Разработка методов направленного 11- и 14-гидроксилирования стероидов
На правах рукописи
Ядерец Вера Владимировна
Разработка методов направленного 11- и
14-гидроксилирования стероидов
03.01.06. «Биотехнология (в том числе
бионанотехнологии)»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2011
Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» Российской Академии Наук кандидат химических наук Научные руководители: Андрюшина Валентина Александровна;
кандидат биологических наук Войшвилло Наталия Евгеньевна доктор химических наук
Официальные оппоненты:
Заварзин Игорь Викторович кандидат биологических наук Мурыгина Валентина Павловна Московский государственный
Ведущая организация университет пищевых производств.
Защита диссертации состоится 22 марта 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета.
Автореферат разослан 21 февраля 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, Пискункова Н.Ф.
кандидат биологических наук 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время в медицине и ветеринарии в качестве лекарственных средств, как правило, используются модифицированные аналоги стероидных гормонов, обладающие более сильным и направленным действием, не отягощенным побочными эффектами. Особое место среди модифицированных стероидов занимают гидроксилсодержащие стероиды, поскольку введение гидроксила в любое положение молекулы приводит либо к повышению ее биологической активности, либо к изменению направленности действия, причем на активность влияет не только положение, но и пространственная ориентация гидроксигруппы относительно стероидного скелета.
Так, например, гидроксигруппа при С16 - за глюкокортикоидную активность. Введение гидроксила в 9-положение стероидной молекулы приводит к интермедиатам, широко используемым в фармацевтической практике для синтеза фторированных кортикоидов противовоспалительного и антиаллергического действия. Гидроксилированные в 14-положение андростаны являются важными интермедиатами синтеза высокоактивных гестагенов, а 11 -гидроксилирование прегнановых производных повышает гестагенный и контрацептивный эффект. Избирательное гидроксилирование в 11-положение стероидной молекулы приводит к синтезу высокоактивных кортикостероидов противовоспалительного и антиаллергического действия, таких как гидрокортизон, преднизолон, триамцинолон, дексаметазон и др., многие из которых входят в список жизненно необходимых и имеют неоценимое практическое использование в онкологии, пульмонологии, дерматологии, ревматологии и других областях медицины. [Fernandes P. et al.
2003].
Спрос на стероидные лекарственные препараты в мире с каждым годом возрастает, что объясняется ухудшением экологии и ростом в связи с этим онкологических, аллергических и других заболеваний. Эта ситуация диктует необходимость поиска путей синтеза новых высокоактивных аналогов стероидов с улучшенными терапевтическими свойствами. Опыт синтеза новых стероидных соединений, являющихся структурными аналогами природных гормонов, и изучения их активности, открывает перспективу дальнейших исследований с целью создания новых эффективных препаратов, приемлемых в медицине и ветеринарии в лечебных целях и для регуляции рождаемости. Поэтому тема настоящего исследования, посвященная синтезу гидроксил-содержащих стероидов, обладающих высокой и пролонгированной активностью, не отягощенной сопутствующими побочными эффектами, является чрезвычайно актуальной.
Состояние вопроса. Химический синтез стероидных соединений труден и многостадиен и, как правило, наиболее сложным этапом этого синтеза является введение гидроксильной группы. Поэтому проблема селективного гидроксилирования относится к числу важнейших в химии стероидов. И только микробиологическое гидроксилирование позволяет заменить многостадийный химический синтез одностадийной биоконверсией. Поэтому при модификации стероидной молекулы предпочтение отдается микробиологической трансформации, отличающейся стерео- и регио специфичностью, недоступной химическим методам и не требующей предварительной защиты имеющихся в молекуле функциональных групп.
Немаловажную роль играет в этом случае и экологическая безопасность.
Зачастую, микробиологическое гидроксилирование является единственно возможным методом. [Fernandes P. et al. 2003].
Однако, несмотря на полувековую историю применения микробиологических методов трансформации стероидов, процесс гидроксилирования по-прежнему остается наименее изученным.
Недостаточно сведений о зависимости направленности микробиологического гидроксилирования от структуры стероидного субстрата и таксономического положения микроорганизма-трансформатора.
Используемые в известных способах синтеза штаммы недостаточно селективны, процесс гидроксилирования проводится при низких нагрузках стероидного субстрата с низкими выходами целевых продуктов, а образующиеся многочисленные побочные продукты значительно затрудняют стадии выделения и очистки.
Продолжает оставаться неизвестной физиологическая роль гидроксилирования стероидов грибами, у которых скорость, направление и ориентация трансформации зависят от вида микроорганизма, трансформируемого субстрата и ряда физико-химических факторов. Поэтому актуален поиск новых продуцентов с высокой стерео – и регио специфической гидроксилазной активностью и подбор условий, позволяющих осуществлять данный процесс селективно с максимальным выходом целевого продукта.
В настоящее время идентифицированы различные микроорганизмы, использование которых позволяет осуществить почти все возможные трансформации стероидной молекулы. Из них наибольшую практическую значимость имеют следующие реакции: гидроксилирование (7/, 9-, 11/-, 14-,15/, 16-), 1,2-дегидрирование и селективное отщепление боковой цепи стеринов и желчных кислот, получившие промышленное применение в производстве стероидных лекарственных препаратов.
Объектами настоящего исследования являются практически значимые процессы направленного 11- и 14-гидроксилирования, открывающие пути синтеза новых модифицированных стероидов с ценными фармакологическими свойствами.
Анализ фактического материала, накопленного к настоящему времени, свидетельствует о том, что, в отличие от 11-гидроксилирования, которое осуществляют достаточное число микроорганизмов, способность к накоплению 11-гидроксистероидов с удовлетворительным выходом, но в смеси с 11-гидроксипродуктами, присуща ограниченному количеству видов грибов (Absidia orchidis, Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans, Cochliobolus lunatus). И только штаммы Curvularia lunata (коллекций - АТСС, IFO, NRRL, ВКМ, ВКПМ и др.) из 35 известных видов широко распространенного в природе плесневого гриба рода Curvularia, проводят гидроксилирование 4-3-кетостероидов преимущественно в 11-положение и применяются в промышленности для получения гидрокортизона и его производных.
Несмотря на внушительное число исследований, выполненных с различными штаммами грибов и, главным образом с C. lunata, особого прогресса в процессе 11-гидроксилирования не наблюдается: используемые штаммы далеки от совершенства, а нагрузки субстратов невысоки.
Что касается 14-гидроксилирования, то интерес к этой реакции обусловлен тем, что 14-гидроксистероиды или сами по себе обладают физиологической активностью, или открывают путь к синтезу соединений с высокой контрацептивной и канцеролитической активностью [Yoshioka H. et al. 1994]. Однако в мировой практике используются только несколько препаратов этого ряда, что объясняется трудностью их синтеза, а конкретно - сложностью введения гидроксильной группы в стерически затрудненное 14-положение. Кроме того, микробиологическое 14-гидроксилирование по сравнению с 9- и 11-гидроксилированием менее изучено.
