Разработка новой формы биопрепарата для очистки водных объектов от тонких нефтяных пленок 03. 00. 23 - биотехнология автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук моск
На правах рукописи
АУШЕВА Хадишат Ахметовна РАЗРАБОТКА НОВОЙ ФОРМЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ОТ ТОНКИХ НЕФТЯНЫХ ПЛЕНОК 03. 00. 23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук
Москва – 2007 1
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета им. Д. И. Менделеева.
Научный консультант: кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович
Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Винаров Александр Юрьевич кандидат биологических наук, научный сотрудник Ботвинко Ирина Васильевна
Ведущая организация:
Московский Государственный Университет инженерной экологии
Защита диссертации состоится « 29 » мая 2007 г в 12:30 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 212.204.13 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9) в МАЗе.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан « 28 » апреля 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета ДМ 212.204.13 И. В. Шакир
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Одним из основных и крупномасштабных загрязнителей акваторий является нефть и продукты ее переработки. Применение комплексных методов ремедиации воды подразумевает использование на последнем этапе микробиологических методов очистки, основанных на применении микроорганизмов-нефтедеструкторов, для которых нефтепродукты являются основным источником углерода и энергии. Большинство биопрепаратов, применяемых для биоремедиации водных поверхностей, представляют собой сухие порошки, содержащие высушенные клетки нефтедеструкторов, либо пастообразные формы микроорганизмов. В последние годы для биоремедиации водных поверхностей используются иммобилизованные формы микроорганизмов, обладающие рядом преимуществ по сравнению со свободными клетками, наиболее ценным из которых следует считать положительную плавучесть. В качестве носителей для иммобилизации могут быть использованы как материалы природного происхождения, так и синтетические носители различной природы с плотностью меньшей, чем плотность воды. В основном, во всех методах биоремедиации воды с использованием иммобилизованных микроорганизмов наряду с окислением нефти происходит её сорбция на самих носителях. Это свойство, с одной стороны, позволяет быстрее удалить загрязнения с поверхности воды, делая доступным растворение кислорода в приповерхностном слое. С другой стороны, возрастающая концентрация загрязнителя непосредственно в зоне окисления снижает скорость биодеструкции. Разработка новой формы биопрепарата для ремедиации водных поверхностей является актуальной задачей, при решение которой возможно улучшение многих экологических приемов очистки пресных и морских акваторий.
Цели и задачи исследования Основной целью работы явилась создание новой формы биопрепарата, обладающей положительной плавучестью, предназначенной для очистки водных поверхностей от тонких нефтяных пленок.
Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Разработать метод иммобилизации клеток-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, обладающих положительной плавучестью.
2. Адаптировать данный метод к различным группам микроорганизмов:
бактерий, дрожжей, а также микроводорослей.
3. Изучить свойства полученной препаративной формы: активность препарата, срок хранения и способность к разложению в естественной экосистеме.
4. Определить дозы вносимого препарата при различных концентрациях нефтяных загрязнений.
5. Провести опытные испытания по ликвидации нефтяных загрязнений в реальных условиях.
Научная новизна. Впервые применен для создания биопрепарата метод иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатных гранулах, позволяющий увеличить их деструкционный потенциал.
Показано, что н-алканы, эмульгированные в Са-альгинатные гранулы, позволяют придать гранулам положительную плавучесть.
Показано, что применение новой препаративной формы с эмульгированными н-алканами позволяет увеличить скорость биоремедиации за счет локализации иммобилизованных и свободных клеток в приповерхностном слое воды.
Установлено, что одновременная иммобилизация клеток микроводорослей с клетками нефтедеструкторов способствует интенсификации процесса биоремедиации за счет обогащения биогенным кислородом.
Практическая значимость. Разработан новый метод удаления тонких нефтяных пленок с поверхности акваторий с помощью иммобилизованных клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов. Определены параметры получения Са-альгинатных гранул с иммобилизованными клетками нефтедеструкторов, влияющие на характеристики биопрепарата. Наработана опытная партия новой препарата для удаления тонких нефтяных пленок с поверхности пресных водоемов и испытана в реальных условиях ЗАО «Транснефть». Показано, что применение нового биопрепарата позволяет снизить количество нефтяных углеводородов (НУГВ) за 21 сутки при температуре от 10 до 22оС в экспериментальном варианте до 95%. Получен патент Российской Федерации на способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на III Международном конгрессе по управлению отходами «ВэйсТэк-2003» (Москва, 2003), III Международной научно-технической конференции «Экология и научно – технический прогресс» (Пермь, 2005), III Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), IV Международной научно-технической конференции «Экология и научно – технический прогресс» (Пермь, 2005), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе патент Российской Федерации и две статьи.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 145 страницах текста и включает 32 рисунка и 22 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, содержащего ссылок, из которых 42 на иностранных языках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили углеводородокисляющие штаммы из различных коллекций: Acinetobacter valentis (ВКПМ, В-6727), Acinetobacter calcoaceticus (ВКПМ, В-5064), Yarrowia lipolytica (Звягильская Р. А.), штаммы бактерий, выделенные из различных образцов почв прибрежной зоны Каспийского моря, а также микроводоросли Platymonas viridis, Dunaliella tertiolecta (коллекция МГУ им. М.В. Ломоносова).
