Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах
На правах рукописи
Холстов Александр Викторович РАЗРАБОТКА БИОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ВИДЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИКАНТОВ В ПРОТОЧНЫХ ВОДНЫХ СИСТЕМАХ 03.01.02 - биофизика 03.01.06 – биотехнология (в том числе, бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануля Российской академии наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна,
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович, Заведующий кафедрой биофизики Физического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор Яненко Александр Степанович, заместитель директора ГНЦ РФ ФГУП "ГосНИИгенетика"
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н. Н. Семенова Российской академии наук
Защита состоится «30» января 2013 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 по химическим и биологическим наукам при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н. Н. Семенова Российской академии наук
Автореферат разослан » декабря 2012 года «
Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039.01, к.х.н. Мазалецкая Л. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Развитие промышленного производства усиливает воздействие на окружающую среду, и это, в первую очередь, отражается на состоянии водоемов и почв. Одновременно с интенсификацией того или иного производства увеличиваются и объёмы жидких промышленных и бытовых отходов. Хорошо известно экотоксичное воздействие хлор- и фосфорорганических пестицидов, нефтепродуктов, производных тяжелых металлов на природные биологические объекты. Разработка эффективных методов анализа состояния объектов окружающей среды, включая проведение постоянного мониторинга качества воды и состояния почв, становится особенно актуальной.
Получение информации о наличии экотоксикантов в режиме реального времени прежде всего в воде позволяет своевременно выявлять загрязнения и принимать меры по их ликвидации. В этой связи разработка подходов к созданию технологий экспресс-определения токсичности водных образцов в проточных аналитических системах является особенно актуальной. Также важной является возможность проведения экомониторинга состояния почв без проведения сложной пробоподготовки.
В настоящее время для проведения анализа состава природных сред на наличие экотоксикантов используются разнообразные физико химические и биологические методы. Первая группа методов дает оценку концентрации загрязнителей с высокой точностью и чувствительностью, однако вследствие проведения многоэтапной пробоподготовки и применения специального оборудования получение информации о наличии токсичных веществ в режиме реального времени с помощью данных методов является проблематичным. Устранение указанных недостатков представляется возможным при использовании биологических методов индикации экотоксикантов, основанных на применении биоиндикаторов (БИ) – живых организмов, способных давать специфический ответ на присутствие в среде экотоксикантов. Значительным преимуществом БИ является их способность реагировать на широкий спектр экотоксикантов различных классов, в то время, как физико-химические методы анализа узкоспецифичны, и при наличии сложной анализируемой матрицы требуется применение более чем одной методики анализа.
Среди широкого спектра БИ эффективными для использования признаны клетки микроорганизмов – микроводорослей и фотобактерий. В основе функционирования данных БИ лежат изменения параметров флуоресценции хлорофилла (для клеток микроводорослей) или параметров биолюминесценции бактериальной люциферазной системы (для клеток фотобактерий) в результате воздействия экотоксикантов на клетки микроорганизмов.
Стабилизация характеристик клеток микроорганизмов при их применении в аналитических целях с обеспечением их удержания и эффективным функционированием в течение длительного времени в проточных системах достигается иммобилизацией клеток БИ с использованием разнообразных носителей.
Вместе с тем, пока нет четких критериев выбора характеристик и состава носителя для иммобилизации биоиндикаторов, метода и условий иммобилизации клеток, включая подготовку клеток к иммобилизации – накопление биомассы, подлежащей иммобилизации, в которой максимально сохранена целостность и метаболическая активность клеток.
Разработка новых биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных клеток микроводорослей или фотобактерий, подбор носителей для иммобилизации с целью достижения высокой эффективности функционирования клеток микроорганизмов, особенно в проточной среде, являются актуальными как для биотехнологии получения таких БЭ, так и для экологической биофизики, устанавливающей общие закономерности влияния физико-химических условий проведения анализа на аналитические и кинетические характеристики иммобилизованных клеток при определении экотоксикантов. Кроме того, разработка новых БЭ необходима для того, чтобы заполнить ниши фундаментальных знаний о свойствах иммобилизованных клеток, а также получить представление о возможности оптимизации условий получения такого рода систем, позволяющих повысить их чувствительность (порог определения) по отношению к соответствующим загрязнителям.