В целом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что не смотря на большое количество работ, посвященных проблемам 11- и 14 – гидроксилирования, многие вопросы, имеющие ключевое значение для решения проблемы селективности и повышения эффективности этих процессов остаются недостаточно изученными.
Поэтому представлялось целесообразным разработать и оптимизировать методы направленного 11- и 14-гидроксилирования, обеспечивающие селективность процесса, а также максимальную нагрузку исходного субстрата и выход целевого продукта. Кроме того, планировалось на основе полученных гидроксистероидов разработать схему синтеза гестагенов нового поколения (аналогов пролигестона) и изучить их биологическую активность.
Цели и задачи работы. Основной целью работы являлась разработка методов направленного 11- и 14-гидроксилирования стероидной молекулы, открывающих путь к синтезу высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:
1. Выявить наиболее активные штаммы со способностью к 11- и 14-гидроксилированию стероидов андростанового и прегнанового рядов;
2. Провести селекционные работы с выбранными штаммами для разработки способов 11- и 14-гидроксилирования с повышенными нагрузками стероидных субстратов;
3. Исследовать взаимосвязь между строением стероидной молекулы и направлением реакций гидроксилирования с помощью выбранных микроорганизмов;
4. Разработать эффективный способ 14-гидроксилирования андростендиона как первой стадии синтеза препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного и канцеролитического действия;
Разработать эффективный способ 11-гидроксилирования 4-3 5.
кетостероидов для синтеза высокоактивных аналогов стероидных лекарственных препаратов;
6. Провести исследования по синтезу пролигестона и его аналогов из андростендиона и наработать 14-гидроксилированные производные прегнана для изучения их биологической активности.
Научная новизна работы. Методом лабораторной селекции при непосредственном участии автора получен новый штамм Curvularia lunata с маркером резистентности к антибиотику генетицину “G-418”, отличающийся от известных штаммов высокой селективностью в процессе 11 гидроксилирования. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-988 и защищен патентом РФ № 2399674 (Бюл. Изобр. № 26 от 20.09.2010).
Впервые с использованием штамма C. lunata ВКПМ F-988 разработан способ направленного 11-гидроксилирования 4-3-кетостероидов, который может быть использован при разработке биотехнологических методов получения новых лекарственных препаратов противовоспалительного и антиаллергического действия.
Впервые с использованием штамма C. lunata ВКПМ F-981, полученного ранее в лаборатории биотехнологии стероидов, разработан способ 4-3,17-дикетоандростенов, направленного 14-гидроксилирования перспективных в синтезе новых стероидных препаратов канцеролитического, контрацептивного и антигонадотропного действия. На способ 14 гидроксилирования получен патент РФ № 2 407 800 (Бюл. Изобр. № 36 от 27.12.2010).
Оптимизированы процессы 11- и 14-гидроксилирования новыми штаммами грибов, что позволило значительно увеличить нагрузку некоторых стероидных субстратов в реакциях гидроксилирования грибами.
Осуществлен синтез пролигестона из основного предшественника андростендиона с использованием на первой стадии разработанного метода направленного 14-гидроксилирования.
Впервые показана возможность использования 14 гидроксикортексолона в качестве интермедиата в синтезе гестагенов нового поколения.
Впервые получен новый аналог пролигестона с высокой контрацептивной активностью.
Практическая значимость работы. Результаты работы являются основой новых биотехнологических методов получения ценных гидроксистероидов, которые или сами по себе обладают высокой биологической активностью или являются полупродуктами синтеза новых высокоэффективных аналогов стероидов.
Полученные в процессе исследования штаммы могут быть использованы в промышленном производстве стероидных лекарственных препаратов с уникальной фармакологической активностью.
Проведенная оптимизация способов направленного 11- и 14 гидроксилирования стероидов позволит использовать эти методы при масштабировании процессов синтеза гидроксилсодержащих стероидных аналогов с ценными терапевтическими свойствами.
Разработан способ получения гестагенов нового поколения и показана их высокая контрацептивная активность.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 сообщение, 5 тезисов и патента РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: I Всероссийской научно практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (2007, Пущино), XX зимней международной молодёжной научной школе «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва), XXVIII Российской Школе «Наука и технология» (2008, Миасс), V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2009, Москва), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. (2009, Москва), Международной конференции «Передовые технологии российских инноваторов» (2010, Париж.) Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 115страниц печатного текста, 11 таблиц, 38 рисунков. Библиография включает 153 наименований, из них 123 иностранных работ.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Культивирование микроорганизмов. Культивирование мицелиальных грибов, используемых в работе, за исключением Rhisopus nigricans, проводили в жидкой среде следующего состава (г/л): глюкоза – 20.0, пептон – 5.0, дрожжевой экстракт – 5.0, соевая мука – 10.0, рН = 6.0-6.3. Среда для выращивания R. nigricans содержала (г/л): глюкоза – 10.0, кукурузный экстракт – 15.0, KH2PO4 – 1.0, рН = 5.4-5.6. Культуры выращивали в 70-100мл среды в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение 72 ч при температуре 29С и скорости перемешивания 220 об/мин. Посевной материал (10% об.) переносили в свежую среду того же состава. Для получения рабочего мицелия продолжали инкубацию в течение 24-48 ч. Для трансформации в условиях растущей культуры через 16-18 ч роста вносили стероидный субстрат в виде раствора в метаноле (2 % об.) в количестве 0.5-1.0 г/л.
Получение гриба C. lunata, устойчивого к генетицину “G-418”.
Клоны гриба, резистентные к генетицину, получали методом ступенчатой селекции на указанной выше агаризованной среде в чашках Петри, но содержащей антибиотик в определенной концентрации. Был получен штамм, обладающий способностью к росту на среде с генетицином в количестве мкг/мл. Агаризованную среду с антибиотиком максимальной концентрации использовали для поддержания культуры.
Трансформацию стероидов отмытым мицелием C. lunata проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл при температуре 28-29С и скорости перемешивания 220 об/мин. В качестве среды для трансформации использовали 1/15 M фосфатный буфер, рН = 6.0 – 6.2, который разливали в колбы по 50-70 мл. Стероидные субстраты вносили в виде растворов в органических растворителях (диметилформамид (ДМФА), метанол (МеОН), количество которых составляло 4% об, а также в виде тонко измельченного порошка или в виде комплекса с метилциклодекстрином (МЦД).
Аналитические методы.