Для выделения и культивирования бактериальных культур использовали среды Ридера и Раймонда, для галотолерантных – модифицированные среды Раймонда и Ридера с добавлением 2% NaCl, для культивирования микроводорослей использовали среду Гольдберга, для культивирования дрожжей среду следующего состава, г/л: NH4Cl-15;
KH2PO4-5;
Na2HPO4-10;
MgSO4 x 7H2O-0,5;
NaCl-10;
глюкоза 20;
дрожжевой экстракт-5,0, рН 6,0-6,2.
Идентификацию микроорганизмов проводили по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, используя определители бактерий Берджи, 1997;
Смирнов, 1990. Дифференциацию бактерий по Граму проводили с использованием 3% раствора КОН.
В качестве поллютанта и источника углерода использовали нефть Малгобекского и Краснодарского месторождений.
Количественный учет бактерий проводили чашечным методом Коха путем подсчета выросших на них колоний. Учет дрожжей и микроводорослей проводили, используя камеру Горяева. Для учета иммобилизованных клеток Са альгинатные гранулы предварительно разрушали в фосфатном буфере (Райнина и др., 1986).
Иммобилизацию микроорганизмов проводили в 2% растворе альгиновой кислоты, к которому добавляли суспензию клеток в соотношении 1:1. Для придания положительной плавучести в растворе эмульгировали н-алканы фракции С12-С16. Для проведения процесса иммобилизации использовали инжекционную установку, состоящую из перистальтического насоса, инжектора и ротаметра для измерения расхода воздуха. Методика иммобилизации заключалась в следующем: смесь из колбы пропускали через иглу со скоростью 500 мл/ч;
отрыв образующихся капель полимера осуществлялся под воздействием воздушной струи из компрессора, подаваемой в область инжектирования со скоростью 2·10-3 м3/мин;
капли попадали в 2% раствор хлорида кальция, где происходила сшивка альгината катионами кальция. Полученные гранулы выдерживали в растворе хлорида кальция 30 минут, после чего промывали декантацией водопроводной водой и использовали для последующих экспериментов.
Исследования деструкции нефтяных загрязнений проводили на минеральной синтетической среде с добавлением 1% (по объему) нефти в динамических условиях (110 об./мин.) и 25о С. Длительность экспериментов составляла от 3 до суток.
Лабораторные эксперименты по оценке эффективности способа очистки воды от нефтяных загрязнений заключались в следующем. Для каждого эксперимента готовили 7 стаканов объемом 1000 см3 с содержанием водопроводной (или соленой) воды 500 мл, на водную поверхность которых вносили нефть с концентрацией от 2,6 г/м2 до 10,6 г/м2. Непосредственно на нефтяное пятно вносили препарат, количество которого варьировалось от 0,5 мл до 1,5 мл.
Содержание остаточных нефтепродуктов определяли методом извлечения суммы неполярных и малополярных углеводородов органическим растворителем – четыреххлористым углеродом (СCl4). Интенсивность поглощения каждого раствора определяли на инфракрасном спектрометре «ИКФ-2» ( = 3,42 нм).
Концентрация нефтепродуктов определялась по предварительно составленному калибровочному графику.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Биодеструкция нефти в периодических условиях микроорганизмами, иммобилизованными в Са-альгинатный гель В качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов был выбран Са-альгинатный гель. Характерная черта методики включения микроорганизмов в такой гель – это простота операций по формированию гранул, в том числе задание любого требуемого размера, а также вполне удовлетворительные свойства иммобилизованных биокатализаторов после их получения. Задача заключалась в исследовании возможности применения Са-альгинатного геля в качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов.
Иммобилизацию проводили по оригинальной методике, где предварительно простерилизованный (20 мин., 120 оС) 2% раствор альгиновой кислоты смешивали с культурой микроорганизмов-нефтедеструкторов и культуральной жидкостью в объемном соотношении 1:1. В качестве микроорганизмов нефтедеструкторов были использованы бактериальные штаммы Acinetobacter valentis и Acinetobacter calcoaceticus в поздней экспоненциональной фазе роста, характеризующиеся широким спектром окислительной активности по отношению к углеводородам нефти. Исследование способности иммобилизованных микроорганизмов-нефтедеструкторов ассимилировать нефть проводили при периодическом культивировании их в аэробных условиях, в качестве контроля использовали нативную культуру. Сравнение полученных данных по культивированию в периодических условиях иммобилизованных и свободных клеток Acinetobacter valentis и Acinetobacter calcoaceticus показало, что в случае использования иммобилизованных клеток интенсивность роста и процесс накопления биомассы в культуральной жидкости превышали аналогичные показатели для свободных клеток (табл.1). Результаты по степени биодеструкции нефти, полученные с использованием иммобилизованных клеток, также превосходили результаты для свободных клеток. При этом наиболее активным в отношении деструкции НУГВ был Acinetobacter valentis, у которого степень утилизации нефти иммобилизованными клетками составила 68%, в то время как для Acinetobacter calcoaceticus она была 60%. Acinetobacter valentis был выбран для проведения последующих экспериментов.
