Иммунобиологическая характеристика вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз
На правах рукописи
КУКУШКИНА Мария Сергеевна
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ВАКЦИННЫХ И ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ
ВИРУСОВ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ
03.00.06 Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Владимир-2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный
центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)
Научный руководитель:
- доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ДИЕВ Вячеслав Иванович
Официальные оппоненты:
- доктор биологических наук, профессор СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (ГНУ ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирской обл.
- доктор биологических наук, профессор ЕРЕМЕЦ Владимир Иванович ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП»), г. Щелково Московской обл.
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ»), г. Москва.
Защита диссертации состоится « 24 » июня 2008г. в 10 часов на заседании со вета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Автореферат разослан « 22 » мая 2008г.
Ученый секретарь по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семенова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Оспу овец и оспу коз относят к особо опасным болез ням животных, способным вызвать эпизоотии и наносить большой экономический ущерб. По классификации МЭБ до 2004 года они относились к списку «А», а в со ответствии с новой классификацией они включены в список болезней МЭБ, подле жащих обязательному уведомлению, в категорию «Болезни овец и коз». В послед ние годы оспу овец и оспу коз стали рассматривать как две самостоятельные болез ни. По современной классификации, возбудители этих болезней ДНК – содержащие вирусы sheeppoxvirus и goatpoxvirus входят в род Capripoxvirus семейства Poxviridae. Считают, что возбудители оспы овец (ВОО) и оспы коз (ВОК) состоят в близком генетическом, антигенном и серологическом родстве, но по патогенности обладают строгой видовой специфичностью и являются отдельными таксономиче скими видами [В.Н. Сюрин и др.,1998].
Оспа овец и оспа коз эндемичны на Ближнем Востоке, в Центральной и Юж ной Азии, Китае, а также в Центральной и Северной Африке. По данным Междуна родного эпизоотического бюро, в 1996-2007 гг. неблагополучными по этим заболе ваниям были 55 стран, в том числе семь стран СНГ;
в России оспа мелких жвачных регистрировалась в 1994-2000 гг. и 2002-2003гг. [В.М. Захаров и др.,2003;
В.И. Ди ев и др.,2004;
OIE 1996-2004].
Несмотря на то, что каприпоксвирусы преимущественно поражают свой вид животных-хозяев, жестко детерминированной специфичностью они не обладают и способны инфицировать гетерологичные виды животных. Описана способность штаммов ВОО и ВОК в экспериментальных условиях вызывать заболевание как у овец, так и у коз [В.Н. Сюрин и др.,1998;
Д.В. Грачев,2006;
Davies F.G.,Otema C.,1981;
Kitching R.P.,1989].
Способность каприпоксвирусов относительно легко преодолевать межвидо вые барьеры и сходство клинических признаков вызываемых ими заболеваний у мелких жвачных животных делают недостаточной диагностику оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС (бугорчатки) на основании только клинических дан ных, вызывают необходимость разработки лабораторных методов видовой диффе ренциации вирусов.
Как показали недавние исследования, идентичность полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов составляет 97% [Е.С. Орлова и др.,2004-2006;
Bhat P.P.,1998]. Чрезвычайно близкое родство не позволяет разли чать каприпоксвирусы вирусологическими и серологическими методами. Видовую дифференциацию каприпоксвирусов до недавнего времени удавалось проводить только рестрикционным картированием или секвенированием геномной ДНК [Е.С.
Орлова и др.,2004-2006;
Black D.N. et al.,1986;
Bhat P.P. et al.,1998].
В то же время эпизоотологические наблюдения показали, что оспа возникала неоднократно среди коз, привитых против оспы овец, в то время как заболевания среди вакцинированных овец не регистрировали [И.Т. Сатторов и др.,2003].
В связи с этим изучение иммунобиологических характеристик вакцинных и вирулентных штаммов вирусов оспы овец и оспы коз имеет как научное, так и практическое значение.
Цели и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключа лась в сравнительном изучении иммунобиологических характеристик вакцинных, вирулентных штаммов и полевых изолятов вирусов оспы овец и оспы коз.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- дать сравнительную характеристику иммунобиологических свойств штам мов вирусов оспы овец и оспы коз, хранящихся в музее ФГУ «ВНИИЗЖ»;
- выделить и изучить иммунобиологические свойства полевых изолятов ви русов оспы овец и оспы коз при возникновении оспы мелких жвачных на террито рии Российской Федерации и стран СНГ;
- изучить особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первич ных и перевиваемых культурах клеток и провести поиск наиболее технологичных и производительных систем культивирования этих вирусов;
- разработать методы получения препаратов для диагностики оспы овец и ос пы коз, а также выявления антител в крови животных;
- изучить на восприимчивых животных и в серологических реакциях степень антигенного родства между каприпоксвирусами - вирусами оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС, а также с вирусами оспы крупного рогатого скота, свиней, лошадей и верблюдов;
- определить уровень поствакцинальных и постинфекционных антител в кро ви овец против вирусов оспы овец и оспы коз;
- изучить устойчивость вакцинированных и не вакцинированных овец и коз к перекрестному заражению.
Научная новизна исследований. В результате проведенных исследований:
- изучены иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году штаммов «Приморский 2003» и «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз;
- дана сравнительная характеристика иммунобиологических свойств штам мов вирусов оспы овец и коз;
- изучены особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первич ных и перевиваемых культурах клеток и отработана технология получения их в культурах клеток гонад козы (КГ-91), трофоварианте культуры клеток гонад козы (ГК), производственной линии клеток ВНК-21 стационарным, роллерным и суспен зионным методами;
- изучены на восприимчивых животных и в серологических реакциях степень антигенного родства между вирусами оспы овец, оспы коз и нодулярного дерматита КРС, а также с вирусами оспы КРС, свиней, лошадей и верблюдов;
- экспериментально оценена устойчивость вакцинированных и непривитых овец и коз к перекрестному заражению вирусами оспы овец и оспы коз;
- определено влияние длительного хранения на биологическую активность вирусов оспы овец и оспы коз.
Практическая значимость исследований. Практическое значение работы состоит в том, что производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз после изучения иммунобиологических свойств был депонирован во Все российской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всерос сийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.);
- контрольный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз после изучения был де понирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарст венных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.).
Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» методические рекомендации:
- «Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г.;
- «Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки ре акции длительного связывания комплемента», 2006 г.;
- «Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивиро ванию аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г.;
- «Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирус вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», 2006 г.
Результаты научных исследований вошли в следующие нормативные документы:
- СТО «Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая» утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 07.08.2007 г.;
- СТО «Набор для диагностики оспы овец иммуноферментным методом», утвер жденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21.04.2008 г.;
- СТО «Набор препаратов для диагностики оспы овец в реакциях длительного свя зывания комплемента и диффузионной преципитации», утвержденный заместите лем руководителя Россельхознадзора 21.04.2008 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
- иммунобиологические свойства штаммов вирусов оспы овец и коз;
- иммунобиологические свойства выделенных в 2003 году вирулентного «Приморский 2003» и вакцинного «ВНИИЗЖ 2003» штаммов вируса оспы коз;
- особенности репродукции вирусов оспы овец и оспы коз в первичных и пе ревиваемых культурах клеток стационарным, роллерным и суспензионным метода ми;
- устойчивость вакцинированных животных к перекрестному заражению ви русами оспы овец и коз;
- антигенное родство между вирусами оспы овец, оспы коз, нодулярного дер матита КРС и оспы других видов животных.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано научных работ, в т.ч. 1 работа в издании по перечню ВАК.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на научных конференциях «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства»
(Алматы, 2000), «Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого ро гатого скота» (ФГУ ВНИИЗЖ, 2002), «ВУЗ и АПК: задачи, проблемы и пути реше ния» (Махачкала, 2002), «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» (Душанбе, 2003), а также доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2000-2007гг.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором са мостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с к.б.н. Т.И. Корпусовой, к.в.н. Д.К. Басовой, Г.А. Блотовой, к.в.н. Н.В. Мороз, за что автор выражает им сер дечную благодарность.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах ком пьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, вы воды, практические предложения и приложения. Список литературы включает источника, в том числе 71 на русском языке. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 41 таблицей.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы. В работе использованы следующие штаммы вирусов:
- вирусы оспы овец: эпизоотический контрольный штамм «Афганский» в ви де органно-тканевого лиофилизированного материала с инфекционной активностью 5,33 lg ИД50/0,5 см3;
вакцинный штамм «ВНИИЗЖ», полученный в перевиваемой культуре клеток гонад козы (КГ-91), титр 5,0-6,0 lg ИД50/см3 лиофилизированный;
- вирусы оспы коз: вирулентный штамм «Pellor» в виде органно-тканевого лиофилизированного материала с инфекционной активностью 7,0 lg ИД50/0,5 см3;
производственный контрольный штамм «Приморский 2003», органно-тканевой лиофилизированный с инфекционной активностью 7,1 lg ИД50/0,5 см3;
производст венный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003», полученный в перевиваемой культуре клеток гонады козы (КГ-91), лиофилизированный, титр 5,5-7,0 lg ИД50/см3;
- вирус оспы КРС штамм Cowpox, лиофилизированный, расплодка на культу ре клеток куриных эмбрионов, титр 5,0 lg ТЦД50/см3, получен в 1981г.;
- вирус оспы лошадей штамм МНР-76, лиофилизированный, выделен от ло шадей в 1976 году, в Монголии, расплодка на культуре клеток ПЯ, титр 5,0 lg ТЦД50/см3;
- вирус нодулярного дерматита (бугорчатки) крупного рогатого скота виру лентный штамм «Эфиопский».
Животные. В работе использованы овцы романовской породы (93 гол.), бес породные козы и их помеси с зааненской породой (68 гол.), крупный рогатый скот 12-месячного возраста (6 гол.), а также морские свинки и кролики породы «Шин шилла» массой 2,0-2,5 кг.
Культуры клеток. На различных этапах работы были использованы сле дующие культуры клеток: первичная культура клеток почки овцы;
перевиваемые клеточные культуры почки обезьяны Vero, Marc-145 (клоновый вариант клеток почки эмбриона макаки - резус МА-104), почки сирийского хомячка (BHK-21), го нады козы (КГ-91), почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки теленка (MDBK), почки эмбриона свиньи (СПЭВ).
Питательные среды. При культивировании первичных и перевиваемых культур клеток использовали питательные среды Игла, ПСС, 199 по стандартной прописи с добавлением 5-10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и содержанием 50 мкг/ см3 гентамицина, 2,5 мг/л амфотерицина В и 0,3 мг/ см3 глю тамина.
Культивирование вирусов оспы овец и коз. Культивирование вирусов оспы овец и коз проводили на культурах клеток стационарным, роллерным и суспензи онным методами.
Для культивирования вирусов оспы овец и коз стационарным способом на перевиваемых культурах клеток использовали 48-72-часовой монослой культуры, выращенный в клинских матрасах в стационарных условиях.
Для роллерного культивирования культуру клеток выращивали в 3-х литро вых бутылях с использованием среды Игла с 5-10 % нормальной сыворотки КРС, мкг/мл гентамицина, 0,03% глютамина.
Для суспензионного культивирования использовали культиваторы КС-40 с рабочим объемом суспензии 10-15 литров. Исходная концентрация клеток состав ляла 1,3-1,7 млн/см3. Культуру клеток инфицировали вирусом в дозе 0,01, 0,1 и 1, ТЦД50/кл, рН вирусной суспензии поддерживали в интервале 7,0-7,2.
Репродуктивную активность вируса оценивали по времени появления ЦПД, интенсивности его развития и титру накопления вируса.
Определение инфекционной активности вирусов оспы овец и оспы коз.
Определение титра инфекционности вирусов оспы овец и оспы коз производили путем титрования на перевиваемой культуре клеток гонад козы. Титр вируса вы числяли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3.
Изучение клинических признаков оспы при экспериментальном зараже нии овец и коз. Клинический осмотр инфицированных и контрольных животных проводили по общепринятой методике. При осмотре места введения вирусов оспы овец и оспы коз учитывали наличие утолщения кожи, местной гиперемии и других изменений в этой области. Патологоанатомическое вскрытие проводили по обще принятой методике с описанием состояния всех органов и систем организма.
