Трансгеноз как индуктор мейотической рекомбинации у томата (на примере ускорения селекции lycopersicon esculentum mill.)
На правах рукописи
ЮНУСОВ Зиннур Ризаевич
ТРАНСГЕНОЗ КАК ИНДУКТОР МЕЙОТИЧЕСКОЙ РЕКОМБИНАЦИИ
У ТОМАТА (НА ПРИМЕРЕ УСКОРЕНИЯ СЕЛЕКЦИИ Lycopersicon
esculentum Mill.)
Специальность: 03.02.07 – генетика
06.01.05 – селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА – 2011 Диссертационная работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно исследовательский институт биологической защиты растений Россельхозакадемии.
Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор, Академик РАН и РАСХН Жученко Александр Александрович
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Чесноков Юрий Валентинович Кандидат сельскохозяйственных наук Кан Людмила Юрьевна
Ведущая организация ГНУ Всероссийский научно исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии
Защита диссертации состоится «15» июня 2011 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском Государственном Аграрном Университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, Тимирязевская ул., 49 Учёный совет РГАУ – МСХА имени К.А.
Тимирязева (тел./факс 499-976-24-92).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан «13» мая 2011 года, и размещен на официальном сайте университета: www.timacad.ruU.
HU H
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Л.С. Большакова 2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Традиционные методы повышения продуктивности сельскохозяйственных культур за последние полвека значительно усовершенствовались. Возможности исследователей для получения новых форм растений, создания нового генофонда расширяются за счёт новейших методов отдалённой гибридизации, трансгеноза, применения ДНК маркеров, ускоренной гомозиготизации гибридных потомств и направленного мутагенеза [HWatsonH, CrickH, H 1953;
Цицин, 1981;
Кордюм, 1982;
Дубинин, 1986;
Шевелуха, 1992;
Кильчевский, Хотылёва, 1997;
Bertolla, Simonet, 1999 и др.].
Однако традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, не позволяющих эффективно использовать всю потенциальную и доступную отбору генотипическую изменчивость, свойственных культуре. Одним из методов, дающим возможность обойти все естественные межвидовые репродуктивные и рекомбинационные барьеры является генная инженерия. Она позволяет оперировать (комбинировать, переносить от одного вида к другому) практически любыми генами, принадлежащими к совершенно не родственным организмам или даже синтезированных искусственно [Картель, 1989;
Дейнеко, 1998;
Ермишин и др., 2005;
Глазко, 2006;
Чесноков, 2007 и др.].
Особенно большие возможности генной инженерии могут открыться в плане использования методов трансгеноза для индукции мейотической рекомбинации на основе переноса в межвидовые гибриды растений эндогенных индукторов кроссинговера [Жученко, 2001;
2003;
2008].
С учётом первостепенной важности задачи повышения адаптивного потенциала культивируемых растений, а также обеспечения биологической безопасности в связи с широкомасштабным распространением генетически модифицированных организмов (ГМО), вопрос об индуцированном изменении частоты и спектра рекомбинаций под воздействием нуклеиновых кислот чужеродного происхождения заслуживает особого внимания.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в разработке и применении комплексного (с элементами молекулярно-генетического анализа) методического подхода к установлению изменения частоты и спектра генетической рекомбинации на основе индукции мейотического кроссинговера у маркированных мутантных форм томата под воздействием чужеродной трансгенной ДНК экзогенного происхождения.
Работа направлена на решение фундаментальной проблемы экологической генетики и селекции растений – установление механизмов формообразовательного процесса, обусловленного индуцированием генетической рекомбинации.
Для достижения цели были решены следующие задачи:
• проведен отбор маркерных мутантных форм томата с четким проявлением фенотипических признаков на ранней стадии онтогенеза;
• подобраны трансгенные формы томата и проведена молекулярно-генетическая оценка образцов;
3 • проведены скрещивания отобранных мутантных форм с трансгенными линиями томата, получены F1 гибриды;
• проведен молекулярно-генетический анализ полученных F1 гибридов;
• проведен комплексный морфотипический и молекулярный (генетический) анализ расщепляющихся F2 гибридов потомства самоопыленных растений F гибридов;
• проведена оценка изменения частот фенотипических классов и их спектра в присутствии чужеродной трансгенной ДНК в геноме одной из родительских форм;
• проведена оценка фотосинтетической активности F1 трансгенных гибридов и их родительских форм;
оценка гибридных комбинаций и их родительских форм по содержанию пигментов в листьях томата.
Научная новизна. Впервые у томата, строгого самоопылителя, доказана высокая роль воздействия чужеродной трансгенной ДНК (Ds-элемент кукурузы и ген нуклепротеина Np вируса бронзовой пятнистости томата) в расширении частот и спектра новообразований в классической мейотической схеме рекомбиногенеза.
Получены гибриды на основе скрещивания трансгенных линий и мутантных форм томата с уникальным формообразовательным процессом в расщепляющихся поколениях, у которых был проведен комплексный фенотипический и молекулярный генотипический анализы, позволившие установить соответствие теории практике.
Научно-практическая значимость. Установлено молекулярно-генетическое расщепление морфологических и селективных маркерных генов, определяющих их взаимодействие в процессе мейотического кроссинговера.
Выявлено проявление тератологических признаков у растений томата на всех этапах онтогенеза при использовании для гибридизации трансгенных растений.
Получена качественная характеристика этого процесса.
Установлено, фотосинтетическая активность увеличивается в ряду Мутант – Сорт – ГМО – Гибрид, в аналогичной последовательности увеличивается суммарное содержание хлорофиллов a + b и каротиноидов.
Результаты работы используются в учебно-научной деятельности ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.
Тимирязева» и в ГНУ ВНИИ растениеводства им. Н.И.Вавилова Россельхозакадемии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Трансгены вызывают изменение частоты и спектра мейотической рекомбинации в F1 томата.
2. Экзогенная ДНК обуславливает вариации проявления фенологических и морфологических признаков в гибридных поколениях трансгенных и мутантных форм томата (трёхдольные зародышевые листья, отсутствие точки роста, две точки роста, фасциация, изменённые листовые пластинки).
