой (+), мальтозой (–), малонатом натрия (+/–), ставили тесты на образование индола (–/+), утилизацию ацетата (+/–) и ферментацию сорбита (+).
В результате проведенных исследований, из объектов ветеринарного надзора и патологического материала, были выделены и идентифицированы штаммов Providencia rettgeri.
3.2. Выделение бактериофагов Providencia и селекция клонов фагов Исследования, направленные на выделение умеренных бактериофагов из предположительно лизогенных бактериальных культур рода Providencia путём спонтанной индукции (Гольдфарб, 1961), а также под воздействием ультрафиолетового излучения (Лурия, Дарнелл, 1970), не позволили выявить лизогенное состояние у рассматриваемых штаммов.
Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов из объектов внешней среды (Гольдфарб, Тимаков, 1961). Материалом служили следующие объекты: сточные воды свиноводческих хозяйств и молочно товарных ферм из разных хозяйств Ульяновской, Самарской областей, республики Татарстан, сточные воды мясокомбината.
Сточные воды фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. В колбу, содержащую стерильный МПБ в количестве 50 мл, вносили 20 мл фильтрата сточных вод и по 1 мл всех имеющихся у нас штаммов бактерий рода Providencia. Таким образом, каждая проба сточной воды испытывалась на наличие фагов ко всем имеющимся культурам бактерий рода Providencia. Колбу помещали в термостат и инкубировали в течение дней при 37 °С. После этого содержимое колбы разливали в стерильные пробирки, центрифугировали, одну из пробирок с супернатантом обрабатывали хлороформом (в соотношении 1:10), а вторую прогревали на водяной бане при 58-60 °С в течение 30 минут. Такая обработка смеси позволяет выделить термоустойчивые и устойчивые к воздействию хлороформа фаги. Полученные пробы исследовали методом агаровых слоев по Грациа. Чашки ставили в термостат на 18-24 часа при 37 °С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага.
Сточные воды свиноводческих хозяйств и МТФ, мясокомбината Ульяновской обл., фекалии животных Фильтрат 20 мл МПБ 50 мл В термостат 37 °С на 5 суток Центрифугат 1. Обработка 2. Обработка хлороформом температурой (1 : 10) 30 мин (58 – 60 °С) 30 мин Посев по методу Грациа положительный отрицательный Наличие негативных колоний или зон лизиса Рис. 1. Схема выделения бактериофагов Providencia из объектов ветеринарного надзора Образовавшиеся негативные колонии или часть зоны лизиса отвивали на МПБ с индикаторными культурами. Для этого в две пробирки с 4,5 мл МПБ (рН 7,4 – 7,6) добавляли стерильной пипеткой 0,2 мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры бактерий рода Providencia. В одну из пробирок отвивали негативную колонию, а вторая пробирка служила контролем. Посевы помещали в термостат и инкубировали их при 37 °С до выраженного помутнения в контрольной пробирке (4-6 часов). Затем содержимое опытной пробирки освобождали от микробных клеток прогреванием на водяной бане при 58-60 °С в течение 30 минут. Прогретый фильтрат переносили стерильной пипеткой в пробирку и использовали для дальнейшего пассирования фага.
Селекцию и повышение литической активности выделенных бактериофагов осуществляли с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, предложенной И.М. Габриловичем (1992);
С.Н. Золотухиным (1994, 2007).
Готовили разведение фага в мясопептонном бульоне рН (7,2-7,4) от 10- до 10-9. Фаг высевали методом агаровых слоев (по Грациа), используя разведения 10-6-10-9, таким образом, чтобы на питательном агаре сформировались отдельные негативные колонии. После 24-часового инкубирования в термостате, отвивали бактериологической петлей одну негативную колонию, расположенную изолированно от других не менее чем на 10 мм и помещали в пробирку с мясопептонным бульоном, туда же вносили 18 часовую бульонную индикаторную культуру Providencia в количестве 0,2 мл.