Получение антигена для серологических и вирусологических исследований.
Антигены вирусов оспы овец и оспы коз получали путем культивирования их на культуре клеток гонад козы КГ-91 или после инфицирования ими естественно вос приимчивых животных (овец и коз) и дальнейшего концентрирования антигена в 100 - 300 раз.
Получение гипериммунной сыворотки для серологических и вирусологиче ских исследований. Специфическую сыворотку к вирусу оспы овец получали со гласно «Методике получения гипериммунной сыворотки против оспы овец» (ВНИ ИЗЖ, 2002). Специфическую сыворотку к вирусу оспы коз получали по разрабо танной нами методике путем трехкратной гипериммунизации предварительно вак цинированных или переболевших коз с использованием антигена, полученного на культуре клеток гонад козы или вирулентного тканевого вируса оспы коз и трех кратной гипериммунизации кроликов очищенным и концентрированным культу ральным антигеном вируса оспы коз.
Статистическая обработка полученных результатов. При статистиче ской обработке результатов исследований были использованы общепринятые мето ды, рекомендованные Гланцем С. (1999) и другими авторами, а также компьютер ная программа Microsoft Office Excel 2003.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по оспе овец и коз в мире и Российской Федерации Анализ неблагополучных стран по оспе овец и оспе коз в 1996-2006 гг. по официальным данным МЭБ показал, что наибольшее количество неблагополучных по оспе овец и оспе коз государств приходится на Азию и Африку. Наличие оспы овец и оспы коз ежегодно отмечают в 10-15 африканских государствах и в 9- странах Юго-Восточной Азии. Из европейских стран оспа овец и оспа коз регист рировалась только в странах Балканского полуострова (Болгария, Греция и Турция).
Из стран СНГ за указанный период неблагополучными по оспе овец и оспе коз яв лялись Россия, Грузия, Азербайджан, Казахстан, Киргизия, Туркменистан, Таджи кистан, Узбекистан. К настоящему времени свободными от оспы овец и оспы коз остаются страны Америки, Австралия и Океания.
Анализ вспышек оспы среди овец и коз в мире по видам заболевших животных в 1996-2004 гг. свидетельствует, что наиболее часто в неблагополучных по оспе стра нах заболевали овцы (около 35% стран), а также овцы и козы (50-60% стран).
Вспышки оспы только среди коз регистрировали практически ежегодно в государ ствах, составляющих 2-6% от общего количества стран, неблагополучных по оспе.
Оспа мелкого рогатого скота в течение 1993-1999 гг. в России отмечалась ежегодно. В течение этих лет было зарегистрировано 85 очагов оспы в различных регионах Российской Федерации преимущественно среди овец, с общим количест вом заболевших 17295, из которых пало 10773. Летальность составила 68,55%.
В течение 2000, 2002 и 2003 гг. заболевание среди овец и коз оспой установ лено в Астраханской области, Приморском крае и Еврейской автономной области.
В эти годы отмечалось 18 очагов оспы среди овец и коз с общим количеством забо левших 1096, из которых пало 589 животных. Летальность составила 53,7%. В 2001, 2004, 2005-2007 гг. наличие оспы овец и оспы коз на территории России не регист рировали.
2.2.2. Изучение иммунобиологических свойств известных штаммов вирусов оспы овец и коз Вопросы дифференциальной диагностики оспы овец и оспы коз, изучения инфекционной патологии, вызываемой этими вирусами при перекрестном зараже нии животных, являются актуальной проблемой.
С этой целью нами были проведены сравнительные исследования иммуно биологических свойств некоторых штаммов и полевых изолятов вирусов оспы овец и коз.
Для изучения культуральных свойств этих штаммов использовали первичную культуру почки овцы (ПО) и перевиваемые культуры клеток КГ-91, ПСГК, ППК, МDBK, СПЭВ, Vero, ВНК-21, Marc-145, ЭН. Репродуктивную активность вируса оценивали по времени появления ЦПД, интенсивности его развития и титру накоп ления вируса. Было установлено, что чувствительными является только первичная культура почки овцы и перевиваемые культуры клеток гонад козы КГ-91 и ВНК-21.
В первичной культуре клеток ПО штаммы «Афганский» и «ВНИИЗЖ» виру са оспы овец вызывали характерное ЦПД, титр вируса составлял 4,75-5,0 lg ТЦД50/см3. В перевиваемых культурах клеток КГ-91 и BHK-21 вирус также репро дуцировался с появлением специфичного ЦПД, титр вируса составлял 6,0 и 3,5 lg ТЦД50/см3, соответственно. Вирулентный штамм «Pellor» вируса оспы коз в переви ваемой культуре клеток гонад козы КГ-91 накапливался до 6,25 lg ТЦД50/см3.
Изучение клинических признаков оспы проводили при экспериментальном заражении овец и коз. У двух овец, зараженных вирулентным вирусом оспы овец штамм «Афганский», болезнь проявилась на 3 сутки и характеризовалась повыше нием температуры тела, образованием ярко-красного плотного отека кожи в месте введения вируса с последующим развитием тяжелой генерализованной формы. Ов цы, оставались больными в течение 14 дней (срок наблюдения).
Козы, инфицированные штаммом «Афганский», на заражение реагировали толь ко непродолжительной гипертермией и кожной реакцией в месте введения вируса.
У овец и коз, привитых вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец температурная реакция и какие-либо клинические признаки отсутствовали.
У двух зараженных штаммом «Рellor» коз на 7-8 сутки регистрировали подъ ем температуры тела до 40,6-41,1°С и на 11 и 17 сутки эти животные погибли. У за раженной овцы на 6–7 сутки после заражения температура тела поднялась до 40,4 40,6°С и наблюдалась незначительная местная реакция в виде гиперемии.
Таким образом, было показано, что вирулентные штаммы вирусов оспы овец и оспы коз имеют различную степень патогенности для гомологичного и гетероло гичного видов животных.
2.2.3. Идентификация полевых изолятов вирусов оспы овец и коз В течение 2002-2003 гг. с подозрением на оспу овец и оспу коз в ФГУ «ВНИ ИЗЖ» поступали пробы патологического материала и сыворотки крови из Примор ского края и Еврейской АО - Российской Федерации, а также Республики Таджики стан.