Основной целью данной работы являлась разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроводорослей (МВ) и фотобактерий, позволяющих определять в проточных системах присутствие экотоксикантов в концентрациях ниже предельно допустимых (ПДК), и исследование операционных характеристик БЭ при их использовании в различных условиях.
В работе решались следующие основные задачи:
разработка биотехнологических подходов к получению БЭ в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС) клеток микроорганизмов на основе клеток микроводорослей Chlorella species, Thalassiosira weissflogii, а также фотобактерий Photobacterium phosphoreum;
исследование биофизических параметров и операционных характеристик БЭ в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов и стабильность аналитического сигнала (интенсивность иммобилизованных клеток при хранения и мониторинге экотоксикантов;
температурные диапазоны применения иммобилизованных клеток);
оценка кинетических параметров взаимодействия клеток микроорганизмов с экотоксикантами и нижних пределов обнаружения экотоксикантов, обоснование возможности повышения чувствительности БЭ для детекции соответствующих загрязнителей.
Научная новизна работы.
На основе применения методов кибернетики предложено для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. Получено кинетическое уравнение изменения концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке в ходе биохимической реакции с экотоксикантом.
Впервые установлено удельное количество активных молей различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клетки фотобактерий. Показано, что повышение чувствительности клеток фотобактерий к экотоксикантам достигается уменьшением удельного количества активных молей экотоксикантов.
В биофизических исследованиях клеток фотобактерий родов Photobacterium и Vibrio, иммобилизованных в криогель ПВС впервые обнаружено явление смещения в сторону более коротких длин волн пика интенсивности биолюминесценции клеток фотобактерий.
Установлено, что иммобилизация малых концентраций (до 10%) клеток микроводорослей Chlorella sp. и T. weissflogii в криогель ПВС путем включения клеток в матрицы носителя при ее формировании в условиях отрицательных температур приводит к повреждению фотосинтетического аппарата (ФСА) клеток микроводорослей.
Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя, позволяющий избежать повреждения ФСА клеток микроводорослей, наблюдаемого при формировании матрицы носителя в условиях отрицательных температур.
Практическая значимость работы.
Впервые для достижения наилучших условий формирования БЭ обоснованы биотехнологические параметры получения БЭ на основе клеток фотобактерий и микроводорослей, иммобилизованных в криогель ПВС, для определения присутствия экотоксикантов в природных средах.
Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей, введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя криогель ПВС, под действием центробежных сил при – центрифугировании.
Предложены конкретные составы БЭ на основе клеток микроорганизмов (микроводорослей Chlorella sp. и T. weissflogii и фотобактерий P. phosphoreum) для определения в природных средах присутствия экотоксикантов в концентрациях ниже ПДК.
Обоснованы оптимальные условия хранения БЭ, позволяющие стабилизировать высокий уровень аналитического сигнала иммобилизованных клеток:
- хранение БЭ на основе клеток фотобактерий свыше 50 недель при температуре -80С не приводит к значительной потере аналитических характеристик;
- хранение БЭ на основе клеток микроводорослей свыше 30 суток в оптимизированных условиях освещения (интенсивность и соотношения длительности фаз «свет : темнота») не приводит к значительному снижению величины аналитического сигнала.
Обоснованы оптимальные условия функционирования разработанных БЭ при определении присутствия экотоксикантов (температурные режимы, скорости протока среды, для клеток микроводорослей – режимы внешнего освещения).
Личный вклад автора. В ходе исследования автором лично производилось планирование экспериментов, статистическая обработка экспериментальных данных, оформление результатов работы, а также подготовка научных публикаций по результатам работы и участие с докладами на научных конференциях.
Автором самостоятельно разработан подход к моделированию биохимической реакции взаимодействия иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке и предложена математическая модель, описывающая данный процесс в условиях проточной водной среды.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийских и Международных конференциях: II и III Международных конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия, 2008, 2009);
VIII, XIX, X, XI ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 2008, 2009, 2010, 2011);
Итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – годы», (Москва, Россия, 2008, 2009);
Международных конференциях «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, Украина, Международной конференции «Biocatalysis-2009:
2009, 2011);
Fundamentals & applications» (Архангельск, Россия, 2009);
Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, Россия, 2009);
Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, Россия, 2010);
14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2010);
Международной научно практической конференции «Юность за экологический прогресс» (Баку, Азербайджан, 2010);
III-й Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, Россия, 2011).
