Использование эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят для изучения возбудителей инфекционных респираторных болезней птиц
На правах рукописи
ЧУПИНА Ольга Андреевна
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПЛАНТАТОВ ТРАХЕИ КУРИНЫХ
ЭМБРИОНОВ И ЦЫПЛЯТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ
ИНФЕКЦИОННЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ
03.00.06 «Вирусология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Владимир-2009
Работа выполнена в федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)
Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ДИЕВ Вячеслав Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Пономарев Алексей Петрович (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных») кандидат ветеринарных наук, Зуев Юрий Владиславович (ФГУ «ВГНКИ»)
Ведущая организация: ГНУ научно-исследовательский «Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ «ВНИИВВИМ», г. Покров).
Защита диссертации состоится 24 марта 2009 г. в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Автореферат разослан «_» февраля 2009г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семенова 1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Инфекционные болезни птиц, протекающие с признаками поражения респираторного тракта, являются актуальной проблемой для современного промышленного птицеводства. К наиболее распространенным заболеваниям относится инфекционный бронхит кур (ИБК), борьба с которым осложнена тем, что вызывающий его коронавирус способен проявлять высокую изменчивость, что приводит к появлению штаммов с новыми антигенными свойствами. Важным условием эффективной профилактики ИБК является соответствие антигенных свойств полевых изолятов возбудителя и штаммов, используемых для изготовления вакцины. Это обусловливает необходимость постоянного изучения выделенных возбудителей.
Определение антигенных свойств вирусов с использованием лабораторных моделей, таких как развивающиеся куриные эмбрионы (КЭ) или клеточные культуры, затруднено из-за продолжительной адаптации полевого вируса к указанным биологическим системам. За это время могут изменяться биологические и антигенные свойства штамма. Специфическое патогенное действие вируса на КЭ проявляется только после проведения 5-10 и более слепых пассажей, что удлиняет время выделения и затрудняет типирование вируса в реакции нейтрализации (РН).
Некоторые штаммы вируса ИБК даже после продолжительного пассирования в КЭ не проявляют четкого эмбриопатического действия, что затрудняет детекцию и количественный учет вируса. Одной из альтернатив КЭ является выделение вируса ИБК в переживающих эксплантатах трахеи, где активная репликация вируса и проявление его цитопатического действия происходит уже в первом пассаже. Это значительно ускоряет и удешевляет процесс исследования, а также позволяет избегать изменений свойств вируса.
Применение переживающих эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят – трахеальной органной культуры (ТОК) - для вирусовыделения и серологических исследований рекомендовано МЭБ и широко используется для исследования вируса ИБК. С этой целью практикуются различные способы ее приготовления и использования, которые, как правило, в публикациях иностранных авторов описаны недостаточно подробно, и в связи с этим затруднена воспроизводимость полученных результатов (J.K.A. Cook et al., 1976;
A.E. Castro et al., 1988;
J. Ignjatovic, L. Galli, 1995).
Кроме этого, имеются сообщения о высокой чувствительности ТОК к другим инфекционным агентам, вызывающим респираторные болезни птиц (J.K.A. Cook, D. Cavanagh, 2002;
P.F. Markham et al., 2003).
Недостаточная изученность проблемы получения и практического использования ТОК послужила основанием для проведения комплексных исследований в этом направлении.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось обоснование использования переживающих эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят для выделения и изучения биологических и иммунологических особенностей вируса инфекционного бронхита кур и других инфекционных возбудителей респираторных болезней птиц.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- на основе литературных данных проанализировать эпизоотическую ситуацию по ИБК в мире и в России;
- оптимизировать методику приготовления и поддержания органной культуры трахеи куриных эмбрионов и цыплят;
определить чувствительность трахеальной органной культуры к различным инфекционным агентам, вызывающим респираторные расстройства у птиц;
- разработать методику титрования вируса инфекционного бронхита кур и возбудителей других болезней в трахеальной органной культуре;
- разработать методику типирования вируса инфекционного бронхита кур с использованием переживающих эксплантатов трахеи;
- оценить биологические свойства четырех изолятов вируса ИБК, встречающихся в России, в трахеальной органной культуре;
- разработать метод оценки безвредности и иммуногенности вакцин с учетом сохранения цилиарной активности в эксплантатах трахеи.
Научная новизна исследований. В результате проведенных нами исследований:
- впервые в России разработана методика приготовления, поддержания и использования трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят для выделения и исследования биологических свойств возбудителей респираторных заболеваний птиц;
- определена чувствительность ТОК к вирусам ИБК, ньюкаслской болезни (НБ), вирусу инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ), пневмовирусу птиц (ПВП), аденовирусу птиц, возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц;
- разработана методика титрования вышеуказанных инфекционных агентов;
- разработана методика оценки антигенного родства штаммов и изолятов вируса ИБК в реакции нейтрализации (РН) в ТОК;
- предложен метод оценки безвредности и иммуногенности вакцин против ИБК.
Практическая значимость исследований. Практическое значение работы состоит в том, что разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
- «Методические указания по выделению, титрованию и оценке антигенного родства вариантов вируса инфекционного бронхита кур в трахеальной органной культуре», 2006 г.;
- «Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят», 2006 г.
Трахеальная органная культура использована для выделения отечественных штаммов изолятов вируса ИБК и оценки «Щелковский», «IBV663-07»
биологических и серологических свойств штаммов «Калужский», «Таганрогский», изолятов «Щелковский», «IBV663-07», которые были использованы для создания полиштаммовой вакцины против ИБК. Оценена патогенность изолятов «Щелковский» и «IBV663-07» вируса ИБК. Результаты научных исследований вошли в следующие нормативные документы, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
- СТО «Вакцина против инфекционного бронхита кур полиштаммная инактивированная эмульсионная», 2006 г.;
- промышленный регламент на производство вакцины против инфекционного бронхита кур полиштаммной инактивированной эмульсионной», 2006 г.