ТСХ. Пробы стероидов экстрагировали этилацетатом (1:2 об.) и анализировали на пластинках Silufol UV 250 нм (Чехословакия) и Sorbfill UV 250 нм (Россия), используя систему хлороформ/ацетон (7:3). Для анализа трансформации 5-олефинов использовали цветные реакции, для чего пластинки опрыскивали растворами сульфата церия или ванилина в водных растворах серной или хлорной кислот и нагревали до 70-80о С.
ВЭЖХ анализ проводили на колонке “Нуклеосил С18” 250 х 4.0 мм.
Подвижная фаза – смесь 70% метанола с 30% воды, подкисленной концентрированной ортофосфорной кислотой (1 мл кислоты на 1 л воды).
Скорость подвижной фазы – 1.2 мл/мин. Детекция в УФ при 240 нм, чувствительность 0.05 ед. ОП на шкалу. Пробы вводили инжектором с дозирующей петлей, вместимостью 10 мкл. Определение проводили при комнатной температуре. Концентрация стандартов - 1 мг/мл.
Выделение продуктов трансформации. Мицелий C. lunata отфильтровывали, промывали водой и проверяли с помощью ТСХ содержание в нем стероидов. При их наличии мицелий экстрагировали этилацетатом. Фильтрат (трансформационная среда) и промывную воду объединяли и экстрагировали до полного извлечения стероидов.
Объединенный экстракт осветляли активированным углем и упаривали на роторном испарителе. Полученный остаток сушили до постоянного веса и анализировали с помощью ТСХ. Для получения индивидуальных соединений использовали метод кристаллизации в органическом растворителе (метаноле). Многокомпонентные смеси разделяли препаративной хроматографией на стеклянных пластинках Merck Kieselgel 40 F254 или на колонке с SiO2 40-100 мк. На колонке выделяли также побочные соединения, которые накапливались в маточных растворах при перекристаллизации стероидов.
Выход соединений рассчитывали по формуле Q=100·P/(S·(Mp/Мs), где Р вес выделенного кристаллического продукта, S – количество взятого в реакцию субстрата, Мp - молекулярный вес продукта, Мs - молекулярный вес субстрата.
Хроматографирование на пластинке. 20-25 мг смеси стероидов растворяли в 1-2 мл хлороформа или в смеси хлороформ/метанол (1:1) и наносили на пластинку (20х20 см), которую помещали в систему хлороформ/ацетон (4:1). Распределение полос со стероидами определяли на УФ-хромотоскопе или проявляя раствором ванилина в хлорной кислоте.
Сорбент, содержащий определенный стероид, снимали с пластинки и промывали хлорофомом на фильтре Шотта. Растворитель упаривали и выделяли кристаллический продукт, который промывали эфиром. Структуру веществ подтверждали ПМР-спектроскопией.
Хроматографирование на колонке. Многокомпонентную смесь растворяли в хлороформе и заливали на колонку, заполненную силикагелем из расчета 1 г смеси на 50 мл силикагеля. Элюировали смесью хлороформ/ацетон от 7:1 до 4:1, контролируя появление целевого стероида с помощью ТСХ. Элюат упаривали, кристаллический остаток промывали эфиром. Предполагаемую структуру подтверждали ПМР-спектроскопией.
Протонный магнитный резонанс (ПМР) использовали для идентификации продуктов трансформации. Спектры ПМР снимали на ПМР спектрометре XL-400 («Varian» США) в CDCl3 или в смеси CDCl3 и D DMSO.
Все эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью Exel (MS Office 2007).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
2.2.1. Разработка способа 14-гидроксилирования.
2.2.1.1. Выбор способа гидроксилирования. Для синтеза биологически активных 14-гидроксилсодержащих прегнанов последнего поколения, в частности препарата пролигестона, возможны два подхода. Первый включает первоначальное построение диоксиацетоновой цепи у андростанов ( химических стадий) с последующим одностадийным микробиологическим введением гидроксильной группы в 14-положение.
Согласно второму пути, сначала осуществляется введение 14 гидроксигруппы химическим или микробиологическим способом в молекулу стероида и последующим наращиванием прегнановой боковой цепи до получения целевого продукта.
Исходными соединениями в обоих вариантах являются андростендион (АД) и дегидроэпиандростерон (ДЭА) – полупродукты синтеза стероидных препаратов из растительного сырья. Первоначально мы проверили возможность введения гидроксильной группы при С14 с помощью химических реакций.
К сожалению опробованные нами варианты синтеза оказались неудачны:
Нам не удалось получить 14-ОН-АД химическим путем, а выход 14-ОН ДЭА не превысил 35%. Это согласуется с известными из литературных источников данными по химическим методам 14-гидроксилирования, отличающимся жесткими условиями реакций и чрезвычайно низкими выходами.
Прямое введение кислородной функции в неактивное положение стероидного ядра на стыке колец С и D стероидной молекулы (intact ring system) было осуществлено путем окисления хромовым ангидридом 5,6 дибромида ацетата ДЭА в уксусной кислоте в безводных условиях по методу Физера c последующим дебромированием продукта реакции. Однако данный способ оказался малоэффективным. Таким образом, микробиологическое 14-гидроксилиирование оказалось предпочтительнее.
2.2.1.2. Исследование гидроксилазной активности плесневых грибов.
Кортексолон (в-во «S») – основное соединение в синтезе биологически активных стероидных соединений, а после введения 14-гидроксигрупы и удаления гидроксильной группы в 21-положении может быть рассмотрено как ценный интермедиат в синтезе гестагенов нового поколения.
Поэтому, на первом этапе исследования была проведена работа по поиску культур, способных вводить 14-гидроксильноую группу в молекулу АД, ацетата ДЭА (АДЭА), в-во «S». Для исследования были выбраны культуры, имеющиеся в коллекции Центра «Биоинженерия» РАН:
Cunninghamella blakesleeana ВКМ F-993, Cunninghamella echinulata ВКМ F 1059, Curvularia lunata ВКПМ F-981, Helicostylum piriforme ВКМ F-1068, Mortierella isabellina ВКМ F-1626, Rhizopus nigricans LBS, Thieghemellа hyalospora LBS. Основанием для такого выбора служили литературные данные о способности штаммов этих микроорганизмов к образованию 11- и 14-гидроксипроизводных 4-3-кетоcтероидов ряда андростана и прегнана.
Результаты представлены в табл.1.
Таблица 1.
