Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов водорослей дальневосточных морей
На правах рукописи
Мартыяс Екатерина Александровна
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ ВОДОРОСЛЕЙ
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Владивосток 2012
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, Анисимов Михаил Михайлович
Официальные оппоненты: Звягинцева Татьяна Николаевна доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, заведующий лаборатории химии ферментов Санина Нина Михайловна доктор биологических наук, профессор, Дальневосточный федеральный университет
Ведущая организация:
Федеральное государственное унитарное предприятие «Тихоокеанский научно исследовательский рыбохозяйственный центр» (ФГУП «ТИНРО-Центр»).
Защита состоится «28» июня 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail:
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан «28» мая 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Морские водоросли издавна используются в пищевых целях, а также в сельском хозяйстве в качестве удобрений. Это богатый источник разнообразных по структуре и биологической активности веществ.
Некоторые из этих веществ могут служить ценным сырьем для производства фармацевтической, косметической продукции, стимуляторов продуктивности сельскохозяйственных животных и урожайности сельскохозяйственных культур.
Моря Дальнего Востока богаты большим разнообразием видов бурых, красных и зеленых водорослей, некоторые из них образуют массовые скопления и заросли. В последние годы внимание исследователей привлекли низкомолекулярные метаболиты морских водорослей, такие как фенольные соединения, отдельные классы глицерогликолипидов, триацилглицеринов, жирных кислот и фотосинтетических пигментов. Пигменты, полиненасыщенные жирные кислоты и свободные аминокислоты бурых водорослей при систематическом употреблении водорослей в пищу принимают активное участие в регуляции обмена веществ. Известно, что аккумулируемые в водорослях фотосинтетические пигменты, а так же глицерогликолипиды, обладают широким спектром биологического действия. Для этих соединений характерен целый ряд свойств:
противоопухолевое, противомикробное, антиоксидантное, противовирусное, противовоспалительное и др.
В то же время данные по содержанию биологически активных веществ в водорослях дальневосточных морей носят несистематический характер, отсутствуют сведения об изменении биологической активности низкомолекулярных метаболитов в зависимости от видовой принадлежности, места обитания и сезона сбора морских макрофитов.
Поиск соединений, содержащихся в морских водорослях и обладающих широким спектром биологической активности, а также изучение влияния на активность этих соединений места и сезона сбора водорослей является актуальной задачей. Накопление подобного рода знаний может привести, с одной стороны, к созданию новых перспективных лекарственных средств и биологически активных препаратов, а с другой – к увеличению продуктивности комплексной переработки и более рациональному использованию морских ресурсов.
Цель исследования: изучить биологическую активность низкомолекулярных метаболитов, структуру и биологическую активность глицерогликолипидов морских водорослей дальневосточных морей, относящихся к трем отделам: Clorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) охарактеризовать биологическую активность экстрактивных веществ, выделенных из морских водорослей Охотского и Японского морей и определить виды водорослей наиболее перспективные для дальнейшего изучения;
2) изучить биологическую активность липофильных экстрактов бурых водорослей, относящихся к порядкам Laminarioides и Fucales, в зависимости от сезона и места сбора водорослевого материала;
3) изучить биологическую активность отдельных классов низкомолекулярных метаболитов, выделенных из липофильных экстрактов 4-х видов бурых водорослей: Saccharina cichorioides, Fucus evanescens, Eualaria fistulosa и Sargassum pallidum;
4) изучить биологическую активность отдельных классов низкомолекулярных метаболитов бурых водорослей S. cichorioides и S. pallidum в зависимости от сезона сбора;
5) выделить глицерогликолипиды из липофильных экстрактов двух видов красных: Tichocarpus crinitus и Neorhodomela larix, четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, E. fistulosa и S. pallidum. Определить структуру гликозидной части глицерогликолипидов каждого класса, охарактеризовать их жирнокислотный состав и биологическую активность.
Научная новизна. Впервые были получены данные о биологической активности суммарных экстрактов и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов морских водорослей Охотского и Японского морей. Показаны значимые различия в биологической активности общего, гидрофильного и липофильного экстрактов морских водорослей трех отделов: Clorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta, и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов, выделенных из четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, E.
fistulosa и S. pallidum. Для липофильных экстрактов из F. evanescens и S.
cichorioides и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов S. cichorioides и S. pallidum изучена биологическая активность в зависимости от места и сезона сбора водорослевого материала. Впервые изучена биологическая активность глицерогликолипидов из липофильных экстрактов двух видов красных водорослей:
T. crinitus и N. larix и четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F.
evanescens, E. fistulosa и S. pallidum. Определена структура гликозидной части и жирнокислотный состав этих глицерогликолипидов. Установлены сезонные изменения в жирнокислотном составе и биологической активности глицерогликолипидов, выделенных из бурых водорослей S. cichorioides и S.
pallidum.
Практическая значимость. Полученные сведения о противомикробной и цитотоксической активности низкомолекулярных метаболитов морских водорослей в отношении карциномы Эрлиха, при отсутствии цитотоксической активности в отношении нормальных клеток теплокровных животных, могут быть полезны при разработке на их основе различных препаратов медицинского, ветеринарного и сельскохозяйственного назначения. Данные об изменчивости количества накапливаемых низкомолекулярных метаболитов, обладающих биологической активностью в зависимости от места, физиологического состояния и сезона сбора водорослевого материала, могут быть использованы при заготовке сырья для получения биологически активных веществ из бурых водорослей.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором на следующих конференциях: XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 7-14 сентября 2009);
XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 7-14 сентября 2010);
Международная конференция «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 12-13 октября 2010);
Пятый международный симпозиум «Химия и химическое образование» (Владивосток, 12-18 сентября 2011).
Публикации. Автором опубликовано 15 работ, из них по теме диссертации – 8, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах из перечня ВАК, тезисов в сборниках материалов научных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биоиспытания и механизма действия биологически активных веществ ТИБОХ ДВО РАН 5 мая 2012 года.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего цитируемые работы. Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста и содержит 32 таблицы, 6 рисунков и 1 схему.
Сокращения и условные обозначения. ГЛ – глицерогликолипиды, ГЭ – гидрофильные экстракты, ДАГ – диацилглицерины, ДГДГ – дигалактозил диацилглицерины, ЖК – жирные кислоты, КССВ – константы спин-спинового взаимодействия, ЛЭ – липофильные экстракты, МГДГ – моногалактозил диацилглицерины, МГМГ – моногалактозилмоноацилглицерины, МЭЖК – метиловые эфиры ЖК, ОЭ – общие экстракты, СЖК – свободные ЖК, СС – свободные стерины, СХДГ – сульфохиновозилдиацилглицерины, ТАГ – триацилглицерины, ФЛ – фосфолипиды, ФСП – фотосинтетические пигменты, Хл – хлорофиллы, ЭЖК – эфиры ЖК.