Основные положения, выносимые на защиту:
- методика приготовления и поддержания ТОК куриных эмбрионов и цыплят;
- чувствительность ТОК к вирусу ИБК и ряду других возбудителей инфекционных респираторных заболеваний кур;
- методика количественного учета возбудителей;
- методика оценки антигенного родства штаммов и изолятов вируса ИБК в реакции нейтрализации в ТОК;
оценка антигенных свойств штаммов вируса ИБК - «Калужский», выделение, оценка патогенности и изучение «Таганрогский», иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИБК «Щелковский», «IBV663-07» с использованием ТОК;
- патогенность изолятов возбудителя респираторного микоплазмоза птиц с использованием ТОК;
- иммуногенность вакцин против инфекционного бронхита кур, определяемая с учетом цилиарной активности трахеи после вакцинации и контрольного заражения.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано научных работ, в т.ч. 4 в издании, входящем в перечень, рекомендованный ВАК.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей инфекционных заболеваний», г. Казань, 2005 г.;
на Международной научно практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященной 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир, 2008 г., опубликованы в материалах 6-ой Всеросийской научно-практической конференции С международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней», в г. Москва, 2007 г.;
15th World Veterinary Poultry Congress, Beijing, China, 2007;
а также доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2001-2007 гг.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены совместно с к.б.н. С.В..
Фроловым, к.б.н. Л.О. Щербаковой, к.б.н. И.А. Руниной, Е.В.Овчинниковой, за что автор выражает им искреннюю благодарность.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 187 источников, в том числе 27 на русском языке. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 22 таблицами.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Инфекционные возбудители.
Вирус ИБК:
- штамм "Таганрогский", выделен в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2001г. от птицы птицефабрики «Таганрогская» Ростовской области, 15-го пассажа в СПФ-куриных эмбрионах;
- штамм «Калужский», выделен в ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1999 г. от цыплят бройлеров птицефабрики «Калужская» Калужской области, 7-го пассажа в СПФ куриных эмбрионах;
- полевой изолят «Щелковский», выделен в 2004 г. из патматериала от цыплят птицефабрики «Щелковская», Московской области, 7-го пассажа в СПФ-РКЭ, нативный;
- изолят «IBV663-07», аллантоисная жидкость СПФ-куриных эмбрионов первого пассажа, получен из Краснодарской краевой ветеринарной лаборатории;
- штамм «Н-120» серотип Массачусетс, получен в лиофилизованном виде из ФГУ «ВГНКИ»;
- штамм «Н-52» серотип Массачусетс, получен в лиофилизированном виде из ФГУ «ВГНКИ»;
- штамм «Чапаевский» серотип Массачусетс;
- вакцинный штамм «4/91» серотип 793/В;
- вакцинный штамм «D274» серотип Д207;
- штамм «М41» серотипа Массачусетс, получен из ФГУ «ВГНКИ».
Вирус НБ, штамм «Ла-Сота» с титром 9,5 lg ЭИД50/см3.
Вирус ИЛТ, вакцинный штамм «О» с титром 6,0 lg ЭИД50/см3.
Аденовирус-4 птиц (вирус CELO, штамм «Phelps»).
ПВП, вакцинный штамм«PV03-B» и полевой изолят «aMPV/B/2-07».
Реовирус птиц, штамм «S 1133».
Mycoplasma gallisepticum:
- референтный штамм «S6», - референтный штамм «R»;
- изолят «Магнитогорский», из птицехозяйства Челябинской области;
- изолят «Красный колос», из птицехозяйства Липецкой области;
- изолят «Красносулимский», из птицехозяйства Ростовской области.
Mycoplasma synoviae, производственный штамм «WVU 1853».
Куриные эмбрионы. Использовали КЭ категории СПФ фирмы Lohman Tierhzuch (Германия). Инкубацию эмбрионов проводили при температуре 37±0,5С и относительной влажности воздуха 60%.
Животные. В опытах использовали клинически здоровых цыплят, полученных в условиях лаборатории из СПФ-КЭ, и цыплят кросса «Хайсекс коричневый», из птицефабрики «Кинешемская», свободных от антител к ИБК, в возрасте 5-120 суток.
Оптимизация условий приготовления и поддержания трахеальной органной культуры. Для приготовления ТОК использовали СПФ-КЭ сроком инкубации 19, 20, 21 сутки и СПФ-цыплят в возрасте 1, 14, 21, 30, 45 и 60 суток.
Кольца трахеи препарировали при помощи скальпеля, ножниц, бритвенного лезвия.
ТОК культивировали в чашках Петри, в полистироловых 24-луночных культуральных плашках и в герметически закрытых резиновыми пробками стеклянных пробирках диаметром 12,5 мм. Для подготовительных работ и культивирования ТОК использовали готовые поддерживающие среды ПСС, ПСП, Игла, 199, РС-3М, Фрея, фетальную сыворотку КРС.
Оценка цилиарной активности в ТОК. За цилиарной активностью в ТОК наблюдали в прямой и инвертированный световые микроскопы при увеличении х100. Скоординированное биение цилей на всей внутренней поверхности кольца принимали за 4 балла, интенсивное движение ресничек на 3/4 периметра - 3 балла, достаточно активное движение цилей на участке, составляющем около половины поверхности эпителия - 2 балла, а остаточную активность цилей на отдельных участках трахеи или на 1/4 ее внутренней поверхности - 1 балл. Подсчитывали в баллах среднюю цилиарную активность (ЦА) ТОК, учитывали время наступления цилиостаза в кольцах.
Определение чувствительности ТОК к возбудителям, вызывающим респираторные заболевания птиц. Для определения чувствительности ТОК к респираторным патогенам проводили заражение эмбриональных культур вирусами ИБК различных штаммов и изолятов, вирусами болезни Ньюкасла штамма «Ла Сота», инфекционного ларинготрахеита штамма «О», аденовирусом-4 птиц производственного и полевого штаммов, а также возбудителем респираторного микоплазмоза Mycoplasma gallisepticum (Mg) референтных штаммов и полевых изолятов. На поддерживающей среде готовили разведения вирусов, содержащие 1- – 10-9 ЭИД50 вирусов, 10 -1 – 10-9 КОЕ микоплазм.
Выделение изолятов вируса ИБК. Выделение полевого возбудителя из патматериала при исследовании вариантов вируса ИБК проводили по обычной методике. Полученный вируссодержащий материал (ВСМ) инокулировали по 0, см3 в аллантоисную полость СПФ-куриных эмбрионов (КЭ) со сроком инкубации 10 суток. Экстраэмбриональную жидкость собирали через 3 суток после заражения и использовали для последующих пассажей, эмбрионы исследовали на наличие специфических для ИБК изменений. ВСМ вносили также в ТОК с последующим наблюдением за ними, сбором культуральной среды и гомогената инфицированных тканей.