Таблица 1. Рост иммобилизованных и нативных клеток микроорганизмов Acinetobacter valentis и Acinetobacter calcoaceticus на средах, содержащих нефть в качестве единственного источника углерода Культура Численность клеток в Содержание нефти, мг/л микроорганизмов Тип клеток среде, кл/мл начальная конечная начальное конечное 2,3x105 2,7x нативные Acinetobacter 8460 6,4x иммобилизованные valentis - 8472 3,14x105 1,8x нативные Acinetobacter 8468 4,5x иммобилизованные calcoaceticus - 8463 Примечание: конц. 1% по объему, периодические условия, 96 ч.
Исходя из полученных результатов, предположили, что клетки нефтедеструкторов после иммобилизации в Са-альгинатный гель:
остаются жизнеспособными и активными в отношении деструкции нефтяных углеводородов, при этом наблюдается усиление степени биодеструкции;
- клетки выходят из гранул и участвуют в процессе биодеструкции нефти в свободном состоянии.
1.1. Разработка методики создания Са-альгинатных гранул, обладающих положительной плавучестью С целью создания новой формы биопрепарата, способного в течение длительного времени удерживаться на поверхности воды, была модифицирована методика получения Са-альгинатных гранул с иммобилизованными микроорганизмами-нефтедеструкторами. Для придания Са-альгинатным гранулам положительной плавучести были рассмотрены различные методы, сущность которых заключалась в уменьшении удельной плотности получаемых гранул. Для этого была снижена концентрация альгината натрия, осуществлено эмульгирование в альгинат материалов, обладающих низкой удельной плотностью, а также наполнение Са-альгинатных гранул газовыми пустотами. В итоге в качестве материала, обладающего низкой удельной плотностью, были выбраны н-алканы фракции С12-С16. В результате проведения серий экспериментов была определена оптимальная концентрация н-алканов, необходимая для придания Са-альгинатным гранулам положительной плавучести, которая составила 10% от общего объема клеточной суспензии и альгината натрия. Включение бактериальных клеток в Са-альгинатный гель проводили в следующем порядке: в 100 мл 2% альгината натрия эмульгировали н-алканы ( мл), после чего полученную эмульсию смешивали со 100 мл суспензии клеток (108-109кл/мл). Полученные гранулы хранили в физиологическом растворе при температуре + 4 оС.
1.2. Деструкция пленочной нефти препаратом на основе иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis Были проведены модельные эксперименты с полученным препаратом по биодеструкции пленочной нефти в лабораторных условиях (2,4 г/м2). Результаты проведенного эксперимента показали целесообразность использования иммобилизованных в Са-альгинатный гель клеток Acinetobacter valentis для ассимиляции пленочной нефти, а также преимущества иммобилизованных форм клеток перед свободными. Степень биодеструкции нефти за 30 дней экспозиции составила для иммобилизованных клеток 92%, для свободных 68% (рис. 1).
2, Концентрация нефти, г/м 1, 0, 0 5 10 15 20 25 30 Время, сутки иммоб. кл свобод. кл Рис. 1. Динамика биодеструкции пленочной нефти препаратом на основе иммобилизованных в Са–альгинатных гранулах клеток Acinetobacter valentis.
2. Исследование параметров, влияющих на свойства препарата 2.1. Размер Са – альгинатных гранул Для исследования влияния размера гранул на активность препарата были поставлены эксперименты для 3 серий гранул (300 мкм, 700 мкм, и 1200 мкм) с включенными микроэмульсиями н-алканов (10% по объему) и клетками Acinetobacter valentis. Масса внесенных гранул была одинакова во всех вариантах и составляла 1 г. Было установлено, что с увеличением размера гранул уменьшается способность биопрепарата к деструкции нефти. Так, при использовании гранул со средним размером 300 мкм за 3 дня культивирования биодеструкции подверглось 52% нефти, в то время как увеличение размеров до 1200 мкм привело к замедлению процесса биодеградации нефти до 17% (рис.2). С увеличением размера гранул уменьшается удельная поверхность гранул, отнесенная к единице объема, что ведет к уменьшению численности клеток, выходящих из Са-альгинатных гранул. Возможно, также имеет место угнетение микроорганизмов, находящихся в более глубоких слоях гранул, вследствие диффузионных ограничений. Согласно полученным результатам, был предложен наиболее оптимальный режим иммобилизации, при котором размер Са альгинатных гранул не превышал 300 мкм. При максимальном расходе воздуха 0,002 м3/мин с использованием иглы диаметром 0,6 мм были получены гранулы размером от 200 мкм до 500 мкм. Количество образующихся гранул в зависимости от их размера, при заданных условиях, описывалось кривой Гаусса и средний размер их составлял 300 мкм. (рис.3).