Благодарность за научное сотрудничество и помощь в работе. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., профессору Анисимову Михаилу Михайловичу, к.б.н. Наталье Ивановне Герасименко за неоценимую помощь в работе, а также курировании ее химической части, Наталье Германовне Бусаровой за помощь в проведении жирнокислотного анализа липидов, Степану Викторовичу Логвинову за расшифровку полученных спектров ЯМР, к.б.н. Скрипцовой Анне Владимировне за сбор и идентификацию водорослевого материала, к.ф-м.н. Лихацкой Галине Николаевне за помощь в изучении антиоксидантной активности. Автор выражает свою искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории микробиологии за внимательное отношении и предоставление коллекционных штаммов микроорганизмов, оборудования и реактивов для работы по определению противомикробной активности, и сотрудникам лаборатории биоиспытания и механизма действия биологически активных веществ, за помощь в работе. Автор также выражает искреннюю благодарность к.х.н. Денисенко В.А., Моисеенко О.П., Ким Н.Ю., д.х.н. Новиковой О.Д., к.б.н. Портнягиной О.Ю.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Водорослевый материал. Исследуемые в работе виды водорослей были определены и отнесены к 9-ти видам красных водорослей: Ceramium kondoi Yendo, Chondrus pinnulatus (Harv.) Okamura, Mazzaella laminariodes (Bory de Saint – Vincent) Fredericq (4311’N, 13154’E), Delesseria serrulata Harvey, Neorhodomela larix (Turner) Masuda, Palmaria stenogona Perestenko, Ptilota filicina (Farl.) J.Ag., Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupz. (4304’N, 13157’E) (сбор водорослей март 2010, бухта Соболь, Японское море), Neorhodomela larix (2) (Turner) Masuda (4237N, 13107E) (сбор водорослей сентябрь 2009, бухта Троицы, Японское море), принадлежащих к 5-и семействам;
2-ум видам зеленых водорослей: Acrosiphonia sonderi (Ktz) Kornm, Ulva fenistrata Ruprecht (4304N, 13154E) (март 2010, бухта Соболь, Японское море) и 11 видам бурых водорослей: Eualaria festulosa Postels & Ruprecht (5017,9N, 15518,0E), Fucus evanescens C. Agardh (1) (5017,9N, 15518,0E), F. evanescens C. Agardh (2) (4558,2N, 15011,1E), F. evanescens C.
Agardh (3) (4330,6N, 15249,0E), F. evanescens C. Agardh (4) (5018,2N, 15517,0E) (август 2008, Охотское море), Undaria pinnatifida (Harv.) Wynne, Cystoseira crassipes (Turn) C. Ag., Desmarestia viridis (Mll) Lam., Costaria costata (Turn) Saund, Saccharina japonica (Miyabe) Okamura, Coccophora langsdorfii (Turn) Grev, Sargassum pallidum (Turn) C. Ag., Scytosiphon lomentaria (Lyngb.) Link. (4304N, 13157E), S. cichoriodes (Miyabe) (4311N, 13154E) (март 2010, бухта Соболь, Японское море), L. bongardiana (Postels & Ruprecht), L. longipes (Miyabe), L.
yezoensis (Miyabe), L. bongardiana f bongardiana (Postels & Ruprecht) (5017,9N, 15518,0E) (август 2008, Охотское море), принадлежащих к 7-и семействам.
Экстракцию низкомолекулярных метаболитов из водорослевого материала проводили смесью растворителей различной полярности (этанол 96%, этанол :
ацетон 1 : 2 (объемные соотношения), этанол : хлороформ 1 : 2 (объемные соотношения) с использованием гомогенизатора MPW-324 (Польша). Все экстракты объединяли и упаривали до Vmin с получением ОЭ. ЛЭ и ГЭ извлекали из ОЭ добавлением к последнему хлороформа. Водная фракция содержала преимущественно фенольные соединения – ГЭ, а хлороформная – липофильные – ЛЭ.
Выделение отдельных классов низкомолекулярных метаболитов проводили методом колоночной хроматографии, градиентом концентраций этанола в хлороформе. Содержание веществ в элюате контролировали при помощи ТСХ в системе Поля.
Идентификацию глицерогликолипидов проводили с использованием метода ЯМР. Спектры ЯМР 1H и 13C регистрировали на спектрометре Bruker Avance DPX 500 (Германия) с рабочей частотой 500 МГц для ядер 1Н и 125 МГц для ядер 13С.
Взаимодействия первого порядка между ядрами 1Н и 13С определяли в эксперименте HSQC. Взаимодействия второго, третьего и четвертого порядка между ядрами 1Н и 13С определяли в эксперименте HMBC, оптимизированном для КССВ 8 Гц.
Определение жирнокислотного состава липидов проводили по методу Хартмана и Реджино (Hartman, Regino, 1973) переэтерификацией липидов с получением МЭЖК. Жирнокислотный состав МЭЖК определяли, используя методы ГЖХ и ГЖХ/МС. Масс-спектры получали на приборе AMD 604 S («Itektra», Германия) с прямым вводом образца в ионный источник, способ ионизации – электронный удар (70 эВ, 8 квт).
Противомикробную активность определяли на твердых агаризованных средах измерением ширины зоны ингибирования роста микроорганизмов, измеряемой в мм от края лунки (Анисимов и др., 2010). Противомикробную активность оценивали на микроорганизмах Vibrio alyinolyticus КММ 644, Staphylococcus aureus ATCC 21027, Escherichia coli ATCC 15034, Candida albicans KMM 453 Aspergilius niger КММ 4634, Fusarium oxysporum КММ 4639, предоставленных из Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (КММ 453, Россия). Штаммы фитопатогенных грибов Septoria glycines и Cercospora sojina были предоставлены из коллекции ГНУ Дальневосточного научно-исследовательского института защиты растений (ГНУ ДВНИИЗР, Уссурийск).
Гемолитическую активность определяли на эритроцитах белых мышей при рН 6,0 и рН 7,4, после инкубирования в 96-ти луночных планшетах в течение 3 ч при 37С. Лизис клеток оценивали по изменению оптической плотности суспензии эритроцитов на фотометре планшетного формата PowerWave XS, при длине волны 700 нм («Biotek», США).
Цитотоксическую активность определяли на спленоцитах мышей и клетках асцитной карциномы Эрлиха, после инкубирования в течение часа при 37С, рассчитывая соотношение мертвых клеток к их общему числу. Гибель клеток фиксировали трипановым синим, подсчет вели с помощью светового микроскопа ImagerA1 («Carl Zeiss», Германия), используя программу AxioVision (версия 4,7) («Carl Zeiss», Германия).
Эмбриотоксическую активность определяли на оплодотворенных яйцеклетках морского ежа Strongylocentrotus intermedius (Бузников, Подмарев, 1975).
Инкубирование эмбрионов проводили в течение 3 ч при 24С.
Антиоксидантную активность определяли неферментативным железоиндуцированным методом окисления гомогената мозга мышей (Лихацкая, 2002).
Статистическая обработка данных. Все полученные результаты были обработаны при помощи программы STATISTICA 6,0.
Результаты и обсуждение Получение и биологическая активность экстрактивных веществ морских водорослей Общий, гидрофильный и липофильный экстракты (ОЭ, ГЭ и ЛЭ, соответственно) были получены в результате экстракции смесью растворителей различной полярности, что позволило максимально полно извлечь низкомолекулярные метаболиты. Среди всех исследованных экстрактов красных водорослей наибольшей противомикробной активностью в отношении S. aureus обладали ЛЭ из C. pinnulatus, L. niponica, M. laminariodes, N. larix и P. filicina. При этом ЛЭ красных водорослей обладали незначительной, за исключением ЛЭ из P.
filicina, гемолитической активностью, что делает их перспективными для дальнейшего использования в качестве источника противомикробных соединений.
ОЭ и ЛЭ зеленых водорослей A. sontarii и U. fenistrata, а так же ГЭ из U.
fenistrata обладали высокой противостафилококковой активностью и не показывали значимой гемолитической активностью. Полученные данные свидетельствуют о перспективности поиска противомикробных агентов среди метаболитов зеленых водорослей.