Количественный учет вируса ИБК. Инфекционную активность вируса ИБК определяли титрованием в СПФ-РКЭ сроком инкубации суток по 9- общепринятой методике, а также в органной культуре трахеи КЭ, внося в культуральные сосуды с эксплантатами трахеи разведения вируса на поддерживающей среде. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера и выражали в дозах, вызывающих инфекцию в 50% зараженных эмбрионов (ЭИД50) и в дозах, вызывающих цилиостаз в половине зараженных органных культур (CD50).
Оценка патогенности изолятов вируса ИБК. Патогенность изолята «Щелковский» с титром инфекционности 4,76 lg CD50/ см3 изучали на 11 СПФ цыплятах 3-суточного возраста методом введения вируса в объеме 0,1 см интраназально-интраокулярно и 0,1 см3 – перорально каждому цыпленку.
Ежедневно наблюдали за состоянием птиц. Цилиарную активность учитывали через 3 и 10 суток после заражения.
Биопробу изолята IBV633-07 проводили на 19 цыплятах 11-суточного возраста. Заражение птиц проводили интраназально-перорально-интратрахеально и на конъюнктиву глаз. Общее количество вируса ИБК для одного цыпленка составляло 300 CD50. Через 7 и 40 суток после заражения по 2 цыпленка из опытной группы были убиты и проведено патологоанатомическое вскрытие.
Для исследования ЦА извлекали трахею, избегая повреждения тканей, и помещали ее в среду ПСП. Не позднее 1 часа после вынужденного убоя из верхнего, среднего и нижнего отделов трахеи бритвенным лезвием готовили по поперечных среза толщиной 0,5-1 мм и исследовали под световым микроскопом при увеличении х100. ЦА оценивали в баллах, как описано выше. Признаком заболевания считали среднюю ЦА трахеи цыпленка ниже 2 баллов.
Оценка иммунобиологических свойств отечественных изолятов вируса ИБК. Для оценки антигенного родства возбудителей к референтным и исследуемым штаммам вируса ИБК получали гипериммунные сыворотки крови кур и проводили реакцию нейтрализации (РН) в ТОК.
Для опыта по перекрестному заражению использовали 36 СПФ-цыплят, из которых 12 служили контролем, а остальные в возрасте 3 суток были иммунизированы инактивированными эмульгированными препаратами вируса ИБК в объеме 0,5 см3 в грудную мышцу: 12 цыплят – препаратом изолята «Щелковский», титр которого до инактивации составлял 6,2 lg CD50/ см3, а других цыплят – препаратом штамма Н-120 серотипа Массачусетс с титром до инактивации 7,2 lg ЭИД50/ см3. Через 21 сутки после иммунизации цыплят разделили на 6 изолированных групп по 6 птиц в каждой и подвергали перекрестному заражению вируссодержащей суспензией соответствующих штаммов в дозе 10000 CD50 в 1 см3 интраокулярно-интраназально-перорально.
Через 4 суток после контрольного заражения был проведен вынужденный убой и вскрытие птиц. Для каждой птицы и для группы определяли среднюю ЦА трахеи, как описано выше. Устойчивыми к заражению считали цыплят, средняя ЦА трахеи которых составляла не менее 2 баллов.
Подтверждение идентичности выделенных изолятов вируса ИБК.
Подтверждение идентичности выделенного на СПФ-КЭ и в ТОК вируса инфекционного бронхита проводили методом ПЦР совместно с лабораторией молекулярной диагностики болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ».
Определение антител к ИБК в сыворотках крови кур. Титр сывороточных антител к ИБК определяли в непрямом твердофазном варианте ИФА, с помощью набора фирмы Synbiotics.
Определение патогенности полевых изолятов Mycoplasma gallisepticum для восприимчивых животных. По 10 неиммунных цыплят в возрасте 10-20 суток заражали интраназально-окулярно-перорально культуральной суспензией изолятов «Магнитогорский», «Красносулимский», «Красный колос» и штамма «R» в дозе 500 CD50/0,5 см3. Клинические наблюдения за зараженной птицей проводили в течение 20 суток. Через 7 и 14 суток по 2 птицы из каждой группы убивали, исследовали внутренние органы, определяли цилиарную активность (ЦА) под световым микроскопом (увеличение х100). Для каждой птицы индивидуально и для каждой группы определяли среднюю ЦА трахеи в баллах как описано выше.
Заболевшими считали цыплят, средняя ЦА трахеи которых составляла менее баллов.
Статистическая обработка полученных результатов. При статистической обработке результатов исследований были использованы общепринятые методы, рекомендованные С. Гланцем (1999) и другими авторами, а также компьютерные программы «Statistica: Basic Statistics and Tables» и Microsoft Office Excel 2003.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Эпизоотическая ситуация по ИБК Анализ доступной литературы позволил в определенной степени систематизировать данные, полученные разными авторами, о более 100 штаммах вируса ИБК, принадлежащих к более 70 различным серотипам. Распространение ИБК носит глобальный характер, и наибольшее число исследованных штаммов описано в странах с развитым промышленным птицеводством. При этом существуют серотипы вируса ИБК, такие как Массачусеттс, Коннектикут, которые распространены практически повсеместно, и специфические для отдельных географических регионов группы штаммов, например, австралийские. Однако с течением времени штаммы, первоначально выделенные в определенном регионе, получают более широкое географическое распространение и регистрируются в местности, где ранее они не были отмечены. Так произошло с рядом родственных в генетическом отношении изолятов, выделенных в Китае, а затем во Франции, Нидерландах. Полученные данные свидетельствуют о широком географическом распространении и высокой серологической вариабельности вируса ИБК, что вызвало множество исследований по выделению и определению антигенных свойств штаммов вируса ИБК.
Данные исследований, проведенных в ФГУ «ВНИИЗЖ» в период 1998- гг., показывают, что вирус ИБК в России и сопредельных регионах широко распространен и продолжает изменяться. До 2004 г. отмечали доминирование изолятов, родственных штаммам серотипа Массачусетс, доля которых превышала В дальнейшем более широкое распространение получили изоляты, 40%.