Гидроксилирование в-ва «S», АД и АДЭА плесневыми грибами Субстраты, реакции «S» АД АДЭА Культура основная побочная основная побочная основная побочная реакция реакция реакция реакция реакция реакция 17-СО C. lunata 11- 14- 14 7 17-ОН 14 C. blakesleeana 11- 11- н/пр 7 н/пр следы 14 C. echynulata 11- 11- н/пр 7 н/пр следы H. piriforme н/пр н/пр 7 н/пр 17-СО M. isabellina 11- 11- н/пр 17-ОН T. hyalospora 11- 11- 17-СО - 17-ОН 7 н/пр R. nigricans 11- 6- 11- 6- 11- 11 Прим. н/пр – смесь неидентифицированных продуктов;
17-СО - 17-ОН– восстановление кетогруппы при С17;
(-) – отсутствие реакции.
Как видно из представленных данных, 14-гидроксилирование как основная реакция протекала только при гидроксилировании АД с помощью культуры C. lunata. Наблюдалось образование 14-гидрокси-АД (14-ОН АД), а в качестве побочного соединения - 11-гидрокси-тестостерона (11 ОН-ТС) (см. рис.1). При трансформации в-ва «S» для всех штаммов, кроме H. piriforme, отмечена способность вводить в в-во «S» 11-гидроксигруппу. И только при трансформации с помощью C.lunata наблюдалось образование 14-производного, но в качестве побочного продукта (рис.2).
CH 3 O CH 3 O CH 3 OH HO CH 3 CH H H CH 3 H OH + H H H O O O АД 14-ОН-АД 11-ОН-TC Рис. 1. Гидроксилирование АД C. lunata.
O CH OH O O CH OH 2 CH2 OH CH3 CH3 CH HO OH OH OH H3C CH H H H3C H H H H H + H OH O O O «S» «F» 14-ОН-«S»
Рис. 2. Гидроксилирование «S» C. lunata.
Для культуры R. nigricans, в отличие от С. lunata, характерна одинаковая направленность гидроксилирования 4-3-кетостероидов ряда прегнана (в-во «S»,) и андростана (АД). При наличии 11-/11- гидроксилазной активности по отношению к в-ву «S», хотя и слабой, у культур С. blakesleeana, C. echinulata, M. isabellina при гидроксилировании АД наблюдалось образование смеси трудно разделяемых гидроксипроизводных. Тем не менее, в культуральной жидкости грибов рода Cunninghamella зафиксировано присутствие 14-ОН-АД в следовых количествах. В ряде случаев идентифицированы продукты восстановления С17-кетогруппы, т.е.
происходила реакция, которая является первым шагом к деструкции кольца D. Следовательно, т.н. смесь не идентифицированных продуктов могла состоять из целого ряда гидроксипроизводных, образующихся на разных стадиях разрушения стероидной молекулы.
Исключением являются эксперименты с культурой T. hyalospora, которая гидроксилировала в-во «S» и АДЭА, но АД только восстанавливала в ТС, который оказался основным продуктом трансформации, что для данной культуры показано впервые.
У исследуемого штамма H. piriformе способность вводить 14 гидроксигруппу в в-во «S» и АД не обнаружена, хотя согласно литературным данным [Hu S.-h. et al. 1995] этот вид образует 14-гидроксипроизводные из ТС, АД и прогестерона (4ПГ).
Таким образом, для 11- и 14–гидроксилирования был выбран штамм С.lunata F-981, полученный ранее в нашей лаборатории методом селекции при непосредственном участии автора.
2.2.1.2. Выбор субстрата для синтеза 14-гидроксилированных производных прегнана. С целью выбора субстрата для синтеза гестагенов нового поколения был проведен анализ продуктов трансформации стероиднов андростанового, прегнанового и эстранового рядов.
Идентификация продуктов гидроксилирования проводилась с помощью ПМР-спектроскопии. Концентрация исходных соединений – 1г/л. Результаты представлены на рис.3 и 4.
CH3 OH CH3 OH CH 3 O CH 3 O HO H CH 3 H CH 3 H H H H H H R OH H R O O O O 19- нор-ТС 11-ОН-19-нор-ТС R= H - АД, АДД R= H - 14-ОН-АД, 14-ОН-АДД R= H – ОН – 9-ОН-АД R= H -9,14-дигидрокси-АД CH3 OH CH3 OH CH3 OH CH3 OH HO CH3 CH3 CH CH CH3 CH H H CH CH3 H H H H H H + + H H H H O O OH OH O O 17-СН3-ТС 11-ОН-17-СН3-ТС 7-ОН-17-СН3-ТС 7-ОН-17-СН3-ТС O O O O CH3 CH HO H CH3 H CH H H H H O O канренон 11-ОН-канренон Рис. 3. Гидроксилирование 4-3-кетоандростенов C.lunata.
Установлено, что основными продуктами гидроксилирования 4-3-кето прегнанов мицелием C. lunata являются 11-гидроксистероиды.
Гидроксилирование 4-3-кетоандростенов с кетогруппой при С17 – андростадиендиона (АДД), АД и 9-гидрокси-АД (9-ОН-АД) происходило в основном в 14-положение. Гидроксилирование 17-гидрокси-андростенов – канренона и ТС происходило так же, как и гидроксилирование прегнанов, – в 11-положение. А при трансформации 17-метил-тестостерона (17-СН3 ТС) помимо 11-гидроксилирования, наблюдалось введение гидроксильной группы в 7- и 7-положения.
O O O CH 2 OH CH 2 OR O CH2OR CH CH2 OH CH CH3 CH3 HO OH OH HO OR ' OH H CH3 H CH3 CH CH H H CH3 CH H H H H H H H H O O O O R, R’= Н - «S» «F» R= Н – 16-СН3-«S» 16-СН3-«F»
R - Ас, R’= Н – 21-Ас-«S» R= Ас - 21-Ас-СН3-«S»
R, R’= Ас – 17,21-диацетат- «S»
O O CH O O CH 2 OH CH 2 OH CH3 CH CH3 CH CH HO OH HO OH OH OH H CH H H H CH CH CH H H H H H H H H O O O O CH CH 6-СН3-«S» 6-СН3-«F» 17-ОН- 4ПГ 11,17-дигидрокси-4ПГ O CH O CH3 CH CH HO O O H CH H CH H H H H O O 16,17-оксидо- 4ПГ 11-ОН-16,17-оксидо- 4ПГ Рис. 4. Гидроксилирование 4-3-кетопрегнанов C. lunata.
Данные гидроксилирования АД, ТС и 17-СН3-ТС отчетливо демонстрируют зависимость положения и ориентации вводимой гидроксильной группы от структуры стероидной молекулы. Они хорошо согласуются с основными положениями теории направленного гидроксилирования, разработанной проф. Джонсом с сотр. для 5-Н стероидов, согласно которой направление вводимой в стероиды гидроксигруппы определяется структурой стероидной молекулы, определяющей в свою очередь ее ориентацию по отношению к активному центру фермента [Jones E. R. H. 1973].