Среди исследованных бурых водорослей наибольшую биологическую активность обнаружили экстракты из видов, принадлежащих к семействам Laminariaceae (S. cichorioides и S. japonica) Costariaceae (C. costata), Desmarestiaceae (D. virides) и Sargassaceae (S. pallidum). Наиболее высокая противомикробная активность ГЭ среди всех тестируемых бурых водорослей принадлежала представителям из отдела Fucales (F. evanescens). Наиболее значимой гемолитической активностью при слабокислом значении рН обладали ОЭ и ЛЭ из F. evanescens, ЛЭ S. japonica. Данные виды водорослей широко распространены в дальневосточных морских акваториях и образуют массовые заросли, что делает их удобным для исследования объектом. Было определено, что наиболее перспективным и интересным для дальнейшего изучения являются вещества липофильной природы, содержащиеся в хлороформной фракции ОЭ. Было показано, что ЛЭ в основном содержат низкомолекулярные метаболиты, такие как липиды и ФСП, которые обладают значительной гемолитической и противомикробной активностью в отношении грамположительных бактерий S.
aureus.
Биологическая активность липофильных экстрактов, полученных из бурых водорослей Показано, что биологическая активность ЛЭ из бурых водорослей Е.
fistulosa, L. longipes L. bongardiana f. bongardiana, L. bongardiana и L. yezoensis, собранных в Охотском море, в значительной степени определяется видовой принадлежностью морских макрофитов. Также было показано, что ЛЭ полученные из стволиков и пластин таллома водорослей, различаются по активности. Так, ЛЭ из пластин L. bongardiana f. bongardiana, L. bongardiana и L. yezoensis показывали более высокие значения ингибирования роста грамположительных бактерий S.
aureus, по сравнению с ЛЭ из стволиков.
Влияние места сбора на биологическую активность липофильных экстрактов, полученных из Fucus evanescens Противомикробная активность ЛЭ из бурых водорослей F. evanescens варьировала в зависимости от места сбора исследуемого объекта, однако ее показатели были невысоки в отношении используемого ряда микроорганизмов.
Самые высокие значения ингибирования роста S. аureus были отмечены для ЛЭ из F. evanescens, собранных в бухте Кратерной (о. Янкича). ЛЭ из водорослей, собранных в бухте Рудная (зал. Опричник), не показали активности в отношении используемых в работе тестовых штаммов микроорганизмов (табл. 1).
Таблица 1. Противомикробная активность ЛЭ из F. evanescens Место сбора водоросли Микроорганизмы S. aureus E. coli C. albicans F. oxysporum зона ингибирования роста, мм Охотское море о. Итуруп 2,2 ± 0,2 1,3 ± 0,2 0,3 ± 0,2 0,2 ± 0, о. Уруп 1,1 ± 0,0 н.а. 1,5 ± 0,2 1,2 ± 0, о. Янкича, б. Кратерная 3,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 2,3 ± 0,3 1,8 ± 0, о. Парамушир таллом 1,0 ± 0,0 0,7 ± 0,2 1,6 ± 0,1 н.а.
молодые приростки 0,8 ± 0,2 н.а. н.а. 0,3 ± 0, Японское море зал. Опричник, б. Рудная н.а. н.а. н.а. н.а.
Нитрофунгин 3,8± 0,2 3,8± 0,2 6,0± 0,0 11,0± 0, н.а. – нет активности ЛЭ из F. еvanecsens показали значительную гемолитическую активность с выраженным pH-зависимым эффектом (табл. 2). Гемолиз усиливался в слабокислой среде, что является весьма ценной информацией для дальнейших исследований в области поиска новых противоопухолевых препаратов. Наибольшей гемолитической активностью обладали ЛЭ из F. еvanecsens, растущих в бухте Рудная, у о. Итуруп и у о. Уруп. Самая высокая зависимость гемолитической активности от рН среды была отмечена у ЛЭ из водорослей, произрастающих в бухте Рудная (табл. 2).
Таблица 2. Гемолитическая активность ЛЭ из F. evanencses Место сбора водоросли ЭД50, мг/мл pH 6,0 pH 7, о. Итуруп 8,4 15, о. Уруп 16,1 52, о. Янкича, б. Кратерная 75,0 100, о. Парамушир таллом 36,4 100, молодые приростки 78,7 100, зал. Опричник, б. Рудная 1,6 59, Сапонин 7,5 40, Влияние сезона сбора на биологическую активность липофильных экстрактов, полученных из Saccharina сichorioides Биологическая активность низкомолекулярных метаболитов морских водорослей меняется не только в зависимости от их вида и места произрастания, но также от сезона сбора водорослевого материала.
Таблица 3. Противомикробная активность ЛЭ из S. cichorioides Микроорганизмы Время сбора V. alginolyticus S. aureus E. coli C. albicans A. niger F. oxysporum водоросли зона ингибирования роста, мм март:
взрослые н.а. 6,8 ± 0,2 2,3 ± 0,2 0,8 ± 0,2 2,2 ± 0,2 3,8 ± 0, ювенильные – 4,3 ± 0,2 8,8 ± 0,2 1,0 ± 0,0 – – май* н.а. 4,0 ± 0,3 1,3 ± 0,2 н.а. 3,0 ± 0,2 0,8 ± 0, июнь* н.а. 3,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 3,0 ± 0, июль* – н.а. 1,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а.
сентябрь* 4,0 ± 0,0 6,7 ± 0,3 3,7 ± 0,2 3,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 9,8 ± 0, октябрь* 2,0 ± 0,0 5,3 ± 0,2 2,5 ± 0,0 2,0 ± 0,0 4,8 ± 0,2 7,5 ± 0, ноябрь* н.а. 3,4 ± 0,2 н.а. н.а. н.а. 2,0 ± 0, Нитрофунгин 6,0 ± 0,0 14,0 ± 0,0 3,8 ± 0,2 6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2 3,8 ± 0, н.а. – нет активности;
«–» – активность не исследовали;
* – взрослые водоросли.
Влияние сезона сбора на биологическую активность оценивали на ЛЭ, полученных из S. cichorioides, показавших самые высокие значения противомикробного действия среди бурых водорослей (табл. 3). Широкий спектр противомикробного действия в отношении исследуемых микроорганизмов показали ЛЭ из S. cichorioides, собранных в марте и сентябре месяце. Высокие значения гемолитической и цитотоксической активности были показаны для ЛЭ из водорослей, собранных в марте и ноябре месяце (табл. 4).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о влиянии сезона сбора водоросли на накопление веществ отвечающих за биологическую активность ЛЭ, полученных из S. cichorioides. Отмечено, что ЛЭ из водорослей, собранных в сентябре месяце (водоросли, находящиеся в фертильном состоянии) и в холодные месяцы (март и ноябрь), обладают более значительным биологическим потенциалом по сравнению с ЛЭ, полученными из водорослей в другие месяцы.
Таблица 4. Гемолитическая и цитотоксическая активность ЛЭ из S. cichorioides Гемолитическая Цитотоксическая Эмбриотоксическая Время сбора водоросли активность, ЭД50, активность, активность, ЭД50, мкг/мл спленоциты мкг/мл мышей, ЭД50, pH 6,0 pH 7, мкг/мл Март 2,3 3,2 8,6 75, Май 100,0 43,2 100,0 72, Июнь 15,2 25,0 100,0 36, Сентябрь 40,6 36,6 100,0 20, Октябрь 26,0 24,0 63,0 68, Ноябрь 2,42 5,8 15,8 Сапонин 7,5 40,0 - «-» – активность не исследовали Получение суммарных фракций и отдельных классов низкомолекулярных метаболитов из бурых водорослей С помощью колоночной хроматографии из ЛЭ бурых водорослей были получены следующие классы соединений: ФСП (хлорофиллы, каротиноиды и фукоксантин), ТАГ, ДАГ, СС, СЖК, ЭЖК, ФЛ, ГЛ, МГДГ, ДГДГ и СХДГ.