принадлежавшие к Европейской группе, в частности, штаммам D274, B1648, 4\91, китайским штаммам, а ряд изолятов были вариантными и не соответствовали вакцинным штаммам.
Оптимизация условий приготовления и поддержания ТОК Полученный экспериментальный опыт свидетельствует, что известная методика приготовления и поддержания ТОК, описанная в литературе, не обеспечивает достаточно полного и продолжительного сохранения цилиарной активности переживающими эксплантатами трахеи в условиях наших исследований. Недостатками апробированной методики являются неспецифическая гибель культур и небольшая продолжительность жизни эксплантатов. Для проведения вирусологических исследований необходимо было отработать условия приготовления и поддержания ТОК.
Данные наших экспериментов позволяют заключить, что на продолжительность жизни ТОК влияет тщательность приготовления культуры.
Следует избегать травмирования трахеи при ее извлечении, очистке от прилежащих тканей и нарезке. Определены оптимальные условия приготовления, поддержания и использования ТОК. Эти условия, которые включают в себя нарезку колец вручную бритвенным лезвием, культивирование в стеклянных пробирках диаметром 12,5 мм с 1 см3 питательной среды ПСП, ПСС или Игла с антибиотиками в роллерном аппарате при температуре 37 0С, обеспечивают сохранение ЦА до 7-10 сут. после приготовления,Наличие сыворотки КРС, в т. ч. фетальной, в концентрации от 1% до 30%, не влияло на срок сохранения ЦА в эксплантатах трахеи. Менее трудоемким является культивирование ТОК в полистироловых культуральных плашках с объемом среды 0,5 или 1 см3 в СО2-инкубаторе, однако время сохранения ЦА при таком способе культивирования несколько ниже, чем при использовании пробирок и роллерного аппарата (в течение 6-7 суток), а метод требует больших материальных ресурсов.
Чувствительность ТОК эмбрионов кур к вирусу ИБК Для изучения действия вируса ИБК в ТОК вносили непатогенные или слабопатогенные для кур вакцинные штаммы, а также адаптированные и не адаптированные к КЭ патогенные штаммы и изоляты. Результаты опытов представлены в табл. 1.
Таблица Чувствительность ТОК эмбрионов кур к различным штаммам и изолятам вируса ИБК (n=5) № Возбудитель Титр вируса Начало Срок Титр в ТОК, lg ЦД50/см п/п в СПФ-КЭ, действия наступления lg ЭИД50/см3 вируса в ТОК, ч цилиостаза, ч* 1 «Н-52» 7,0±0,3 48-120 6,62±0, 2 «М-41» 6,0 48-120 6,25±0, 3 «Н-120» 72-120 6,08±0, 7,35±0, 4 «D 274» 5,75 72-120 5,64±0, 5 «4/91» 72- 4,85±0,13 4,98±0, 6 «Калужский» 72-120 6,25±0, 6,35±0, 7 «Таганрогский» 72-144 5,85±0, 6,20±0, н/и 8 «Щелковский» 72-120 5,25±0, * - показаны сроки раннего и позднего цилиостаза н/и – не исследовали Действие вируса ИБК в переживающих эксплантатах трахеи проявлялось через 24-48 ч после заражения. Отмечалось набухание подслизистого слоя трахеи, сужение просвета кольца. Движение ресничек нарушалось и на некоторых участках прекращалось. Ресничная каемка эпителия становилась прерывистой. Отмечалось появление в поле зрения небольшого количества отмерших клеток. Далее признаки дистрофии и десквамации тканей усиливались, и через 72-120 ч цилиарная активность в ТОК полностью прекращалась, т. е наступал цилиостаз. Сроки наступления цилиостаза не зависели от степени патогенности и адаптации вируса к культуральным системам. Ряд штаммов вызывал цилиостаз в ТОК лишь через 144 ч после заражения, поэтому при исследовании новых вариантов вируса ИБК целесообразно увеличить срок наблюдения до 144-168 ч.
Чувствительность ТОК к вирусам, вызывающим респираторные расстройства у птиц Поскольку эпителий трахеи является сайтом репликации многих возбудителей респираторных заболеваний птиц, нами была исследована чувствительность ТОК к ряду вирусов, которые вызывают у кур поражение верхних отделов дыхательных путей. Для этого проводили заражение ТОК вирусами ИЛТ, НБ, аденовирусом 4 птиц (СЕLO), ПВП производственного штамма и полевого изолята, реовирусом птиц.
Результаты наблюдения за ТОК представлены в табл. 2, из данных которой следует, что действие вируса ИЛТ проявлялось не ранее 72 ч после внесения его в ТОК и выражалось в набухании тканей трахеи с образованием выпячиваний в просвет кольца, дискоординации ЦА с утратой на отдельных участках. Изменения в тканях происходили медленно. Слизистое перерождение затрагивало глубокие слои эпителиальных клеток, отмечалось большое количество слизеобразного клеточного дебриса. Цилиостаз в ТОК, зараженных суспензией вируса с высокой его концентрацией в пределах 105 –107 ЭИД50 наступал не ранее 96 ч, а в кольцах трахеи, в которые вносили 1-10 ЭИД50 возбудителя, цилиостаз отмечался через ч после заражения. Титр вируса в ТОК составил 6,55±0,15 lg CD50/см3.
Вирус НБ вызвал изменения цилиарного эпителия ТОК уже в первые сутки после заражения. Через 24 ч отмечался ранний цилиостаз в части культур, а через 96 ч – во всех пораженных ТОК. При развитии патологического процесса в эксплантатах трахеи было отмечено быстрое разрушение ресничек эпителия и массовое отслоение разрушенных вакуолизированных клеток в просвет кольца.
Титр вируса НБ в ТОК составил 8,11±0,09 lg CD50/см3.
