Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами
На правах рукописи
Касаткина Арина Николаевна
Зерновая дробина как основа для получения биологически
активных добавок с пробиотическими свойствами
Специальность: 03.00.23. – Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание
ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2008
Работа выполнена на кафедре биотехнологии инженерного экологического факультета Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Громовых Татьяна Ильинична доктор технических наук Иванова Людмила Афанасьевна
Ведущая организация: ОАО Государственный научно исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентст ва по управлению Федеральным имущест вом (ФГУП ГОСНИИ Синтезбелок)
Защита состоится 2 декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного Совета ДМ 212.204.13 при Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менде леева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, тел. (499) 978-74-66, факс (499) 978 74-92.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им.
Д.И. Менделеева
Автореферат разослан «_»_2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 И.В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Разработка способов получения биологически активных со единений и белково-углеводных кормовых продуктов из целлюлозосодержащих материа лов является одним из актуальных направлений развития современной биотехнологии.
Опыт, накопленный в России, показывает эффективность использования методов микро биологического синтеза для решения проблемы обеспечения животноводства высокоцен ным белком при использовании в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельско го хозяйства, лесной, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и др. [Л.К.
Эрнст, 1988].
К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с после дующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофазным культивировани ем микроорганизмов [В.И. Шарков и др., 1973;
В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985;
Е.Г.
Борисенко и др., 2003;
В.И. Панфилов, 2004].
Широкое использование антибиотических и других фармацевтических средств в настоящий период развития человечества в условиях напряженного состояния окру жающей среды обусловило важность использования пробиотических препаратов для со хранения здоровья человека. Большое внимание исследователей и практиков уделяется получению пробиотических продуктов для животноводства, что связано, в первую оче редь, с проблемами отечественного кормопроизводства. В последние годы структура фуражных кормов в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вы нужденному введению в комбикорма трудно перевариваемых и низкокалорийных компо нентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо, пивная дробина и др.). При этом отрицательное влияние на биологическую ценность фуражных кормов оказывает также использование в их составе белков, в основном, растительного происхождения (соевый, подсолнечный и рапсовый шроты, горох и др.), что приводит к увеличению доли трудно перевариваемых компонентов в кормах [Э.В. Удалова и др., 2004]. Разработка способов повышения сте пени усвояемости этих компонентов – одна из важных биотехнологических задач.
Одним из промышленных крупномасштабных трудноусвояемых целлюлозосодер жащих отходов является зерновая дробина – отходы пивоваренного и спиртового произ водства (до 35 млн. т/год в РФ), которые в настоящее время направляются либо на очист ные сооружения, либо сливаются на поля орошения и в водоемы, что наносит экологиче ский ущерб окружающей среде.
Дробина в нативном состоянии не является биологически ценным кормовым про дуктом, так как в ее составе преобладают целлюлоза, гемицеллюлозы и трудноперевари ваемый протеин. Она является источником лишь ряда питательных веществ, в частности, углеводов и минеральных веществ. Однако дробина не обладает токсичными свойствами, что, несмотря на ее низкую усвояемость и биологическую ценность, определяет возмож ность ее непосредственного использования в кормовых целях [И. Егоров и др., 2006;
Е.
Калошина и др., 2006;
В. Двалишвили и др., 2007].
Анализ литературы, касающийся исследований и разработки способов повышения биологической ценности зерновой дробины, показывает, что эффективность биотехноло гических способов получения биологически активных кормовых добавок на ее основе может быть повышена за счет совершенствования способов биоконверсии целлюлозосо держащих компонентов сырья и биосинтетической активности культивируемых на гидро лизатах микроорганизмов.
Целью настоящей работы явилось исследование способов получения белково углеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами на основе зерновой дроби ны.
В задачи работы входило:
- изучение гидролиза зерновой дробины при использовании нативных целлюлолитических ферментов микроорганизмов и промышленных мультиэнзимных композиций;
- разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на фермента тивных гидролизатах зерновой дробины с целью получения белково-углеводной кормовой добавки и добавки, обогащенной селеном и йодом;
- твердофазное культивирование бактерий рода Bacillus на зерновой дробине;
- культивирование молочнокислых бактерий и их ассоциаций на нативной дробине и ее ферментолизатах;
- исследование возможных способов получения БАД, обладающих пробиотическими свойствами.
Научная новизна результатов исследований. Исследована возможность получения БАД с различными функциональными свойствами (белково-углеводная добавка, белково углеводная добавка, обогащенная селеном и йодом и белково-углеводная добавка, обла дающая пробиотическими свойствами) на основе зерновой дробины при культивировании дрожжей и молочнокислых бактерий. Впервые изучено влияние культуральной жидкости гриба Trichoderma viride, целевых мультиэнзимных композиций и бактерий рода Bacillus на ферментативную деструкцию зерновой дробины. Исследовано стабилизирующее дей ствие химических аналогов факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолов – на комплекс ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции. Исследован угле водный состав ферментативных гидролизатов дробины, показано, что наибольшую долю углеводов составляют пентозы. Впервые показан активный рост молочнокислых микроор ганизмов на ферментолизатах дробины, обогащенных автолизатом предварительно куль тивируемых микроорганизмов (дрожжей, грибов и бактерий). Показана наибольшая ак тивность инокулята ассоциативных культур кефирных грибков при культивировании на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.
Практическая значимость. Разработаны технологические режимы переработки зерновой дробины - отходов пивоваренного производства – для получения белково углеводной кормовой добавки, исследованы двухстадийные процессы культивирования дрожжей и молочнокислых культур на ферментолизатах дробины, включающих стадию автолиза дрожжевых клеток, а также показана возможность переработки дробины в ана эробных условиях при использовании штамма бактерий Bacillus cereus БП-46, обладаю щего целлюлолитической активностью.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство-технологии экология» (Киров, 2006);
на IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчин никова (Пущино, 2006);
на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». (Москва, 2007.);
и Российской школе–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвя щённой 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва – Пущино, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страни цах машинописного текста, содержит 48 таблиц и 33 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы и 4 глав экспериментальных исследований. Список литературы вклю чает 168 источников, из них 38 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформули рованы цель и задачи исследований.
В первой главе представлен систематизированный обзор научно-технической, нормативной и патентной литературы, в котором представлена характеристика возмож ных способов переработки зерновой дробины, рассмотрены способы биодеградации цел люлозосодержащего сырья и повышения биологической ценности.
Во второй главе описаны экспериментальные методы исследований и даны харак теристики объектов исследований. Для выполнения экспериментальной части использова лись стандартные методы испытания и современные приборы и оборудование.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали отходы пивоваренного производства – нативную зерновую дробину (влажность 80-90%) и измельченную воздушно-сухую (влажность 10%), пре доставленные, соответственно, Очаковским пивоваренным заводом и частной пивоварней «Wienen Bier».
В работе использовали штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставлен ный Звягильской Р.А., штамм гриба Trichoderma viride из коллекции кафедры биотехноло гии РХТУ им. Д.И. Менделеева, штамм Bacillus cereus БП-46, выделенный Ушаковой Н.А.
из слепой кишки большой полевки (институт проблем экологии и эволюции животных им.
А.Н. Северцова РАН);
штаммы молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus casei– B 7657, Lactobacillus acidophilus – AT-41, Lactococcus lactis ТБ2 из коллекции института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского и из института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, кефирные грибки, используемые для приготовления заква сок на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, а также неидентифицированные молочнокислые бактерии, растущие на глюкозе, выделенные из кефирных грибков;
штамм условно-патогенной культуры Staphylococcus aureus из коллекции кафедры био технологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также культуру инфузории Tetrahymena pyri formis, предоставленную Долговым В.А. (Институт ветеринарной санитарии).