Во всех случаях в ФГУ «ВНИИЗЖ» при подозрении на оспу овец и коз ис следования проб проводили комплексным методом, т.е. путем заражения культуры клеток КГ-91, определением специфической активности в серологических реакци ях, постановкой ПЦР и, в отдельных случаях, биопробой.
В течение 2002-2003гг. в результате проведенных исследований в двух слу чаях был обнаружен вирус оспы овец и в двух случаях - вирус оспы коз.
При заражении перевиваемой культуры клеток гонады козы патологическим материалом отмечали наличие ЦДП. Вирус оспы коз, выделенный из проб патоло гического материала, присланного в 2003 году из Еврейской АО, был изучен, ко миссионно испытаны его иммунобиологические свойства и штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под наименованием «Приморский 2003».
Кроме патологического материала из хозяйств, где было подозрение на оспу овец и коз, также доставляли сыворотки крови от больных и переболевших живот ных, в которых обнаруживали специфические антитела к вирусам оспы овец и коз.
Результаты этих исследований показали, что сыворотки крови овец и коз, со держащие антитела к вирусу оспы коз, активнее реагировали с гомологичным виру сом оспы коз, чем с гетерологичным вирусом оспы овец.
2.2.4. Изучение иммунобиологических свойств штаммов «Приморский 2003» и «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз Вирус оспы, выделенный от коз в Приморском крае, нами исследован на пе ревиваемой культуре клеток гонад козы, в РДП и РДСК со специфическими сыво ротками и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили со вместно с к.б.н. А.В. Щербаковым и Е.С. Орловой.
Заражение перевиваемой культуры клеток гонад козы показало наличие ци топатических изменений, характерных для вирусов оспы овец и коз.
Ранее проведенными исследованиями было показано, что выделенный штамм «Приморский 2003» обладал патогенными свойствами и вызывал заболевание и ги бель зараженных коз. Уровень инфекционной активности вируса оспы коз штамм «Приморский 2003» на козах составил 7,1 lg ИД50/0,5см3.
Была испытана чувствительность разных линий культуры клеток - ПО, КГ 91, ПСГК, МDBK, СПЭВ, Vero, ВНК-21, Marc-145. При этом лучшие результаты получены при использовании 3-х суточной перевиваемой культуры клеток гонад козы КГ-91. Титр вируса к 10 пассажу достигал значения 6,5 lg ТЦД50/см3.
Вирус оспы коз штамм «ВНИИЗЖ 2003» после наработки и лиофилизации был испытан в лабораторных условиях на козах. Экспериментальными исследова ниями было установлено, что иммунизация коз штаммом «ВНИИЗЖ 2003» защи щала их при контрольном заражении штаммом «Приморский 2003» вируса оспы коз. Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» был комиссионно испытан, депо нирован и паспортизирован.
В дальнейшем штамм «ВНИИЗЖ 2003» был использован для изготовления мо новалентной вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз, которые были испытаны в эпизоотических условиях в Республике Таджи кистан с положительным результатом. Было установлено, что вакцинация овец и коз во всех случаях сопровождалась образованием антител, титр которых был выше на 30 день по сравнению с титрами антител через 10 дней после иммунизации.
Изучение антигенной активности ассоциированной вирусвакцины против ос пы овец и оспы коз проводили методом исследования сывороток крови вакциниро ванных овец в РН – против вируса оспы овец, а коз – против вируса оспы коз через 10, 20 и 30 дней после иммунизации животных, а в РДП – с антигеном вируса оспы овец.
Было установлено, что иммунизация животных ассоциированной вакциной сопровождалась образованием вируснейтрализующих антител в крови животных, уровень которых был выше против вируса оспы коз.
2.2.5. Разработка оптимальных условий культивирования вирусов оспы овец и оспы коз Для изучения особенностей репродукции вирусов оспы овец и коз различны ми способами были использованы вакцинный штамм вируса оспы овец «ВНИИЗЖ»
и вакцинный штамм вируса оспы коз «ВНИИЗЖ 2003», перевиваемые культуры клеток гонад козы (КГ-91), ее производственный трофовариант и монослойно суспензионная ВНК-21. Монослойную и роллерную культуру клеток заражали с ад сорбцией и без адсорбции вируса на клетках.
Результаты проведенных исследований показали, что оптимальной множест венностью инфицирования культуры клеток является доза вируса 0,1 ТЦД50/кл. В дальнейшем было проведено сравнение культивирования вирусов оспы овец и оспы коз стационарным, роллерным и суспензионным методами.
Было установлено, что при стационарном способе культивирования с исполь зованием перевиваемой культуры клеток КГ-91 вирусы оспы овец и оспы коз нака пливались в титрах 5,35-5,6 lg ТЦД50/см3, а при роллерном культивировании - 6, lg ТЦД50/см3. В трофоварианте культуры клеток гонад козы накопление вируса в среднем было выше на 0,75-1,25 lg по сравнению с культурой КГ-91 при обоих спо собах культивирования. Накопление вируса в культуре клеток ВНК-21 оказалось в пределах 3,55-4,3 lg ТЦД50/см3, что значительно уступает показателям при получе нии вируса оспы в перевиваемой культуре клеток КГ-91.
При суспензионном культивировании вирусов оспы овец и оспы коз в произ водственной линии клеток ВНК-21 средний титр был на 0,2-0,6 lg ТЦД50/см3 выше, чем при стационарном способе культивирования. При стационарном способе мак симальные сроки культивирования составляли 4-5 суток, а при использовании рол лерного и суспензионного методов сокращались до 3-4 суток.
Таким образом, результаты исследований показали, что для получения виру сов оспы овец и оспы коз пригодны перевиваемые культуры клеток гонад козы КГ 91, трофовариант культуры клеток гонад козы (ГК), а также производственная мо нослойно-суспензионная линия клеток ВНК-21. Более выраженное накопление ви русов отмечено в культурах клеток КГ-91 и ГК при использовании роллерного спо соба культивирования.