3. Интрогрессия чужеродного генетического материала (трансгена) в F гибриды позволяет значительно расширить спектр доступной отбору генотипической 4 изменчивости, обогатить генофонд и сократить время на получение ценного исходного материала для селекции.
Апробация результатов исследований. Основные результаты работы были представлены: VII молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2007;
Международная научно-практическая конференция «Генофонд, селекция и технология возделывания пасленовых культур», Астрахань, 2007;
V научно-практическая конференция молодых ученых и аспирантов «Проблемы и перспективы развития современных элементов технологий производства сельскохозяйственной продукции», Астрахань, 2008;
Всероссийская научная конференция «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России», Санкт-Петербург, 2008;
6-я Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем», Краснодар, 2010.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 06-04-08097 офи и № 08-04-13596-офи_ц.
Публикации. Материалы диссертации изложены в 7 научных публикациях, в т.ч. одна в рецензируемом издании, рекомендованной ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста, включает 18 таблиц, 43 рисунка, состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает источников, в том числе 127 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе обобщены литературные данные о культуре томата – как одной из основных сельскохозяйственных культур и классическом объекте в генетике и селекции растений. Представлен анализ общего состояния возделываемых растений, созданных с использованием методов биотехнологии. Отмечено, что будет расширяться сфера, частота и степень влияния ГМО на окружающую среду.
Подробно обсуждаются вопросы расширения частоты и спектра рекомбинаций за счет эндогенных, экзогенных факторов и мобильных генетических элементов.
Определена актуальность совокупного изучения выше изложенных факторов, для установления влияния трансгеноза на мейотическую рекомбинацию.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использовали образцы генетической коллекции лаборатории «Изучение и поддержание генетической коллекции томата» ГНУ ВНИИБЗР, кафедры генетики МСХА им. К.А. Тимирязева, а также John Innes Centre, United Kingdom и Agrobioinstitute, Bulgaria (табл. 1).
5 Таблица 1 – Линии томата, использованные в работе Образец, Хромо Получено из Маркеры № по сома, коллекции каталогу локус Кафедра Money Дикий тип генетики МСХА maker John Innes Дикий тип Money Centre, United maker Ds-элемент tds-10 Kingdom Agrobioinstitute,Дикий тип R 480* Bulgaria Np-ген m-2 – очень мелкие хлоротичные пятна на листьях 6 (77) Мо 393 ВНИИБЗР c – число сегментов листа уменьшено 6 (104) ful – листья желтые в точках роста 4 (24) е – искривленная центральная жилка листа 4 (66) Mo 628 ВНИИБЗР hl – отсутствие опушения 11 (48) а – отсутствие антоциана во всех вегетативных 11 (68) частях растения wv – желтая точка роста 2 (410) aa – полное отсутствие антоциана во всех частях 2 (50) Мо 755 ВНИИБЗР растения d – все части растения уменьшены 2 (70) wv – желтая точка роста 2 (41) Мо 934 ВНИИБЗР are – почти нет антоциана до завязывания плодов 2 (58) d – все части растения уменьшены 2 (70) * Локализация трансгена не определена Трансгенная линия Money maker tds-10 с Ds-элементом кукурузы в 4 хромосоме любезно предоставлена Джонатаном Джонсом, The Sainbury laboratory, John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, United Kingdom [Briza, Carroll et al., 1995]. Трансгенная линия томата R 480, несущая ген нуклеопротеина (Np) вируса бронзовой пятнистости томата (TSWV), любезно предоставлена академиком А. Атанасовым, Agrobioinstitute, 1164 Sofia, Bulgaria [Stoeva et al., 1998;
Stoeva, 1999].
Исследования проводили на базе Всероссийского НИИ биологической защиты растений (ГНУ ВНИИБЗР): поле, теплица, фитотрон, в период с 2006 по 2010 гг.
Молекулярно-генетический анализ полученных гибридов и их родительских форм проводили в ГНУ ВНИИ риса (Краснодар) и ГНУ ВНИИБЗР (Краснодар).
Цитологические исследования проводили в РГАУ – МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва). Физиологические и биохимические исследования проводили на базе лабораторного оборудования ГНУ ВНИИ риса (Краснодар) и ГНУ СКЗНИИСиВ (Краснодар).
6 Растения томата для скрещивания выращивали в полевых условиях. F1 гибриды выращивали в полевых условиях и климакамерах в вегетационных 5л сосудах по методике [Журбицкий, 1968]. При выращивании в климакамерах (влажность 65%, освещенность 20 кЛк, температура +25оС ± 2оС, фотопериодизм – 16 часов день, часов ночь, влажность почвы поддерживалась на уровне 60-70% от ППВ) условия были оптимальны для нормального роста и развития растений. Температура поддерживалась постоянной в течение суток с тем, чтобы исключить влияние градиента температур, что является дополнительным фактором рекомбинации.
Гибридизацию проводили на первых трех кистях по общепринятой методике [Веселовский, 1965]. Растения F2 получали в потомстве самоопыленных растений F гибридов.
Для проведения цитологического анализа использовали модифицированную методику фиксации материала и приготовления цитологических препаратов [Жученко, Грати и др. 1980]. Учет частоты хиазм проводили согласно классификации бивалентов [Darlington, 1937].Частоту хиазм определяли в раннем диакинезе. При фиксации бутонов предварительно проводили оценку стадии развития материнских клеток пыльцы приготовлением временных ацетокарминовых препаратов пыльников томата [Паушева, 1988].
Расщепляющиеся гибридные комбинации F2 выращивали в условиях защищенного грунта (в лизиметрах). При достижении сеянцами фазы 3-4 настоящих листьев проводили идентификацию по маркерным признакам. Частоту рекомбинации оценивали методом максимального правдоподобия с учетом наиболее вероятных гипотез о причинах нарушений (жизнеспособность гамет, зигот, неполная пенетрантность маркеров) [Жученко, Король, 1981].
Выделение растительной ДНК проводили CTAB-методом, предложенного Дж.
Дойлем [J.J. Doyle, 1990]. Оценку на наличие в генотипе ряда линий томата трансгенной вставки проводили по регуляторным областям P-35S-промотора и NOS3 терминатора. Для амплификации использовали праймеры, синтезированные фирмой «Стинол» (Москва) (табл.2).