Одновременно ставили контроль – мясопептонный бульон с индикаторной культурой без фага. Опытные и контрольные пробирки культивировали в термостате при 37 °С в течение 4-6 часов. Полученные фаголизаты прогревали на водяной бане при 58-60 °С 30 минут и исследовали методом агаровых слоев.
Отбирали идентичную исходной негативную колонию и пассировали. В результате проведенных исследований из объектов внешней среды нами выделены и селекционированы 14 штаммов бактериофагов Providencia.
3.3. Характеристика фагов бактерий рода Providencia Морфологию негативных колоний изучали в разведении фагов 10 -7-10-9 с индикаторной культурой на питательном агаре в посевах методом агаровых слоев по Грациа. Учет проводили через 18-24 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С. Отмечали величину негативных колоний, форму, степень прозрачности, характер краев колоний, наличие и величину неполного лизиса.
Образовавшиеся негативные колонии разделили на два типа (Бабков, 1973).
К первому типу относятся четкие прозрачные колонии округлой формы, с ровными краями, диаметром от 1,0 до 2,0 мм. Колонии второго типа – прозрачные колонии округлой формы, с ровными краями, диаметром от 3,0 до 4,0 мм, с отсутствием зоны неполного лизиса, без вторичного роста культуры.
Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах. Активность по методу Аппельмана выражается максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема по методу Грациа. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Литическая активность бактериофагов рода Providencia № Название фага Индикаторная Активность фагов пп культура по Аппельману по Грациа 10-5 1,1 х F-73 УГСХА Providencia rettgeri 104а +0,2 х 10-6 1,5 х F-45 УГСХА Providencia rettgeri Д +0,1 х 10-6 3,2 х F-17 УГСХА 3 Providencia rettgeri H +0,1 х 10-6 5,3 х F-20 УГСХА 4 Providencia rettgeri 104 a +0,3 х 10-6 1,1 х F-1 УГСХА Providencia rettgeri Д +0,3 х 10-5 1,4 х F-70 УГСХА Providencia rettgeri Д +0,2 х 10-5 7,1 х F-9 УГСХА Providencia rettgeri М +0,3 х 10-5 2,4 х F-7 УГСХА Providencia rettgeri Н +0,2 х 10-9 4,2 х F-67 УГСХА Providencia rettgeri Н +0,1 х 10-10 1,8 х F-87 УГСХА Providencia rettgeri Н +0,2 х 10-5 1,4 х F-36 УГСХА 11 Providencia rettgeri C +0,3 х 10-6 2,6 х F-38 УГСХА Providencia rettgeri Н +0,1 х 10-5 2,5 х F-28 УГСХА 13 Providencia rettgeri 104a +0,4 х 10-8 2,5 х F-41 УГСХА 14 Providencia rettgeri +0,2 х Для изучения спектра литической активности использовали метод нанесения капель бактериофагов на газон исследуемой культуры (Ганюшкин, 1988;
Золотухин, 2004). В качестве исследуемых культур использовали штаммов бактерий рода Providencia.
В результате проведенных исследований нами установлено, что изученные фаги обладали разным диапазоном литической активности.
Широким диапазоном по отношению к изучаемым культурам обладают фаги F 73 УГСХА и F-17 УГСХА – 60,7 %, F-20 УГСХА, F-1 УГСХА и F-28 УГСХА – 64,3 %, F- 9 УГСХА и F-41 УГСХА – 53,6 %, F-67 УГСХА – 85,7%, F- УГСХА – 82,1 %.
Для дальнейшего изучения отобрали два бактериофага с наибольшим диапазоном по отношению к изучаемым культурам – фаг F-87 УГСХА, который лизировал 82,1 % и фаг F-67 УГСХА – 85,7 % штаммов бактерий рода Providencia, а в сумме фаги проявили литическое действие в отношении 96,4 % всех исследованных культур.