2.2.6. Изучение патогенных и антигенных свойств вирусов оспы овец и коз Для заражения взрослых овец и коз местных пород были использованы вирус оспы овец штамм «Афганский» с инфекционной активностью 5,25 lg ИД50/см3 и ви рус оспы коз штамм «Приморский 2003» с титром 7,1 lg ИД50/0,5см3.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что вирусы оспы овец и оспы коз обладали избирательной патогенностью, после инокуляции вирулентного гомологичного вируса оспы регистрировали генерализацию оспенно го процесса и гибель большинства зараженных животных. После инфицирования гетерологичным вирусом отмечали непродолжительную гипертермию и местную реакцию в виде гиперемии.
Следующим этапом наших исследований было изучение иммуногенных свойств вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец на овцах и козах. С этой целью 4-х овец и 4-х коз иммунизировали аттенуированным штаммом «ВНИИЗЖ»
вируса оспы овец по 10000 ТЦД50/см3, затем через 21 день инфицировали вирулент ными штаммами вирусов оспы овец и оспы коз.
Было установлено, что у овец, привитых вакцинным вирусом оспы овец, по сле контрольного заражения вирулентными вирусами оспы овец и коз клинических признаков болезни не было выявлено.
Заболевание отмечали только у привитых коз, из которых у двух, зараженных штаммом «Афганский», оно характеризовалось повышением температуры тела до 41,0С, покраснением и развитием кожного отека в месте введения вируса, без гене рализации заболевания. У других вакцинированных коз, зараженных штаммом «Приморский 2003», болезнь протекала тяжело и характеризовалась гипертермией до 40,0-41,5С продолжавшейся в течение 9 сут, отеком кожи в месте введения ви руса, генерализацией оспенного процесса по всей поверхности тела, отеком головы, конъюнктивитом, ринитом, угнетением, снижением аппетита, истощением. Специ фичность болезни подтверждена постановкой РДСК.
2.2.7. Получение антигенов и гипериммунных сывороток к вирусам оспы овец и оспы коз Для получения специфической сыворотки к вирусу оспы овец использовали 4-х овец романовской породы 2–3-летнего возраста массой 30–40 кг, которым пред варительно вводили подкожно вирусвакцину против оспы овец из штамма «ВНИ ИЗЖ», согласно наставлению. Через 21 день этих животных и трех не иммунных овец подвергали заражению вирулентным вирусом оспы овец, штамм «Афганский».
Заражение невакцинированных овец проводили с целью получения от них реконва лесцентной сыворотки. Через 30 дней проводили цикл трехкратной иммунизации животных. Для этого использовали культуральный концентрированный антиген, приготовленный из штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец, полученный в переви ваемой культуре клеток КГ-91. С целью активизации иммунного ответа вируссо держащий материал вводили вместе с сапонином. Антиген с содержанием 3-5 мг сапонина вводили трехкратно, подкожно, в бесшерстые места в несколько точек с интервалом 7 дней в объеме 5 см3 на каждую инъекцию. Динамику накопления ан тител в крови иммунизированных животных определяли в РДСК, РДП и РН (табл.1).
Таблица Специфическая активность сыворотки крови овец в процессе гипериммунизации Животные Кратность Активность сывороток в кол-во в иммунизации Характе РДП РДСК РН (log2) после ристика группе вакцинации н/и н/и 2,46±0, заражения Ц -1:2 1:10 - 1:20 3,37±0, Вакциниро 10 1-й иммуниз. Ц -1:16 1:10 - 1:30 5,55±0, ванные 2-й иммуниз. 1:4 -1:16 1: 60 - 1:120 6,11±0, 3-й иммуниз. 1: 16 - 1:32 1: 120 - 1:240 6,73±0, заражения 1:4 - 1:32 1:120 - 1:240 4,73±0, Реконва- 1-й иммуниз. 1:4 -1:32 1:120- 1:240 5,73±0, лесценты 2-й иммуниз. 1:8 - 1:32 1:120- 1:240 6,5±0, 3-й иммуниз. 1:16 - 1:32 1:240 - 1:320 7,0±0, Примечание: Ц - активность сыворотки в неразведенном виде, н/и - не исследовали.
Результаты проведенных исследований показали, что сыворотка крови обла дала высокой активностью, которая зависела от кратности иммунизации или пере болевания овец оспой.
Гипериммунную сыворотку против вируса оспы коз получали путем подкож ного введения козам вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в разведении 1:25 в объеме 1 см3. Через 21 день вакцинированных коз заражали виру лентным вирусом оспы коз штамм «Приморский 2003» методом введения суспен зии вируса внутрикожно в область внутренней поверхности хвоста по ИД50/0,5см3. Через 30 дней проводили цикл трехкратной иммунизации антигеном, приготовленным из штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз (табл. 2).
Таблица Специфическая активность сыворотки крови коз в процессе гипериммунизации Животные Кратность Активность сывороток в кол-во в иммунизации Характе РДП РДСК РН (log2) после ристика группе вакцинации н/а н/а 2,76±0, заражения Ц -1:2 1:10 - 1:20 3,77±0, Вакциниро 10 1-й иммуниз. Ц -1:16 1:10 - 1:30 5,55±0, ванные 2-й иммуниз. 1:4 -1:16 1: 60 - 1 6,23±0, 3-й иммуниз. 1:16 - 1:32 1: 120 - 1:160 6,55±0, заражения 1:8 - 1:32 1 - 1:120 4,73±0, Реконва- 1-й иммуниз. 1:8 -1:32 1 - 1:120 5,73±0, лесценты 2-й иммуниз. 1:8 - 1:32 1 - 1:120 6,11±0, 3-й иммуниз. 1:16 - 1:32 1:120 - 1:160 6,73±0, Примечание: Ц - активность сыворотки в неразведенном виде, н/а - не активна Результаты исследований показали наличие высокой активности сыворотки крови при гипериммунизации вакцинированных и переболевших коз культураль ным концентрированным антигеном оспы коз, приготовленным на перевиваемой культуре клеток гонады козы.
В отдельных опытах была получена гипериммунная сыворотка крови кроли ков. С этой целью проводили заражение животных методом введения суспензии вируса оспы коз штамм «Приморский 2003» внутрикожно в 5-6 точек, в области па ха в объеме 0,5 см3 на каждое животное. Через 21 день кроликов подвергали гипе риммунизации концентрированным очищенным антигеном.