Показано, что содержание и соотношение низкомолекулярных метаболитов, выделенных из ЛЭ, варьирует в зависимости от вида и сезона сбора водорослей.
Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов, выделенных из бурой водоросли Eualaria fistulosa Было показано, что СЖК, ФСП и ГЛ, выделенные из ЛЭ Е. fistulosa, обнаружившего отсутствие биологической активности в ходе скрининга, обладают ингибирующим действием в отношении различных тестовых штаммах микроорганизмов. Также было показано, что различные ГЛ (МГДГ, ДГДГ, СХДГ), выделенные из E. fistulosa, обладают противомикробной, рН-зависимой гемолитической и цитотоксической активностями, что подтверждает наличие антагонистических взаимодействий веществ в экстрактах. Было отмечено несколько классов соединений (МГДГ, ДГДГ, СХДГ и СЖК), перспективных для дальнейшего изучения их биологической активности.
Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов, выделенных из Fucus evenescens Суммарные фракции некоторых низкомолекулярных метаболитов: ФСП (хлорофиллы, каратиноиды, -каротин);
СС, СЖК;
ГЛ (МГДГ, ДГДГ, СХДГ) были получены из ЛЭ F. evenescens с помощью колоночной хроматографии.
Было показано, что все исследуемые метаболиты показали сильное ингибирующее действие в отношении фитопатогенных грибов S. glycines, паразитирующих на сое. Высокой противомикробной активностью в отношении используемого ряда микроорганизмов обладали отдельные классы ГЛ, выделенные из F. evenescens.
Хлорофиллы и каротиноиды, за исключением -каротина, полученные из F.
evenescens, также показали значимую антифунгальную активность в отношении фитопатогенов сои, не ингибируя при этом рост C. albicans, A. niger и фитопатогенных грибов F. oxysporum. Также было обнаружено, что ФСП из F.
evenescens обладают антиоксидантной активностью, причем каратиноиды из этого вида водоросли более активны, чем хлорофиллы (рис. 1). Полученные данные об антиоксидантной активности ФСП важны для дальнейшего использования водорослей F. evanescens в качестве сырья для получения природных и недорогих антиоксидантов.
Антиоксидантная активность, % ДГДГ СХДГ Каротиноиды Хлорофиллы - 0 200 400 600 800 1000 Концентрации, мкг/мл Рис. 1. Антиоксидантная активность ГЛ и ФСП бурой водоросли F. evenescens Влияние сезона сбора на биологическую активность липидов и фотосинтетических пигментов, выделенных из Saccharina сichorioides Ранее было описано, что ЛЭ из водорослей, собранных в марте и сентябре, обладают высокой противомикробной активностью, а в марте и ноябре – гемолитической и цитотоксической. В связи с этим, было изучено влияние сезона на биологическую активность липидов и ФСП из ЛЭ S. cichoriodes, собранных в марте и ноябре.
С помощью колоночной хроматографии из ЛЭ S. cichorioides, собранных в марте месяце, были получены суммарные фракции следующих низкомолекулярных метаболитов: ТАГ, СЖК, Хл, в соотношении 85 : 5 : 10 %, соответственно;
ТАГ, СС, Хл, в соотношении 10 : 45 : 45 %, соответственно;
СС, Хл, в соотношении 70 :
30 %, соответственно. Кроме того, в составе индивидуальных фракций были получены некоторые метаболиты:
-каротин;
фукоксантин;
Хл;
ГЛ;
МГДГ;
ДГДГ и СХДГ. Из S. cichorioides, собранных в ноябре месяце, были выделены только индивидуальные фракции низкомолекулярных метаболитов: ТАГ;
СС;
Хл;
фукоксантин;
МГДГ;
ДГДГ и СХДГ.
Было показано, что биологическая активность липидов и пигментов из одного вида водоросли существенно меняется в зависимости от сезона сбора водорослевого материала. Были обнаружены вещества, выделенные из ЛЭ S.
cichorioides, собранных в марте месяце, содержащие ФСП, такие как хлорофиллы и фукоксантин, которые проявили себя как активные противомикробные агенты в отношении всех используемых микроорганизмов, а также как вещества с антиоксидантной активностью, но не показали при этом гемолитического и цитотоксического действия. ТАГ, СЖК и Хл в составе суммарных фракций, показали довольно значимые результаты в тестах на цитотоксическую и гемолитическую активности, но не обнаружили достаточно высокого противомикробного действия. Липиды и ФСП, выделенные из ЛЭ S. cichorioides, собранных в ноябре месяце, обладали достаточно высокой рН-зависимой гемолитической активностью, но в тоже время не показали значительного противомикробного действия как таковые из водорослей, собранных в марте месяце.
Влияние сезона сбора на биологическую активность липидов и пигментов, выделенных из Sargassum pallidum Водоросли рода Sargassum sp. богаты биологически активными метаболитами и имеют перспективу для разработки новых лекарственных средств, однако биологические функции и периоды накопления отдельных веществ в этих водорослях требуют изучения. В качестве объекта для более глубокого исследования влияния сезона сбора водоросли на биологическую активность липидов и пигментов морских макрофитов был выбран вид бурых водорослей S.
pallidum, широко распространеный в дальневосточных морских акваториях.
Из образцов S. pallidum, собранных в различные месяцы (март, июнь, август, ноябрь), были выделены липиды, отдельных классов и ФСП. Показано, что биологическая активность липидов бурых водорослей зависит от сезона сбора материала. Противомикробная активность в большей степени наблюдалась у ГЛ, выделенных из водорослей, собранных в холодное время года, а выраженной гемолитической активностью обладали липиды из S. pallidum, собранных в ноябре.
Было показано, что водоросли рода Sargassum sp., произрастающие в дальневосточных морях, содержат меньшее количество биологически активных метаболитов в сравнении с представителями этого рода в более теплых морях.
Структура глицерогликолипидов, выделенных из морских водорослей Tichocarpus crinitus, Neorhodomela larix, Saccharina cichorioides, Fucus evanescens, Eualaria fistulosa и Sargassum pallidum В предыдущих частях работы были обсуждены результаты исследования отдельных классов липидов и ФСП и их суммарных фракций, выделенных из бурых водорослей принадлежащих к разным семействам (Alariaceae, Fucaceae, Laminariaceae, Sargassaceae). Для дальнейшей работы по изучению взаимосвязи между структурой и биологической активностью наше внимание привлекли ГЛ:
МГДГ, ДГДГ и СХДГ, обнаруженные в каждом из исследованных виде водорослей в достаточном количестве и обладающие выраженной биологической активностью.
Отдельные классы МГДГ, ДГДГ и СХДГ были получены с помощью колоночной хроматографии.
Идентификация глицерогликолипидов Анализ липидных экстрактов из морских водорослей T. crinitus, N. larix, S.
cichorioides, F. evanescens, E. fistulosa и S. pallidum с помощью метода ТСХ в системе растворителей (CH3)2CO–C6H6–H2O, в соотношении 91 : 30 : 8 (по объему), показал присутствие трех основных по содержанию компонентов (ГЛ-I, ГЛ-II, ГЛ III), которые давали положительную реакцию с антроновым реагентом и имели такую же хроматографическую подвижность как МГДГ, ДГДГ и СХДГ из листьев шпината Spinacia oleracea. Для структурной идентификации ГЛ был использован метод ЯМР.