Таблица Чувствительность ТОК к вирусам, вызывающим респираторные расстройства у птиц (n=3) № Вариант возбудителя Начало Срок Титр в ТОК, lg CD50/см п/п действия наступления возбудителя в цилиостаза* ТОК Вирус ИЛТ, шт.«О» 72 ч 96-168 ч 1 6,55±0, Вирус НБ, шт «Ла-Сота» Менее 20 ч 24-96 ч 2 8,11±0, Аденовирус 4 птиц (CELO) 96-168 ч 3 5,90±0, 72 ч ПВП, вакцинный штамм 96-168 ч 4 4,45±0, ПВП, патогенный изолят 96-168 ч 5 5,71±1, Реовирус не обнаружено не обнаружен не обнаружен * - показаны сроки раннего и позднего цилиостаза При заражении ТОК аденовирусом-4 птиц и ПВП патологические изменения в тканях отмечались через 72 ч, которые характеризовались набуханием подслизистого слоя, замедлением движения цилей. Часто цилиарная активность была утрачена только на отдельных участках эксплантатов и цилиостаза не наступало, поэтому учет результатов титрования был затруднен. Титр вакцинного штамма ПВП составил 4,45 lg CD50/см3, а патогенного изолята – 5,71 lg CD50/см3.
При внесении в ТОК реовируса и наблюдении в течение 10 суток в зараженных культурах по сравнению с контрольными не было выявлено изменений.
Изменения в ТОК, вызываемые различными инфекционными агентами, сходны. Поэтому целесообразно вносить в ТОК заведомо известный возбудитель, а при скрининге патологического материала при цилиотоксичности образца следует проводить идентификацию инфекционного агента другими методами.
Чувствительность ТОК к возбудителям респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц Исследование возможности культивирования в ТОК Mycoplasma gallisepticum (M. gallisepticum) и Mycoplasma synoviae (M. synoviaе) сопровождалось подбором оптимальных условий проведения опытов. Для изучения использовали 19- суточные СПФ куриные эмбрионы фирмы “Lohman Tierzucht” (Германия). При внесении в выбранную среду ПСП или ПСС до 50 % среды Фрея, необходимой для роста микоплазм, снижения цилиарной активности ТОК не наблюдалось.
Безвредность ПСП для микоплазм была подтверждена реизолированием возбудителя из ТОК на 6-ые сутки после заражения и однократной смены среды.
Для исследования использовали референтные штаммы M. gallisepticum: «S6»
и «R», а также изоляты, выделенные из патологического материала птицехозяйств РФ - изолят «Магнитогорский» (Челябинская область), изолят «Красный Колос»
(Липецкая область) и изолят «Красносулимский» (Ростовская область).
Титрование и проводили, внося в M. gallisepticum M. synoviaе свежеприготовленные ТОК с объемом поддерживающей среды 0,9 см3 по 0,1 см суспензии каждого из разведений возбудителя в среде Фрея с десятикратным шагом, не менее чем в 4-х повторностях. В качестве контроля использовали не менее 5 образцов незараженных ТОК.
При использовании в качестве поддерживающей среды ПСП без сыворотки развитие M. gallisepticum проходило в ассоциации с живыми клетками эксплантатов трахеи, что вызывало поражение цилиарного эпителия и выражалось в потере цилиарной активности. Действием M. gallisepticum, по которому учитывали наличие в культуре микроорганизма, считали полный цилиостаз в кольце трахеи.
Через 24-48 ч после заражения в ТОК отмечали набухание тканей, децилиацию эпителия и его десквамацию. Явления дистрофии и некроза в тканях становились более выраженными, отмечали глубокие поражения подслизистого слоя, наличие большого количества клеточного дебриса. Цилиостаз в зараженных ТОК наступал не ранее 72 ч, а гибель зараженных культур наблюдалась на 4- сутки после инфицирования.
При сравнительной оценке значений титров полевых изолятов и штамма определенных разными методами, исследовали «S6» M. gallisepticum, инфекционную активность штамма «S6» M. gallisepticum, используемого для производства вакцин, и полевых изолятов микоплазм. Проводили параллельное титрование возбудителей на твердой питательной среде и в трахеальной органной культуре. ЦА наблюдали ежедневно в течение 5 суток. Титр инфекционной активности исследованных образцов был рассчитан в цилиостатических дозах (CD50) и в колониеобразующих единицах (КОЕ) (табл. 3).
Поскольку титры, рассчитанные в CD50 и в КОЕ сопоставимы, можно говорить о высокой чувствительности ТОК к M. gallisepticum. Оценивая результаты проведенных исследований можно сделать заключение, что изолят «Магнитогорский» показал наибольшую активность, сопоставимую с штаммом «S6» M. gallisepticum. При этом инфекционная активность M. gallisepticum изолята «Магнитогорский» в ТОК была 6,83±0,72 lg CD50/см3, а на питательной среде - – 6,0±0,3 lg КОЕ/см3, штамма «S6» – 6,36±1,09 lg CD50/см3 и 7,0±0,4 lg КОЕ/см3, соответственно.
Из данных табл. 3 следует, что при изучении изолятов «Красный Колос» и «Красносулимский» установлены также аналогичные результаты, т. е. активность M. Gallisepticum при титровании в ТОК и в твердой питательной среде не имеет существенных различий.
Таблица Титр инфекционной активности изолятов Mycoplasma gallisepticum, определенный разными методами (n=3) Инфекционная Количество Изолят / штамм активность в ТОК колониеобразующих единиц (lg CD50/см3) (lg КОЕ/см3) «Магнитогорский» 6,83±0,72 6,0±0, «Красный колос» 4,55±1,21 5,0±0, «Красносулимский» 4,20±0,33 4,0±0, «S6» 6,36±1,09 7,0±0, Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности ТОК при изучении инфекционной активности изолятов Mycoplasma gallisepticum.
Патогенность полевых изолятов Mycoplasma gallisepticum для восприимчивых животных При постановке биопробы клинические наблюдения за зараженной птицей проводили в течение 20 суток. После заражения выбранными изолятами M.
gallisepticum у птиц всех групп на 5-7 сутки наблюдали конъюнктивиты, легкие респираторные расстройства (серозные риниты, трахеальные хрипы). При вскрытии птиц через суток после заражения изолятами 14 «Магнитогорский», «Красносулимский», «Красный колос» отмечали трахеиты. У птиц, зараженных штаммом «R», выявляли синуситы, аэросаккулиты, очаговую пневмонию.
Цилиарная активность эпителия трахеи птиц, зараженных изолятами M.
gallisepticum, представлена в табл. 4. Установлено, что в группах цыплят, зараженных микроорганизмом, ЦА трахеи через 7 сут. после заражения была достоверно снижена по сравнению с контролем (p0,01). При заражении штаммом «R» цилиарная активность в ТОК отсутствовала, по-видимому, в связи с более высокой патогенностью данного возбудителя по сравнению с другими изолятами.