Положения, выносимые на защиту.
1. Биочувствительные элементы в виде иммобилизованных клеток фотобактерий или МВ для определения различных классов экотоксикантов в водных проточных средах. Способы получения и составы БЭ.
2. Кинетические и операционные характеристики взаимодействия БЭ с экотоксикантами.
3. Математическая модель, описывающая биохимическую реакцию иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке в условиях проточной водной среды.
Публикации. По материалам диссертации представлено публикаций, из них: 2 статьи в международных журналах, входящих в списки цитирования ВАК, 2 Патента РФ на изобретение, 16 тезисов докладов в материалах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и конгрессов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 177 ссылок. Работа изложена на 153 страницах, содержит 41 рисунок и 39 таблиц.
Автор выражает благодарность соавторам совместных публикаций, директору ИБХФ РАН им. Н. М. Эмануэля Варфоломееву С. Д., научному руководителю Ефременко Е. Н. и отдельно профессорам Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова Исмаилову А. Д. (Кафедра микробиологии), Рубину А. Б. и Погосяну С. И. (Кафедра биофизики) за содействие в разработке БЭ на основе клеток фотобактерий и микроводорослей, соответственно.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экспериментальная часть Объекты исследования. Для создания БЭ присутствия экотоксикантов в природных средах в работе использовались штаммы пресноводных микроводорослей и морских Chlorella species микроводорослей Thalassiosira weissflogii, а также штаммы фотобактерий Photobacterium phosphoreum и Vibrio harveyi, полученные из Коллекции микроорганизмов МГУ (Россия) и American Type Culture Collection (США).
Методы исследования. Культивирование свободных клеток микроорганизмов проводилось в качалочных колбах объемом 750 мл при температуре 12°С для клеток фотобактерий и 21°С для микроводорослей в жидкой питательной среде. Для клеток микроводорослей T. weissflogii использовалась питательная среда f/2 medium, для клеток Chlorella sp. – питательная среда Прата, для клеток фотобактерий – питательная среда Фаргали с добавлением дрожжевого экстракта и пептона. Культуры клеток микроводорослей выращивались в условиях искусственного освещения.
Накопление биомассы определялось по изменению оптической плотности суспензии клеток. Жизнеспособность иммобилизованных клеток контролировалась по концентрации внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом с использованием реагента фирмы Люмтек (Россия) и люминометра Microluminometr 3560 (New Horizons Diagnostics Co, США).
Раствор ПВС (марка 16/1, SinopecCorp., Китай) в заданной концентрации (7 – 15%) готовился путем смешения навески полимера с питательной средой, соответствующей определенной культуре микроорганизмов, стерилизовался (0,5 ати., 108°С, 30 мин), затем охлаждался до комнатной температуры. Нужное количество биомассы клеток смешивалось с раствором ПВС до получения однородной массы.
Полученной смесью при помощи стерильного шприца заполнялись ячейки 96-луночных планшетов, которые выдерживались в морозильных камерах при различных температурах (-80°С -10°С) для формирования гранул криогеля ПВС. После выдерживания БЭ в морозильной камере в течение 12-24 ч его помещали в холодильник для размораживания при 4 – 8°С. Через 12-20 ч (для каждой индивидуальной культуры) получался полностью сформированный образец иммобилизованных в криогель ПВС клеток.
Все полученные образцы БЭ хранились в минимальной питательной среде, соответствующей микроорганизмам, использованным для получения БЭ.
Биолюминесценция свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий анализировалась на люминометре 1250 LKB-Wallac (Швеция) с оценкой относительной интенсивности биолюминесценции (в процентах от величины исходного сигнала) и спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse (США). Биолюминесцентная активность клеток определялась в 1 мл 2% NaCl или непрерывном потоке того же раствора через ячейку прибора после 1–2 мин термостатирования.