Таблица 2 – Молекулярные маркеры для идентификации интрогрессий Название 5' – 3' последовательность Длина NOS-F GAA TCC TGC CGG TCT TG NOS-R TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 35S-F GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 35S-R GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» ("ДНК-технология", Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» ("Bio-Rad", USA). Разделение продуктов амплификации осуществляли в 2 %-ном агарозном геле.
7 Газообмен и интенсивность транспирации листьев растений измеряли портативной системой фотосинтеза LI 6400 ("LiCor", США). Интенсивность окраски листьев измеряли хлорофиллометром (N-тестер) SPAD-502 ("Minolta", Япония).
Содержание пигментов в листьях (хлорофилл а, хлорофилл b, каротиноиды) определяли на спектрофотометре Genesys 8 ("Genesys", США), с последующим расчетом по формулам Лихтенталера [Lichtentaller, 1983].
Математическую обработку экспериментальных данных маркерного анализа проводили на персональном компьютере по программам, разработанных Королем А.Б. и Прейгелем И.А. (ИЭГ АН Молдова, 1985). При статистической обработке полученных результатов применяли критерии Стьюдента, Фишера и 2 [Доспехов, 1973;
Литтл, Хилз, 1981].
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Молекулярно-генетический анализ трансгенных форм томата Для проведения молекулярно-генетической оценки образцов трансгенных форм томата методом полимеразной цепной реакции (ПЦР-анализ) проводили выявление наличия P-35S-промотора вируса мозаики цветной капусты и NOS3-терминатора (гена нопалин синтетазы из Agrobacterium tumefaciens). В результате проведенного анализа нами были выявлены ПЦР фрагменты, соответствующие по своим молекулярным массам специфично амплифицированным последовательностям P-35S промотора (195 пар оснований) и NOS3-терминатора 180 (п.о.).
По результатам скрининга геномной ДНК были отобраны формы, которые содержали в своей генетической конструкции оба праймера (промотор P-35S и терминатор NOS3). Дальнейшая работа велась с отселектированными формами.
Трансгенные формы были скрещены с мутантными формами томата. В результате указанного скрещивания получено 16 F1 гибридов, которые были самоопылены и в поколении F2 подсчитана частота рекомбинации (п. 3.3). Контролем служили гибриды, полученные от скрещивания мутантных форм с сортом Money maker.
На рис. 1 и 2 представлен электрофоретический анализ отдельных образцов F гибридов. Полученные результаты обобщены в табл. 3.
ГM+ 1 2 3 4 5 6 ГM+ 7 8 9 10 11 12 ГM+ MB Рисунок 1 – Электрофоретический анализ продуктов ПЦР-реакции с праймером под P 35S-промотор в 2 % агарозном геле (195 п.о.). МВ – маркер молекулярного веса;
ГМ+ – положительный контроль;
1-12 – исследуемые образцы 8 ГM+ 1 2 34 5 6 ГM+ 7 8 9 10 11 12 ГM+ MB Рисунок 2 – Электрофоретический анализ продуктов ПЦР-реакции с праймером под NOS3-терминатор в 2% агарозном геле (180 п.о.). МВ – маркер молекулярного веса;
ГМ+ – положительный контроль;
1-12 – исследуемые образцы Таблица 3 – Молекулярно-генетическая оценка некоторых генотипов в расщепляющихся линиях F Наличие регуляторных элементов №в Маркерные Комбинация скрещивания ГМ-конструкции списке гены P-35S-промотор NOS3-терминатор 1 Money maker tds-10 Мо 755 + + aa – d 2 Money maker tds-10 Мо 755 + + wv 3 Money maker tds-10 Мо 755 + + aa 4 Money maker tds-10 Мо 755 + + d 5 Мо 393 R 480 – – c 6 Мо 393 R 480 – – m- 7 Мо 393 R 480 – – c – m- 8 Мо 393 R 480 – + –– 9 R 480 Мо 393 + + c 10 R 480 Мо 393 + + m- 11 R 480 Мо 393 – – c – m- 12 R 480 Мо 393 – – –– Примечание: (+) продукт ПЦР присутствует;
(–) продукт ПЦР отсутствует. Растения, у которых в геномной ДНК выделялись фрагменты с двумя анализируемыми праймерами выделены темно-серым цветом;
геномная ДНК только с одним из праймеров, выделена светло-серым цветом.
Из-за наличия большого объёма материала, в поколении F2 на наличие трансгена исследовались не все комбинации, а выборочно. Знак (–) не означает, что в данной комбинации скрещивания полностью отсутствует трансген, а показывает, что только в данном растении из этой группы, общей по фенотипу, трансген отсутствует.
Знак (+) указывает на наличие трансгена, который прошел через мейоз и имеется в исследуемых образцах.
При идентификации расщепляющихся популяций F2 наблюдалось выщепление нетипичных форм, некоторые из которых были оценены на наличие в них трансгенов (табл. 4).
9 Таблица 4 – Молекулярно-генетическая оценка некоторых генотипов с тератологическими изменениями в расщепляющихся линиях F Наличие регуляторных элементов ГМ-конструкции № Комбинация Примечание P-35S-промотор NOS3-терминатор 1 R 480 ГМО – – 2 Money maker tds-10 ГМО – + 3 Mo 628 R 480 F2 (нетипич.) + + 4 Mo 628 R 480 F2(нетипич.) + + 5 Mo 628 R 480 F2(нетипич.) + + 6 Mo 393 Money maker F2(нетипич.) – – 7 Money maker tds-10 Mo 628 F2(нетипич.) + + 8 Money maker tds-10 Mo 628 F2(нетипич.) – – 9 R 480 Mo 393 F2(нетипич.) + – 10 R 480 Mo 393 F2(нетипич.) + + 11 R 480 Mo 393 F2(нетипич.) + + 12 R 480 Mo 393 F2(нетипич.) + – 13 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) + + 14 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) + + 15 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) + + 16 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) + + 17 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) – – 18 R 480 Mo 393 F2 (нетипич.) – – 19 Mo 393 Money maker tds-10 F2 (нетипич.) – + 20 Money maker tds-10 Mo 393 F2 (нетипич.) – + 21 Money maker tds-10 Mo 393 F2 (нетипич.) – + Примечание: (+) продукт ПЦР присутствует;
(–) продукт ПЦР отсутствует. Растения, у которых в геномной ДНК выделялись фрагменты с двумя анализируемыми праймерами выделены темно-серым цветом;
геномная ДНК только с одним из праймеров, выделена светло-серым цветом. Образец под номером 6 – гибрид Мутант Сорт.