Изучение специфичности бактериофагов рода Providencia по отношению к представителям следующих видов: Proteus mirabilis, Morganella morganii, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Klebssiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, а так же Streptococcus spp., Citrobacter spp., Serratia spp. проводили методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры (Ганюшкин, 1988).
В результате изучения чувствительности бактериофагов к действию температуры, установили, что фаги F-87 УГСХА, F-67 УГСХА понижали свою физиологическую активность при температуре 67 °С и инактивировались при температуре 810 С (F-87) и 880 С (F-67 УГСХА) в течение 30 минут.
Обработка бактериофагов F-87 УГСХА, F-67 УГСХА хлороформом, выявила выраженную устойчивость к воздействию данного агента в течение минут.
3.4. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов Providencia Для разработки технологических параметров изготовления и контроля индикаторных бактериофагов Providencia использовали отобранные штаммы фагов F-87 УГСХА, F-67 УГСХА и индикаторные культуры Providencia rettgeri Н 87, Providencia rettgeri Н 67. Индикаторные бактериофаги Providencia изготавливали путем культивирования в питательном бульоне (рН 7,4-7,6) с индикаторными бактериальными культурами.
Индикаторные культуры хранили на полужидком МПА (рН 7,2-7,4) с 0,3% агара при температуре 2-4 С и пересевали каждые 2-3 месяца.
3.5. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий рода Providencia Учитывая строгую специфичность отобранных бактериофагов F-87 и F- серии УГСХА по отношению к штаммам бактерий рода Providencia, мы разработали схему ускоренной идентификации данных микроорганизмов (рис.
2). Посев материала производили на среды: Эндо, Плоскирева, Левина, инкубировали при 37 °С 18-20 часов. Для дальнейшего изучения отобранные колонии с чашек пересевали в МПБ, МПА и инкубировали при °С 6-18 часов до появления выраженного помутнения среды. Бактериальные культуры микроскопировали (окраска по Граму) и при обнаружении в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, располагающихся единично парами или короткими цепочками, подвергали фагоидентификации и идентифицировали по биохимическим свойствам.
Бактериологический метод Биохимические свойства выделенных штаммов изучали в соответствии с выше упомянутыми методическими указаниями. По результатам изучения биохимических свойств определили родовую принадлежность культур (табл.
2).
Таблица 2 – Идентификация выделенных штаммов бактериологическим методом Тесты р-я Фогес-Проскауэра образование индола цитрат Симмонса р-я с метилротом Обозна Род и вид образование H2S Объекты чение микроорганизм фенилаланин исследования подвижность пробы ов малонат сорбит ацетат 1в – – – – – + + + + + E. coli вода 2в – – – – + + + + + + spp.Providencia 3в – – – – + + + + + + spp.Citrobacter 1к – – – – – + + + + + E. coli комбикорм 2к – – – – – + + + + + spp.Providencia 3к – – – – + + + + + + spp.Citrobacter 1ф – – – – – + + + + + spp.Proteus 2ф – – – – + + + + + + spp.Serratia 3ф – – – – – + + + + + spp.Providencia фекалии 4ф – – – – – + + + + + E. coli 5ф – – – – – + + + + + spp.Proteus 6ф – – – – – + + + + + E. coli мясо 1м – – – – – + + + + + spp.Providencia Фагоидентификация На поверхность МПА в чашки Петри пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 6-18 часовой культуры исследуемых микроорганизмов, равномерно распределяли по поверхности среды. Чашки ставили в термостат для подсушивания газона на 15-20 минут. Дно чашки маркером делили на три сектора: на поверхность засеянной среды первого и второго секторов, пипеткой легким прикосновением капли, наносили по одному штамму фагов, на третий сектор по центру в качестве контроля наносили стерильный МПБ. Чашки после подсушивания помещали в термостат на 18-24 часов при 37 °С. Результат считали положительным, если на месте нанесения хотя бы одного из штаммов фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса. Фагоидентификация выделенных изолятов бактерий рода Providencia во всех объектах подтверждена результатами исследований биохимических свойств (табл. 3).