Для определения флуоресцентных характеристик хлорофилла ФСА клеток МВ полученные гранулы с иммобилизованными клетками МВ помещались в виалу и заливались соответствующей питательной средой до объема 3 мл. В виалах проводились измерения значения Fv / Fm. Для измерения флуоресценции хлорофилла использовался прибор (типа флуориметра PAM-2000, Германия), разработанный на Кафедре биофизики Биологического факультета МГУ. Нормальными значениями относительной переменной флуоресценции Fv / Fm для клеток Chlorella sp.
и T. weissflogii являлись 0,70-0,75 и 0,60±0,65 ед. соответственно.
Для дискретного анализа водного раствора экотоксиканта одна гранула с иммобилизованными клетками микроорганизмов помещалась в кювету прибора и к грануле добавлялось 900 мкл среды (2% NaCl для морских микроорганизмов и 0,5% NaCl для пресноводных). После 1- минут термостатирования перед проведением анализа экотоксиканта снимались показания аналитического сигнала (I0). Затем в среду вносилась анализируемая проба в объеме 100 мкл. После экспонирования пробы в течение 30 минут снова регистрировалась величина аналитического сигнала (I). На основе полученных данных для клеток фотобактерий рассчитывалась относительная остаточная интенсивность биолюминесценции:
Iост (%) =I/I0·100% Для непрерывного мониторинга экотоксикантов аналитическая ячейка приборов заменялась специально сконструированной камерой с проточной кюветой. Аппаратурное обеспечение включало также систему протока среды (термостат, перистальтический насос). Скорость протока среды: 0,5 – 6,0 мл/мин, объем реактора— 1,5 мл.
В качестве модельного образца почвы использовалась смесь, состоящая из стерильного чернозема и песка в массовом соотношении 1:1.
Для создания образца загрязненной почвы к почве добавляли раствор экотоксиканта известной концентрации из расчета 1 мл раствора на 1 г почвы и оставляли полученную смесь до полного высыхания почвы.
Концентрация экотоксиканта рассчитывалась с учетом изменения массы почвы при высушивании. Экстракция экотоксиканта из почвы проводилась в растворе 2% NaCl + 3% этилового спирта из расчета 15 мл экстрагента на 1,0 г почвы при температуре 22±1°C в течение 30 минут на шейкере инкубаторе при скорости 120 об/мин.
При обработке всех экспериментальных данных рассчитывалось среднее значение и значение стандартного отклонения не менее чем для трех измерений.
Результаты и обсуждение Разработка и исследование операционных свойств образцов 1.
биочувствительных элементов в виде клеток микроводорослей, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта В ходе разработки БЭ на основе клеток МВ было установлено, что в результате иммобилизации клеток МВ в криогель ПВС через процедуру «замораживания-оттаивания» суспензии клеток в растворе ПВС происходят необратимые повреждения ФСА клеток микроводорослей, что выражается в снижении величины относительной переменной флуоресценции Fv / Fm в 3,7 раза и более относительно величины, характерной для исходной суспензии клеток МВ.
В связи с этим, введение клеток микроводорослей в криогель ПВС осуществлялось разработанным оригинальным способом, который заключается в нанесении клеточной суспензии на поверхность сформированного носителя (криогеля ПВС) с последующим принудительным введением клеток в макропоры полимерного носителя в центрифуге под действием центробежных сил (5000-14000g) в течение 1- мин. Использование данного способа позволило оптимизировать процесс приготовления высокоэффективного БЭ в виде иммобилизованных клеток МВ (таблица 1).
Установлено, что максимальное значение параметра Fv/Fm – аналитического сигнала клеток МВ, достигается при получении БЭ на основе иммобилизованных клеток микроводорослей с применением 11% криогеля ПВС – для иммобилизации клеток пресноводных зеленых микроводорослей Chlorella sp. и 9% криогеля ПВС – для иммобилизации клеток морских диатомовых микроводорослей T. weissflogii. Вводимые концентрации биомассы клеток МВ составляют 1% для клеток Chlorella sp. и 0,03% для клеток T. weissflogii, соответственно.
Таблица 1 – Характеристики образцов БЭ, полученных при иммобилизации клеток микроводорослей Chlorella sp. и T. weissflogii методом принудительного введения клеток в поры криогеля ПВС, содержащие разные концентрации полимера.
Концентрация ПВС, % Fv/Fm [АТФ], моль/г образца БЭ F Chlorella sp.