Особый интерес представляло получение 14-гидроксипроизводного СN-АД, поскольку метод построения из данного соединения прегнановой боковой цепи известен и легко осуществим [Патент РФ № 2156255]. Однако вместо него при микробиологическом гидроксилировании СN-АД (рис. 5.) получили с низким выходом 14-ОН-АД (не более 30%), причем при концентрации субстрата не выше 0.5 г/л. По-видимому, ингибирующее влияние циангидринной группировки не способствовало образованию нужного продукта, к тому же сама эта группировка оказалась неустойчивой в условиях гидроксилирования.
CH 3 N CH 3 O CH 3 O OH CH 3 H CH 3 CH H H H OH H H O O O CN-АД АД 14-ОН-АД Рис. 5. Гидроксилирование CN-АД (0.5 г/л) C. lunata.
На основании полученных результатов, для оптимизации условий микробиологического 14-гидроксилирования был выбран АД (рис. 2).
В связи с высокой гидрофобностью указанного субстрата были проведены эксперименты по определению его оптимального количества.
Результаты представлены в табл. 2.
Таблица № 2.
Трансформация АД и накопление продуктов гидроксилирования Содержание продуктов Время Степень Концентрация гидроксилирования, % трансформации, конверсии АД, г/л ч АД, % 14-OH-АД 11-ОН-ТС 2.0 28 80 58 3.0 40 50 42 следы 4.0 40 40 30 следы Как видно из табл. 2, наибольшая степень конверсии АД и максимальное содержание 14-ОН-АД (55-58%), имели место при нагрузке исходного не выше 2 г/л.
Можно предположить, что концентрация АД является лимитирующим фактором при его трансформации с помощью мицелия C. lunata. В нашем случае из-за высокой гидрофобности АД, большая его часть оставалась недоступной для стероидных гидроксилаз и концентрация 2.0 г/л являлась предельной.
2.2.1.3. Поиск путей регуляции 11/14-гидроксилазной активности С. lunata. В связи со способностью выбранной культуры образовывать 11- и 14-гидроксипроизводные в обоих рядах проводилась работа по поиску условий, позволяющих проводить процессы более селективно. Известно, что на гидроксилазную активность влияют возраст микроорганизма трансформатора и его количество, состав ростовой и трансформационной сред, наличие в среде индукторов ферментной активности или веществ, влияющих на проницаемость клеточной стенки, способы внесения трансформируемых субстратов и т.п. В ряде случаев показано, что изменение указанных факторов помогает регулировать как скорость, так и соотношение основных продуктов.
Как видно из табл. 3 и 4 наибольшей стероид-гидроксилазной активностью обладает мицелий, возраст которого соответствует 24 ч.
Однако, оптимальное количество биомассы, необходимое для эффективного превращения в-ва «S» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) в в-во «F» (гидрокортизон) и в 14-ОН-АД соответственно, различно. Для трансформации в-ва «S» оно составляет 13.5-15.0 г/л (сухой вес), для АД – 9.5 – 10.5 г/л. В оптимальных условиях была достигнута степень конверсии в-ва «S» - не ниже 90%, содержание в-ва «F» – 60%;
степень конверсии АД - 80-85%, содержание 14-ОН-АД – 60%.
Таблица 3.
Потребление «S» и накопление основных продуктов трансформации в зависимости от возраста мицелия и его количества Содержание АД и продуктов гидроксилирования, % АД 14-OH-АД 11-ОН-ТС Возраст Время мицелия, ч тр-ии, ч биомасса*, г/л 1 2 1 2 1 24 24 следы - 60 50 10 48 24 - 0,2 40 45 следы Прим.* 1 – 9,5-10 г/л;
2 – 13,5-15 г/л.
Таблица 4.
Потребление АД и накопление основных продуктов трансформации в зависимости от возраста мицелия и его количества Содержание «S» и продуктов гидроксилирования, % Возраст «S» «F» 14-OH-S Время тр мицелия, ии, ч биомасса*, г/л ч 1 2 1 2 1 24 26 10 - 55 62 10 48 26 15 следы 47 52 8 Прим.* 1 – 9,5-10 г/л;
2 – 13,5-15 г/л.
Необходимо отметить, что увеличение биомассы с 9.5 до 15.0 г/л при трансформации АД привело к интенсификации процессов восстановления и и увеличению содержания таких побочных продуктов, как ТС и 11-ОН-ТС (схема гидроксилирования АД представлена на рис. 6).
Также известно [Суходольская Г.В. и др, 1986], что для мицелия С. lunata, находящегося в стационарной фазе роста, что соответствует 48 ч, характерна более высокая 14-гидроксилазная активность по отношению к в ву «S». Однако в нашем случае эти данные не были подтверждены, и лучшие результаты получены с культурой в середине экспоненциальной фазы роста (24 ч). Можно предположить, что происходящие со временем морфофизиологические изменения клетки приводят к изменению массообменных процессов, и в результате трудно растворимые стероиды становятся недоступными для стероидных гидроксилаз. Подтверждением сказанного является тот факт, что мицелий, находящийся в стационарной фазе роста, имеет черный цвет в отличие от светлокоричневой окраски растущего мицелия, что свидетельствует о накоплении меланина в клетке.
[Lanisnik R. et al. 2003]. Поэтому, если предположить, что гидроксилирование стероидов – это одна из стадий их детоксикации, то защищенный меланином мицелий становится невосприимчивым к внешним экзогенным веществам, в том числе и к стероидам.
O CH CH3 H H H OH H3C O АД CH3 H O CH3 H H ТС O CH3 H CH3 O HO H OH CH3 H O H H OH 14-ОН-АД CH HO O 11-ОН-АД O H3C CH3 H HO H H CH3 H H OH O 11-ОН-ТС O 11,14-дигидрокси-АД Рис. 6. Продукты трансформации АД C. lunata ВКПМ F- Не привело к увеличению активности мицелия и выращивание его в среде, содержащей индукторы, в качестве которых мы использовали АД, в-во «S», 4ПГ и ДЭА в количестве 0.2 г/л. Литературные данные также подтверждают конститутивную природу 11-гидроксилазы [Smith K. E et. al.
1994.] Конверсия в-ва «S» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) в буферах разного состава не выявила существенных различий в накоплении в-ва «F» и 14-ОН-АД соответственно или соотношении основных реакций к побочным. (рис. 7 и 8) Примечание к рис. 7 и 8: 1 – фосфатный буфер (контроль);
2 – цитратный буфер;
темные символы – в-во «S», АД;
светлые – в-во «F», 14 ОН-АД.
Во всех приведенных примерах степень конверсии исходных соединений и выход целевых продуктов были практически одинаковыми.