Определение химического состава зерновой дробины и полученных на ее основе продуктов проводили по гостированным методикам: влажность [ГОСТ 1396.3 92(27548.97)];
«сырой» протеин [ГОСТ 1396.4(2874-89)];
«сырая» клетчатка [ГОСТ 1396.2-91];
«сырая» зола [ГОСТ 26226-95];
содержание безазотистых экстрактивных ве ществ - расчетным методом. Для определения первоначальной влажности, сырого протеи на и сырой клетчатки использовали также метод ИК-спектроскопии (ближняя область ин фракрасного спектра). Определение проводили на ИК-анализаторе, модель 4500, Aptek, США-Россия.
Микотоксины в исходном сырье и конечных продуктах анализировали с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа RIDASCREEN® FAST, R-Biopharm, Гер мания.
Ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства ввиду гетерофазно сти процесса осуществляли при перемешивании 80-100 об/мин, t - 50±0,5°С, рН среды – 5,0-5,5, время экспозиции – 2 часа. В качестве ферментных препаратов применяли культу ральную жидкость гриба Trichoderma viride, а также мультиэнзимные композиции Ф-ПД 1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, разработанные НТЦ «Лекарства и биотехнология».
Ферментативную активность определяли согласно стандартным методикам: целлю лолитическая активность [ТУ 9291-036-3458871-2001];
ксиланазная активность [ТУ 9291 034-34588571-2001];
-глюканазная активность [ТУ 9291-034-34588571-2001];
протеоли тическая активность [ГОСТ 20264.2-88];
амилолитическая активность [ГОСТ 20264.4-89];
эндоглюканазная активность – вискозиметрический метод в модификации [А.П. Синицын и др., 1995].
При изучении стабилизации мультиэнзимных композиций использовали химические аналоги факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолы (АОБ) – С7 и С12-соединения (Sigma), степень очистки С7 – 0,8;
С12 – 0,9999, предоставленные институтом микробиоло гии им. С.Н. Виноградского РАН.
Определение углеводного состава ферментолизатов пивной дробины проводили ме тодом тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» (РФ), ТУ 26–11–17–89. Коли чественный состав углеводов оценивали на денситометре «Sorbfil», (Россия), ТУ 4436 003-16943778-99.
Грибы и дрожжи культивировали в глубинных гетерофазных условиях в колбах объ емом 250 и 750 см3 при 100 и 500 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180-200 об/мин.) при 30-32°С и 28-30°С, соответственно;
молочнокислые микроорганиз мы - в анаэробных условиях при 37,5±0,20С в пробирках объемом 30 см3 и в колбах объе мом 50 и 250 см3 при 20, 30, 100 и 150 см3 питательной среды, соответственно;
бациллы – в колбах объемом 250 см3 при 100 и 150 см3 питательной среды при инкубировании на ка чалке (180-200 об./мин) при 29-300С.
Твердофазное культивирование грибов осуществляли при температуре 300С в тече ние 5-ти суток в лабораторном реакторе, оснащенном компрессором, обеспечивающим расход воздуха через стерильный воздушный фильтр до 2,4 л/мин. Твердофазное культи вирование бактерий Bacillus cereus БП-46 – в колбах объемом 500 и 750 см3 при 70-75% ном заполнении в течение 48 часов при температуре 30±1°С в микроаэрофильных услови ях.
Автолиз дрожжей проводили в течение 12 часов при 400С в анаэробных условиях.
Для автолиза грибов использовали модифицированный метод [Аладашвили Н.В. с соавт., 1991] с добавлением этилового спирта в концентрациях от 1,0 до 3,0%, при 550С продол жительность экспозиции составляла 23 часа. Продукт после твердофазного культивирова ния бацилл на зерновой дробине в течение 24 часов выдерживали при температуре 550С в анаэробных условиях, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеи новую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Але нова, 1990 г.].
Молочную кислоту определяли методом Баркера-Саммерсона [S.B. Barker and Wil liam H. Summerson, 1940];
восстанавливающие сахара – модифицированным методом Шомоди-Нельсона и фенол-сернокислым методом Дюбуа [А.П. Синицын и др., 1995].
Уровень содержания селена и йода в кормовых добавках определяли методом спек трофотовольтометрии, Р.4.1.1672-03 «Руководство по методам и анализам БАВ в пище».
Острую токсичность полученных кормовых добавок определяли на тест-объекте ин фузории Tetrahymena pyriformis [ГОСТ 28178-89].
Пробиотическую активность бацилл и молочнокислых культур характеризовали на основании их устойчивости к температуре 60-650С, к желчи, ферментам пищеварительно го тракта, поваренной соли (NaCl), фенолу, к щелочной реакции среды [Л.А. Банникова, 1975, Ж.К. Тулемисова, 2002].
Антагонистические свойства продуктов в отношении патогенных культур определя ли методом диффузии в агаризованные среды МПА, ГПС и MRS [Н.С. Егоров, 1986, Ж.К.
Тулемисова, 2002].
Оценку симбиотических свойств штамма Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур проводили при их совместном культивировании на твердых питательных средах ГПС и MRS.
Идентификацию штамма Bacillus cereus БП-46 проводили методом мультисубстрат ного тестирования (МСТ) при использовании системы МСТ «ЭКОЛОГ» [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005]. Регистрацию данных МСТ при использовании программно аппаратного комплекса ЭКОЛОГ (автор–М. В. Горленко). Для математической обработки данных МСТ использовали статистические пакеты STATISTICA.
Статическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета статисти ческих программ Microsoft Office Excel 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В третьей главе представлены результаты исследований ферментативных гидроли затов зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных биологически ак тивных кормовых добавок.
Зерновая дробина - отход пивоваренных и спиртовых производств - представляет со бой нерастворимые оболочки зерна.
Химический состав исследованных образцов дробины Очаковского пивоваренного завода и частной пивоварни «Wienen Bier» показывает незначительное различие по со держанию «сырой» клетчатки и «сырого» протеина: 19,0 и 18,0% а.с.в. и 25,0 и 21,0% а.с.в., соответственно (таблица 1). Высокое содержание клетчатки в дробине до 19,0% и лигнина до 10,0% обосновывает необходимость использования комплекса гидролитиче ских ферментов для ее деструкции и возможность использования данного сырья для по лучения белково-углеводных кормовых добавок с различными функциональными свойст вами.
Таблица Химический состав зерновой дробины (% а.с.в.) Партия дроби- Лигнин БЭВ «Сырой» «Сырая» «Сырая» «Сырой»
ны протеин клетчатка зола жир Отходы Оча ковского пиво 25,0±0,25 19,0±0,22 3,9±0,11 5,3±0,12 10,0±0,19 36,8±0, варенного заво да Отходы частной пивоварни 21,0±0,23 18,0±0,18 3,5±0,12 5,1±0,10 9,5±0,23 42,9±0, «Wienen Bier»
Предподготовка зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных кормовых БАД включала стадии ее сушки (до остаточной влажности 7-8%), измельчения (1,5-2,0 мм), суспендирования и ферментативной обработки. При изучении реологических свойств водной суспензии измельченной дробины было показано хорошее перемешивание суспензии при содержании сырья 10% (масс.). Все дальнейшие исследования проводили при 10%-ной концентрации зерновой дробины в суспензии, при этом в водной фазе опре делялось до 8,0 г/л легко экстрагируемых редуцирующих веществ (РВ).
Ферментативную деструкцию зерновой дробины изучали при использовании натив ных целлюлитических ферментов грибов рода Trichoderma и бактерий рода Bacillus, а также промышленных мультиэнзимных композиций.