Через 14 дней ЦА трахеи птиц, зараженных изолятом «Магнитогорский» и штаммом «R» не восстанавливалась и отличалась по сравнению с контролем (p0,01), тогда как после заражения другими изолятами она была сопоставима с ЦА контроля. Это согласуется с данными анализа нуклеотидной последовательности гена GapA, который показал отличия исследуемых изолятов от патогенного штамма «R». Изоляты формировали отдельную генетическую группу, близкую к слабопатогенному штамму S6.
Таблица Средняя цилиарная активность трахеи цыплят, зараженных изолятами Mycoplasma gallisepticum, баллы (n=5) Изоляты Сроки после заражения (сутки) 7 «Магнитогорский» 1,8±0,4* 2,1±0,4* «Красный колос» 2,1±0,4* 3,0±0, «Красносулимский» 1,7±0,3* 3,7±0, «R» 0 0,3±0,1* Контроль 3,8±0,3 3,8±0, * - ЦА группы достоверно (р0,01) различается с контролем Вышеизложенное свидетельствует о возможности использования ТОК для изучения патогенных свойств штаммов Mycoplasma gallisepticum.
2.2.6. Исследование иммунобиологических свойств патогенных изолятов вируса ИБК, выделенных на территории РФ Исследование изолята «Щелковский» вируса ИБК. В 2005 г. в ФГУ«ВНИИЗЖ» из патологического материала от погибших цыплят на СПФ эмбрионах был выделен вирус ИБК, нуклеотидное секвенирование области гена S которого показало высокий уровень гомологии с вакцинным штаммом «Н-120»
серотипа Массачусетс, использовавшимся в хозяйстве в составе вирусвакцины. Тем не менее, многократное применение для профилактики заболевания вакцин из штамма «Н-120» в данном хозяйстве не обеспечило защиты от ИБК. В связи с этим для подбора вакцинного штамма и разработки эффективной схемы вакцинации были проведены исследования биологических свойств исследуемого изолята «Щелковский».
При попытке адаптации изолята к СПФ-КЭ путем «Щелковский»
инокулирования вируссодержащей суспензии в аллантоисную полость эмбрионов не отмечали выраженного эмбриопатического действия вируса в течение пассажей. Тем не менее, наличие вируса в СПФ-КЭ было подтверждено методом ПЦР и при внесении аллантоисной жидкости зараженных эмбрионов в ТОК, где вирус оказывал цитопатическое действие через 48-72 ч, вызывал дистрофию, десквамацию цилиарного эпителия и цилиостаз через 6 суток после заражения. В дальнейшем ТОК использовали в качестве тест-системы для определения титра выделенного вируса, который составил после 7 пассажа в СПФ-КЭ 5,25±0,43 lg CD50/см3.
При постановке биопробы на СПФ-цыплятах первые 3-суточных клинические признаки, характеризовавшиеся наличием угнетенного состояния и бронхиальных хрипов, были отмечены через 48 ч. В течение последующих 9 суток доля заболевших птиц увеличивалась и через 11 суток после заражения достигала 100%. При этом респираторные признаки болезни становились более выраженными и сопровождались затруднением дыхания, сильными хрипами и слизистыми пенистыми выделениями из носовых отверстий. Затем с 12 по 16 сутки после заражения наблюдали уменьшение количества больных цыплят до 4 из 9 и снижение тяжести клинических признаков заболевания.
При вскрытии цыплят, убитых на четвертые сутки после заражения, отмечали гиперемию и отек трахеи, признаки воспаления легких в области бифуркации бронхов. Выявлена десквамация эпителия трахеи, цилиарная активность трахеи не обнаружена. Через 10 суток после заражения при вынужденном убое цыплят обнаруживали покраснение и слизистые пробки в месте бифуркации трахеи, очаговую пневмонию и нефрит. ЦА на всем протяжении трахеи не наблюдали. Из материала от всех убитых цыплят в ТОК был выделен вирус ИБК.
Через 16 суток после заражения обнаруживали частичную репарацию и восстановление ЦА эпителия трахеи. При вскрытии вынужденно убитых цыплят выявляли очаговую пневмонию, а также отмечали мозаичную окраску и увеличение в размерах почек. Таким образом, установлено, что изолят «Щелковский» является патогенным для цыплят.
Исследование биологических свойств изолята вируса ИБК IBV663-07, выделенного в Краснодарском крае. В 2007 г. на одной из птицефабрик Краснодарского края от заболевших цыплят в возрасте 40-45 дней с признаками поражения почек был отобран патматериал. ВСМ в виде суспензии почек цыплят и аллантоисной жидкости РКЭ после первого пассажа был получен из Краснодарской краевой ветеринарной лаборатории.
При исследовании методом полимеразной цепной реакции было установлено наличие в патматериале генома вируса ИБК. В дальнейшем проводили компьютерный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена S вируса, который показал, что данный изолят, обозначенный как IBV663-07, является генетически родственным изолятам, выделенным в Южной Корее (Korea K3-3), Франции (FR/L-145OT/05) и Китае (QXIBV, JX 99 01), нуклеотидная гомология данного участка генома с которыми составила более 97%.
Для адаптации вируса к КЭ проведено 6 пассажей в РКЭ. При этом вирус обладал характерным для вируса ИБК эмбриопатическим действием, которое начали отмечать в 5 пассаже на 11 сутки после заражения эмбрионов, выражавшегося в карликовости, скручивании эмбриона, сморщивании желточного мешка и увеличении количества аллантоисной жидкости.
При внесении изолята в ТОК на третьи сутки инкубации отмечали набухание подслизистого слоя, сужение просвета трахеи, снижение активности цилиарного движения. Цилиостаз в культурах наступал через 72-96 ч после заражения. Титр инфекционной активности вируса в экстраэмбриональной жидкости в течение пассажей не превышал 3,0 lg СD50/см3.
При проведении биопробы фиксировали угнетение, ринит, трахеальные хрипы, которые проявились у инфицированных цыплят на 4 сутки после заражения.