На основании сравнения данных спектров ЯМР 1H и 13С ГЛ-I, ГЛ-II, ГЛ-III с литературой (Al-Fadhli et al., 2006;
Kim et al., 2007), ГЛ-I идентифицировали как 1,2-диацил-3-О-(-D–галактопиранозил)-sn-глицерин (МГДГ) (1), ГЛ-II как 1,2 диацил-3-О-(-D-галактопиранозил-(1,6)-0--D-галактопиранозил)-sn-глицерин (ДГДГ) (2), а ГЛ-III как 1,2-диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо--D-глюкопиранозил) sn-глицерин (СХДГ) (3).
6'''' HO CH 5'''' OH O 6''' 1'''' OH HO CH2 4'''' 6''' 5''' O CH O CH2 O OH 2'''' O 3'''' 5''' 3 2'' 3'' n3'' n2'' n1'' 1'' O CH2 O OH OH O OH 4''' 2'' 3'' n3'' n2'' n1'' 2 HC O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH3 1'' 1''' OH 4''' 2 HC O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH 1''' 2''' 1 CH2 O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH 3''' 2''' 1 CH2 O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH 3''' 1' n3' n2' 2' 3' n1' 1' n3' n2' 2' 3' n1' OH O OH O 1 6''' O3S CH 5''' O CH2 O O 3 2'' 3'' n3'' n2'' n1'' 1'' OH 4''' 2 HC O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH 1''' 2''' 1 CH2 O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH OH 3''' 1' n3' n2' 2' 3' n1' OH O Из ЛЭ S. cichorioides был выделен не идентифицированный ГЛ-IV, который по данным ТСХ имел меньшую хроматографическую подвижность, чем МГДГ.
В спектре ЯМР 1H образца ГЛ-IV из S. cichorioides присутствуют сигналы, которые характерны для остатков жирных кислот: 0,852-0,902 (т., 3Н) – терминальные СН3-группы, 2,341 (м., 2Н) и 1,612 (м., 2Н) – СН2-группы в - и в -положениях к карбонилу, 1,277-1,362 м.д. фрагмента (CH2)n. В спектрах ЯМР С им соответствуют сигналы с 35,56 м.д. и 26,60 м.д. для СН2-групп в - и в положениях к карбонилу. Атомы углерода карбонильных групп имеют 176 м.д.
Дальнейший анализ спектров ЯМР 1H и 1H-1H COSY ГЛ- IV показал наличие в структуре глицеринового фрагмента и гексозы (, м.д.):
4,161 (1Н, дд., J=4,6;
11,3) –H-1a и 4,126 (1Н, дд., J=6,1;
11,3) – H-1b, 3, (1Н, м.) –H-2;
3,901 (1Н, дд., J=5,2;
10,5) – H-3a и 3,650 (1Н, дд., J=4,6;
10,5) – H-3b;
4,222 (1Н, д., J=7,6) – H-1', 3,530 (1Н, дд., J=7,6;
9,7) – H-2', 3,459 (1Н, дд., J=9,6;
3,3) – H-3', 3,815 (1Н, дд., J=3,3;
1,1) – H-4', 3,503 (1Н, м., J=1,2;
5,4;
6,8) – H 5';
3,710 (1Н, дд., J=5,4;
11,4) и 3,751 (1Н, дд., J=6,8;
11,4) – H-6'a и H-6'b.
Сравнение интегральных интенсивностей сигналов протонов фрагментов ЖК с 2,341;
1,612;
0,858-0,902 и протонов сахара показывает, что ГЛ-IV имеет моноацил-глицериновый фрагмент. Сдвиг сигнала С-2 ( 70,26) и связанного с ним протона ( 3,985) глицеринового фрагмента в сильное поле, а сигналов С-1 и С-2 в более слабое поле по сравнению со значением соответствующих атомов C и Н в МГДГ и ДГДГ указывает на то, что в sn-2 положении вместо остатка ЖК, находится гидроксильная группа. Кроме того, в спектре HMBС наблюдаются кросс-пики между протонами при С-1 – глицерина и карбонильным атомом углерода ЖК, что так же указывает на локализацию ЖК в sn-1 положении глицеринового фрагмента. Эти данные позволили идентифицировать ГЛ-IV как 1 О-ацил-3-О-(-D–галактопиранозил)-sn-глицерины (МГМГ) (4). Этот же класс ГЛ был выделен из СЛ E. fistulosa и S. pallidum, что было подтверждено данными 1H ЯМР.
6''' HO CH 5''' O CH OH O OH 4''' 2 HC OH 1''' 2''' 1 CH2 O CH2 CH2 [...] CH2 CH2 CH 3''' 1' n3' n2' 2' 3' n1' OH O Таким образом, из ЛЭ морских водорослей были выделены 1,2-диацил-3-О (-D-галактопиранозил)-sn-глицерины (МГДГ) (1), 1,2-диацил-3-О-(-D галактопиранозил-(1,6)-О--D-галактопиранозил)-sn-глицерины (ДГДГ) (2), 1,2 диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо--D-глюкопиранозил)-sn-глицерины (СХДГ) (3).
В бурых водорослях S. cichorioides, E. fistulosa и S. pallidum впервые обнаружены ГЛ-IV, которые были идентифицированы как 1-О-ацил-3-О-(-D– галактопиранозил)-sn-глицерины (МГМГ) (4). Все выделенные ГЛ, принадлежащие к одному классу, имели идентичное строение гликозидной части, но в то же время существенно отличались по составу ЖК.
Жирнокислотный состав глицерогликолипидов В представленной работе изучен жирнокислотный состав идентифицированных ГЛ: МГДГ, ДГДГ, СХДГ и МГМГ.
Жирнокислотный состав моногалоктозилдиацилглицеринов Во всех исследованных МГДГ наблюдалось высокое содержание пальмитиновой, миристиновая кислоты и суммы олеиновой и -линоленовой ЖК.
Для МГДГ, выделенных из ЛЭ водорослей семейств Laminariaceae и Sargassaceae, было показано высокое содержание стеаридоновой, арахидоновой и эйкозапентаеновой ЖК. Состав ЖК в изученных МГДГ значительно менялся в зависимости от видовой принадлежности водоросли и сезона их сбора.
Исследуемые МГДГ были самыми ненасыщенными из всех ГЛ изученных видов морских водорослей.
Жирнокислотный состав дигалоктозилдиацилглицеринов Основной ЖК во всех исследованных ДГДГ являлась пальмитиновая кислота. Кроме того, во всех выделенных ДГДГ наблюдалось высокое содержание суммы олеиновой и -линоленовой ЖК. Содержание миристиноваой кислоты варьировало от 0 до 30,8 % в зависимости от вида и сезона сбора водорослевого материала. Насыщенность ЖК, входящих в состав исследуемых ДГДГ морских водорослей, была выше, чем в МГДГ. В жирнокислотном составе ДГДГ, так же как и в случае с МГДГ наблюдались изменения в зависимости от вида и сезона сбора водорослей.
Жирнокислотный состав сульфохиновозилдиацилглицеринов Нами было показано, что СХДГ – это самые насыщенные из ГЛ морских водорослей, в которых пальмитиновая является основной по содержанию жирной кислотой. Так же как и во всех изученных нами ГЛ морских водорослей, в СХДГ содержались значимые количества миристиновой и суммы олеиновой и линоленовой ЖК. Кроме того, как и для первых двух классов ГЛ, для СХДГ характерны изменения состава ЖК в зависимости от видовой принадлежности водоросли, из которых они были получены, а также от сезона сбора водорослевого материала.