Биодеградация дробины грибом Trichoderma viride Было исследовано влияние характера посевного материала гриба Tr. viride (споры и вегетативные клетки) на его рост и целлюлолитическую активность при развитии на зер новой дробине в глубинной и поверхностной культуре. Показано, что на измельченной дробине (15,-2,0 мм) в качестве инокулята могут быть использованы обе формы посевного материала, на нативной дробине – только вегетативные клетки.
Поскольку ферменты целлюлазного комплекса являются индуцибельными, было изучено влияние различных индукторов на целлюлолитическую активность гриба Tr.
viride. Показано, что измельченная зерновая дробина наряду с такими известными индук торами, как свекловичный жом, пшеничные отруби, кристаллическая целлюлоза и лакто за, также является эффективным индуктором целлюлаз.
На третьи сутки культивирования в глубинной культуре целлюлазная активность гриба составляла около 25,0 ед./мл, при твердофазном культивировании – 19,0 ед./мл.
При исследовании ингибирования целлюлолитической активности Tr. viride продук тами гидролиза дробины установлено, что ферментативная активность гриба снижалась при дополнительном внесении глюкозы с систему в концентрациях выше 0,4%, что обос новывает целесообразность ассимилирования редуцирующих веществ, образующихся при гидролизе зерновой дробины, другими организмами для повышения активности роста гриба и его целлюлолитической активности на дробине.
Поскольку при культивировании грибов на целлюлозосодержащих субстратах цел люлолитические ферменты секретируются ими непосредственно в культуральную жид кость (КЖ), была исследована возможность использования культуральной жидкости гриба Tr.viride в качестве ферментного препарата для гидролиза зерновой дробины.
Культуральная жидкость была получена при культивировании гриба на измельчен ной дробине Tr.viride, целлюлолитическая активность которой составляла около 25, ед./мл.
Для ферментативной обработки дробины культуральную жидкость стандартизовали, предварительно разбавляя ее таким образом, чтобы на 1 г дробины приходилось не более единиц целлюлолитической активности. Клетки гриба от КЖ не отделяли.
Была изучена динамика накопления редуцирующих сахаров в зависимости от соот ношения «фермент-субстрат» (количество гидролизуемой дробины составило 1,0;
2,0;
3,0;
4,0;
5,0;
10,0;
15,0 и 20,0%) и продолжительность ферментолиза. Гидролиз проводили при t =500С, pH=5,0 и интенсивности перемешивания 80-100 об/мин.
Результаты исследований, представ 18, ленные на рис.1 показали, что концентра 16, ция редуцирующих сахаров в течение 1% 14,00 2% 3% мин. инкубирования увеличивалась при 4% 5% 12,00 10% повышении содержания дробины в среде 15% 20% масс. конц. дробины 10, РВ, г/л от 1,0 до 10,0% (масс.). При дальнейшем 8, повышении концентрации сырья от 10,0 до 20,0% содержание РВ было практически 6, одинаковым и составляло 16,-17,0 г/л. При 4, концентрации дробины от 1,0 до 5,0% 2, прирост РВ был ниже и составлял, соответ 0, ственно, 1,40 и 9,25 г/л. Содержание «сы 0 15 30 45 60 75 90 120 150 180 210 Время, мин.
рой» клетчатки в твердой фазе при этом Рис.1. Динамика накопления редуцирую снижалось, в среднем, на 6,0% (с 19,0 до щих сахаров при ферментолизе дробины культу 13,0% а.с.в.).
ральной жидкостью гриба Tr.viride При экспозиции реакционной среды свыше 120 минут концентрация РВ оставалась на постоянном уровне во всех вариантах опыта.
Таким образом, в качестве оптимального режима ферментативного гидролиза дроби ны культуральной жидкостью гриба Tr.viride может быть рекомендован следующий: 10% ная суспензия дробины, целлюлолитическая активность КЖ – 10 единиц на 1 г дробины, время экспозиции 120-150 минут, перемешивание 80-100 об/мин., рН 5,0 и t=500C.
Для повышения степени конверсии зерновой дробины проводили твердофазное культивирование гриба Tr.viride на измельченной дробине (размер частиц 45 мм) в лабо раторном реакторе в стерильных условиях при высоте слоя дробины 60 мм, t = 300С, рН 4,5, влажности среды 55-60% и аэрации. Каждые 12 часов субстрат увлажняли стериль ным раствором минеральных солей, отводя тем самым и продукты гидролиза дробины, способных репрессировать активность целлюлолитических ферментов гриба. Культиви рование проводили до начала споруляции культуры (до образования воздушного мицелия над поверхностью субстрата).
Для повышения содержания усвояемого белка в полученном продукте биомассу вы росшего на дробине гриба Tr. viride подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу выдерживали в течение 23 часов при t=550C, используя в качестве мембранотропного ин дуктора автолиза этиловый спирт в концентрации 1,0;
2,0 и 3,0%.
Полученные в результате исследований данные показали, что при поверхностном культивировании Tr. viride на дробине и последующем автолизе содержание протеина в твердой фазе повышалось до 29,0%. По сравнению с контрольным образцом содержание «сырого» протеина при добавлении на стадии автолиза этилового спирта в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0% (об.) повышалось, соответственно, с 25,0% до 25,5, 27,0 и 29,0% а.с.в. При чем, дальнейшее повышение концентрации этанола в среде нецелесообразно, поскольку при выделении продуктов для использования их в качестве кормовых или пищевых доба вок (с точки зрения их безвредности) предпочтительнее автолиз проводить в присутствии этанола в концентрации не более 3 %.
Таким образом, при поверхностном культивировании грибов на дробине возможно получение белково-углеводного продукта, содержащего не более 13,0% «сырой» клетчат ки и не менее 29,0% «сырого» протеина.
Анализ содержания микотоксинов в полученных ферментолизатах показал, что кон центрация афлатоксина В1 определялась на порядок ниже его ПДК.
Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus В работах Ушаковой Н.А. [2004, 2006] была показана способность ферментативно го расщепления целлюлозы бактериями, выделенными из слепой кишки травоядных жи вотных, где они выполняют роль, аналогичную биоценозу рубца жвачных животных, то есть обладают целлюлолитической и пробиотической активностью.
Один из штаммов бактерий р. Bacillus БП-46 выделенных из слепой кишки боль шой полевки Microtus fortis, первично идентифицированный как Bacillus subtilis, был лю безно предоставлен нам для исследований Н.А. Ушаковой.
Методом мультисубстратного тестирования, основанном на анализе спектров по требляемых субстратов [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005], было показано, что Bacillus БП-46 является представителем вида B.cereus. Принадлежность данного штамма к виду cereus также была подтверждена данными филогенетического анализа.
Изучение физиолого-биохимических свойств B.cereus БП-46 показало, что для роста данного микроорганизма как в аэробных условиях, так и в анаэробных требуются источ ники органического азота. Штамм является спорулирующим. Исследования ферментатив ной активности бацилл показали, что Bacillus cereus БП-46 является активным продуцен том протеолитических (110 ед./мл) и целлюлолитических ферментов (18,9 ед./мл), что оп ределяет потенциальную возможность его использования для деструкции зерновой дро бины.
Учитывая условия природного местообитания бацилл, был разработан микроаэроб ный твердофазный способ культивирования бациллы, имитирующий природные условия ее жизнедеятельности (нейтральное значение рН, влажность 55-60%, размеры твердых частиц не более 1 мм, анаэробные условия). Для этого культуральную жидкость выращен ной аэробно в жидкой питательной среде B.cereus БП-46 смешивали с равным количест вом сухой стерильной дробины. Массу 55%-влажности помещали в микроаэрофильные условия и инкубировали 48 часов при 29-300С.