Количество гранул, % биодеструкции 50 нефти, % Степень 1 2 300 700 200 250 300 350 400 450 Средний размер Са-альгинатных гранул, мкм Размер гранул, мкм Рис. 3. Распределение Са-альгинатных Рис. 2. Зависимость степени гранул по размерам при выбранном биодеструкции нефти от размера режиме иммобилизации.
Са – альгинатных гранул.
2.2. Влияние концентрации иммобилизованных клеток С целью определения оптимальной концентрации клеток в геле, необходимой для эффективного процесса биодеградации углеводородов нефти, был поставлен эксперимент с использованием гранул, содержащих различный титр иммобилизованных клеток (106, 107, 108, 109 кл/мл гранул). На основе результатов расчета остаточной концентрации нефти была рассчитана степень биодеструкции (рис.4).
При использовании препарата с наименьшим титром клеток (106 кл/мл гранул) в течение всего процесса биодеструкции окислению подверглось лишь 50% нефти. С увеличением концентрации иммобилизованных клеток до 107 кл/мл гранул степень биодеструкции углеводородов нефти существенно повысилась и составила к концу экспозиции 75%. При дальнейшем увеличении титра иммобилизованных клеток до 108 и 109 кл/мл гранул величина биодеструкции в обоих вариантах была примерно одинакова и составляла 86% - 88%.
Степень биодеструкции нефти, % а б 80 в г 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, сутки Рис. 4. Степень биодеструкции нефти препаратом на основе иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis в зависимости от начальной концентрации иммобилизованных клеток: а – 109, б – 108, в – 107, г – 106 кл/мл гранул.
Таким образом, для эффективного процесса биодеградации нефти было предложено проводить иммобилизацию концентрированной суспензии клеток для получения препарата с содержанием титра клеток не меньше 108 кл/мл гранул.
Дальнейшее увеличение концентрации клеток в геле было нецелесообразно, так как это не приводило к увеличению степени биодеструкции.
2.3. Влияние биогенных элементов на процессы биодеградации нефти.
Для ускорения процесса утилизации углеводородов нефти была рассмотрена возможность иммобилизации в Са-альгинатные гранулы бактерий в суспензии с добавлением кукурузного экстракта в качестве стимулятора роста. Исследования динамики биодеструкции нефти препаратом, содержащим 5% кукурузного экстракта, проводили по стандартной методике, в качестве контроля использовались гранулы без содержания кукурузного экстракта. В ходе исследования было установлено, что при наличии кукурузного экстракта процесс окисления протекал практически без лаг-фазы, при этом в течение первой недели утилизации подверглось около 50% нефти (с 9,6 г/м2 до 5 г/м2). Но затем скорость процесса снизилась, и остаточная концентрация в контрольных и опытных образцах была практически одинакова.
Для исследования влияния кукурузного экстракта на срок хранения препарата гранулы, содержащие иммобилизованную культуру Acinetobacter valentis и кукурузный экстракт, были заложены на хранение при температуре 4o C.
В процессе хранения препарата, содержащего кукурузный экстракт, наблюдалось его вымывание из гранул. Также было выявлено заражение препарата посторонней микрофлорой по истечении 3 месяцев хранения.
Таким образом, использовать кукурузный экстракт целесообразно в том случае, когда предусматривается незамедлительное применение препарата.
2.4. Биоразложение Са – альгинатных гранул Используемый нами метод иммобилизации предполагает разрушение гранул носителя при наличии в среде определенных концентраций ионов фосфора или натрия, которые, связывая кальций, способны разрушать структуру геля. Также в процессе проведенных исследований было выявлено, что Са-альгинатные гранулы способны разлагаться под действием аборигенной микрофлоры.
Разрушение протекало с изменением структуры гранул: размыванием краев, разрыхлением, изменением плавучих свойств. Учитывая, что по окончании процесса биодеструкции носитель с иммобилизованными клетками представляет собой дополнительный источник загрязнения, данное свойство является несомненным достоинством препарата.
2.5. Хранение препарата Полученный препарат с иммобилизованными микроорганизмами Acinetobacter valentis и эмульгированными н-алканами был заложен на хранение в физиологическом растворе (100 мл физраствора на 100 мл препарата) при температуре +4 oC. Каждый месяц в течение полугода определяли степень биодеструкции пленочной нефти препаратом, а также численность клеток в Са альгинатных гранулах. Опыты ставились параллельно в трех повторностях.
В результате проведенных исследований по определению удельной активности препарата установлено, что в процессе хранения в первые 2 месяца степень биодеструкции препарата снизилась лишь на 3%, при этом титр иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis существенно не изменился (табл.2).
Таблица 2. Определение активности препарата и титра иммобилизованных клеток в процессе хранения.