Были проведены исследования по определению минимальной концентрации микробных клеток в исследуемых объектах (табл. 4), при которой возможно обнаружить бактерии рода Providencia бактериологическим методом.
По результатам данных исследований заражающая концентрация микробных клеток бактерий рода Providencia в объектах исследования составила 2,3 х 104 м.к./мл. При исследовании фекалий чувствительность понижается до 3,5 х 105 м.к./мл из-за обильной обсемененности посторонней микрофлорой.
Таблица 3 – Фагоидентификация выделенных штаммов Результаты Результат Исследуем Обозначен идентификации по F-87 F- фагоидентифи ый объект ие пробы УГСХА УГСХА биохимическим кации свойствам 1в – – – E. coli вода 2в + + Providencia spp.Providencia 3в – – – spp.Citrobacter 1к – – – E. coli комбикорм 2к – + Providencia spp.Providencia 3к – – – spp.Citrobacter 1ф – – – spp.Proteus 2ф – – – spp.Serratia 3ф + + Providencia spp.Providencia фекалии 4ф – – – spp.Citrobacter 5ф – – – E. coli 6ф – – – spp.Proteus 7ф – – – E. coli мясо 1м – + Providencia spp.Providencia Время, затраченное на исследование, час 48 Таблица 4 – Обнаружение бактерий рода Providencia в различных концентрациях бактериологическим методом Объекты Количество микробных клеток в 1 мл (г) исследования 102 103 104 Вода – – – + + Мясо – – – + + Комбикорм – – – + + Фекалии – – – – + Примечание: «+» – положительный результат, «–» – отрицательный результат.
Таким образом, схема фагоидентификации в сравнении с традиционной схемой, изложенной в вышеупомянутых методических указаниях, позволяла сократить сроки исследования в два раза, результат получали спустя 48 часов с меньшими затратами посуды и реактивов. В то время как бактериологическим методом время исследования занимало 96 часов (рис.2).
Исследуемый I II материал Посев на дифференциально диагностические среды: Эндо, 24 часа Плоскирева, Левина Микроскопия (окраска по Граму) 18 – 24 часа 6 – 18 часов Отбор колоний и пересев в МПБ, МПА Посев газона культуры на Посев на среды для чашки с МПА и изучения биохимических фагоидентификация свойств, пересев на МПА 18 – 24 часа 48 – часов положите отрицате льный льный положитель отрицател ный ьный Providencia Providencia 48 часов (2 суток) 96 часов (4 суток) Рис.2. Выделение и ускоренная идентификация бактерий рода Providencia с помощью бактериофагов (I) в сравнении со схемой бактериологического исследования (II) 3.6. Разработка оптимальных условий постановки РНФ Для определения параметров постановки РНФ и разработки количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, при разной заражающей концентрации, исследование проводили по методике, предложенной В.Я. Ганюшкиным (1988), с использованием МПБ контаминированного 18-часовыми индикаторными культурами (Providencia rettgeri Н 87, Providencia rettgeri Н 67) от 101 до 105 м.к./мл.
Фаги F-87 УГСХА, F-67 УГСХА использовали в рабочем разведении, содержащем не более 105 фаговых корпускул в миллилитре. В колбы с 50 мл МПБ вносили индикаторные культуры в концентрации 105, 104, 103, 102, м.к./мл. Готовили 3 широких пробирки для каждого разведения культуры и контроля. В пробирки № 1, № 2 вносили по 9 мл МПБ с культурой, в пробирку № 3 – 9 мл стерильного МПБ. Затем в пробирки № 1, № 3 добавляли 1 мл индикаторного фага в рабочем разведении, а в пробирку № 2 вносили по 1 мл МПБ (контроль на присутствие свободного фага).