По окончании ферментации клетки бацилл подвергали автолизу. Для этого гетеро генную массу, содержащую непрогидролизованную зерновую дробину и клетки B. cereus БП-46, выдерживали в течение 24 часов при температуре 550С в условиях затрудненного доступа кислорода, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеино вую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова, 1990 г.].
Содержание «сырого» протеина в полученном продукте определялось на уровне 34,5% а.с.в., «сырая» клетчатка снижалась на 12,5% (с 18,0 до 7,5% а.с.в.) Таким образом, была показана возможность твердофазного культивирования Bacillus cereus БП-46 на зерновой дробине, повышение ее биологической ценности и получения кормового продукта, содержащего «сырого» протеина не менее 34,0%, «сырой» клетчатки не более 8,0%.
Полученный продукт обладал основными пробиотическими свойствами: был устой чив к температуре в диапазоне 60-650С, в щелочной среде до рН 9,6, к действию желчи и пищеварительных ферментов.
Деструкция зерновой дробины мультиэнзимными композициями Для более эффективной конверсии дробины были проведены исследования по изу чению ферментативного гидролиза указанного сырья с применением новых комплексных ферментных препаратов (Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3). Характеристика мультиэнзимных композиций (МЭК) представлена в таблице 2.
Выбор ферментов, входящих в состав мультиэнзимных композиций, был обусловлен присутствием в трудногидролизуемой зерновой дробине природных полимеров: целлюло зы, гемицеллюлоз типа ксиланов, арабиноксиланов, прочно связанных с целлюлозой, не растворимого протеина, а также следовых количеств непрогидролизованного -глюкана.
Таблица Качественный и количественный состав Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД- Фермент, входящий в со- Ф-ПД-1 Ф-ПД-2 Ф-ПД- став мультисистемы Активность, ед./г Целлюлаза 800 1000 Ксиланаза 4000 4000 -глюканаза 950 950 Протеаза (нейтральная) 50 - При определении оптимальных условий ферментативной обработки исследуемого сырья показано, что оптимальными условиями ферментолиза дробины мультиэнзимными композициями являются: диапазон рН 5,0-5,5, температура – 500С, интенсивность пере мешивания 80-100 об./мин., время экспозиции 2 часа.
Подбор фермент-субстратного соотношения проводили следующим образом: для ферментолиза были подготовлены водные суспензии дробины при гидромодуле от 1,0 до 15,0% при концентрациях мультиэнзимного препарата Ф-ПД-1 0,1 и 1,0% (масс.) (табл. 3).
Таблица Прирост РВ* (г/л) при разных соотношениях дробины и препарата Ф-ПД- Концентрация дробины, % Концентрация Ф-ПД-1, % (масс.) (масс.) 0,1 % 1,0 % 1,0 0,9±0,10 2,8±0, 3,0 1,8±0,13 3,2±0, 4,0 4,5±0,24 6,0±0, 5,0 6,9±0,12 7,5±0, 6,0 7,6±0,11 10,0±0, 8,0 8,0±0,25 14,4±0, 9,0 8,4±0,10 14,9±0, 10,0 11,4±0,13 15,3±0, 15,0 5,2±0,10 12,8±0, Показано, что максимальный выход редуцирующих сахаров, 15,3 г/л наблюдался при обработке 10%-ной суспензии дробины 1%-ным раствором Ф-ПД-1. Отмечено, что при введении препарата в дозе 0,1% уровень прироста редуцирующих сахаров (11,4 г/л) ока зался достаточно высоким, и повышение дозы ферментного препарата до 1,0% не обеспе чивало адекватного прироста сахаров. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата до 15% и выше, приводило к заметному снижению прироста сахаров на 16,0–54,0%, что было связано с затруднением процесса перемешивания вследствие повышения вязкости среды и ухудшением массообменных характеристик в инкубируемой системе.
Все дальнейшие исследования ферментативного гидролиза препаратом Ф-ПД-1 про водили с использованием 10 %-ной суспензии дробины.
Также изучали влияние избыточных концентраций мультиэнзимного препарата на прирост редуцирующих сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе дробины, и на содержание «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе прогидролизо ванного сырья. Для этого были использованы следующие концентрации Ф-ПД-1: 0,1;
0,5;
1,0;
2,0;
4,0 и 5,0%.
Таблица Эффективность гидролитического воздействия разных концентраций Ф-ПД-1 на дробину Концентрация Содержание РВ* Прирост РВ, «Сырая» клет- «Сырой» про Ф-ПД-1, % после гидролиза, г/л чатка, % а.с.в. теин, % а.с.в.
г/л (масс.) 0,0 - - 19,0±0,49 25,0±0, 0,05 9,5±0,25 1,5±0,09 18,6±0,25 24,5±0, 0,075 10,5±0,13 2,5±0,10 18,0±0,16 24,0±0, 0,1 12,3±0,11 4,3±0,12 16,0±0,22 23,0±0, 0,5 13,9±0,12 5,9±0,12 15,9±0,20 22,8±0, 1,0 15,3±0,13 7,3±0,15 15,8±0,19 22,4±0, 2,0 15,4±0,15 8,4±0,12 15,7±0,25 22,1±0, 4,0 15,8±0,20 8,1±0,10 15,7±0,22 22,0±0, 5,0 15,8±0,14 8,2±0,13 15,7±0,21 22,0±0, *Содержание легко экстрагируемых РВ до гидролиза (без фермента) в 10%-ной суспензии дроби ны составляло 8,0 г/л При введении в реакционную смесь как низких концентраций препарата Ф-ПД- (0,05–0,1%), так и избыточных (1,0–5,0%) в инкубируемой среде не отмечено существен ного накопления РВ (табл. 4). «Сырая» клетчатка под воздействием ферментов гидролизо валась лишь на 3,0% при введении 0,1% Ф-ПД-1, и степень ее конверсии не возрастала при введении повышенных концентраций фермента. Аналогичная тенденция наблюдалась и по содержанию нерастворимого «сырого» протеина – снижение на 2,0 – 3,0%.
Таким образом, было показано, что оптимальным фермент-субстратным соотноше нием является 0,1 % Ф-ПД-1 и 10%-ная суспензия зерновой дробины. При этом суммарная концентрация РВ в гидролизате определялась на уровне 12,3 г/л.
Для снижения расхода ферментов на единицу сырья при сохранении высокой степе ни биоконверсии зерновой дробины были испытаны мультиэнзимные препараты Ф-ПД- и Ф-ПД-3, отличающиеся от Ф-ПД-1 более высоким уровнем содержания целлюлазы и протеазы в мультисистемах, соответственно (табл. 5). В связи с этим доза вводимых пре паратов составляла 0,05;
0,075 и 0,1% (масс.).
Таблица Показатели гидролитического воздействия мультиэнзимных композиций Ф-ПД-2 и Ф-ПД- на зерновую дробину Показатель Ф-ПД-2, % Ф-ПД-3, % 0,050 0,075 0,100 0,050 0,075 0, Прирост РВ*, г/л 27,0±0,15 30,0±0,25 33,5±0,22 28,5±0,26 30,5±0,25 35,0±0, «Сырая» клетчат- 16,8±0,21 13,4±0,19 10,5±0,25 17,4±0,22 14,2±0,19 9,5±0, ка, % а.с.в.
«Сырой» проте- 23,0±0,16 19,8±0,24 18,0±0,25 21,8±0,23 18,6±0,20 15,0±0, ин, % а.с.в.
*Без учета начальной концентрации легко экстрагируемых редуцирующих веществ в 10% ной суспензии дробины – 8 г/л.