Для в-ва «S» степень конверсии составляла 90%, содержание в-ва «F» не превышало 60%, содержание 14-ОН-«S» -15%;
степень конверсии АД - 80 85%, содержание 14-ОН-АД – 60%, 11-ОН-ТС – 15%.
Рис. 7. Потребление «S» и 3, накопление «F».
1 2, Стероид, г/л 1, 0, 0 5 10 15 20 2 Время, ч 1,5 1 Рис. 8. Потребление АД Стероид, г/л и накопление 14-ОН-АД 1 0, 0 5 10 15 20 Время, ч Согласно литературным данным, некоторые растворители, солюбилизаторы и поверхностно активные вещества позволяют регулировать как скорость реакции, так и выход, и соотношение основных продуктов трансформации. [Horhold C. et al. 1999] Влияние ДМФА и МеОН на потребление в-ва «S» (4.0 г/л) и АД (2.0 г/л) и соответственно накопление в-ва «F» и 14-ОН-АД показано на рис. 9-10.
Примечание к рис. 9-10: способ внесения субстратов: 1- микрокристаллы (контроль);
2 – 4% р-р ДМФА;
3 – 4% р-р МеОН.
2, 2 Рис. 9. Накопление в-ва «F»
Стероид, г/л 1, в присутствии растворителей.
0, 5 10 15 20 Время, ч 1,4 1, Стероид, г/л Рис. 10. Накопление 0, 14-ОН-АД в 0, присутствии растворителей.
0, 0, 5 10 15 20 Время, ч В присутствии ДМФА и МеОН отмечено частичное ингибирование биоконверсии в-ва «S» и АД. Наблюдалось уменьшение степени конверсии исходных соединений (с 85% для контрольных образов до 50% в варианте с ДМФА), и уменьшение выхода целевых продуктов (с 60% до 40% в варианте с ДМФА).
2.2.1.4. Селекционные работы с культурой C. lunata ВКПМ F-981.
Несмотря на то, что гидроксилазы низших грибов содержат ионы некоторых тяжелых металлов, влияние последних на выход основного и побочного продуктов гидроксилирования изучено недостаточно. Известно, что выход гидроксипродуктов, образуемых C. lunata, возрастал в присутствии Fe2+, но не Сu2+, а накоплению побочных 6- и 14 гидроксистероидов, образуемых C. blakesleeana, способствовали ионы Zn2+.
Совместно с сотруд. лаборатории биоинженерии антибиотиков Центра «Биоинженерия» РАН были получены клоны C. lunata ВКПМ F-981 с устойчивостью к тяжелым металлам (Сo, Мо и Сu). Мы рассчитывали найти среди полученных мутантов клоны гриба, отличающиеся биохимическими и физиологическими свойствами от исходного штамма.
Гидроксилазную активность проверяли по отношению к в-ву «S» у клонов, резистентных к ионам Со2+ и Сu2+, так как при максимальной исследуемой концентрации солей 2% молибден не ингибировал рост гриба.
На средах с Со2+ и Сu2+ ингибирование роста происходило при концентрациях 0.45 и более 0.5% соответственно.
Следует заметить, что мицелий, выращенный на агаровой среде, содержащей токсичные для него дозы солей тяжелых металлов (0.4% CoCl или 0.45 и 0.5% CuSO4), и перенесенный в жидкую питательную среду, не содержащую указанные соли, отличался от контрольного варианта наличием черной пигментации уже на ранней стадии роста.
Таблица 5.
Гидроксилирование 4 г/л «S» мицелием C. lunata, выращенным в присутствии солей меди и кобальта.
Концентрация солей в Стероиды в реакционной смеси, % агаровой среде, % «S» «F» 14-ОН-«S»
СuSO4, 0.2 15 49 СuSO4, 0.35 42 следы CoCl2, 0.3 13 40 7. Контроль 7 58 У клонов, резистентных к солям в максимальной концентрации (0.4% 2+ и 0.5% Cu2+) полностью отсутствовала гидроксилазная активность.
Со Мицелий, выращенный при более низких концентрациях ионов Со2+ и Cu2+, проявлял гидроксилазную активность по отношению к в-ву «S», но меньшую по сравнению с контролем (табл. 5).
Уменьшение гидроксилазной активности мицелия, резистентного к солям тяжелых металлов, можно объяснить несколькими способами. С одной стороны, используемые соли могут быть ингибиторами гидроксилазных ферментов, и поэтому реакции протекают с меньшей скоростью, или же, исходя из предположения о том, что гидроксилирование в-ва «S» является следствием реакции детоксикации, то защищенный меланином мицелий становится более устойчив к токсичным для него экзогенным веществам, присутствующим в окружающей среде. Однако не исключено, что увеличение содержание меланина в клетке приводит к такому изменению клеточной проницаемости, когда стероид становится недоступным ферментным системам.
Наряду с ранее рассмотренными путями повышения стероид трансформирующей активности микроорганизмов особое внимание уделяется применению водорастворимых стероидных комплексов [W. Lu et al. 2007], для образования которых используют различные производные циклодекстринов (ЦД). При разработке способа 14-гидроксилирования наряду с другими параметрами (варьирование температуры, рН, способа внесения субстрата, использование ПАВ, индукторов, растворителей и др.) мы использовали ранее найденный в нашей лаборатории для процессов гидроксилирования универсальный солюбилизатор - МЦД. В результате были подобраны оптимальные условия для трансформации АД с нагрузкой 6.0 г/л, (количество биомассы 14.5-15 г/л) (табл. 6). По найденному способу была проведена наработка 14-ОН-АД для разработки метода синтеза пролигестона и его аналогов.
Таблица 6.
Трансформация АД мицелием C. lunata ВКПМ F-981 в присутствии МЦД* Время тр-ии, Субстрат и продукты трансформации ч АД 14-OH-АД ТС 11-ОН-ТС Содержание стероидов в реакционной смеси, % 18 30 35 10 следы 24 22 44 13,5 40 6 60 15 46 следы 58 10 *Прим. соотношение стероид/МЦД 1:5 (весовое).
Разработанная технология 14-гидроксилирования с помощью культуры C. lunata ВКПМ F-981 была подтверждена на примерах получения 14 гидроксипроизводных 4-3,17-дикетоандростенов (АД, АДД и 9-ОН-АД).
Помимо оптимизации условий микробиологической трансформации, были разработаны условия выделения и очистки целевых гидроксипродуктов с высокими выходами и качеством. И на разработанный способ 14-гидроксилирования стероидов получен патент РФ № 2407800 от 27.12.2010 Бюл. Изобр. № 36.
14-ОН-АД Рис. 11. Содержание 14-ОН-АД в трансформационной среде при 6 г/л АД (46 ч, ВЭЖХ).
2.2.2. Разработка способа 11-гидроксилирования.