Жирнокислотный состав моногалактозилмоноацилглицеринов Было показано, что ЖК состав МГМГ значительно отличался от состава ЖК изученных МГДГ, хотя содержание пальмитиновой кислоты также было значительным во всех лизо-формах этого класса ГЛ, кроме того, все МГМГ содержали стеариновую кислоту в достаточно больших количествах.
Биологическая активность глицерогликолипидов морских водорослей В работе была определена противомикробная, гемолитическая и цитотоксическая активность ГЛ двух видов красных водорослей (N. larix и T.
crinitus) и четырех видов бурых водорослей (E. fistulosa, F. evenesctns, S.
сichorioides и S. pallidum). Кроме того, была определена активность ГЛ, выделенных из ЛЭ S. сichorioides и S. pallidum, в зависимости от сезона сбора водорослей.
Биологическая активность моногалоктозилдиацилглицеринов Противомикробная активность МГДГ варьировала в зависимости от вида водорослей, из которых они были получены. Кроме того, нами были обнаружены различия в активности МГДГ, выделенных из ЛЭ одного вида водоросли, собранных в разные сезоны (табл. 5).
Таблица 5. Противомикробная активность МГДГ Вид Месяц Микроорганизмы водоросли сбора S. aureus E. coli C. A. niger F. S. glycines albicans oxysporum зона ингибирования роста, мм март 1,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. н.а. н.а.
N. larix март н.а. н.а. н.а. - - T. crinitus август 7,0 ± 0,0 5,7 ± 0,3 2,8 ± 0,2 - - Е. fistulosa ноябрь 5,7 ± 0,2 2,5 ± 0,0 13,7 ± 0,2 5,0 ± 0,0 6,7 ± 0,3 2,0 ± 0, F.
evenescens март 3,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. н.а. S.
сicharioidesноябрь 2,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. 2,5 ± 0,2 март 2,5 ± 0,2 н.а. 3,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 н.а. н.а.
S. pallidum июнь н.а. 2,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. 4,0 ± 0, август н.а. н.а. н.а. н.а. н.а. 2,0 ± 0, ноябрь 3,0 ± 0,0 2,2 ± 0,2 1,2 ± 0,3 н.а. 1,0 ± 0,0 н.а.
Нитрофунгин 14,0 ± 0,0 3,8 ± 0,2 6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2 3,8 ± 0,2 н.а.
н.а. – нет активности;
«-» – активность не определяли Отмечено, что значительной противомикробной активностью в отношении тестовых культур грибов обладали МГДГ из F. evenescens, а самую высокую противобактериальную активность показали МГДГ из Е. fistulosa. МГДГ из красных водорослей были неактивны в отношении использованных тестовых штаммов микроорганизмов, только МГДГ из N. larix незначительно ингибировали рост S. aureus (табл. 5). Наибольшую активность в отношении S. aureus показали МГДГ из Е. fistulosa и F. evenescens. Противомикробная активность МГДГ из S.
сichorioides, незначительно менялась в зависимости от сезона сбора водорослевого материала. МГДГ из S. pallidum, собранных в холодное время года, показали умеренную противостафилококковую активность. В то время как, МГДГ из S.
pallidum, собранных в летние месяцы, не показали ингибирующего действия в отношении грамположительных бактерий S. aureus. МГДГ из красных водорослей N. larix незначительно ингибировали рост S. aureus, а МГДГ из красной водоросли T. crinitus были неактивными в отношении грамположительных бактерий (табл. 5).
Противомикробная активность МГДГ, выделенных из исследуемых видов водорослей, в отношении S. aureus и E. coli имела линейную зависимость от количественного содержания миристиновой кислоты (рис. 2). Для остальных ГЛ, подобные зависимости выявлены не были.
12 Зона ингибирования, мм Зона ингибирования, мм E. coli S. aureus r2=0, r2=0, -2 - 0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 25 30 Содержание ЖК, % Содержание ЖК, % Рис. 2. Взаимосвязь противобактериальной активности и количественного содержания миристиновой кислоты в МГДГ В литературе встречаются данные о высокой противомикробной активности МГДГ, содержащего в первом положении пальмитиновую кислоту, а во втором эйкозапентаеновую (Al-Fadhli et al., 2006). Возможно, что в МГДГ изученных нами бурых водорослей активность также усиливалась за счет высокого содержания ПНЖК, однако в этом случае не удалось обнаружить концентрационной зависимости.
Только четыре МГДГ из 10 исследованных ингибировали рост диморфных дрожжевых клеток C. albicans (табл. 5). В большей степени противомикробную активность в отношении C. albicans показали МГДГ из F. evenescens. Умеренную степень ингибирования роста дрожжей показали МГДГ из Е. fistulosa и S. pallidum (сбор водоросли в марте месяце). Анализируя данные по составу ЖК и биологической активности, изучаемых нами МГДГ мы предположили, что за противомикробную активность в отношении диморфных дрожжевых клеток C.
albicans отвечает высокое содержание суммы олеиновой и -линоленовой кислот в этих ГЛ Широкий спектр ингибирующего действия в отношении грибных культур показали МГДГ из F. evenescens. Эти ГЛ обладали высокой активностью в отношении фитопатогенных грибов. МГДГ из S. cichorioides, собранных в ноябре месяце, показали умеренное ингибирование роста культуры фитопатогенного гриба F. oxysporum. Все МГДГ из S. pallidum показали разную противомикробную активность в отношении используемых в работе тестовых штаммов грибов. Так, МГДГ из водорослей, собранных в марте месяце, ингибировали A. niger, из водорослей, собранных в июне и августе – рост фитопатогенных грибов сои S.
glycines, а МГДГ из водорослей, собранных в ноябре, незначительно ингибировали рост F. oxysporum (табл. 5).
Гемолитической активностью в значительной степени обладали только МГДГ, выделенных из бурых водорослей (табл. 6). Для МГДГ из F. evenescens, S.
сichorioides и S. pallidum было показано цитотоксическое действие на спленоциты мышей. МГДГ из Е. fistulosa были токсичны для клеток карциномы Эрлиха в низкой концентрации, но не проявляли токсичности в отношении нормальных клеток. Скорее всего, эту активность обеспечивает высокое, по сравнению с другими изучаемыми МГДГ, количественное содержание миристиновой кислоты в МГДГ из Е. fistulosa. Гемолитическая активность с выраженным рН-зависимым эффектом была показана для МГДГ, выделенных из бурых водорослей F.
evenescens и S. сichorioides, собранных как в летний так и в зимний период. МГДГ из S. pallidum, собранных в ноябре месяце, вызывал лизис эритроцитов в самых низких концентрациях, при обоих значениях рН среды (табл. 6).
Таблица 6. Гемолитическая и цитотоксическая активность МГДГ Вид Месяц сбора Гемолитическая активность, Цитотоксическая активность, водоросли ЭД50, мкг/мл ЭД50, мкг/мл рН 6,0 рН 7,4 спленоциты карцинома мышей Эрлиха март 100,0 100,0 100,0 100, N. larix март 100,0 100,0 - 100, T. crinitus август 100,0 100,0 100,0 7, Е. fistulosa ноябрь 8,5 20,2 21,7 100, F. evenescens март 43,3 100,0 32,8 100, S. cichorioides ноябрь 5,8 14,3 100,0 март 100,0 100,0 100,0 100, S. pallidum июнь 100,0 100,0 100,0 100, август 96,4 100,0 68,4 100, ноябрь 1,1 1,8 - 10, Сапонин 7,5 40,0 - «-» – активность не определяли Таким образом, МГДГ, выделенные из ЛЭ бурых водорослей обладают наибольшим биологическим потенциалом, по сравнению с МГДГ из красных водорослей. Самую значительную противомикробную активность, в сочетании с гемолитической и цитотоксической активностью, показали МГДГ из бурой водоросли F. evenescens. МГДГ из Е. fistulosa также значительно ингибировали рост бактерий, вызывали гибель клеток карциномы Эрлиха, не оказывая при этом токсического действия в исследуемых концентрациях на эритроциты и спленоциты мыши. Выраженной гемолитической активностью обладали МГДГ из S.