Концентрация нефти в Срок Численность Степень пленке, г/м хранения клеток в 1 мл биодеструкции препарата препарата нефти, % исходная конечная 8,7x10 1 сутки 9,6 1,15 7,25x10 1 месяц 9,64 1,15-1,25 87- 5,64x10 2 месяца 9,55 1,43 2,82x10 3 месяца 9,63 1,73-1,92 80- 4 месяца 2,16x10 9,58 2,1-2,39 75- 6 месяцев 6,38x10 9,62 2,89 В дальнейшем наблюдалось постепенное снижение численности иммобилизованных клеток, и после 6 месяцев хранения их численность уменьшилась более чем в сто раз. Что касается величины биодеструкции нефти препаратом, то после 4 месяцев она составляла 75-78%, а после полугода хранения 70%, что на 18% меньше первоначальной величины.
Таким образом, разработанный биопрепарат, содержащий бактерии нефтедеструкторы, иммобилизованные путем включения в гранулы Са-альгинатного геля и эмульгированные н-алканы, способен стабильно сохранять свою деструктивную активность при длительном хранении в жидкой среде, что создает более широкие возможности его использования при ремедиации загрязненных объектов.
3. Применение препарата Для разработки технологии удаления пленочных НУГВ в воде были проведены исследования в лабораторных условиях для определения следующих параметров:
– оптимального количества препарата на единицу поверхности;
– действия препарата на нефтяных пленках разной толщины.
3.1. Влияние количества вносимого препарата на процесс биодеструкции Количество иммобилизованных клеток, вносимых на единицу загрязненной нефтью поверхности, является очень важным параметром, определяющим экономическую эффективность препарата. Для исследования влияния количества биопрепарата на скорость биодеструкции нефти были поставлены эксперименты, в которых оно варьировалось от 0,5 до 1,5 мл. При этом отношение площади, занимаемой иммобилизованными клетками, к площади нефтяного загрязнения составляло от 1:2 до 1:6. Анализ полученных данных (рис.5) показал, что изменение концентрации нефти в ходе процесса биодеструкции для всех вариантов было практически одинаково. Использование большего количества препарата с иммобилизованными клетками лишь незначительно сокращало остаточную концентрацию углеводородов к концу экспозиции. Учитывая, что увеличение количества вносимого препарата не приводило к возрастанию величины биодеструкции пленочных НУГВ, как наиболее оптимальный, был предложен расход препарата 0,5 мл (50 мл на м2 водной поверхности).
3.2. Влияние толщины нефтяной пленки на динамику биодеструкции.
Была поставлена серия экспериментов по исследованию влияния концентрации нефти, находящейся на единице поверхности, на её биодеструкцию под воздействием иммобилизованных клеток. В процессе биодеструкции нефти иммобилизованными клетками Acinetobacter valentis (рис.6) в первые 5 суток скорость ассимиляции нефти во всех вариантах была довольно низкая. С 5 по сутки процесс окисления протекал интенсивно, и за этот период утилизировалось до 65% нефти при концентрации внесенной нефти 10,6 г/м2, для остальных вариантов степень утилизации достигла 75-80%. Далее процесс протекал с меньшей скоростью, и на 30 сутки степень биодеструкции для вариантов с содержанием нефти 2,6 г/м2 и 5,4 г/м2 составила 87-92% соответственно и 80% для концентрации нефти 10,6 г/м2. Как показали результаты подсчета остаточной концентрации нефти на конец экспозиции, увеличение первоначального объема внесенной нефти приводило к возрастанию остаточной нефти, хотя объем нефти, подвергшейся биодеструкции, при этом возрастал.
Таким образом, разработанный нами метод иммобилизации позволяет использовать иммобилизованные микроорганизмы Acinetobacter valentis в процессах биоремедиации воды с содержанием нефтепродуктов до 10 г/м2, превышающей допустимое содержание нефти в тонкой нефтяной пленке в 4 раза.
12 Концентрация нефти, г/м Концентрация нефти, г/м 2 в б а 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Время, сутки Время, сутки 0,5 мл 1 мл 1,5 мл Рис. 5. Динамика биодеструкции пленочной Рис. 6. Кинетика биодеструкции нефти нефти при внесении различного количества препаратом на основе иммобилизованных препарата. клеток Acinetobacter valentis при содержании нефти в пленке:
а – 2,6 г/м2;
б – 5,4 г/м2;
в – 10,6 г/м2.
3.3. Механизм биодеструкции В результате проведения экспериментов по исследованию выхода клеток из гранул, а также изучения накопления клеток на определенной глубине моделированного водоема был предложен механизм биодеструкции пленочной нефти разработанной препаративной формой, согласно которому процесс ассимиляции нефти протекает, в основном, с участием свободных клеток, вышедших из Са – альгинатных гранул. Иммобилизованные микроорганизмы, внесенные в объем воды, имеют различные профили распределения клеток по глубине и по времени (рис.7), причем профиль изменения обусловлен одновременно несколькими параметрами, среди которых наибольшее значение имеют: выход клеток из гранул, рост в свободном состоянии и оседание клеток в глубь водоема. Высокая концентрация клеток непосредственно в зоне окисления нефти свидетельствует о том, что выход клеток из иммобилизованного состояния и рост клеток преобладают над скоростью их погружения, что обеспечивает наиболее эффективное удаление нефтяных загрязнений.