В итоге у двух линий из 13 с участием в качестве родительской формы трансгенного растения R 480, несущего ген устойчивости к бронзовости томатов TSWV, а также в пересеваемом потомстве самой трансгенной родительской формы, вставки генов не обнаружено. У одной линии из 5 с участием в качестве родительской формы Money maker tds-10, несущей мобильный Ds-элемент кукурузы, вставки генов также не обнаружено.
Проявление чужеродных генов у трансгенных растений с точки зрения классической генетики следует рассматривать как доминантные мутации. Поэтому генотип исходного растения, в геном которого произошло встраивание одной ДНК инсерции, может быть определен как гемизигота. Например, при встраивании маркерного гена нуклеопротеина (Np) вируса бронзовой пятнистости томата (TSWV) в составе одной ДНК инсерции на ядерный геном, генотип исходного трансформанта можно записать как np+/np-. При самоопылении такого трансформанта перенесенный ген np станет комбинироваться в составе гамет и среди потомков будут выявляться три генотипических класса в соотношении 1 np +/ np+ : 2 np+/np- : 1 np-/np-, т.е.
выявляются два класса: 3 np+ : 1 np-. Отклонения от ожидаемых соотношений (3 : 1;
15 : 1;
63 : 1 и т. д. согласно законам Менделя) в случае одной и более независимых встроек при сохранении равновероятного расхождения хромосом в мейозе и равновероятном образовании всех типов гамет, одинаковой жизнеспособности зигот условно будут свидетельствовать о нарушении нормального и стабильного уровня экспрессии маркерного гена.
3.2. Цитологический анализ нарушений мейоза у гибридов между трансгенными и мутантными формами томата Проводили цитологический анализ на стадии диакинеза – метафазы-I выявляли характер конъюгации хромосом у изучаемых форм (табл. 5).
Таблица 5 – Анализ нарушений в диакинезе некоторых форм томата Всего Количество клеток содержащих:
клеток 12 11 закрытых 11 закрытых 10 закрытых проана закрытых и1 бивалентов бивалентов, Образец лизиро бивалентов открытый и2 тривалент и 0B вано, (норма), бивалент, унивалента, унивалент, шт. шт. шт. шт. шт.
629 608 17 4 Money maker Mo 628 248 238 8 2 Money maker tds-10 312 291 14 7 Money maker tds- 361 340 13 5 Mo Money maker Mo 628 286 275 9 2 Установлено, что в метафазе I мейоза не все биваленты могут быть закрытого типа (то есть кольцеобразные, имеющие минимум две хиазмы). В разных клетках может наблюдаться разное количество открытых бивалентов, однако в нашем случае количество открытых бивалентов было не более одного на проанализированную клетку любой формы. Наличие открытых бивалентов не нарушает общего течения мейоза, но указывает на ослабление конъюгации.
Анализ материнских клеток пыльцы на стадии диакинеза – метафазы I показал, что большинство клеток у трансгенной формы Money maker tds-10 и F1 гибрида, полученного с ее участием, имело бивалентную конъюгацию хромосом.
Сорт Money maker и маркерная линия Мо 628, а также F1 Money maker Mo имеют более высокую долю клеток со всеми закрытыми бивалентами в сравнении с трансгенной формой Money maker tds-10 и F1 Money maker tds-10 Mo 628. Кроме того, у Money maker tds-10 и ее гибрида оказалась наивысшей среди всех изученных форм доля клеток с унивалентами – соответственно 0,022 и 0,014 по сравнению с 0,006 у Money maker, 0,008 у Мо 628 и 0,007 у F1 Money maker Мо 628 (табл. 6).
Таблица 6 – Доли и преобразованные в радианы (угловые меры) доли клеток с нарушениями в метафазе I мейоза некоторых форм томата Всего Доля клеток с хромосомными ассоциациями клеток Доля клеток с проана- 12 закрытых 11 закрытых и 11 закрытых 1 открытый бивалентов и нарушениями Образец лизиро- бивалентов бивалент 2 унивалента вано, шт. р р р р 629 0,967 2,776 0,027 0,33 0,006 0,155 0,033 0, Money maker Mo 628 248 0,96 2,739 0,032 0,36 0,008 0,179 0,04 0, Money maker tds-10 312 0,933 2,618 0,045 0,428 0,022 0,298 0,067 0, Money maker tds- 361 0,942 2,655 0,036 0,382 0,014 0,237 0,058 0, Mo Money maker Mo 286 0,962 2,749 0,031 0,354 0,007 0,168 0,038 0, Для оценки достоверности различий использовали критерий Фишера (табл. 7).
Таблица 7 – Критерии Фишера при оценке общего числа нарушений в диакинезе у трансгенных растений и гибридов с их участием Money Money maker Money Money Образец Mo 628 maker tds- tds-10 Mo maker maker 10 628 Mo Money maker Mo 628 F1 = 0,26 Money maker tds-10 F1 = 5,27U F1 = 2,02 U Money maker tds-10 Mo 628 F1 = 3,36 F1 = 1,01 F1 = 0,24 Money maker Mo 628 F1 = 0,I4 F1 = 0,02 F1 = 2,6 F1 = l,4l Табличное значение на уровне 95% F = 3,86. Таким образом, попарное сравнение долей клеток с общим числом нарушений в диакинезе по методу Фишера, с помощью которого можно сравнивать доли как из больших, так и из малых выборок, причем с одной и той же точностью, показало достоверные отличия образца Money maker tds-10 от сорта Money maker.
Можно предположить, что данные различия обусловлены наличием Ds элемента у образца Money maker tds-10.
При изучении анафазы I установлено увеличение доли нарушений у Money maker tds-10 (0,113) по сравнению с F1 Money maker tds-10 Mo 628 (0,046), вторым родителем Mo 628 (0,052) и остальными формами Money maker (0,009) и F1 Money maker Mo 628 (0,007). Возможно, повышенное число клеток с аномальным расхождением хромосому Money maker tds-10 также связано с влиянием Ds-элемента на прохождение анафазы I. Сходные результаты получены и при анализе анафазы II мейоза, а именно только образцы Money maker tds-10 и Money maker tds-10 Mo имели соответственно 0,057 и 0,013 клеток с нарушениями.