Показано, что оптимальным соотношением фермент-субстратного комплекса для ферментативного гидролиза дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 также является 10% ная суспензия зерновой дробины и 0,1%-ный раствор мультиэнзимной композиции. При рост редуцирующих сахаров при гидролизе дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 со ставил, соответственно, 25,5 и 27,0 г/л (табл. 5).
«Сырая» клетчатка при действии Ф-ПД-2 в дозе 0,05-0,1% уменьшалась с 19,0 до 16,8-10,5% а.с.в. Также отмечено наибольшее снижение уровня «сырого» протеина с 25, до 15,0% при действии препарата Ф-ПД-3 в дозе 0,1%, содержащего в своем составе про теазу.
Таким образом, первичная оценка мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-2 и Ф-ПД- выявила преимущество Ф-ПД-3, под действием которого осуществлялся более эффектив ный гидролиз «сырого» протеина, и отмечена тенденция к повышению выхода РВ и раз рушения «сырой» клетчатки по сравнению с другими МЭК.
Таблица Сравнение эффективности гидролитического воздействия мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 на зерновую дробину Дробина после обработки Ферментолизат (жидкая фаза) МЭК, Ф-ПД (твердая фаза) Общее со- Прирост РВ, г/л Раствори 0,1% «Сырая» «Сырой»
держание мый клетчатка**, протеин**, (масс.) РВ*, г/л белок, % % а.с.в. % а.с.в.
Ф-ПД-1 20,5±0,25 12,5±0,11 4,0±0,15 16,0±0,49 21,0±0, Ф-ПД-2 33,5±0,21 25,5±0,13 7,0±0,19 10,5±0,38 18,0±0, Ф-ПД-3 35,0±0,19 27,0±0,12 10,0±0,14 8,5±0,44 15,0±0, *Включая начальное содержание легко экстрагируемых РВ в 10%-ной суспензии дробины - 8,0 г/л **Исходное содержание «сырой» клетчатки в дробине 19%, «сырого» протеина - 25%.
В результате проведенных исследований, было показано, что мультиэнзимные пре параты по-разному воздействуют на структурные компоненты зерновой дробины (табл. 6).
Так, прирост РВ составил от 12,5 до 27,6 г/л, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 3,0 – 10,0%, «сырой» протеин – на 5,0 – 10,0%. При этом показано, что по сравнению с препа ратами Ф-ПД-1 и Ф-ПД-2, более эффективным гидролизующим агентом являлся мульти энзимный препарат Ф-ПД-3, поскольку он способствовал деградации целлюлозных ком понентов дробины, в среднем, на 19,0–47,0% и белка – на 16,7–28,6%, присутствие про теазы в составе Ф-ПД-3 обеспечивало более глубокую конверсию нерастворимого про теина зерновой дробины.
При изучении углеводного состава ферментолизатов дробины методом тонкослой ной хроматографии показано, что в их состав входят пентозы, гексозы, дезоксигексозы, представленные L-рамнозой, и ряд олигосахаридов. Доля пентоз в гидролизатах составля ла 45,0–47,0%, гексоз – 40,0–45,0% и 13,0–20,0% - смесь поли - и олигосахаридов (табл. 7).
Таблица Фракционный состав углеводов в ферментолизатах дробины, % (масс.) Пентозы Гексозы Смесь поли – и D,L- D- D МЭК D- олигоса Арабино- Галакто- Фрукто D-Ксилоза D-Глюкоза Манноза харидов за за за Ф-ПД-2 20,0±0,49 25,0±0,38 10,0±0,25 5,0±0,11 5,0±0,13 15,0±0,31 20,0±0, Ф-ПД-3 22,0±0,51 25,0±0,44 12,0±0,22 7,0±0,12 8,0±0,12 13,0±0,27, 13,0±0, Результаты определения углеводного состава показывали, что ферментолизаты зер новой дробины могут быть использованы в качестве питательной основы для культивиро вания дрожжей и молочнокислых микроорганизмов для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами, предназначенных для кормления сельскохозяйственных животных.
Известно, что одним из эффективных способов стабилизации ферментов является воздействие низкомолекулярных соединений фенольной природы - алкилоксибензолов, синтезирующихся в фазе роста развивающейся микробной культуры.
Исходя из литературных данных, исследовали влияние факторов микробного ана биоза на стабильность ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции Ф-ПД 3, при ферментативном гидролизе зерновой дробины.
Для этого использовали химические аналоги факторов микробного анабиоза - алки локсибензолы (АОБ): С7-АОБ и С12-АОБ, предоставленные институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.
Изучение влияния АОБ на ферментативный гидролиз зерновой дробины мультиэн зимной композицией Ф-ПД-3 проводили при следующих режимах:
- диапазон рабочих концентраций гомологов: для С7-АОБ - 0,05-4,6 мг/см3;
для С12-АОБ 0,001-0,15 мг/см3.
- прединкубационный способ внесения АОБ в реакционную смесь, когда исследуемые го мологи – С7-АОБ в течение 30 минут и С12-АОБ в течение 60 минут – раздельно выдержи вали в растворе с ферментом или с субстратом и затем проводили ферментативный гидро лиз.
ЦлА 107, КсА 106, Ферментативная активность, % Модификация структуры ферментов -Гл ПС 105, мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 гомо 104, логом - С7-АОБ во всем диапазоне приме 103, 102, няемых концентраций (0,05-4,6 мг/см3) 101, обуславливала повышение каталитической 100, активности всех изучаемых ферментов. Для 99, 98, всех ферментов, кроме протеазы, изменения 0,00 0,05 0,10 0,50 1,00 1,50 2, активности имели осциллаторный характер и С7-АОБ, мг/см 110, зависели от концентрации вносимого С7 ЦлА Ферментативная активность, % КсА АОБ (рис. 2).
108,0 -Гл ПС Активность целлюлазы во всех вариан 106, тах прединкубации с С7-АОБ повышалась, в 104, среднем, на 7,0-20,%, ксиланазы – на 2,-8,0%, 102, -глюканазы – на 2,0-7,0%, на протеазную 100, активность гомолог активирующего влияния 98, практически не оказывал.
0,00 0,05 0,10 0,50 1,00 1,50 2, С7 -АОБ, мг/см Анализ полученных данных показал, что при 30-ти минутной прединкубации С7 120,0 ЦлА Ферментативная активность, % КсА АОБ (0,5 мг/см3) с дробиной прирост РВ -Гл 115, ПС составил 24,5 г/л;
с Ф-ПД-3 – 28,0 г/л (при 110, дозе С7-АОБ - 1,0 мг/см3);
с дробиной и Ф ПД-3 –32,0 г/л - (при дозе С7-АОБ - 1, 105, мг/см3) 100, Отмечено, что стабильность фермента 95, тивной активности мультиэнзимной компо 0,00 0,05 0,10 0,50 1,00 1,50 2, С7 -АОБ, мг/см зиции Ф-ПД-3 в целом сохранялась, ее Рис. 2. Влияние на ферментативную активность снижение на 20% определялось по истечении мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 раздельной 180 минут ферментолиза дробины.
прединкубации с С7-АОБ: 1- дробины, 2 - Ф-ПД-3, 3 – дробины и Ф-ПД-3.
Таким образом, в результате проведенных исследований показано стимулирующее влияние фактора С7-АОБ на ферментативный гидролиз пивной дробины мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 при модификации указанным ауторегулятором гидролизуемого сы рья и МЭК.
Исследования влияния на мультиэнзимные композиции другого гомолога - С12-АОБ показали, что взаимодействие С12-АОБ с целлюлолитическими и протеолитическими ферментами мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 не обуславливало стимуляцию их ката литической активности, при более высоких концентрациях гомолога (выше 0,05 мг/см3) вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения активности, и степень гидролиза дробины не повышалась.