lg концентрации свободных клеток 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Глубина, см 2 5 3 Рис. 7. Распределение клеток Acinetobacter valentis по глубине:
1 – на 5 сутки;
2 – на 10 сутки;
3 – на 15 сутки;
4 – на 20 сутки;
5 – на 30 сутки 3.4. Исследование динамики биодеструкции различных нефтей Исследования проводилось для трех видов нефтей, различающихся по вязкости и содержанию серы. Во всех вариантах наблюдалось снижение содержания НУГВ на поверхности воды (табл.3). Было также установлено, что с увеличением вязкости и содержания сернистых соединений возрастает остаточное содержание нефтепродуктов в воде. Полученные данные открывают возможность использования препарата на основе иммобилизованных клеток для биоремедиации водных объектов при загрязнении различными типами нефтей.
Таблица 3. Физико – химические характеристики использованных нефтей Вязкость, Содержание Степень Месторождение Содержание общей серы, Плотность, биодест- нефтепродуктов, г/м мм2/с нефти № /№ г/см3 рукции, % при при начальное конечное % 20°С 50°С Малгобек Вознесенская 1 (Республика 186,53 40,92 0,28 0,928 79 10,68 2, Ингушетия) Скважина 550- Малгобек Вознесенская 2 (Республика 3,27 2 0,13 0,846 88,5 9,8 1, Ингушетия) Скважина Троицко Анастиевская 3 4,45 2,57 0,15 0,809 86 9,54 1, (Краснодар. кр.) 3.5. Натурные испытания С целью определения эффективности действия препарата в условиях, приближенных к естественным, были проведены натурные испытания разработанного биопрепарата. Работы проводились на территории промышленной площадки ООО «ЭКОсервис – НЕФТЕГАЗ» г. Жуковский, с 08 августа 2002 г. по 3 сентября 2002 г. Проведенные испытания подтвердили эффективность действия препарата при содержании НУГВ в пленочной нефти до 10 г/м2. Остаточное количество нефтепродуктов к концу испытаний (25 день) составило 5,4% от исходного количества.
4. Разработка препарата для биоремедиации морской воды 4.1. Выделение и отбор галотолерантных штаммов микроорганизмов Методом накопительных культур из различных образцов почв прибрежной зоны Каспийского моря на минеральной среде Раймонда с нефтью и 2% NaCl были выделены наиболее активные штаммы микроорганизмов. Из общего числа выделенных штаммов для дальнейших исследований были оставлены два, которые проявили наибольшую нефтеокисляющую активность (табл.4):
- культура с желтой пигментацией: колонии гладкие, маслянистые, профиль слабовыпуклый, края ровные;
размер колоний 2-3 мм. Клетки сферические, диаметром 0,5-2 мкм, попарно-соединенные или в виде скоплений неправильной формы, но не в цепочках. Грамположительные, неспорообразующие. Облигатные аэробы, каталазоположительные, галотолерантные, растут при 5% NaCl. По предварительной оценке отнесены к роду Micrococcus.
- культура с белой пигментацией: колонии гладкие, маслянистые, профиль слабовыпуклый. Размер колоний, полученных при рассеве на твердые питательные среды, составлял 1-2 мм. Клетки палочковидные, подвижные, размер клеток 0,3-0,5 x 1,2-2,0 мкм. Грамотрицательные, неспорообразующие.
Оптимальная температура роста составляет 25оС. Идентифицирован как Pseudomonas sp.
Таблица 4. Рост галотолерантных микроорганизмов при культивировании на нефти в качестве единственного источника Степень биодеструкции Культура Биомасса, г нефти, % 3,52 Yarrowia lipolytica 2,85 Pseudomonas sp.
3,00 55, Micrococcus sp.
Примечание: конц. 1% по объему, периодические условия, 96 ч.
Также в работе была использована культура дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставленная Звягильской Р.А. Данная культура способна развиваться в соленых средах и характеризуется достаточно высокой окислительной способностью по отношению к углеводородам нефти.
Культивирование данных штаммов микроорганизмов на искусственной морской воде, (концентрация солей 20 г/л), содержащей нефть в качестве единственного источника углерода показало, что наибольшей окислительной способностью по отношению к углеводородам нефти обладает штамм Micrococcus sp. (55,2%) (табл.4), наименьший результат был получен при культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica (42%). Следует также отметить, что при культивировании бактериальные штаммы Pseudomonas sp. и Micrococcus sp.
выделяли в среду ПАВ, что способствовало ускорению процесса деструкции нефти.