Пробирка № 1 с контаминированным МПБ и индикаторным фагом является опытной. Пробирка № 2 (контаминированная бактериями рода Providencia) без фага была контрольной для выявления в пробе МПБ свободного фага. Пробирки № 3 – контроль на титр индикаторного фага. После культивирования при 37 °С содержимое каждой пробирки разводили МПБ (рН 7,4-7,6) так, чтобы при высеве 1 мл содержимого из пробирки № 3 (контроль на титр фага) на чашках образовалось несколько десятков негативных колоний фага. В пробирке № 3 индикаторный фаг находился в концентрации нескольких тысяч корпускул в 1 мл, и для того, чтобы получить в конечном разведении несколько десятков корпускул в 1 мл, содержимое пробирки № 3 разводили в 20 раз, т.е. 0,25 мл исследуемой смеси вносили в 4,5 мл МПБ. Содержимое опытных пробирок № 1 и № 2 разводили аналогично. Инактивацию бактерий разведенных смесей пробирок № 1, № 2, № 3 проводили прогреванием в водяной бане при температуре 58-60 °С в течение 30 минут. После этого, содержимое пробирок исследовали на определение числа корпускул фага методом агаровых слоев. Высевы методом агаровых слоев проводили через часов инкубации исследуемого материала с фагом в термостате при 37 °С. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования, подсчитывая число негативных колоний фага, образовавшихся на плотной питательной среде в опытной пробе и в контроле.
При наличии в исследуемом материале свободного фага (пробирка № 2) подсчитывали число фаговых частиц на чашке и вычитали из числа фаговых частиц индикаторного фага в опытных чашках (пробирка № 1). Полученную разницу сравнивали с контролем (пробирка № 3). РНФ, оцененная как сомнительная или слабо положительная, не имела диагностического значения.
Учитывалось увеличение титра в 5 и более раз.
Установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых корпускул в контрольных пробах при контаминации МПБ бактериями рода Providencia в концентрации 2,5 х м.к./мл для фага F-87 УГСХА и 2,8 х 104 м.к./мл для фага F-67 УГСХА.
Для установления оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями, необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ.
Наиболее оптимальным являлся режим РНФ при 6-часовой инкубации исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в концентрации 103 микробных клеток в 1 мл исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов. Однако чувствительность РНФ повышается там, где режим инкубации общего времени составляет 22 часа, и позволяет обнаруживать бактерии (Providencia rettgeri Н 87, Providencia rettgeri Н 67) в концентрации 102 м.к./мл. Бактериологическим методом удалось обнаружить бактерии рода Providencia в концентрации 3,8 х 104 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось до 96 часов.
ВЫВОДЫ 1. В объектах ветеринарного надзора и патологическом материале Providencia обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолировано и идентифицировано 26 штаммов Providencia rettgeri.
2. Из 120 проб объектов внешней среды было выделено и селекционировано 14 бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Providencia.
3. Выделенные фаги имеют литическую активность от 10-5 до 10-10 по Аппельману и от 4,2 х 107 ± 0,1 х 107 до 8,3 х 109 ± 0,2 х 109 фаговых корпускул в 1 мл по Грациа. Установлено, что два бактериофага отличались широким диапазоном литической активности: F-87 УГСХА лизировал 82,1 % штаммов бактерий рода Providencia, F-67 УГСХА – 85,7 %, а в сумме фаги лизировали 96,4 % всех исследованных культур. Они обладали строгой специфичностью:
не лизировали бактерии других родов и семейств.
4. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля бактериофагов Providencia позволяют получить специфический диагностический препарат штаммов F-87 УГСХА и F-67 УГСХА с высокой литической активностью. Разработанная схема с применением фагов F- УГСХА и F-67 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Providencia за 48 часов.
5. Штаммы фагов F-87 УГСХА и F-67 УГСХА были устойчивы к воздействию высокой температуры. Нижний порог термоинактивации составляет 67 С, верхний – 88 С. Фаги не меняют литической активности при воздействии хлороформа в течение 40 минут.
6. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора и в патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (F-87 УГСХА и F-67 УГСХА), позволяют обнаружить бактерии рода Providencia в концентрации 103 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18 22 часа.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Для изготовления диагностического фагового биопрепарата диагностикума предлагаются в качестве производственных штаммы фагов F- УГСХА и F-87 УГСХА.
2. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Providencia F-67 УГСХА и F- УГСХА», 3. Индикацию и идентификацию бактерий рода Providencia следует проводить с помощью набора диагностических фагов согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Providencia в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов F- УГСХА и F-87 УГСХА.
4. Материалы научных исследований по выделению и изучению биологических свойств бактериофагов рода Providencia рекомендованы для включения в список учебно-методической литературы для студентов и аспирантов по дисциплинам: биотехнология, микробиология, вирусология по биологическим, медицинским и ветеринарным специальностям и направлениям.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Барт Н.Г. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий / Н.Г. Барт [и др.] // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Материалы международной научно-практической конференции, Ульяновск, 2006. – С. 227 231.
2. Барт Н.Г. Разработка оптимального метода выделения диагностического препарата / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А.Васильев // Молодежь XXI века: Материалы II-ой открытой Всероссийской научно практической конференции молодых ученых, 24-26 апреля, 2007. – Ульяновск, 2007. – Ч.1. – С.34-36.
3. Барт Н.Г. Определение устойчивости бактериофагов и бактерий рода Providencia к воздействию хлороформа / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А.Васильев // Молодежь XXI века: Материалы II-ой открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, 24-26 апреля, 2007. – Ульяновск, 2007. – Ч.1. – С.36-38.
4. Барт Н.Г. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Providencia / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА, 20-22 мая 2008. – Ульяновск, 2008.
– Т. 4. – С. 22-24.
5. Барт Н.Г. Выделение фагов бактерий рода Providencia из объектов внешней среды и патологического материала // Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А.
Васильев // Труды Всероссийского совета молодых ученых аграрных образовательных и научных учреждений. – Москва, 2008. – С. 92-95.
6. Барт Н.Г. Выделение, селекция и изучение некоторых биологических свойств бактериофагов Providencia / Н.Г. Барт, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных:
Материалы международной научно-практической конференции, 13-14 ноября, 2008. – Покров, 2008. – Т. I. – С. 36-39.
7. Барт Н.Г. Бактериофаги Providencia / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А.Васильев // Аграрная наука и образование на современном этапе развития:
опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно практической конференции, 26-28 мая, 2009. – Ульяновск, 2009. – С. 140-146.
8. Барт Н.Г. Биологические свойства бактериофагов Providencia / Н.Г.
Барт, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции.
– Ульяновск, 2009. – С. 202-204.
9. Барт Н.Г. Изменение литической активности бактериофагов Providencia при хранении / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: Материалы III Международной научно практической конференции. – Ульяновск, 2010.– С. 4-5.
10. Барт Н.Г. Разработка методов диагностики, лечения и профилактики инфекционных заболеваний с использованием биопрепарата на основе бактериофагов Providencia / Н.Г. Барт, А.С. Мелехин // Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно-практической конференции. – Ульяновск, 2011. – С.
46-49.
11. Барт Н.Г. Выделение фагов бактерий рода Providencia и изучение их биологических свойств / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Вестник ветеринарии – Ставропольский ГАУ, вып. 59. – 2011. – № 4. – С. 47-48.
12. Барт Н.Г. Выделение бактериофагов рода Providencia / Н.Г. Барт, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы IV Международной научно-практической конференции – Ульяновск, 2012.– С.
236-239.
Подписано в печать 22.02. Формат 60х84 1/16. Печать офсетная Усл.печ.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 432017, Ульяновск, бульвар Новый Венец,