По результатам проведенных исследований в качестве лучшего стабилизатора фер ментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 был выбран гомолог С7 АОБ при дозе внесения 1,0 мг/см3 и времени прединкубации с Ф-ПД-3 30 минут.
Таким образом, на основании проведенных исследований была показана возмож ность биодеструкции зерновой дробины под действием ферментов, продуцируемых гри бом Trichoderma viride, бактериями Bacillus cereus БП-46 и промышленными мультиэн зимными композициями. Редуцирующие вещества, содержащиеся в гидролизатах дроби ны на уровне 35,0-40 г/л, могут быть использованы другими микроорганизмами, обеспе чивающими получение БАД с функциональными свойствами, что и явилось целью иссле дований, проводимых на последующих этапах работы.
В четвертой главе представлены результаты гетерофазного культивирования мик роорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.
Гетерофазное культивирование дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Получение белково-углеводного продукта и продукта, обогащенного мик роэлементами селеном и йодом Для обогащения ферментолизатов дробины микробным белком был исследован рост апатогенного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica, способного усваивать широкий спектр источников углерода, активность роста на гидролизатах растительного сырья которого была показана ранее [Е.Б. Цугкиева, 2007].
Дрожжи выращивали на ферментолизатах зерновой дробины в режиме глубинного гетерофазного культивирования. Для этого 10%-ная водная суспензия сырья обрабатыва лась культуральной жидкостью гриба Trichoderma viride из расчета 10 ед. целлюлолитиче ской активности на 1 г дробины, или мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентра ции 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции со ставляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата в результате ферментативного гидролиза в среде определялись РВ 16,5 и 35,0 г/л при обработке культуральной жидко стью Tr. viride и Ф-ПД-3, соответственно. В полученные ферментолизаты вносили мине ральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей Y. lipolytica в количестве 2,0х106 кл/мл.
Дрожжи культивировали в периодическом режиме до начала стационарной фазы в ферментере (Vобщ.=2 л) при t = 30-320С, рН 5,0, при перемешивании 500 об/мин и аэрации.
Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментолизатах дробины представлены в таблице 8.
Твердая фаза после отстаивания отделялась методом декантации, промывалась и подвергалась термолизу (750С, 30 мин.). Полученный продукт сушили при t=500C до оста точной влажности 7-8%.
В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 85,0-87,0%, прирост дрожжевых клеток 2,5-4,0 х108 кл/мл. Содержание «сырого» протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 8,0-11,0% и составило 29,0-32,0% а.с.в., а содержание «сырой» клетчатки снизилось на 4,0-9,5% и составило 9,5 15,0% а.с.в.
Таблица Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Y.lipolytica на ферментативных гидролизатах зерновой дробины Параметр Ферментолизат Ферментолизат (КЖ гриба) (Ф-ПД-3) Концентрация РВ, г/л:
- начальная 16,5 35, - конечная 2,5 4, Потребление РВ, % 87, 84, Прирост дрожжевых клеток (Nmax-N0), кл/мл х 10 2,5 4, Удельная скорость роста, ч-1 0,09 0, Таким образом, при гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Y.lipolytica на ферментативных гидролизатах дробины, полученных как при использовании культу ральной жидкости гриба Tr. viride, так и МЭК Ф-ПД-3, показана возможность получения белково-углеводного продукта.
Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продук та была исследована возможность его обогащения такими микроэлементами, как селен и йод.
Для обогащения селеном перед началом культивирования дрожжей в среду, содер жащую ферментативный гидролизат дробины и минеральные соли, вносили диоксид се лена в концентрации 20 мг/л, оптимальной для развития культуры Y. lipolytica. Для йоди рования в качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации г/л [Е.Б. Цугкиева, 2007]. Йодирование продукта осуществляли в аэробных условиях по сле начала стационарной фазы роста дрожжей (16-18 часов) в течение 1 часа при 37°С в присутствии окислителя - 1%-ной перекиси водорода.
При культивировании дрожжей в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленной зерновой дробине и после осуществле ния постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоя щий из биомассы дрожжей и твердой непрогидролизованной фазы дробины, который со держал 33,0% «сырого» протеина, «сырой» клетчатки - 9,5%, селена - 35,2 мг/кг и йода 32,7 мг/кг. В продукте, обогащенном селеном, включение йода происходило на 7,0% эф фективнее, чем в продукте, не содержащем селен. Микотоксины в полученных белково углеводных продуктах практически отсутствовали.
Гетерофазное культивирование молочнокислых культур на ферментолизатах зерновой дробины Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования на нативной дро бине и ее ферментолизатах проводили среди штаммов молочнокислых бактерий Lactobacil lus casei– B 7657, Lactobacillus acidophilus – AT-41, Lactococcus lactis ТБ2, ассоциативных культур кефирного грибка G и S, используемых на Ставропольском и Гагаринском молоч ных заводах, и неидентифицируемых культур молочнокислых бактерий, выделенных из данных кефирных грибков и растущих на глюкозе.
Эксперименты показали, что все исследованные молочнокислых культуры способны активно расти на средах, содержащих как молочную сыворотку и глюкозу, так и на фермен тативных гидролизатах зерновой дробины. Для исследований были отобраны бактерии Lac tobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, которые обладали наи большей активностью молочнокислого брожения по показателю снижения рН и общей титруемой кислотности (таблица 9).
Таблица Активность роста молочнокислых бактерий на ферментолизатах зерновой дробины Время культивирования, сут.
1 Культура Титруемая Титруемая рНисх/рНкон кислотность, рНисх/рНкон кислотность, о о Т Т Lactobacillus casei 6,70/4,70 120,0±1,25 6,70/4,80 118,0±1, Lactococcus lactis 6,70/5,30 74,0±1,18 6,70/4,70 122,0±1, Lactobacillus acidophilus 6,70/4,85 90,0±1,25 6,70/4,80 108,0±1, Ассоциативная культура кефирно 6,70/4,50 146,0±1,36 6,70/4,60 130,0±1, го грибка G Ассоциативная культура кефирно го грибка S 6,70/4,60 130,0±1,28 6,70/4,60 128,0±1, Смешанные культуры, выделен 6,70/4,65 138,0±1,35 6,70/4,75 118,0±1, ные из кефирного грибка S Смешанные культуры, выделен 6,70/5,0 96,0±1,25 6,70/4,85 120,0±1, ные из кефирного грибка G Для глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых культур на фермен толизатах зерновой дробины 10%-ную водную суспензию сырья обрабатывали мультиэн зимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешива нии 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата концентрация РВ составила 35,0 г/л. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «MRS» и трехсуточный инокулят бактерий L.casei и ассоциативной культуры кефирного грибка G в количестве 5,0% по объему при плотности популяции не менее 106 КОЕ/мл.
Молочнокислые микроорганизмы культивировали в периодическом режиме в ана эробных условиях при t=370С, рН 6,5-6,8 в течение 17-18 часов.
В процессе гетерофазного культивирования потребление молочнокислыми культу рами редуцирующих сахаров составило 45-48%, плотность популяции L.casei – не менее 108 КОЕ/г, ассоциативной культуры кефирного грибка G – не менее 109 КОЕ/г. Титруемая кислотность продукта, содержащего бактерии L.casei, определялась на уровне 118-1200Т, продукта, содержащего ассоциативную культуру кефирного грибка G – 140-1450Т.
В результате проведенных опытов показано, что подобранные молочнокислые микроорганизмы - L. casei и ассоциативная культура кефирного грибка G - способны раз виваться на ферментативных гидролизатах зерновой дробины, а продукт, получаемый при их культивировании на ферментолизатах, обладает всеми свойствами, определяющими его пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культиви ровании их на обезжиренном молоке.