4.2. Биодеструкция пленочной нефти в морской воде иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов Для исследования процессов деградации пленочных нефтяных загрязнений в морской воде была проведена иммобилизация различных ассоциаций, составленных на основе данных культур. Для получения сравнительных данных проводилась серия контрольных опытов с использованием иммобилизованных монокультур. Результаты анализа остаточной концентрации нефти показали, что все исследованные культуры, а также их ассоциации в иммобилизованном состоянии проявили достаточно высокую активность в отношении деструкции углеводородов нефти в морской воде. Степень биодеструкции нефти с использованием отдельных культур Pseudomonas sp. и Micrococcus sp. составила в этих опытах, в среднем, 59,6% и 64,5% соответственно. Под действием иммобилизованной ассоциации, созданной на основе данных штаммов, деструкции подверглось 73% нефти, что на 8,5% превышало результат, полученный для культуры Micrococcus sp. (рис.8).
Следует отметить, что для культуры дрожжей Yarrowia lipolytica получен худший результат: за весь период экспозиции деструкции подверглось лишь 45,8% нефти (рис 9). Так как в процессах биодеструкции нефти участвуют в основном свободные клетки, то данный результат объясняется низким выходом клеток дрожжей из Са-альгинатных гранул. Этот выход ограничен геометрическим размером клеток. В целом, наличие клеток дрожжей в ассоциациях способствует увеличению степени биодеградации нефти, при этом, максимальный результат получен при использовании ассоциации, состоящей из трех культур (рис.9).
Таким образом, для биодеструкции пленочной нефти в морской воде было рекомендовано использовать препарат, созданный на основе иммобилизованных штаммов Pseudomonas sp. Micrococcus sp. и Yarrowia lipolytica.
Ошибка! Ошибка связи.Рис. 8. Биодеструкция нефти в морской воде иммобилизованными в Концент орация неф т и, г/м Са – альгинатный гель микроорганизмами: 1 – Pseudomonas sp.;
2 – Micrococcus sp.;
3 – Pseudomonas sp. + Micrococcus sp.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, сутки Рис. 9. Биодеструкция нефти в морской воде иммобилизованными в Са-альгинатный гель микроорганизмами: 1 – Yarrowia lipolytica;
2 – Yarrowia lipolytica + Pseudomonas sp.;
3 – Yarrowia lipolytica + Micrococcus sp.;
4 – Yarrowia lipolytica + Pseudomonas sp. + Micrococcus sp.
5. Микроводоросли Процесс биодеструкции нефтей в тонких плёнках под воздействием иммобилизованных клеток - это процесс, на который влияет большое количество факторов, среди которых особо надо выделить диффузию кислорода в зону реакции. Особенно актуальна эта проблема в первое время после внесения препарата, когда нефтяная пленка максимальна по толщине и диффузия кислорода ограничена. Целью проведения экспериментов была попытка создания препарата, содержащего в своём составе кроме клеток нефтедеструкторов клетки микроводорослей для обогащения приповерхностного слоя кислородом и ассимиляции углекислого газа, образующегося при биологическом разрушении нефти.
5.1. Культивирование микроводорослей при наличии нефтяной пленки.
Культивирование проводили в колбах на 100 мл с объемом среды 50 мл, без перемешивания в режиме свет-темнота в течение 60 дней. Исследования проводились для трех концентраций нефти (0,5%, 1% и 2%), рассчитанная высота нефтяного слоя для которых составила 0,179 мм, 0,358 мм, 0,715 мм, соответственно.
Проведенные модельные эксперименты по изучению воздействия нефти на динамику роста микроводорослей Platymonas viridis и Dunaliella tertiolecta показали, что присутствие нефтяной пленки снижало скорость роста клеток по сравнению с контролем в среднем на 30-60%, в зависимости от концентрации нефти. Увеличение содержания нефти в экспериментальной среде приводило к уменьшению концентрации клеток во всех вариантах, хотя четкой линейной зависимости при этом не наблюдалось (рис.10,11).
Проведенный контроль физиологического состояния клеток микроводорослей по нескольким параметрам (форма, размер, окраска, движение) показал, что с увеличением содержания нефти интенсивность движения заметно снижалась, менялся тип движения клеток с поступательного на поступательно вращательный. В вариантах с максимальным содержанием нефти клетки приобретали темно-зеленый цвет, а форма клеток была, в основном, круглая. Для дальнейших экспериментов была выбрана культура Platymonas viridis, как наиболее устойчивая к токсическому действию нефтепродуктов.
7, Lg количества клеток 6, 5, 10 сутки 20 сутки 30 сутки 40 сутки 50 сутки 60 сутки контроль, 0,5% нефти, 1% нефти, 2% нефти Рис.10. Динамика роста численности клеток микроводорослей Platymonas viridis.
7, Lg количества клеток 6, 5, 10 сутки 20 сутки 30 сутки 40 сутки 50 сутки 60 сутки контроль, 0,5% нефти, 1% нефти, 2% нефти Рис.11. Динамика роста численности клеток микроводорослей Dunaliella tertiolecta.
5.2. Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов и микроводорослей Разработанным нами методом были протестированы в морской воде, иммобилизованные в Са-альгинатный гель альго-бактериальные ассоциации.