Через 7 дней после 3-й иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови. Сыворотки крови расфасовывали в ампулы по 1,0 см3, лиофильно высушивали и исследовали в РДСК и РДП. Активность гипериммунных сывороток крови коз и кроликов в РДСК была 1-1:160 и в РДП - 1:8-1:32.
2.2.8. Изучение степени родства между вирусами оспы овец и коз с использованием серологических методов С целью изучения степени родства между вирусами оспы овец и коз нами была исследована в РДСК активность вирусов оспы овец и оспы коз в различных материалах с использованием специфических сывороток (табл. 3).
Таблица Специфическая активность материалов в РДСК Наименование материала Количество Сыворотка специфическая к проб ВОК ВОО Органо-тканевая суспензия ВОК 15 1:30-1:240 н.а.
Концентрированный антиген ВОК 20 1:60-1:320 н.а.
Органо-тканевая суспензия ВОО 15 1:10 1:40-1: Концентрированный антиген ВОО 25 1:10 1:40-1: Примечание: н.а. – не активна.
Исследования показали, что сыворотки к вирусам оспы овец и оспы коз об ладали высокой специфичностью к гомологичному вирусу и слабой к гетерологич ному. Вирус оспы коз в виде органо-тканевой суспензии или антигена давал поло жительную реакцию в разведении 1:30-1:240 или 1:60-1:320 только с гомологичной гипериммунной сывороткой крови, тогда как с гетерологичной к вирусу оспы овец реакция была отрицательной. Органо-тканевая вирусспецифическая суспензия или антиген вируса оспы коз с гомологичной сывороткой был активен в разведении 1:40-1 или 1:40-1:160, а против оспы коз всего 1:10.
2.2.9. Изучение специфической активности вирусов оспы овец и оспы коз при их длительном хранении С целью изучения специфической активности в РДСК и РДП после длитель ного хранения при температуре 4±2°С были исследованы образцы лиофилизиро ванного антигена вируса оспы овец штамм «ВНИИЗЖ» (табл. 4).
Таблица Активность антигена для РДСК и РДП вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» при длительном хранении Срок № Активность антигена в хране п/п РДСК РДП ния, после после исходный исходный мес хранения хранения 1 12 1:40 1:40 1:4 1: 2 24 1:40 1:40 1:4 1: 3 48 1:60 1:40 1:8 1: 4 66 1 1:60 1:16 1: 5 84 1 1:40 1:16 1: Установлено, что при длительном хранении отмечается некоторое снижение активности антигена вируса оспы овец для серологических реакций, которая зави села от сроков хранения. Если через 24 месяца активность антигена в РДП не изме нялась и была 1:4, то через 48 месяцев титр другого образца антигена был - 1:8, по сравнению с исходным он понижался до 1:4, через 66 месяцев – с 1:16 до 1:8 и через 84 месяца - с 1:16 до 1:4, соответственно, сохраняя пригодность для практического использования.
Изучение длительности хранения вирулентного штамма «Приморский 2003»
вируса оспы коз при температуре минус 40С в лиофильно высушенном виде в ам пулах показало, что титр вируса при хранении в течение 3-х лет не снижался и ос тавался на исходном уровне - 7,1 lg ТЦД50/см3.
Исследование биологической активности вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз после лиофилизации путем титрования десятикратных раз ведений вирусной суспензии в перевиваемой культуре клеток гонад козы КГ-91 по казало, что титр вируса при хранении в течение 1-3 лет снижался не более чем на 0,5 lg ТЦД50/см3 и составлял 5,11±0,09 и 5,41±0,15 lg ТЦД50/см3.
2.2.10. Определение антигенного родства между штаммами вируса оспы различных видов животных При изучении антигенного родства между вирусами оспы овец и нодулярно го дерматита КРС были проведены исследования по возможности использования вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» для защиты животных от заболевания нодулярным дерматитом. Для этого было вакцинировано 4 быка 2-х летнего возраста, из которых 2 – в объеме 4 см3 и 2 – 10 см3, содержащих 160 000 и 400 000 ТЦД50/см3, соответственно.
В качестве контроля использовали одно неиммунное животное. Через 21 день после введения вакцины всех животных заразили вирулентным вирусом нодуляр ного дерматита КРС, который вводили внутрикожно в область шеи в объеме по см3 по 0,1 см3 в 50 точек.
Было установлено, что на 4 сутки у всех животных в месте введения вирус ной суспензии отмечено образование узелковых уплотнений, которые на 14 сутки исчезли у 3-х из 4-х животных, привитых вирусвакциной против оспы овец в объе ме 4 см3 и 10 см3. Контрольное животное и одно привитое в дозе 4 см3 болели ноду лярным дерматитом в течение всего срока наблюдения (21 сутки).
При исследовании сывороток крови полученных на 21 день после вакцина ции в РДСК антител против оспы овец не обнаружено, а через 14 дней после зара жения вирусом нодулярного дерматита титр антител был в пределах 1:8.
Полученные данные показали, что крупный рогатый скот, привитый против оспы овец, был частично защищен от заболевания нодулярным дерматитом при экс периментальном заражении.
Изучение антигенного родства между вирусами оспы различных видов сель скохозяйственных животных: овец, коз, КРС, свиней, лошадей и верблюдов прово дили в РДСК (опыты проведены совместно с к.в.н. Д.К. Басовой). Определение ан тигенного родства проводили методом учета результатов реакции по максимальным разведениям сывороток, вызывающих 100%-ную задержку гемолиза эритроцитов и рассчитывали по формуле Архетти и Хорсфала [З. Лярски,1980].
У всех вирусов оспы 100% уровень родства был определен только при взаи модействии гомологичных сывороток и антигенов. В реакциях с гетерологичными сыворотками и антигенами уровень родства составлял от 12% (у вирусов оспы сви ней и КРС) до 43% (у вирусов оспы верблюдов и лошадей).
Таким образом, проведенные исследования показали, что вирусы оспы овец, коз, КРС, свиней, лошадей, верблюдов и гипериммунные к ним сыворотки вступа ют в перекрестные реакции в РДСК, однако они имели существенные различия в антигенном отношении.