2.2.2.1. Трансформация в-ва «S» мицелием C. lunata, резистентным к генетицину «G418». До настоящего времени гидроксилирование «S»
изучалось только с целью получения «F», и образование 14-ОН-«S»
рассматривалось как нежелательный побочный процесс. Поэтому достаточное количество исследований сводилось к поиску методов гидроксилирования, позволивших свести побочные процессы гидроксилирования «S» к минимуму. Однако, мы рассматривали 14-ОН-«S»
как ценный интермедиат в синтезе гестагенов нового поколения. Поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на определение оптимальных условий гидроксилирования не только с целью получения «F», но и ценного интермедиата - 14-ОН-«S».
Одним из способов увеличения гидроксилазной активности микроорганизмов является получение мутантов, устойчивых к воздействию различных экзогенных факторов. [Paraszkiewicz К. et al. 1998.] Полученный методами селекции совместно с лабораторией биоинженерии антибиотиков клон гриба, устойчивый к антибиотику генетицину “G-418” (80 мкг/мл), был проверен на способность к 11 гидроксилированию в-ва «S» при нагрузках 4.0-20.0 г/л. Результаты представлены в табл. 7.
Подобранные условия 11-гидроксилирования с новым штаммом позволили увеличить нагрузку «S» с 4.0 до 20.0 г/л, что существенно превышает известные литературные данные. Можно отметить как высокие степень конверсии исходного соединения и скорость 11 гидроксилирования, так и высокий выход гидроксипродуктов.
Наряду с образованием «F» с выходом 60% при нагрузке 20 г/л, удалось достигнуть выхода 14-ОН-«S» до 25%, который далее был использован в синтезе производных пролигестона.
Таблица 7.
Трансформация «S» мицелием гриба C. lunata ВКПМ F- Выход выделенных продуктов Степень Нагрузка, Способ Время трансформации, % конверсии, г/л внесения тр-ции, ч % «F» 14-OH-«S»
микрокрис 4.0 20 90 62 таллы микрокрис- 48 44 таллы 10. комплекс с 28 91.5 64 МЦД комплекс с 15.0 28 96 62 МЦД комплекс с 20.0 48 98 60 МЦД Штамм C. lunata, устойчивый к антибиотику генетицину «G-418» и обладающий высокой 11-гидроксилазной активностью, был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-988.
F Рис. 12. Состав реакционной среды при трансформации «S» 20 г/л. (48 ч, ВЭЖХ) 14-ОН-«S»
2.2.2.2. 11-гидроксилирование 16-метил-кортексолона (16-СН3 «S») с помощью C. lunata ВКПМ F-988. Высокая 11-гидроксилазная активность нового штамма была подтверждена на примере получения 11 гидроксипроизводного основного предшественника дексаметазона 16-СН3-«S», полученного нами ранее из АД серией химических реакций.
O O O CH3 CH3 CH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH HO OH OH OH H CH CH3 H H CH CH CH3 CH H H H H H OH + O O O 16-СН3-«S» 16-СН3-«F» 14-ОН-16-СН3-«S»
Рис. 13. Гидроксилирование 16-СН3-«S» с помощью мицелия C. lunata ВКПМ F-988.
Как следует из табл. 8, концентрация 2.0 г/л для 11-гидроксилирования 16-СН3-«S» является оптимальной (в виде микрокристаллов). И только использование МЦД позволило увеличить нагрузку стероида до 10.0 г/л, при которой трансформация заканчивалась через 48 ч, степень конверсии составила 80%, а содержание 16-СН3-«F» не ниже 50% (см. табл. 8).
Таблица 8.
Гидроксилирование 16-СН3-«S» C. lunata ВКПМ F- Содержание основных Степень продуктов Нагрузка, Способ Время конверсии гидроксилирования, % г/л внесения тр-ции, ч исходного 14-ОН-16 субстрата, % 16-СН3-F СН3-«S»
микрокрис 1.0 18 85 65 таллы микрокрис 2.0 24 80 55 таллы микрокрис 32 50 40 следы таллы 4. комплекс с 26 80 60 МЦД комплекс с 10 48 80 50 МЦД Помимо оптимизации условий процесса 11-гидроксилирования 4-3 кетостероидов новым штаммом, были подобраны оптимальные условия выделения и очистки гидроксипродуктов. На способ 11-гидроксилирования с помощью C. lunata ВКПМ F-988 получен патент РФ № 2399674 от 20.09.2010.
2.2.3. Синтез пролигестона и его аналога. Согласно литературным данным, основными способами построения прегнановой цепи являются циангидринный метод и конденсация с ацетиленом. Хорошо отработанный на АД циангидринный метод в нашем случае не дал положительного результата из-за сложности подхода CN-иона с -стороны стероидной молекулы, которая стерически блокирована гидроксилом при С14. При ацетиленовом синтезе атака с -стороны стероидной молекулы также является предпочтительной, а образующийся 17-гидрокси-17-замещенный стероид с помощью химических реакций превращается в нужный изомер.
Но существует ряд работ [EU Pat 0189951], в которых показана возможность образования 14,17-дигидрокси-17-замещенных стероидов.
Основным способом получения данного изомера является реакция взаимодействия 14-гидрокси-17-кетостероидов с металлорганическими соединениями, такими как ацетилиды щелочных металлов (К, Na, Li), или реактивом Гриньяра. Мы остановили свой выбор на известном способе проведения ацетиленового синтеза в присутствии сильного основания и эпи амина, который способствует получению нужного 17-этинил,17 гидроксипроизводного.
В результате проведенной работы из полученного нами 14-ОН-АД был синтезирован пролигестон, формула которого представлена на рис. 14.
Помимо 14-ОН-АД в синтезе пролигестона и его аналогов может быть использован и 14-ОН-«S» после предварительного удаления гидроксильной группы при С21. Однако в своей работе мы использовали непосредственно 14-ОН-«S», и в результате проведенной работы было получено ранее не описанное в литературе аналог пролигестона, структурная формула которого указана на рис. 14.
O O CH C CH3 CH2OOCCH CH O O CH3 H H CH C 2H H C C2 H5 O H O H H O O пролигестон 21-ацетат-14,17-проипилидендиокси-4 прегнен-21-ол-3,20-диона Рис. 14. Структурные формулы пролигестона и его аналога.
Указанные соединения были направлены в Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН для исследования их контрацептивной активности, которое проводилось в комбинации с этинилэстрадиолом в соотношении 1:20. Опыты осуществлялись на половозрелых белых крысах-самках линии «Вистар» массой 200-250 г (опыт №1) и 180-200 (опыт №2) г. Животные были получены из питомника «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных.