Однако все отклонения, которые были обнаружены в ходе цитологических исследований, не отражались на фертильности пыльцы у родительских форм и гибридов томатов.
3.3. Морфо-биологический анализ гибридов трансгенных и мутантных форм томата 3.3.1. Гибридологический анализ изменчивости rf в популяции F2 гибридов трансгенных и мутантных форм томата При сцепленном наследовании генов характер расщепления в F2 зависит от многих факторов: расстояния между генами, частоты кроссинговера в микро- и макроспороцитах, типа гетерозиготы, наличия в генотипе перестроек хромосом и специфических мутаций, внешних условий – температуры, облучения и т.д. Мы предположили, что трансгены также могут оказывать влияние на этот процесс.
Поэтому цитологический анализ мейоза был совмещен с гибридологическим анализом в потомстве F1 гибридов.
В некоторых популяциях F2 анализ фенотипических маркерных признаков выявил отклонение их наследования от ожидаемого (3:1), так как экспериментальные значения 2 были больше теоретического при Р = 95 % (табл. 8).
Таблица 8 – Расщепления по маркерным признакам в линиях F2, 2006-2008 гг.
Количество Соотношение № Доля рецес., Вариант растений в Маркер расщеп. 3:1 (3:1) п/п % F2, шт. D/R 2,80 26,3±1,77 0, c 1 Мо 393 Money maker 4,12 19,6±1,59 9, m- 2,42 29,2±1,76 6, c 2 Мо 393 R 480 5,05 16,5±1,43 25, m- 2,12 32,1±1,61 22, c 3 R 480 Мо 393 3,59 21,8±1,43 4, m- 3,04 24,7±1,72 0, c 4 Мо 393 Money maker tds-10 4,95 16,8±1,49 22, m- 2,73 26,8±1,77 1, c 5 Money maker tds-10 Мо 393 3,34 23,0±1,68 1, m- 3,30 23,3±1,70 1, aa 6 Мо 755 R 480 615 6,41 13,5±1,38 43, wv 3,62 21,6±1,66 3, d 3,44 22,5±1,68 2, aa 7 R 480 Мо 755 617 12,13 7,6±1,07 99, wv 4,02 19,9±1,61 8, d 2,75 26,6±1,62 1, aa 8 Мо 755 Money maker tds-10 747 4,34 18,7±1,43 15, wv 2,38 29,6±1,67 8, d 3,69 21,3±1,65 4, aa 9 Money maker tds-10 Мо 755 615 3,92 20,3±1,62 7, wv 2,66 27,3±1,80 1, d 2,45 29,0±1,81 5, e 4,14 19,5±1,58 10, ful 10 Мо 628 R 480 2,52 28,4±1,80 3, hl 7,25 12,1±1,30 55, a 3,20 23,8±1,70 0, e 4,96 16,8±1,49 22, ful 11 Money maker tds-10 Мо 628 2,18 31,5±1,86 13, hl 6,73 12,9±1,34 48, a 3,08 24,5±1,70 0, are 12 Мо 934 R 480 640 3,67 21,4±1,62 4, wv 6,36 13,6±1,35 44, d 1,93 34,1±1,90 27, are 13 Мо 934 Money maker tds-10 621 3,25 23,5±1,70 0, wv 4,01 20,0±1,60 8, d 1,27 44,0±1,96 123, are 14 Money maker tds-10 Мо 934 643 3,43 22,6±1,65 2, wv 2,25 30,8±1,82 11, d Примечание: Теоретически ожидаемый 2=3, Частота мейотической рекомбинации (rf) в отдельных маркерных зонах хромосом достоверно отличалась от значений классической генетической карты томата (табл. 9).
Таблица 9 – Частота кроссинговера у F2 гибридов трансгенных и мутантных форм томата, 2006-2008 гг.
Кол Рекомбинация в сегментах, % во Вариант раст., c – m-2 (27) tcm шт.
Мо 393 Money maker 619 27,4±1, 3, Мо 393 R 480 671 16,9±2, *** R 480 Мо 393 836 28,3±3,23 0, Мо 393 Money maker 2, 631 18,1±2, tds-10 ** Money maker tds- 630 31,2±3,87 0, Мо aa – wv (9) tcm wv – d (29) tcm aa – d (20) tcm Мо 755 Money maker 1492 10,3±2,21 27,9±2,43 20,4±1, 3,53 3, Мо 755 R 480 615 2,2±0,63 18,0±1,24 18,0±1,97 1, *** *** 2,77 3, R 480 Мо 755 617 3,5±1,07 18,2±1,64 28,8±4,48 1, ** ** Мо 755 Money maker 1, 747 5,3±1,24 25,5±2,27 0,72 23,6±2,96 0, tds-10 * Money maker tds- 615 12,2±2,06 0,63 24,9±3,33 0,71 22,3±3,09 0, Мо tcm hl – a (20) tcm e – ful (42) Мо 628 Money maker 712 43,1±1,39 22,4±1, 7, Мо 628 R 480 627 19,4±2,83 18,8±2,77 1, *** Money maker tds-10 8, 626 17,6±2,58 18,1±2,76 1, Мо 628 *** are – wv wv – d (29) tcm are – d (12) tcm tcm (17) Мо 934 Money maker 933 28,8±2,49 12,6±1,89 16,8±1, Мо 934 R 480 640 30,0±3,66 0,24 17,3±2,54 1,50 15,5±2,33 0, Мо 934 Money maker 2, 621 32,9±4,70 0,76 21,4±3,14 21,7±3,34 1, tds-10 * Money maker tds-10 3,76 3, 643 36,8±5,09 1,40 30,0±4,24 29,2±3, Мо 934 *** ** Примечание: *, **, *** – отличия от L. esculentum (Money maker) значимы при Р0,05;
0,01 и 0,001 соответственно. Критические табличные значения коэффициентов Стьюдента для Р 0,95 – t-1,96;
для Р-0,99 – t-2,58;
для Р-0,999 – t-3,29.