сichorioides и S. pallidum, собранных в ноябре месяце. Была показана зависимость противобактериальной активности от содержания миристиновой кислоты в исследуемых МГДГ.
Биологическая активность дигалактозилдиацилглицеринов ДГДГ морских водорослей в значительно меньшей степени ингибировали, по сравнению с МГДГ рост тестовых штаммов микроорганизмов (табл. 7), и в большей степени подавляли рост дрожжеподобных грибов C. albicans. Высокие значения противомикробной активности были отмечены для ДГДГ из N. larix, E.
fistulosa и S. pallidum (август, ноябрь) (табл. 7).
Широкий спектр ингибирующего действия показали ДГДГ из F. evenescens, которые в разной степени ингибировали рост всех используемых штаммов микроорганизмов за исключением A. niger (табл. 7) и C. sojina (данные не приведены). Самую высокую противомикробную активность ДГДГ показали в отношении фитопатогенов сои S. glycines. Относительно F. oxysporum только два ДГДГ показали ингибирующую рост активность – это дигалактозид из F.
evenescens и S. pallidum, собранных в августе месяце. К сожалению, мы не смогли проследить влияние состава ЖК на активность ДГДГ, в связи с чем было выдвинуто предположение, что на противомикробную активность в большей степени оказывает влияние позиционное расположение ЖК в этом ГЛ.
Таблица 7. Противомикробная активность ДГДГ Вид Месяц Микроорганизмы водоросли сбора S. aureus E. coli C. A. niger F. S.
albicans oxysporum glycines зона ингибирования роста, мм март н.а. н.а. 4,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а.
N. larix март 1,0 ± 0,0 н.а. н.а. - - T. crinitus август н.а. н.а. 4,0 ± 0,0 - - Е. fistulosa ноябрь 1,5 ± 0,0 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,0 н.а. 2,0 ± 0,0 5,0 ± 0, F.
evenescens март н.а. н.а. н.а. н.а. н.а. S.
cichorioides ноябрь н.а. н.а. н.а. н.а. н.а. март н.а. н.а. н.а. н.а. н.а. н.а.
S. pallidum июнь н.а. н.а. н.а. н.а. н.а. н.а.
август н.а. н.а. 4,5 ± 0,2 н.а. 2,0 ± 0,0 н.а.
ноябрь н.а. н.а. 2,7 ± 0,2 н.а. н.а. н.а.
Нитрофунгин 14,0 ± 0,0 3,8 ± 0,2 6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2 3,8 ± 0,2 н.а.
н.а. – нет активности;
«-» – активность не определяли Гемолитическая активность была показана для ДГДГ, выделенных из бурых водорослей E. fistulosa, собранных в августе, F. evenescеns, S. сichorioides и S.
pallidum, собранных в ноябре (табл. 8). Все ДГДГ обладали более высокой гемолитической активностью при слабокислом значении рН среды, наибольшую активность обнаружили для ДГДГ из F. evenesctns и S. сichorioides, собранных в ноябре месяце. Показано, что ДГДГ из N. larix и F. evenescеns обладают цитотоксическим действием в отношении спленоцитов мыши, а ДГДГ, выделенные из T. crinitus и E. fistulosa – в отношении карциномы Эрлиха (табл. 8).
ДГДГ из E. fistulosa вызывали 50%-ную гибель клеток опухоли в концентрации 8 мкг/мл, при этом не проявляли токсичности в отношении нормальных клеток (табл. 8). Полученные данные весьма перспективны для дальнейшего исследования ГЛ, как противоопухолевых агентов.
Таблица 8. Гемолитическая и цитотоксическая активность ДГДГ Вид Месяц сбора Гемолитическая активность, Цитотоксическая активность, водоросли ЭД50, мкг/мл ЭД50, мкг/мл рН 6,0 рН 7,4 Спленоциты Карцинома мышей Эрлиха март 100,0 100,0 48,3 100, N. larix март 100,0 100,0 - 37, T. crinitus август 42,3 71,3 100,0 8, Е. fistulosa ноябрь 2,3 10,6 69,8 100, F. evenescens март 100,0 100,0 100,0 100, S. cichorioides ноябрь 2,3 45,3 100,0 март 100,0 100,0 100,0 100, S. pallidum июнь 100,0 100,0 100,0 100, август 100,0 100,0 100,0 100, ноябрь 2,4 4,3 - 10, Сапонин 7,5 40,0 - «-» – активность не определяли Биологическая активность сульфохиновозилдиацилгдицеринов СХДГ морских водорослей в большей степени ингибировали рост грибов особенно фитопатогенных грибов S. glycines и F. oxysporum, чем бактерий.
Значимая гемолитическая активность была отмечена для СХДГ из бурых водорослей S. cichorioides и S. pallidum, собранных в ноябре месяце.
Цитотоксической активностью по отношению к спленоцитам мышей обладали только СХДГ из F. evenescеns. Вероятнее всего, цитотоксическую активность данного ГЛ обеспечивает высокое содержание миристиновой кислоты. СХДГ из T.
сrinitus, содержащие больше всего пальмитиновой кислоты, по сравнению с СХДГ, выделенных из других водорослей, оказывали цитотоксическое действие на клетки карциномы Эрлиха.
Биологическая активность моногалактозилмоноацилглицеринов Противомикробная активность МГМГ, также как и их ЖК состав, существенно отличалась, в зависимости от вида водоросли из которого они были выделены. Только МГМГ из S. cichorioides, собранных в ноябре ингибировали рост грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов (табл. 9). Вероятнее всего, эту активность обеспечивает высокое содержание ПНЖК (41%). МГМГ обладали более выраженной противомикробной активностью в отношении грамположительных бактерий, самое значительное ингибирование роста S. aureus было отмечено при действии МГМГ из S. pallidum. Скорее всего, за противомикробную активность отвечает высокое содержание стеариновой кислоты (57,2%), количество которой в МГМГ из S. pallidum было 2,4 – 2,7 раза больше, по сравнению с липидами из других водорослей. Только для МГМГ из S. pallidum было показано ингибирующее рост действие в отношении фитопатогенов F.
oxysporum. Наличие этой активности коррелирует с высоким содержанием миристиновой и пальмитиновой кислот относительно других исследуемых МГМГ.
Показано, что все выделенные МГМГ не обладали гемолитической и цитотоксической активностями.
Таблица 9. Противомикробная активность МГМГ Вид Месяц Микроорганизмы водоросли сбора S. aureus E. coli C. A. niger F. S.
albicans oxysporum glycines зона ингибирования, мм от края лунки август 2,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. н.а. н.а.
Е. fistulosa ноябрь 1,0 ± 0,0 2,0 ± 0,0 3.0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а.
S.
сichоrioides август 4,0 ± 0,0 н.а. н.а. н.а. н.а. н.а.
S. pallidum Нитрофунгин 14,0 ± 0,0 3,8 ± 0,2 6,0 ± 0,0 12,0 ± 0,2 3,8 ± 0,2 н.а.
н.а. – нет активности;
«-» – активность не определяли Таким образом, МГМГ обладали меньшим биологическим потенциалом, чем МГДГ, только МГМГ из S. pallidum в значимой степени ингибировали рост грамположительных бактерий и условно-патогенных грибов, в то время как МГДГ из этой водоросли не показывали такой активности.