Респираторное расстройство было наиболее выраженным на 6-7 сутки после начала опыта, которое исчезало к 14 суткам. При вскрытии 2 цыплят, подвергнутых убою через 7 суток после инфицирования, выявлены увеличение и мозаичное окрашивание почек, отложение уратов в мочеточниках. У одного цыпленка обнаружены фибринозный экссудат в трахее, отек и серозно-фибринозные отложения в легких. Методом ПЦР исследуемый вирус был обнаружен в трахеях убитых цыплят. В почках и общей пробе, содержавшей трахеи, легкие, почки, миндалины кишечника, геном вируса не был обнаружен. Через 10 недель после заражения при вскрытии цыплят установлено наличие выраженных нефрозо нефритов.
При исследовании в ИФА сывороток крови от инфицированных цыплят наличие титров антител к ИБК отмечали через 10 суток после заражения, когда средний титр антител в крови иммунизированной птицы составлял 1:856. После инокуляции цыплятам концентрированного препарата титры антител повышались и через 21 сутки после инъекции достигли среднего значения 1:1499. Через 10 недель после начала опыта все цыплята были обескровлены, от них была получена специфическая сыворотка с целью использования для дальнейших диагностических исследований.
Оценка антигенного родства штаммов и изолятов вируса ИБК, выделенных на территории РФ Для оценки антигенного родства изолятов и штаммов вируса ИБК были получены специфические гипериммунные сыворотки к референтными штаммам и исследуемым изолятам вируса ИБК и разработана методика постановки РН в ТОК с различными разведениями вируса. Для опытов использовали вакцинные штаммы «Н-120», «D274» «4/91», ранее исследованные отечественные штаммы вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский», изолят «Щелковский» (7 пассаж в КЭ) и гипериммунные сыворотки к этим вирусам.
Для получения специфических гипериммунных сывороток крови кур проводили двукратную иммунизацию цыплят в возрасте суток 30- интраназально-интратрахеально препаратами, содержащими не менее 4,0 lg ЭИД50/0,5см3 или 4,0 CD50/0,5см3 вируса ИБК. Через 14 суток после второй иммунизации цыплятам вводили по 1 см3 инактивированного препарата, изготовленного из того же вирусного материала, в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Через 21 сут. после инокуляции инактивированного вируса птицы были обескровлены для получения гипериммунных сывороток.
Уровни антител к ИБК в ИФА в общем объеме сыворотки к вышеуказанным штаммам составили от 1:4322 до 1:6249.
Для постановки РН готовили ряд последовательных десятикратных разведений каждого из исследуемых вирусов. Гиперимммунные сыворотки крови цыплят инактивировали при 580С в течение 30 мин и разводили питательной средой в соотношении 1:10. Смесь равных объемов разведений от 10-1 до 10-6 вирусной суспензии и сыворотки инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа и вносили по 0,2 см3 в пробирки с ТОК. Объем среды в ТОК составлял 0,8 см3.
Наличие или отсутствие цилиостаза учитывали в течение 5-6 суток после заражения. Индекс нейтрализации штаммов с гомо- и гетерологичными сыворотками рассчитывали по методу Рида и Менча. Цилиостаз в ТОК, наступивший ранее 48 ч после заражения, считали неспецифическим. Определение антигенного родства R штаммов ИБК проводили по методу Архетти (табл. 5).
Полученные данные свидетельствуют о высоком антигенном родстве штамма «Таганрогский» со штаммом «4/91» серотипа «793В» вируса ИБК. Штаммы «Калужский», «Таганрогский» и изолят «Щелковский» по результатам РН существенно отличались от референтных штаммов вируса ИБК.
Для определения протективных свойств вакцины, приготовленной из изолята проводили опыты по перекрестному заражению «Щелковский», иммунизированных цыплят. Для иммунизации применяли инактивированные препараты исследуемых штаммов.
Таблица Антигенное родство R отечественных штаммов и изолятов вируса ИБК с вакцинными штаммами (%) (n=5) Штаммы Сыворотка к штаммам (изоляты) «Н-120» «4/91» «D274» «Калужский»«Таганрогский»
вируса ИБК «Калужский» 71.7±4.79 53.0±1,17 2.3±0,11 42,0±2, «Таганрогский» 5,02±2,66 95,0±0,81 9,0±1,01 42,0±2, «Щелковский» 47,0±0,58 9,1±0,44 11,1±0,27 14,2±1,6 6,7±0, После иммунизации препаратом из штамма «Н-120» у цыплят, зараженных изолятом «Щелковский», выявляли наличие респираторных признаков заболевания и длительное снижение ЦА трахеи, определенное при исследовании их ТОК.
Группа цыплят, иммунизированных препаратом изолята “Щелковский”, оказалась устойчивой к заражению гетерологичным штаммом «М-41» серотипа Массачусетс, гомологичным штамму «Н-120». Эти данные согласуются с результатами, полученными в РН, и свидетельствуют о более широкой вируснейтрализующей способности антител к полевому изоляту «Щелковский» по сравнению с вируснейтрализующей активностью антител к вакцинному штамму «Н-120». Так, ИН сыворотки к изоляту «Щелковский» штамма «Н-120» составил 4,12±0,24 lg CD50, а сыворотки к штамму «Н-120» изолята «Щелковский» - 1,11±0,27 lg CD50.
Полученные данные свидетельствуют о неспособности используемого при изготовлении вакцин штамма защитить цыплят от заражения «Н-120»
описываемым изолятом. В то же время изолят «Щелковский» обладает широкой протективной активностью и способен защитить цыплят при заражении гомологичным штаммом и гетерологичным штаммом «М-41».
3. ВЫВОДЫ 1. Методика приготовления, поддержания и использования трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят обеспечивает оптимальные условия, при которых цилиарная активность ресничного эпителия переживающих эксплантатов трахеи сохраняется на высоком уровне в течение не менее 7-10 суток, что позволяет использовать их для вирусологических и серологических исследований.
2. Установлено, что вирус инфекционного бронхита кур вызывает цилиостаз в трахеальной органной культуре через 48-120 ч после заражения, вирус ньюкаслской болезни – через 24-96 ч, вирус инфекционного ларинготрахеита, пневмовирус и аденовирус 4 птиц – через 96-168 ч, возбудитель респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц – через 72-144 ч.