Хромосома 2. Установлено, что частота мейотической рекомбинации (rf) между маркерами wv и d 2-й хромосомы отличалась от значений генетической карты. В комбинации Мо 755 R 480 и в обратной комбинации скрещивания R 480 Mo отмечено значимое уменьшение частоты кроссинговера в 1,5 раза.
Анализ частоты расщепления rf между генами wv–aa, показал, что у гибридов с участием трансгенных форм частота рекомбинации достоверно значительно ниже, чем у контроля (в 2 – 4 раза). В комбинации скрещивания Money maker tds-10 Мо 755 частота рекомбинации на уровне контроля.
Анализ частоты rf между маркерными локусами aa–d, показал, что у гибридов с участием трансгенных форм частота рекомбинации на уровне контроля. У гибрида с комбинацией скрещивания R 480 Mo 755 частота рекомбинации выше, чем у контроля.
Анализ результатов расщепления гибридов трансгенных форм томата с маркерной формой Мо 934 показал, что частота rf между маркерными локусами в сегменте are–d достоверно значительно выше, чем у контроля. По локусу are–wv, также локализованном в хромосоме 2, у гибрида Money maker tds-10 Мо наблюдается более высокая частота rf, у остальных комбинаций частота рекомбинации на уровне контроля.
Хромосома 4. При анализе rf в сегменте e–ful показано, что частота мейотической рекомбинации в потомстве гибридов, полученных от скрещивания с трансгенными образцами Money maker tds-10 и R 480, достоверно отличалась от значений генетической карты и была существенно ниже.
Хромосома 6. Анализ частоты rf между маркерными локусами с–m-2, показал, что у гибридов с участием трансгенных форм и мутантной формы Мо 393 частота рекомбинации на уровне контроля. Гибриды в комбинации Мо 393 R 480 и Мо Money maker tds-10 достоверно выделяются пониженной частотой рекомбинации.
Хромосома 11. При анализе частоты мейотической рекомбинации в хромосоме rf в сегменте hl–a достоверно не отличалась от значений генетической карты.
Таким образом, наличие трансгенов может оказывать влияние на частоту мейотической рекомбинации (rf), при этом их действие может быть хромосомоспецифично.
Полученные данные свидетельствуют, что частота рекомбинации между разными парами локусов может сильно варьировать в разных гибридных комбинациях. Так, между парами локусов aa–d и are–wv (2 хр.) и hl–a (11 хр.) выявленные частоты сходны с ожидаемой частотой rf, исходя из расстояния по генетической карте и с контролем. С другой стороны, показатель частоты rf между парой локусов wv–aa (2 хр.) и e–ful (4 хр.) был значительно ниже ожидаемого по генетической карте. При этом частота рекомбинации в хромосоме 2 по локусу are – d была также выше, чем в контроле.
Итак, наши экспериментальные данные по изучению мейотической рекомбинации (rf) дают основание утверждать, что интеграция трансгена (Ds элемент, Np-ген) в геном гибридных растений может приводить к локальному изменению частоты мейотической рекомбинации между маркерными генами, расположенными в одной хромосоме. Следовательно, применение в скрещиваниях трансгенных форм томата позволит изменить генотипическую структуру в расщепляющемся потомстве гибридов.
3.3.2. Анализ тератологических признаков при использовании для гибридизации трансгенных растений В расщепляющемся поколении F2 были выявлены сеянцы растений с морфологическими изменениями, несвойственными исходным родительским формам.
В частности, среди новых признаков были отмечены трёхдольные зародышевые листья, две точки роста, отсутствие точки роста, фасциация, изменённые листовые пластинки (рис. 3). Количество образцов, в которых встречались аномальные растения, изменялось по годам от 0,92 до 15,01% (табл. 10).
Если у контрольной гибридной комбинации F2 Mo 393 Money maker количество растений с морфологическими изменениями встречались единично, в 2008 году – 3 шт. на 619 сеянцев, в 2009 году – 4 шт. на 592 сеянца, в процентном соотношении 0,48 и 0,68 % соответственно, то у трансгенных гибридов количество нетипичных растений увеличивалось в десятки раз – до 10-13 %. Это даёт повод предположить о влиянии трансгена как фактора, способствующего увеличению выхода в расщепляющихся поколениях растений с морфологическими изменениями.
К настоящему времени известно, что ДНК-инсерции в растительный геном вызывают изменения различных морфологических признаков. Диапазон таких изменений очень широк: морфология листовых пластинок и строение цветков;
высота растений и карликовость;
снижение апикального доминирования и дополнительное побегообразование;
эмбриолетальность;
мужская стерильность. Частота возникновения таких мутаций в популяции трансгенных растений различна – от 0,2 0,9% до 10,0 - 26,4% [Дейнеко, 1998].
Так как экзогенная ДНК может встраиваться как в структурные, так и в регуляторные области генов, вызывая изменение их экспрессии, то в зависимости от места встройки в геноме, ДНК-инсерции могут вызывать изменения отдельных морфологических признаков и служить маркерами геномной локализации генов, детерминирующих эти признаки.
Аномальные новообразования могут представлять практический интерес для селекции. Так многозародышевость, и, связанная с ней, апомиктичность развития семян, может быть источником гаплоидов, полиплоидов, андрогенно развивающихся растений. Различные формы стерильных растений представляют интерес для гетерозисной селекции. Неодинаковая частота появления уродств у различных видов, сортов, гибридов или потомств отдельных растений свидетельствует о наличии наследственной предрасположенности к появлению аномальной изменчивости, а, следовательно, и возможности отбора в этом направлении [Федоров, 1958;
Серебряков, 1960;
Игнатова, 1971;
Краевой, Махалова, 1975;
Жученко, 1980;
Бухарова, Бухаров, 2008].
Рисунок 3 – Морфологические изменения у растений томата:
а – трехдольные зародышевые листья;
б – отсутствие точки роста после первых двух настоящих листьев (форма листа изменена);
в – отсутствие точки роста;
г – две точки роста;
д – две точки роста, одна без антоциана;
е – фасциация стебля Таблица 10 – Частота проявления аномальной изменчивости растений в поколении F2, 2008-2009 гг.