Исследования проводились для трех ассоциаций: Pseudomonas sp. + Platymonas viridis;
Micrococcus sp. + Platymonas viridis;
Pseudomonas sp. + Micrococcus sp. + Platymonas viridis. Во всех исследованных вариантах присутствие микроводорослей ускоряло процесс биохимического окисления нефти.
Наибольший эффект наблюдался с участием всех трех культур: степень биодеструкции в этом случае составляла 86%, что на 12,5% больше, чем результат, полученный при использовании той же ассоциации, но без микроводорослей (рис.12). Количество нефтепродуктов на единицу поверхности под воздействием иммобилизованной ассоциации Micrococcus sp. + Platymonas viridis снизилось на 73% (с 10,8 г/м2 до 2,88 г/м2), для ассоциации Pseudomonas sp.
+ Platymonas viridis эта величина составила 64 % (с 10,68 г/м2 до 3,6 г/м2).
Количество нефтепродуктов, г/м 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, сутки Рис.12. Биодеструкция пленочной нефти иммобилизованной ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов и микроводорослей:
1- Pseudomonas sp. + Platymonas viridis;
2 - Micrococcus sp. + Platymonas viridis;
3 - Pseudomonas sp. + Micrococcus sp. + Platymonas viridis Таким образом, в результате исследований динамики трансформации нефтепродуктов в морской воде в лабораторных условиях установлено, что использование альго-бактериальных ассоциаций, иммобилизованных в Са альгинатный гель, позволяет интенсифировать процесс биоремедиации.
Выводы 1. Показано, что иммобилизация клеток микроорганизмов-нефтедеструкторов в Са-альгинатном геле позволяет увеличить их потенциал в отношении деструкции НУГВ. Установлено, что включение в Са-альгинатные гранулы н-алканов (до 10%) способствует плавучести препарата и его локализации в приповерхностном слое воды.
2. Показано, что метод получения новой препаративной формы на основе гранул с положительной плавучестью можно использовать для иммобилизации бактерий, дрожжей, микроводорослей и их ассоциаций.
3. Изучена кинетика ассимиляции нефти из поверхностных пленок разной толщины (от 2,6 г/м2 до 10,6 г/м2) иммобилизованными микроорганизмами нефтедеструкторами и показано преимущество применения данной препаративной формы перед аналогичными, содержащими свободные клетки.
Определена доза препарата, необходимая для проведения эффективного процесса биоремедиации, составляющая 50 мл/м2.
4. Определены параметры, влияющие на свойства биопрепарата: условия хранения, положительная плавучесть, выход иммобилизованных клеток в свободное состояние, разрушение гранул.
5. Изучена иммобилизация микроводорослей по разработанной методике, а также коиммобилизация микроводорослей с микроорганизмами нефтедеструкторами. Показано положительное влияние совместной иммобилизации на процессы биодеструкции водных поверхностей.
6. Проведены испытания новой препаративной формы в реальных условиях с содержанием нефти на водной поверхности до 15 г/м2.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАТЦИИ 1. Пат. 2003101274 A RU, C 02 F 3/34. Способ очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами и способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнений нефтепродуктами /Аушева Х.А., Марквичев Н,С., Нехаев С. А., Краюхин А.В., Нехаева И.В. Заявлено 17.01.2003;
опубл. 27.12.2004.
2. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Марквичев Н.С. Влияние толщины нефтяной пленки на динамику ее биодеструкции под действием биопрепарата на основе иммобилизованных клеток Acinetobacter valentis // Химическая промышленность сегодня. – 2007. – № 4. – С. 41-43.
3. Аушева Х.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С.
Использование микроводорослей Platymonas viridis для интенсификации процесса биодеструкции нефти // Успехи в химии и химической технологии. – 2005. – Т.
XIX, № 5. – С. 63-67.
4. Аушева Х.А., Султыгова З.Х., Бабусенко Е.С., Куклева Н.С., Марквичев Н.С.
Препараты - нефтедеструкторы на основе иммобилизованных клеток // Материалы III Международного конгресса по управлению отходами «ВэйсТэк-2003». – Москва, 2003. – С. 163.
5. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С. Исследования влияния концентрации иммобилизованных клеток Acinetobacter sp. на скорость биодеструкции нефтяных пленок // Материалы III Межд. конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития». – Москва, 2005. – С. 33.
6. Аушева Х.А., Марквичев Н.С. Изучение процессов биодеструкции нефти иммобилизованными дрожжами Yarrowia lipolytica // Материалы III Межд. научно – практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно – технический прогресс». – Пермь, 2005. – С. 99-100.
7. Аушева Х.А., Марквичев Н.С. Ассимиляция пленочной нефти иммобилизованными клетками Acinetobacter calcoaceticus // Материалы IV Межд.
научно – практич. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно – технический прогресс». – Пермь, 2005. – С. 82-86.
8. Аушева Х.А., Гончарук Д.А., Бабусенко Е.С., Султыгова З.Х., Марквичев Н.С. Нефтебиодеструкция на водных поверхностях с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов // Материалы Межд. конф.
«Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». – Саратов, 2005. – С.