В пятой главе приведены способы получения биологически активных добавок, обладающих пробиотическими свойствами, на основе зерновой дробины и ее ферменто лизатов.
Придание продукту пробиотических свойств возможно при культивировании на суб страте молочнокислых бактерий, которые для своего развития требуют сложных пита тельных сред и микроаэрофильных условий.
При разработке возможных способов получения пробиотических БАД была исследо вана возможность обогащения питательной среды продуктами автолиза продуцентов бел ка, предварительно культивируемых на ферментолизатах зерновой дробины, учитывали также такие техноэкономические показатели, как необходимость снижения энергоемко сти, уменьшения количества технологических стадий и необходимости гарантий получе ния продукта требуемого качества, что возможно при замене аэробных процессов культи вирования на анаэробные.
Исходя из этих положений, исследовали ряд способов получения белково углеводной добавки, обладающей пробиотическими свойствами:
• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии гриб Tricho derma viride выращивали на измельченной стерильной дробине в условиях твердофазного культивирования. На второй стадии осуществляли автолиз грибной биомассы с добавле нием этанола и на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокис лые бактерии. Результаты представлены в таблице 10.
Таблица Характеристика белково-углеводных продуктов на основе зерновой дробины, полученных при последовательном твердофазном культивировании гриба Tr. viride и молочнокислых микроорганизмов Ассоциативная культура кефир Показатель L. casei ного грибка G «Сырой» протеин в Концентрация этанола, % твердой фазе после 1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 3, автолиза грибных клеток, % а.с.в. 25,6±0,49 27,2±0,25 29,3±0,28 25,6±0,44 27,2±0,27 29,3±0, В том числе раство римый белок, г/л 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0,19 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0, Потребление РВ*:
% 77,3±0,48 80,7±0,63 84,0±0,51 80,7±0,45 85,0±0,49 86,3±0, г/л 11,6±0,27 12,1±0,25 12,6±0,32 12,1±0,27 12,8±0,25 12,9±0, рНисх./рНкон. 6,8/5,7 6,8/5,5 6,8/5,1 6,8/5,5 6,8/4,7 6,8/4, Титруемая кислот 140,0±1,25 160,0±1,30 170,0±1,28 140,0±1,25 150,0±1,32 190,0±1, ность, 0Т Молочная кислота, 8,7±0,27 9,2±0,25 10,8±0,25 9,0±0,31 10,3±0,27 10,8±0, г/л «Сырой» протеин в полученном продук- 29,2±0,49 31,3±0,51 33,9±0,27 30,6±0,31 32,8±0,45 33,5±0, те, % а.с.в.
«Сырая» клетчатка в полученном продук- 13,2±0,25 13,0±0,29 12,9±0,21 12,8±0,29 13,1±0,33 13,1±0, те, % а.с.в.
*Начальная концентрация РВ - 15,0 г/л Результаты, представленные в таблице 10 показывают, что присутствие этилового спирта в среде до 3% стимулировало развитие молочнокислых организмов, причем, пока затель титруемой кислотности для обоих вариантов составил 1401900Т. При этом, в сре де отмечено накопление молочной кислоты: при культивировании L. casei – 8,710,8 мг/л при потреблении 77,384,0% РВ, при культивировании ассоциативной культуры кефирно го грибка G – 9,010,8 мг/л при потреблении 80,786,3% РВ, содержание «сырого» про теина и «сырой» клетчатки составило 29,233,9% а.с.в и 12,813,0% а.с.в., соответствен но.
При исследовании биологической ценности полученных продуктов на тест-культуре Tetrahymena pyriformis было показано отсутствие острой токсичности, также были полу чены данные, подтверждающие их пробиотические свойства и антагонистические свойст ва по отношению к Staphylococcus aureus.
• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии дрожжи Yar rowia lipolytica аэробно выращивали на ферментативных гидролизатах нативной и из мельченной зерновой дробины в условиях глубинного гетерофазного культивирования до потребления примерно 50% редуцирующих веществ, содержащихся в ферментолизате. На второй стадии после автолиза дрожжевых клеток на полученной среде в анаэробных усло виях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 11.
Таблица Результаты аэробно-анаэробного способа получения белково-углеводного продукта, обладающего пробиотическими свойствами, и показатели его качества Ферментативный гидролизат Показатель Нативная дробина Измельченная дробина Гетерофазное глубинное культивирование дрожжей Y.lipolytica РВнач/РВкон, г/л 16,8/9,0 30,5/15, Потребление РВ, % 46,0±0,49 51,0±0, «Сырой» протеин после автолиза, % 24,0±0,20 26,0±0, а.с.в.
Анаэробное культивирование молочнокислых микроорганизмов РВнач/РВкон, г/л 9,0/2,0 15,0/2, Потребление РВ, % 88,0±0,43 93,0±0, Молочная кислота, г/л 7,8±0,49 13,5±0, «Сырой протеин», % а.с.в.:
-в продукте, содержащем L.casei 22,9±0,25 28,8±0, -в продукте, содержащем ассоциатив ную культуру кефирного грибка G 23,0±0,23 30,0±0, «Сырая» клетчатка, % а.с.в. 15,2±0,19 10,2±0, Влажность, % а.с.в. 7,9±0,31 8,0±0, Данные, представленные в таблице11, показывают, что на ферментолизатах из мельченной дробины дрожжи развивались более активно, потребляя до 51% редуцирую щих веществ, что обеспечивало после автолиза дрожжевых клеток накопление «сырого»
протеина в среде до 26,0% а.с.в., при этом содержание «сырой» клетчатки в твердой фазе уменьшалась с 18,0 до 10,2% а.с.в. При культивировании молочнокислых культур на та кой среде потребление РВ составило около 93% при накоплении молочной кислоты до 13,5 г/л. Содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в полученном продукте оп ределялось, соответственно, на уровне 30,0 и 10,2% а.с.в.
Показано, что полученные продукты обладали основными свойствами, определяю щими их пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на молоке, а также проявляли антагонистические свойства по отно шению к условно-патогенной культуре Staphylococcus aureus.
• Двухстадийный анаэробный процесс. На первой стадии в микроаэрофильных ус ловиях проводили твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 на из мельченной стерильной дробине. На второй стадии после автолиза бактериальных клеток на полученном сырье в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии.
Результаты представлены в таблице 12.
При исследовании влияния штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 на развитие мо лочнокислых микроорганизмов было показано отсутствие антагонистических отношений между культурами.
Таблица Показатели процесса последовательного твердофазного культивирования на зерно вой дробине Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур Субстрат для культивирования молочнокислых микроорганизмов После твердофазной фермента После твердофазной фермента ции бацилл на дробине с после ции бацилл на дробине дующим автолизом Показатель Ассоциативная Ассоциативная культура культура L.casei L.casei кефирного кефирного грибка G грибка G Титруемая кислотность, 0Т 80,0±1,25 70,0±1,25 120,0±1,30 150,0±1, рНисх./рНкон. 6,9/5,0 6,9/5,3 6,9/4,3 6,9/4, Молочная кислота, г/л 4,0±0,12 3,4±0,11 6,2±0,10 7,5±0, Сырой протеин*, % а.с.в.:
-после твердофазного культивирования бацилл 24,9±0,44 24,9±0,39 34,8±0,49 34,8±0, -после молочнокислого 26,1±0,49 25,6±0,45 28,5±0,38 29,8±0, брожения Сырая клетчатка**, % 7,8±0,25 7,3±0,22 7,5±0,27 7,8±0, а.с.в.
*Исходное содержание сырого протеина в дробине 21,0%.