Сеянцев, Аномальных растений Комбинация скрещивания Год шт. шт. % 2008 619 3 0, Mo 393 Money maker 2009 592 4 0, 2008 631 12 1, Mo 393 Money maker tds- 2009 349 12 3, 2008 630 11 1, Money maker tds-10 Mo 2009 351 27 7, 2008 671 21 3, Mo 393 R 2009 573 86 15, 2008 836 34 4, R 480 Mo 2009 489 71 14, Мо 755 Money maker tds-10 2008 747 28 3, 2008 615 7 1, Money maker tds-10 Мо 2009 657 8 1, 2008 975 10 1, Мо 755 R 2009 760 7 0, 2008 617 9 1, R 480 Мо 2009 1013 11 1, Мо 628 Money maker tds-10 2009 452 66 14, 2008 626 14 2, Money maker tds-10 Мо 2009 474 50 10, Мо 628 R 480 2008 627 31 4, 2008 621 6 0, Мо 934 Money maker tds- 2009 431 5 1, 2008 643 9 1, Money maker tds-10 Мо 2009 320 8 2, Мо 934 R 480 2008 640 12 1, На основании проведенных исследований установлено, что трансгены (Ds элемент и ген nucleoprotein (Np)) способствуют увеличению выхода в расщепляющихся поколениях растений с морфологическими изменениями.
Использование данных тератологической изменчивости важно для познания закономерностей протекания формо- и видообразования. Потенциальная возможность использования экзогенной ДНК заключается в поиске с их помощью и клонировании уникальных генов растений.
3.4. Анализ фотосинтетической активности F1 трансгенных гибридов томата и их родительских форм Изменение структурной организации генома растений инсерцией экзогенной ДНК может происходить в транскрипционно активных районах растительного генома, что приводит к возможной экспрессии некоторых собственных генов и нарушениям физиологии этих растений. Введение чужеродного фрагмента ДНК может влиять на баланс эндогенных фитогормонов в растении, что приведет к существенному изменению метаболизма клетки и развития растения в целом.
В нашем исследовании мы провели сравнение фотосинтетической активности по фазам развития растений томата: 5-6 настоящих листьев, цветение и созревание плодов.
Интенсивность фотосинтеза по образцам опыта в разные фазы протекала не одинаково и зависела от числа листьев и их площади, интенсивности окраски листа и транспирации.
В фазу 5-6 листьев, когда идёт интенсивный рост вегетативной массы и усиливаются физиологические процессы, интенсивность фотосинтеза (интенсивность СО2-газообмена листа) варьировала от 9,56 до 24,10 мкмольСО2/м2/с (Money maker и Mo 628 соответственно).
В фазы цветение и созревание плодов, когда интенсивность роста вегетативной массы снизилась, интенсивность транспирации понизилась, соответственно уменьшилась и интенсивность фотосинтеза.
В среднем по образцам СО2-газообмен листа составил 13,21 мкмольСО2/м2/с при варьировании от 7,93 (R 480) до 25,52 мкмольСО2/м2/с (F1 Mo 934 Money maker tds-10). Среднее по группам составило, в порядке увеличения ГМО – Сорт – Мутант – Гибрид, соответственно 9,56 – 10,46 – 12,39 – 19,64 мкмольСО2/м2/с (рис. 5А).
А Б Рисунок 5 – Интенсивность СО2-газообмена (А) и транспирации листа (Б) по группам генотипа Интенсивность транспирации у изученных образцов варьировала от 1,49 (R 480) до 6,51 (Мо 393), составив в среднем по опыту 3,38 ммольН2О/м2/с. Среднее по группам составило, в порядке увеличения ГМО – Сорт – Гибрид – Мутант, соответственно 2,24 – 2,65 – 3,33 – 5,01 ммольН2О/м2/с (рис. 5Б).
Из представленных данных видно, что образцы с наибольшей интенсивностью фотосинтеза имеют и большее значение интенсивности транспирации.
Расчет отношения интенсивности фотосинтеза к интенсивности транспирации показал, что это значение увеличивается в ряду Мутант – Сорт – ГМО – Гибрид, и соответственно составило 2,50 – 3,95 – 4,54 – 6,01, т.е. последние более экономно расходуют влагу, образуя больше сухого вещества на единицу поглощенной воды.
Таким образом, гибриды в 1,5 – 2,4 раза более продуктивны, чем родительские растения.
Группы образцов томатов различались не только по содержанию, но и по соотношению пластидных пигментов.
Количество хлорофилла является одним из основных индикаторов степени адаптации растений к условиям произрастания. Суммарное содержание хлорофиллов а и b возрастало в ряду Мутант – ГМО – Сорт – Гибрид (рис. 6).
Рисунок 6 – Содержание пластидных пигментов, отношение хлорофиллов а/b и суммы хлорофиллов к каротиноидам в листьях томата по группам генотипа В то время как в ряду Гибрид – Мутант – Сорт – ГМО увеличивалось соотношение хлорофилл а / b, уменьшалось соотношение хлорофиллов (а+b) / каротиноиды. Последнее связано с тем, что в листьях гибридов образуется больше хлорофилла а, участвующего непосредственно в преобразовании световой энергии в химическую и являющегося основным компонентом пигментной системы, а также каротиноидов, выполняющих функции светособирающей антенны, тем самым, расширяя световой диапазон действия фотосинтетического аппарата.
Таким образом, расчет отношения интенсивности фотосинтеза к интенсивности транспирации показал, что это значение увеличивается в ряду Мутант – Сорт – ГМО – Гибрид, т.е. последние более экономно расходуют влагу, ассимилируя большее количество углекислоты в расчете на единицу поглощенной воды. При этом гибриды в 1,5 – 2,4 раза более продуктивны, чем родительские растения. В этом же ряду увеличивается суммарное содержание хлорофиллов a+b и каротиноидов, что характеризует степень адаптации растений к изменениям факторов внешней среды и их приспособленности к различным экологическим условиям.
Специфика накопления фотосинтетических продуктов определятся генотипом, и в значительной степени влияет на фотосинтетическую активность хлорофилла, что, в свою очередь, влияет на рост и биологическую продуктивность растений и может быть использована в гибридной селекции томата.
ВЫВОДЫ 1. Интрогрессия в геном культурного томата гетерологичных генов вызывает нарушения основных процессов мейоза. Гемизиготное состояние трансгена Ds у F гибридов с участием трансгенных форм приводит к достоверному повышению частоты нарушений в метафазе I и анафазе I мейоза.