Изучаемые эстроген-гестагенные комбинации вводили в виде масляного раствора (растворитель – растительное масло) в желудок (перорально) в объеме 0,3 мл с использованием зонда в течение 14 дней. Доза этинилэстрадиола и гестагена во всех исследованиях была одинаковой и составила 0,04 мг/кг и 0,8 мг/кг соответственно. Животные контрольной группы получали растительное масло в том же объеме и в те же сроки, что и животные подопытных групп.
Результаты представлены в табл. 9-10.
Таблица 9.
Исследование контрацептивной активности (КА) пролигестона (0. мг/кг) в комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг) Количество крыс в группе Группа КА, % животных всего покрытых беременных небеременных 15 14 14 0 контрольная подопытная 17 11 0 11 группа Таблица 10.
Исследование контрацептивной активности (КА) 21-ацетат-14,17 проипилидендиокси-4-прегнен-21-ол-3,20-диона (0.8 мг/кг) в комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг) Количество крыс в группе Группа КА, % животных всего покрытых беременных небеременных 15 12 12 0 контрольная подопытная 11 7 0 7 группа Результаты экспериментального исследования контрацептивной активности (табл. 9-10) показали, что оба исследуемых препарата в количестве 0.8 мг/кг в комбинации с этинилэстрадиолом (0.04 мг/кг) обладают 100%-ной контрацептивной активностью.
Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра контрацептивных препаратов нового поколения, обладающих такими преимуществами, как высокая пролонгированная активность и отсутствие побочных действий.
3. ВЫВОДЫ:
1. Изучена субстратная специфичность C. lunata ВКПМ F-981 и показана зависимость направленности гидроксилирования от строения стероидной молекулы.
2. Разработан метод направленного 14-гидроксилирования стероидов с помощью штамма C. lunata ВКПМ F-981 как первой стадии синтеза высокоактивных препаратов для медицины и ветеринарии антигонадотропного, контрацептивного и канцеролитического действия.
Способ позволяет достигнуть полной конверсии АД за 48 ч с нагрузкой 6.0 г/л, и выходом 14-ОН-АД 60%. На способ получен Патент РФ №2 407 800 (Бюл. Изобр. №36 от 27.12.2010) 3. Разработан способ направленного 11-гидроксилирования стероидов с помощью нового штамма C. lunata ВКПМ F-988. Способ позволяет проводить 11-гидроксилирование кортексолона с нагрузкой до 20 г/л за 48 ч трансформации с выходом гидрокортизона 60% и может быть использован в промышленном масштабе для синтеза высокоактивных глюкокортикостероидных препаратов противовоспалительного, антиаллергического и противошокового действия. На способ получен патент РФ №2399674 (Бюл. Изобр. №26 от 20.09.2010).
4. Подобраны оптимальные условия 11-гидроксилирования 16-метилсодержащих аналогов кортексолона, позволяющие получать полупродукты синтеза дексаметазона и других фторированных противовоспалительных кортикостероидов с выходом 50% при нагрузке субстрата 10 г/л, что значительно превышает мировые стандарты.
5. Разработана схема синтеза пролигестона и его аналогов из 3,17 дикетоандростенов (АД, АДД и 9-OH-АД) - полупродуктов синтеза стероидных лекарственных препаратов из растительного сырья.
6. Проведен синтез пролигестона из 14-ОН-АД, полученного микробиологическим путем по разработанному способу.
7. Получен ранее не описанный в литературе аналог пролигестона 21-ацетат-14,17-пропилидендиокси-4-прегнен-21-ол-3,20-диона - из 14 ОН-«S» с высокой контрацептивной активностью.
Список публикаций по теме диссертации:
1. Ядерец В.В., Андрюшина В.А., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г., Новак М.И., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. Изучение стероидгидроксилирующей активности мицелия Сurvularia lunata.//Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. № 6. С.: 695-700.
2. Ядерец В. В., Андрюшина В. А., Войшвилло Н. Е., Стыценко Т.С., Зейналов О. А.
Изучение путей синтеза биологически активных 14-гидроксилированных стероидов.//Хим. – Фарм. журнал. 2009. № 1. С.: 37-40.
3. Андрюшина В.А. Войшвилло Н.Е. Дружинина А.В., Стыценко Т.С., Ядерец В.В., Скрябин К.Г., Бартошевич Ю.Э., Новак М.И., Домрачева А.Г. Способ 11-гидроксилирования 4-3-кетостероидов.//Патент РФ № 2399674 (Бюл. № 26 от 20.09.2010) 4. Ядерец В.В., Андрюшина В.А., Войшвилло Н.Е., Двойников П.С., Стыценко Т.С., Зейналов О.А., Скрябин К.Г. Способ получения 14-гидроксипроизводных 4-3,17-дикето андростенов.//Патент РФ № 2407800 (Бюл. Изобрет. № 36 от 27.12.2010.) 5. Ядерец В.В., Войшвилло Н.Е., Стыценко Т.С., Егоров И.М. Поиск условий селективного гидроксилирования стероидов с помощью гриба Сurvularia lunata.//Тезисы докладов VII Международного форума «Биотехнология и современность». С.- Петербург, 14 16 июня. 2006. С.: 29- 30.
6. Ядерец В.В. Поиск путей регуляции 14/11-гидроксилирования стероидов грибом Сurvularia lunata путем изменения условий выращивания и трансформации.//Тезисы конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты». Пущино, 24-25 мая.
2007. 42 с.
7. Ядерец В.В. Исследования в области синтеза биологически активных гидроксилсодержащих стероидов.//Наука и технологии. Краткие сообщения 28-ой Российской школы. Миасс, 24-28 июня. 2008. С.: 58-60.
8. Ядерец В.В. Разработка способа направленного микробного гидроксилирования для синтеза стероидных препаратов нового поколения.//Тезисы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 16 20 марта. 2009. С.: 226-227.
9. Ядерец В.В. Особенности гидроксилирования стероидов плесневым грибом Curvularia lunata ВКПМ F-981.//Тезисы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва, 28 сентября – 1 октября.
2009. Т.2. С.: 276-279.
10. Ядерец В.В. Инновационные технологии для получения стероидных фармацевтических субстанций».//Доклад на конференции «Передовые технологии российских инноваторов». Париж, 25-27 ноября. 2010.
Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н. Андрюшиной В.А. и к.б.н. Войшвилло Н.Е. за всестороннюю поддержку при выполнении диссертации, к.х.н.
Стыценко Т.С. за неоценимую помощь при планировании и выполнении работы, Соловьёвой Н.П.
за помощь в снятии и интерпретации ПМР спектров, Комбаровой С.П. за ценные советы, также всем сотрудникам лабораторий биотехнологии стероидов и биоинженерии антибиотиков Центра «Биоинженерия» РАН.