**Исходное содержание сырой клетчатки в дробине 18,0%.
Результаты, представленные в таблице 12, показывают, что молочнокислые бактерии активно развивались на зерновой дробине, обогащенной продуктами автолиза бактерий Ba cillus cereus БП-46, при этом содержание «сырого» протеина в продукте увеличивалось на 13,8%, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 10,5%, показатель титруемой кислотности повышался до 120-1500Т, рН снижался с 6,9 до 4,0-4,3, плотность популяции молочных микроорганизмов составляла не менее 108 КОЕ/г. Содержание молочной кислоты повыша лось в среднем, в 1,5-2 раза.
Исследование свойств полученной кормовой белково-углеводной добавки показало, что все культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в полученных продук тах, обладали терморезистентностью в диапазоне 60-650С и устойчивостью к фенолу, по варенной соли;
к действию пищеварительных ферментов и желчи.
Таким образом, на основании проведенных исследований показана возможность по лучения биологически активных кормовых добавок с различными функциональными свойствами на основе зерновой дробины (белково-углеводная биологически активная до бавка, белково-углеводная биологически активная добавка, обогащенная микроэлемента ми селеном и йодом и белково-углеводная биологически активная добавка, обладающая пробиотическими свойствами), при этом данные продукты могут быть получены на фер ментативных гидролизатах зерновой дробины при культивировании дрожжей в аэробных условиях для обогащения белком, при твердофазном культивировании гриба рода Tricho derma или бактерий рода Bacillus с последующим автолизом микробных клеток и культи вированием молочнокислых микроорганизмов для придания продукту пробиотических свойств.
Общая схема переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами представлена на рисунке 3.
Подготовка зерновой дробины Ферментативная Сушка Измельчение обработка Мультиэнзимные Культуральная Bacillus жидкость гриба композиции cereus БП- Trichoderma viride Способы повышения биологической ценности зерновой дробины для получения БАД с различными функциональными свойствами Обогащение Обогащение белком и Придание пробиоти микробным белком микроэлементами (селен, йод) ческих свойств Твердофазное культивирование Гетерофазное культивирование Гриб Бактерии Дрожжи Trichoderma Bacillus cereus Yarrowia БП- viride lipolytica Автолиз микробных клеток Культивирование молочнокис лых бактерий и ассоциативных культур кефирных грибков Рис. 3. Схема возможных способов переработки зерновой дробины в БАД с функ циональными свойствами ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Исследован ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства – зер новой дробины – под действием целлюлолитического комплекса ферментов грибов Trichoderma viride, бактерий Bacillus cereus БП-46 и технических мультиэнзимных компо зиций, включающих целлюлолитические и протеолитические ферменты;
- определены условия культивирования гриба Tr. viride на зерновой дробине в глу бинной культуре, при накоплении целлюлолитических ферментов в среде до 25 ед./мл и снижении содержания «сырой» клетчатки в дробине с 19,0 до 15,0% а.с.в.;
показана воз можность использования посевного материала гриба в виде спор и вегетативных клеток;
- показана биодеструкция зерновой дробины как при твердофазном культивировании гриба Trichoderma viride, так и при использовании его культуральной жидкости, обеспе чивающая снижение в дробине «сырой» клетчатки на 6%. и накопление в среде РВ до 16, г/л;
- методом мультисубстратного тестирования проведена таксономическая идентифи кация штамма бактерий Bacillus БП-46, показана его принадлежность к виду B.cereus. При твердофазном культивировании бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной дробине «сырая» клетчатка в субстрате снижалась на 11,5%.
- на основании сравнительной оценки эффективности воздействия на зерновую дро бину трех мультиэнзимных композиций Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающихся соста вом и соотношением уровней активности в мультисистемах, был отобран препарат Ф-ПД 3, определены условия его применения, обеспечивающие при 2-х часовой экспозиции на копление РВ в ферментолизате до 35,0 г/л, снижение «сырой» клетчатки и «сырого» про теина в твердой фазе с 19,0 до 8,5% и с 25,0 до 15,0%, соответственно.
2. При исследовании влияния химических аналогов факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) на стабильность ферментативной активности мульти энзимной композиции Ф-ПД-3 показано, что гомолог С7-АОБ в концентрации 1,0 мг/см стабилизировал активность ферментов, входящих в состав Ф-ПД-3, при этом уровень продуктов гидролиза – редуцирующих сахаров – повышался до 40,0 г/л. Препарат С12 АОБ практически не оказывал положительного влияния на ферментативную активность Ф-ПД-3.
3. Исследована активность роста семи молочнокислых бактерий на глюкозе и фер ментолизатах зерновой дробины. Отобраны культуры, наиболее активно развивающиеся на ферментолизатах зерновой дробины - бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, при этом ассоциативная культура кефирного грибка G об ладала большей активностью молочнокислого брожения.
4. Разработаны способы получения БАД с функциональными свойствами:
- белково-углеводной добавки, содержащей до 32,0% «сырого» протеина, а также белково углеводной добавки, обогащенной микроэлементами: селеном (35,2 мг/кг) и йодом (32, мг/кг) при гетерофазном культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica на ферментолиза тах дробины;
- белково-углеводных добавок с содержанием «сырого» протеина не менее 30,0%, «сы рой» клетчатки не более 10,0%, обладающих пробиотическими свойствами, на основе двухстадийного культивирования дрожжей Y. lipolytica, или грибов Tr. viride, или бакте рий B. cereus, автолиза их клеток и последующего выращивания молочнокислых бакте рий;
- белково-углеводной кормовой добавки при двухстадийном твердофазном процессе куль тивирования Bacillus cereus БП-46 на измельченной зерновой дробине в анаэробных усло виях, автолизе клеток бактерий и последующем выращивании молочнокислых микроор ганизмов. Получен продукт с содержанием «сырой» клетчатки не более 8,0% и «сырого»
протеина не менее 34,0% при плотности популяции молочнокислых культур не менее КОЕ/г.
6. По стандартным методикам определена пробиотическая активность полученных БАД на основе зерновой дробины, показано, что культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в продуктах были терморезистентны при t=60-650C, устойчивы к действию поваренной соли, желчи и пищеварительных ферментов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Касаткина, А.Н. Использование мультиэнзимных композиций для деструкции пивной дробины / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Э.В. Удалова // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 59-65.
2. Касаткина, А.Н. Способы повышения биологической ценности дробины / А.Н. Касатки на, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова // Комбикорма – 2008. – № 5 – С. 51-52.
3. Касаткина, А.Н. Разработка биотехнологических способов биодеградации дробины как основы для получения белково-углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Н.Б. Гра дова // Сб. мат. Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство технологии-экология». – Киров: Изд-во ВятГУ, 2006. – С. 179-180.
4. Касаткина, А.Н. Исследование пивной дробины как сырья для получения белково углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина // Материалы IV съезда Общества биотех нологов России им. Ю.А. Овчинникова, 5-7 декабря 2006 г. – Пущино: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2006. – С. 118-119.
5. Касаткина, А.Н. Дробина как сырье для получения белково-углеводных кормовых доба вок и препаратов с пробиотическими свойствами / А.Н. Касаткина, Г.А. Егерева // Мате риалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 15-16 ноября 2007 г. – М: МГУПБ, 2007. – С.17-18.
6. Касаткина, А.Н. Практическое использование специфических микроорганизмов для трансформации целлюлозосодержащего сырья / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Н.А. Уша кова // Тез. докл. международной школы–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию института ГосНИИгенетика, 21-24 октября г. - Москва – Пущино, 2008 г. – С. 43.
7. Заявка на патент на изобретение № 2008119515. Способ получения белково-углеводной биологически активной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова. – заявл. 19.05.2008.