2. Интеграция трансгена (Ds-элемент, Np-ген) в геном растений может приводить к локальному изменению частоты rf между маркерными генами, расположенными в одной хромосоме.
3. Наличие трансгенов может оказывать влияние на частоту мейотической рекомбинации (rf), при этом их действие может быть хромосомоспецифично. Частота рекомбинаций между разными парами локусов может сильно варьировать в разных гибридных комбинациях. Так показатель частоты rf между парой локусов wv–aa 2-ой хромосомы и e–ful 4-й хромосомы в потомстве гибридов, полученных с использованием трансгенных форм томата, был значительно ниже ожидаемого по генетической карте. А частота рекомбинации в комбинациях скрещивания с участием трансгенных форм в хромосоме 2 по локусу are – d была выше, чем в контроле.
4. Обнаружена аномальная изменчивость различных морфологических признаков в гибридных поколениях между трансгенными и мутантными формами томата.
Спектр таких изменений очень широк: морфология листовых пластинок, отсутствие точки роста, две точки роста, фасциация стебля. Частота возникновения мутаций в популяции трансгенных растений различна, варьируя от 0,9% до 15,0%, свидетельствует о том, что экзогенная ДНК (Ds-элемент, Np-ген) может влиять на формообразовательный процесс.
5. Появление нетипичных форм в потомстве различных гибридов с неодинаковой частотой свидетельствует о наличии наследственной предрасположенности к появлению аномальной изменчивости, что существенно расширяет спектр генетической изменчивости культуры томата, а, следовательно, возможность отбора в этом направлении.
6. Использование комплексного гибридологического и молекулярно генетического анализа популяций F2 в потомстве самоопыленных F1 гибридов позволяет оценивать влияние чужеродных трансгенных маркерных генов на изменение частоты rf. При этом анализ совокупных полученных сведений является одним из методов оценки влияния чужеродной трансгенной ДНК.
7. Фотосинтетическая продуктивность увеличивается в ряду Мутант – Сорт – ГМО – Гибрид, т.е. последние более экономно расходуют влагу, ассимилируя большее количество углекислоты в расчете на единицу поглощенной воды, причем гибриды в 1,5 – 2,4 раза более продуктивны, чем родительские растения. В этом же ряду увеличивается суммарное содержание хлорофиллов a+b и каротиноидов, что характеризует степень адаптации растений к изменениям факторов внешней среды и их приспособленности к различным экологическим условиям.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При создании исходного материала в селекции рекомендуется вовлекать в скрещивания доноров экзогенной ДНК или трансгенных форм томата, что позволяет расширить частоту кроссоверов в расщепляющихся потомствах гибридов и увеличивает спектр доступной отбору генотипической изменчивости.
2. Для интенсификации рекомбиногенеза и идентификации хозяйственно-ценных признаков у томата использовать ДНК-инсерции, которые, в зависимости от места встройки в геноме, могут вызывать изменения отдельных морфологических признаков и служить маркерами геномной локализации генов, детерминирующих эти признаки.
3. Для познания закономерностей процессов формо- и видообразования важно использование данных тератологической изменчивости Потенциальная возможность использования экзогенной ДНК (Ds-элемент, Np-ген) заключается в поиске с её помощью и клонировании уникальных генов растений.
4. Для расширения спектра генотипической изменчивости и введения в селекционные линии генов, контролирующих хозяйственно ценные признаки (B, br, cpt, d, ep, ft, j, j-2, ms, s, sl, sp, ste и др.) целесообразно более широко использовать маркерную коллекцию томата, позволяющую решать теоретические и практические задачи в селекционно-генетических исследованиях.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК 1. Юнусов З.Р. Влияние трансгенов на мейотическую рекомбинацию у высших эукариот на примере растений томата / З.Р. Юнусов, А.А. Соловьёв, С.Н.
Михайленко, Р.А. Комахин, А.А. Жученко // Сельскохозяйственная биология, 2009. – № 3. – С. 52-59.
II. Статьи в материалах конференций и симпозиумов 2. Юнусов З.Р. Идентификация трансгенных форм томата / З.Р. Юнусов // «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 7-ая молодёжная научная конференция 4 апреля 2007 года. Сборник докладов. – ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии. – Москва, 2007. – С. 44-45.
3. Юнусов З.Р. Маркерная коллекция томата как ресурсный потенциал изменчивости / С.Н. Михайленко, З.Р. Юнусов // «Генофонд, селекция и технологии возделывания пасленовых культур» Международная научно-практическая конференция 17 – 20 июля 2007 года. Материалы докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ орошаемого овощеводства и бахчеводства. – Астрахань, 2008. – С. 44-47.
4. Юнусов З.Р. Разработка теоретических и экспериментальных моделей механизма индукции частоты и спектра рекомбинации у гетерозиготных растений / А.А. Жученко, Р.А. Комахин, Н.И. Бочарникова, В.В. Комахина, З.Р. Юнусов, С.Н.
Михайленко // «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России» Всероссийская научная конференция 21 – 24 апреля 2008 года.
Материалы докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии. – Санкт-Петербург, 2008. – С. 27-28.
5. Юнусов З.Р. Тератологические проявления у томата при гибридизации с трансгенными растениями / З.Р. Юнусов // «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы» ІІ Международная научно-практическая конференция (2 – 4 августа 2010 года). Материалы докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур. – М.: Изд-во ВНИИСОК, 2010. – Т.1. – С. 578-588.
6. Юнусов З.Р. Влияние гибридизации трансгенной и мутантной форм томата на качество плодов / З.Р. Юнусов, А.А. Хохлова // «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» 6-я Международная научно-практическая конференция 21 – сентября 2010 года. Материалы докладов, сообщений. – ГНУ ВНИИ биологической защиты растений. – Краснодар, 2010. – С. 676-680.
7. Юнусов З.Р. Анализ фотосинтетической активности трансгенных гибридов F1 томата и их родительских форм / З.Р. Юнусов // «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» ІІІ Всероссийский симпозиум 18 – 21 октября 2010 года. Тезисы докладов. – ГНУ Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. – М., 2010. – С. 89.