При изучении биологической активности липидов морских водорослей нами было показано, что среди ГЛ наибольшей противомикробной активностью обладают МГДГ. Гемолитической активностью в равной степени обладают все классы ГЛ. Вид водоросли, из которых были получены ГЛ, существенно влияет не только на состав ЖК, но и на их биологическую активность. Кроме того, было показано, что на биологическую активность влияет состав ЖК и их позиционное расположение в ГЛ, а так же синергический и антагонистический эффекты при взаимодействии молекулярных видов в пуле ГЛ одного класса.
Выводы 1. Получены общие, липофильные и гидрофильные экстракты из морских водорослей Охотского и Японского морей относящихся к трем отделам:
Chlorophyta (2 вида), Phaeophyta (11 видов) и Rhodophyta (9 видов) и охарактеризована их биологическая активность.
2. Показано, что липофильные экстракты, полученные из красных водорослей Chondrus pinnulatus, Laurensia niponica, Mazzaella laminariodes, Neorhodomela larix;
Ptilota filicina;
зеленых водорослей Acrosiphonia sontarii и Ulva fenistrata и бурых водорослей Saccharina cichorioides, S. japonica, Costaria costata и Scytosiphon lomentaria обладают противомикробной активностью в отношении грамположительных бактерий S. aureus.
3. Установлено, что липофильные экстракты из S. cichorioides, обладают высокой противомикробной активностью, зависимой от сезона сбора водорослевого материала. Наиболее активными в отношении грамположительных бактерий и патогенных грибов оказались суммарные фракции липидов и пигментов из S.
cichorioides, собранных в марте, сентябре и октябре.
4. Показано, что липофильные экстракты из бурых водорослей, собранных в холодное время года: Fucus evenescens (бухта Рудная, Японское моря), S.
cichoriodes (Японское море) и Sargassum pallidum (Японское море) и отдельные классы низкомолекулярных метаболитов из бурой водоросли F. evenescens, обладают высокой гемолитической активностью.
5. Установлено, что хлорофиллы и фукоксантин из S. cichorioides, собранные в марте, обладают значительным противомикробным действием в отношении всех используемых микроорганизмов, при отсутствии гемолитической и цитотоксической активности. Суммарная фракция, содержащая триглицериды, свободные жирные кислоты, хлорофиллы, напротив, показала высокую цитотоксическую и гемолитическую активности. Низкомолекулярные метаболиты, выделенные из S. cichorioides, собранных в ноябре, не показали высокого противомикробного действия, но обладали достаточно высокой рН-зависимой гемолитической активностью.
6. Из липофильных экстрактов двух видов красных водорослей: Tichocarpus crinitus и N. larix и четырех видов бурых водорослей: S. cichorioides, F. evanescens, Eualaria fistulosa и Sargassum pallidum выделены три характерных для водорослей класса глицерогликолипидов: 1,2-диацил-3-О-(-D-галактопиранозил)-sn-глицерин (МГДГ), 1,2-диацил-3-О-(-D-галактопиранозил-(1,6)-О--D-галактопиранозил)-sn глицерин (ДГДГ), 1,2-диацил-3-О-(6-дезокси-6-сульфо--D-глюкопиранозил)-sn глицерин (СХДГ). Из бурых водорослей S. cichorioides, E. fistulosa и S. pallidum были выделены ранее не обнаруженные в этих видах водорослей глицерогликолипиды, которые были идентифицированы как 1-О-ацил-3-О-(-D– галактопиранозил)-sn-глицерины (МГМГ). Структуры гликозидной части глицерогликолипидов, принадлежащих к одному классу, имели идентичное строение, в то же время существенно отличались по составу жирных кислот и степени насыщенности в зависимости от вида водоросли и сезона сбора.
Наибольшая биологическая активность наблюдалась для глицерогликолипидов, выделенных из водорослей, собранных в холодное время года.
7. Во всех исследованных глицерогликолипидах морских водорослей было обнаружено высокое содержание пальмитиновой и миристиновой жирных кислот.
В МГМГ было отмечено высокое содержание пальмитиновой и стеариновой кислот. Жирнокислотный состав глицерогликолипидов варьировал в зависимости от вида и сезона сбора водорослей.
8. Показано, что самая высокая противомикробная активность в отношении S.
aureus и C. albicans, была характерна для МГДГ из бурых водорослей F. evanescens и E. fistulosa.
9. Показано, что МГДГ из E. fistulosa обладают цитотоксической активностью в отношении клеток карциномы Эрлиха в достаточно низкой концентрации (ЭД50=7,3 мкг/мл).
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Анисимов М.М., Мартыяс Е.А., Чайкина Е.Л., Герасименко Н.И.
Противомикробная, гемолитическая и фиторегулирующая активность липидных экстрактов из морских водорослей // Химия растит. сырья. 2010. Т.
4. С. 125–130.
2. Анисимов М.М., Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Горовой П.Г.
Противомикробная активность экстрактов и компонентов морских водорослей // Раст. ресурсы. 2012. Т. 48. С. 139–154.
3. Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Бусарова Н.Г., Юрченко Е.А., Скрипцова А.В., Анисимов М.М. Биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов Saccharina сichorioides (Miyabe) (сем.
Laminariaceae). Сезонные изменения активности // Химия растит. сырья. 2012.
Т. 1. С. 97–105.
4. Мартыяс Е. А., Анисимов М. М., Герасименко Н. И. Противомикробная активность экстрактов из бурых водорослей // XII Всерос. Молодеж. Школа конф. По актуал. Проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сент. 2009 г.: сб. тр. г. Владивосток: ДВО РАН, 2009. С. 44.
5. Мартыяс Е.А., Анисимов М.М., Скрипцова А.В. Противомикробная и гемолитическая активности экстрактов водорослей Дальневосточных морских акваторий // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. 2010.: сб. тр. г. Владивосток: ДВО РАН, C. 42.
6. Мартыяс Е.А., Герасименко Н.И., Юрченко Е.А., Анисимов М.М.
Противомикробная, гемолитическая и цитотоксическая активности экстрактивных веществ бурой водоросли Laminaria cichorioides (Miyabe) // Сборник трудов международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» г. Ташкент 2010. С. 56.
7. Мартыяс Е.А., Лихацкая Г.Н., Герасименко Н.И., Ким Н.Ю., Анисимов М.М.
Сравнительное изучение антиоксидантной активности пигментов и глицерогликолипидов бурых водорослей Fucus evanescens и Saccharina cichorioides // 5-й международный симпозиум «Химия и химическое образование» г. Владивосток 2011. С. 32.
8. Мартыяс Е. А., Герасименко Н. И., Бусарова Н. Г., Анисимов М. М.
Сравнительное изучение биологической активности гликолипидов бурых водорослей Fucus evanescens и Sargassum pallidum // VII Всероссийская конф.
«Химия и технология растительных веществ», Сыктывкар, 3–5 окт. 2011 г. :
тез. докл. г. Сыктывкар. Ин-т химии Коми НЦ УрОРАН, 2011. С. 98.
Соискатель Мартыяс Е.А.
Мартыяс Екатерина Александровна БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ ВОДОРОСЛЕЙ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 23.05.12.
Формат 60х84/16. Тираж 100 экз.
Усл. печ. л. 1.0 Заказ № Отпечатано в печатном салоне «Оперативная полиграфия».
ИП Матусевич Ю.И.
690013, г. Владивосток, ул. Трамвайная 14Б, тел. (423)