2.2.11. Изучение поствакцинального гуморального иммунитета против вирусов оспы овец и оспы коз При изучении иммунитета использовали РН, РДСК и ИФА, с помощью кото рых определяли уровень поствакцинальных и постинфекционных антител в сыво ротках крови овец и коз против вируса оспы.
Изучение особенностей гуморального иммунитета проводили на 21 овце и козах, которые были привиты моно- и ассоциированными вирусвакцинами против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в при вивной дозе 1,0 см3, содержащей по 10000 ТЦД50/см3. Образцы ассоциированной вакцины против оспы овец и оспы коз имели разное соотношение антигенов 1:1, 5: и 10:1, где в прививной дозе содержалось вируса оспы овец и коз по 10000 и ТЦД50/см3, по 50000 и 100000 ТЦД50/см3, 100000 и 100000 ТЦД50/см3, соответствен но. Все овцы и козы, включая контрольных, через 21 сутки после иммунизации бы ли заражены вирулентными штаммами «Афганский» вируса оспы овец или «При морский 2003» вируса оспы коз соответственно.
Установлено, что в крови овец, привитых против оспы овец, через 21 день титр антител в РН против оспы овец был выше, чем против оспы коз и соответство вал 3,70±0,23 log2 и 2,88±0,14 log2, соответственно (табл. 5). Аналогичные результа ты получены при иммунизации коз.
Таблица Результаты исследований активности сывороток крови овец и коз, вакцинированных против оспы в РН (n=3) Введена Титр антител к вирусу оспы (log2) Вид живот №№ групп вирус- овец коз вакцина дни против ных 7 14 21 7 14 оспы I овец н/и н/и 1,10±0,32 2,76±0,48 3,70±0,23 2,88±0, овцы II коз н/и н/и н/и 0,87±0,47 2,12±0,42 2,89±0, III овец 0,31±0, 1,10±0,28 2,12±0,25 0,46±0,08 1,75±0,21 2,71± 0, козы IV коз н/о 1,02±0,17 2,49±0,14 0,71±0,05 2,14±0,17 3,58±0, Примечание: н/и – не исследовано, н/о – антител не обнаружено.
При изучении комплементсвязывающей активности сыворотки крови овец, иммунизированных вирусвакциной против оспы овец, установлено через 14 и день наличие антител в титрах 1:2–1:4 и 1:4–16, соответственно на гомологичный вирус, тогда как антител против вируса оспы коз в этих же сыворотках не обнару жено. После заражения животных вирусом оспы овец в крови выявлены антитела в титрах 1:32 у животных, которые были устойчивы к заболеванию и 1:128–1:512 у овец, у которых в месте введения вируса отмечено наличие местной реакции в виде небольшого отека и гиперемии.
При изучении специфической активности сывороток крови в ИФА установ лено наличие более высоких титров антител в крови животных, для которых пред назначена вакцина. Существенные отличия в активности сывороток крови выявле ны у этих животных после экспериментального заражения вирусом оспы овец штамм «Афганский», когда против гомологичного вируса титр антител достигал 1:1600–1:25000, а против вируса оспы коз он был только в пределах 1:100–1:400.
После иммунизации овец вирусвакциной против оспы коз на 21 день титр антител против вирусов оспы овец и оспы коз был невысоким – 1:50–1:100.
После заражения этих животных вирусом оспы овец штамм «Афганский» титр антител против вируса оспы овец достигал больших значений 1:3200–1:25600, тогда как против вируса оспы коз он был значительно ниже – в пределах 1:200–1:400.
В крови контрольных зараженных овец титр антител против оспы овец был ра вен 1:3200, а против вируса оспы коз – 1:100.
3. ВЫВОДЫ 1. Оспа овец и оспа коз широко распространены в мире, в т.ч. и в странах СНГ. По официальным данным МЭБ, с 1996 по 2006гг неблагополучными по этим заболева ниям являлись 60 стран: 27 азиатских, 27 африканских и 6 европейских. В послед ние годы вспышки оспы коз, как самостоятельного заболевания зарегистрированы в странах Азии и в России.
2. Наиболее чувствительными клетками для репродукции вирусов оспы овец и оспы коз являются первичная культура клеток почки овцы, перевиваемая культура кле ток гонад козы КГ-91, ее трофовариант и производственная линия клеток ВНК-21, в которых титр вируса достигал значений 5,5 lg, 7,0 lg, 7,5 lg, 4,5 lg ТЦД50/см3, соот ветственно. Наибольшее накопление вирусов отмечается при роллерном методе культивирования.
3. Экспериментально установлено, что у овец и коз после внутрикожной инокуля ции вирулентного гомологичного вируса оспы (штамм «Афганский» вируса оспы овец и штаммы «Pellor» и «Приморский 2003» вируса оспы коз) регистрируется ге нерализация оспенного процесса и гибель большинства зараженных животных. По сле инфицирования гетерологичным вирусом отмечается только непродолжитель ная гипертермия и местная реакция в виде гиперемии.
4. В целях диагностики оспы овец и оспы коз использованы серологические мето ды: РДСК, РДП, ИФА, для постановки которых разработаны методы получения концентрированного антигена и гипериммунных сывороток крови к вирусу оспы коз на кроликах и козах, активность которых составила в РДСК 1:120-1:160, в РДП 1:16-1:32 и в ИФА – 1:1000-1:4000.
5. Установлены существенные антигенные отличия между вирусами оспы овец и оспы коз с вирусами оспы КРС, свиней, лошадей и верблюдов по данным, получен ным в РДСК. Уровень родства составлял от 13% с вирусом оспы КРС до 27% с ви русом оспы свиней.
6. Вирусы оспы овец и оспы коз в лиофилизированном состоянии при хранении при температуре 4±2°С не снижают биологической активности в течение 24 месяцев.
7. Крупный рогатый скот, иммунизированный вирусвакциной против оспы овец, частично защищен от контрольного заражения вирусом нодулярного дерматита КРС, что подтверждает наличие антигенного родства между этими каприпоксвиру сами.
8. Показано, что ассоциированная вакцина, приготовленная из вирусов оспы овец и оспы коз, защищает иммунизированных животных от прямого заражения виру лентными вирусами. Установлена зависимость эффективности от соотношения в ассоциированной вакцине антигенов вирусов оспы овец и оспы коз.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 1. Для практического использования предлагаются:
- производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганиз мов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации ле карственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.);
- контрольный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (справка о депонировании от 14.06.2006г.).
2. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические доку менты:
«Методические указания по получению гипериммунной сыворотки крови для диагностики оспы коз», 2006 г.;
«Методические указания по диагностике оспы коз методом постановки реак ции длительного связывания комплемента», 2006 г.;
«Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивиро ванию аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы коз», 2006 г.;
«Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирус вакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003», 2006 г.
3. Результаты исследований вошли в следующие нормативные документы:
- СТО «Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая» утвержденный заместителем руководителя Россельхознадзора 07.08.2007 г.;
- СТО «Набор для диагностики оспы овец иммуноферментным методом», утвер жденный заместителем руководителя Россельхознадзора 21.04.2008 г.;
- СТО «Набор препаратов для диагностики оспы овец в реакциях длительного свя зывания комплемента и диффузионной преципитации», утвержденный заместите лем Россельхознадзора 21.04.2008 г.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Культивирование аттенуированного вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» в культуре клеток гонад козы роллерным методом / Л.Б. Кутумбетов, Т.И. Корпусова, Ш.К. Куляшбекова, М.С. Зиновьева // Роль вет. науки в развитии жив-ва: матер.
междунар. науч.-произв. конф., посвящен. 75-летию КазахНИВИ.-Алматы,2000. С.128-129.
2. Изучение патогенности вирусов оспы овец и оспы коз / М.С. Зиновьева, В.М.
Захаров, В.И. Диев, Д.К. Басова // ВУЗ и АПК: задачи, проблемы и пути решения:
сб. науч. тр. межрегион. юбил. науч.-практ. конф.-Махачкала,2002.-С.288-290.
3. Цитопатогенная активность клона Г-35 вируса оспы коз в культуре клеток гонад козы / Л.Б. Кутумбетов, М.С. Зиновьева, Н.И. Корчагина, А.С. Назаров // Акту альн. пробл. патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: матер. конф.
молодых ученых.-Владимир, 2002.-С.7-11.
4. Получение и использование стабильного производственного трофоварианта кле ток гонад козы для вирусологических исследований / Т.И. Корпусова, Б.Л. Манин, Л.Б. Кутумбетов, М.С. Зиновьева, В.В. Михалишин, Ш.К. Куляшбекова, С.В. Хле бопашникова // Биолого-экологические пробл. заразных болезней диких жив-х и их роль в патологии с.-х. жив-х и людей: матер. науч.-практ. конф.-Покров, 2002. С.290-293.
5. Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и коз на гетеровидовых жи вотных / Л.Б. Кутумбетов, М.С. Зиновьева, С.В. Хлебопашникова, Н.И. Ковали шина // Вет. медицина: межвед. тематич. науч. сб. ИЭКВМ.-Харьков,2002.-Вып.80. С.359-362.
6. Усовершенствование методов контроля вакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» / М.С. Зиновьева, А.В. Гарькин, Д.К. Басова, В.И Диев., В.М. Захаров //Актуальн. вопр. зоотехн. науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с.-х. жив-х: матер. 2-й Междунар. науч.-практ. конф. Ставрополь,2003.-С.317-320.
7. Патогенность вируса оспы коз / Л.Б. Кутумбетов, К.Р. Кульбаева, А.С. Назаров, М.С. Зиновьева, О.А. Пронина, В.И. Диев // Актуальн. пробл. болезней жив-х в со времен. условиях: матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящен. 60-летию Тадж НИВИ.-Душанбе,2003.-С.40-42.
8. Влияние длительного хранения лиофилизированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» на специфическую активность / Д.К. Басова, А.В.
Гарькин, М.С. Кукушкина, В.И. Диев, Ф.П. Курченко // Актуальн. пробл. инфек ционной патологии жив-х: матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ».-Владимир,2003.-С.451-452.
9. Получение препаратов для иммуноферментной диагностики оспы коз / О.П.
Бьядовская, Г.Н. Дороненкова, М.С. Кукушкина, А.П. Пономарев, Л.Б. Прохвати лова // Науч. основы обеспечения защиты жив-х от экзотоксинов, радионуклеидов, возбудителей опасных инфекционных заболеваний: матер. Междунар. симпоз. Казань,2005.-Ч.2.-С.70-73.
10. Кукушкина, М.С. Изучение репродукции вирусов оспы овец и коз в перевивае мых культурах клеток / М.С. Кукушкина //Вет. патология.-2006.-№4.-С.78-81.
11. Изучение культуральных свойств аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003»
вируса оспы коз / Н.В. Мороз, В.В. Борисов, В.И. Диев, А.В. Гарькин, М.С. Ку кушкина, Т.И. Корпусова, Д.К. Басова, Г.А. Блотова, А.В. Константинов // Моло дежь и наука XXI века: матер. II-й открытой Всерос. науч.-практ. конф. молодых ученых.-Ульяновск,2007.-Ч.1.-С.116-121.
12. Изучение патогенных свойств штамма «Приморский-2003» вируса оспы коз / М.С. Кукушкина, А.В. Гарькин, Н.В. Мороз, В.И. Диев // Вестн. Кыргызского на уч.-исслед. института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП).-Бишкек,2007.-№1.-С.229-233.
13. Сравнительный анализ эффективности гомологичной и гетерологичной иммуни зации овец и коз против оспы / М.С. Кукушкина, А.В. Гарькин, Н.В. Мороз, В.И.
Диев // Вестн. Кыргызского науч.-исслед. института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Арстанбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП).-Бишкек,2007.-№1.-С.234-238.
14. Изучение культуральных свойств аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003»
вируса оспы коз / Н.В. Мороз, В.В. Борисов, В.И. Диев, А.В. Гарькин, М.С. Ку кушкина, Т.И. Корпусова, Д.К. Басова, Г.А. Блотова, А.В. Константинов // Вестник Кыргызского науч.-исслед. института жив-ва, ветеринарии и пастбищ имени Ар станбека Дуйшеева (КыргНИИЖВиП).-Бишкек,2007.-№1.-С.254-259.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экз., май 2008г.