3. По сравнению с СПФ-эмбрионами кур трахеальная органная культура обладает преимуществами по экономичности за счет сокращения количества куриных эмбрионов в опытах более чем в 10 раз, а также по возможности детекции полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур без их предварительной адаптации к культуральной системе.
4. Методика количественного определения возбудителей в трахеальной органной культуре может быть применена для титрования вирусов инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, пневмовируса и аденовируса 4 птиц, возбудителей респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита птиц.
5. При постановке реакции нейтрализации на трахеальной органной культуре установлено наличие антигенного родства штаммов «Таганрогский» и «4/91»
серотипа «793В» в пределах 95±0,81%, а штамм «Калужский» и изолят «Щелковский» существенно отличались от референтных штаммов вируса ИБК.
6. Показана возможность использования эксплантатов трахеи куриных эмбрионов для оценки степени патогенности изолятов Mycoрlasma gallisepticum.
Изолят «Магнитогорский» и штамм «R» были высокопатогенными, а изоляты «Красносулимский» и «Красный Колос» - умеренно патогенными для цыплят.
7. Отечественные штаммы «Калужский», «Таганрогский» и изоляты «Щелковский», «IBV663-07» вируса инфекционного бронхита кур, являются умеренно патогенными для цыплят и перспективными для использования в составе инактивированных вакцин против ИБК.
8. Безопасность и иммуногенную активность вакцин против ИБК после иммунизации и контрольного заражения цыплят можно оценивать по цилиарной активности эксплантатов трахеи.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Для практического использования предлагаются следующие 1.
методические указания, которые разработаны при выполнении научных исследований по теме, одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:
- «Методические указания по выделению, титрованию и оценке антигенного родства вариантов вируса инфекционного бронхита кур в трахеальной органной культуре» (2006 г.);
- «Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят» (утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» (2006 г.);
Результаты проведенных лабораторных исследований были 2.
использованы при составлении следующей нормативной документации на изготовление, биологический контроль и применение вакцины:
- СТАНДАРТ ФГУ «ВНИИЗЖ» на вакцину против инфекционного бронхита кур полиштаммную инактивированную эмульсионную (СТО 00495527-0000-2008), одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006 г.);
- промышленный регламент на производство вакцины против инфекционного бронхита кур полиштаммной инактивированной эмульсионной, одобрен ученым советом и утвержден директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006 г.).
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Условия получения трахеальной органной культуры куриных эмбрионов для выделения и типирования вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина.
С.В.Фролов, В.И. Диев, А.В. Борисов // Сибирская язва и др. опасные инфекц.
болезни жив-х: Матер. по теме работы круглого стола, приуроченного к 80-летию академика РАСХН Бакулова И. А. – Покров, 2005. – С. 225-227.
Изучение иммунобиологических свойств вариантов вируса 2.
инфекционного бронхита кур, выделенных на территории Российской Федерации / С.В.Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко, Н.Н. Луговская, О.А. Чупина, А.В.
Борисов, Т.В. Хлыбова // Сб. науч. тр. ВГНКИ. – М., 2005. – Т. 65. – С. 108-119.
Обоснование использования российских вариантных штаммов 3.
инфекционного бронхита кур для изготовления инактивированной вакцины / С.В.
Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко, О.А. Чупина, А.В. Борисов // Тр.
Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2005. – Т. 3. – С.
343-357.
4. Изучение антигенного родства изолята «Калужский» к различным серотипам вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, С.В.Фролов, Г.В Батченко, Ю.А. Бочков, В.И. Диев, А.В. Борисов // Научно-практический журнал «Ученые записки УО ВГАВМ», - Том 41, выпуск 2, часть 1, - 2005 – С. 56-57.
5. Определение этиологической роли изолята «Щелковский» вируса ИБК в развитии заболевания / О.А. Чупина, С.В. Фролов, И.А. Борисова, В.И. Диев, А.В.
Борисов // Науч. Основы обеспечения защиты жив-х от экотоксикантов, радионуклеотидов и возбудителей инфекционных заболеваний: матер. Междунар.
Симпоз. – Казань, 2005. – Ч. 2. – С. 402-406.
6. Цилиарная активность эпителия трахеи птиц при инфицировании вирусом инфекционного бронхита кур / Д.А. Глейзер, О.А. Чупина, С.В. Фролов, А.В.
Борисов, Т.В. Хлыбова // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С. 404-408.
7. Изучение иммунобиологических свойств изолята «Щелковский» вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, С.В. Фролов, Л.О. Щербакова, А.В.
Борисов, В.И. Диев. // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С. 329—338.
8. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России в 2004-2005 гг. / Е.В. Овчинникова, Г.А.
Батченко, О.А. Чупина, Л.О. Щербакова, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Тр.
Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т. 4. – С.
362-369.
9. Чупина, О. А. Исследование иммунобиологических особенностей отчественных изолятов вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, Д.А.
Глейзер // Вет. патол. – 2006. - № 4. –С. 120-123.
10. Чупина, О. А. Протективные особенности изолята «Щелковский» вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина // Вет. патол. –2006. - № 4. –С. 123-126.
11. Оценка иммунобиологических свойств изолятов Mycoplasma gallisepticum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, О.А. Чупина, М.И.
Сорокина, Д.Б. Андрейчук, А.В. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Вет. патология. – 2007. - №4(23). – С. 171-174.
Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса 12.
инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.И. Диев, А.В. Борисов // Вет. патология. – 2007. - № 4 (23). – С. 121 126.
13. Изучение биологических свойств изолята вируса инфекционного бронхита кур IBV663-07/ Е.В. Овчинникова, О.А. Чупина, Л.О. Щербакова, А.В.
Борисов, В.В. Дрыгин Генодиагностика инфекционных болезней // (Молекулярная диагностика – 2007). – Сб. тр.6-ой Всерос. Науч.-практ. Конф. С междунар. Участием. – М., 2007. – Т. 2. – С. 40-42.
14. Evaluation of the pathogenicity of Mycoplasma gallisepticum isolates collected from a territory of the Russian Federation / I.A. Runina, M.I. Sorokina, O.A. Chupina, D.B. Andreychuk, V.N. Irza // 15th World Veterinary Poultry Congress.
Abstract
book. – Beijing, China, 2007. – P. 534.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экз., февраль 2009 г.