(8±0,4)10- 7 0,86 0, (13±5,0)10- 9 1,12 0, (20±4,0)10- 11 1,85 0, (15±0,7)10- 13 1,32 0, T. weissflogii (9,8±0,6)10- 7 1,16 0, (14±3)10- 9 1,78 0, (8,2±0,7)10- 11 1,02 0, (6,5±0,4)10- 13 0,72 0, При исследовании зависимости величины относительной переменной флуоресценции (Fv/Fm) от режима освещения клеток МВ установлено (рисунок 1), что допустимыми режимами освещения для сохранения исходного уровня флуоресценции иммобилизованных клеток обоих видов МВ в составе БЭ являются циклы “свет : темнота” с соотношением длительности фаз от 4 : 20 до 16 : 8 часов.
Соотношение T. weissflogii Chlorella sp. Режим длительности 0, осве фаз «свет :
0, щения темнота», ч 0, 1 4 : 0, 2 8 : Fv/Fm 0, 3 12 : 0, 4 16 : 0, 5 20 : 0, 6 24 : 0, 1 2 3 4 5 Режим освещения Рисунок 1 – Зависимость величины относительной переменной флуоресценции иммобилизованных клеток МВ от режима их освещения при разной длительности фаз «свет : темнота». Исследования проводились при экспонировании БЭ в среде 0,5% NaCl (Chlorella sp.) или 2% NaCl (T.
weissflogii) при температуре 16С и интенсивности освещения 20 Вт/м2.
Отклонение от допустимых режимов освещения с увеличением продолжительности световой фазы приводило к быстрому падению значений относительной переменной флуоресценции в 1,5 – 3,0 раза. Эти данные показали возможность использования полученных БЭ в целях экомониторинга in situ в течение длительного времени в природных условиях с естественным циклом солнечного освещения.
При этом установлено, что интенсивность освещения для сохранения флуоресцентных характеристик иммобилизованных клеток микроводорослей не должна превышать 30 Вт/м для клеток Chlorella sp. и 10 Вт/м2 – для T. weissflogii (рисунок 2).
Рисунок 2 – Зави 0, симость величины отно сительной переменной 0, флуоресценции иммо билизованных клеток 0, МВ от интенсивности Fv/Fm 0, внешнего освещения при цикле освещения «12 : 0, 12» (температура 16°С, T. weisflogii среда – 0,5% NaCl для 0,3 Chlorella sp.
клеток Chlorella sp. и 2% 0, 0 20 40 60 80 NaCl для клеток T.
Интенсивность внешнего освешения, Вт/м weissflogii).
Показано, что в условиях проточной системы разработанные БЭ на основе клеток МВ могут сохранять свои параметры флуоресценции в течение, как минимум, 10 суток на исходном уровне в отсутствии экотоксикантов и скорости протока не выше 360 мл/ч.
Для разработанных образцов БЭ в виде иммобилизованных клеток МВ были установлены нижние пределы обнаружения двух классов различных экотоксикантов: ионов тяжелых металлов и азотсодержащих гербицидов, широко применяемых в сельском хозяйстве в условиях дискретного анализа. Временной интервал взаимодействия БЭ с каждым исследованным экотоксикантом для расчета относительной переменной флуоресценции составлял 30 минут (общепринятый стандарт проведения анализа экотоксикантов с применением клеток микроорганизмов в дискретном анализе). Иммобилизованные клетки МВ позволяли определить присутствие экотоксикантов в довольно широких интервалах концентраций. Так, для большинства исследованных соединений (как при определении гербицидов, так и при определении ионов тяжелых металлов) в условиях дискретного анализа диапазон определяемых концентраций составил 110-5 110-2 г/л.
В водной среде с помощью разработанных образцов БЭ также были установлены также нижние пределы обнаружения ионов тяжелых металлов и гербицидов при анализе в проточной аналитической системе в условиях постоянной концентрации экотоксиканта (таблица 2).
Таблица 2 – Нижние пределы обнаружения экотоксикантов при использовании БЭ в виде иммобилизованных клеток МВ в проточной системе. Анализ проводился в водном солевом растворе (T. weissflogii – в 2% NaCl, Chlorella sp. – в 0,5% NaCl) при температуре 16±1С и скорости протока 90 мл/ч. Время анализа – 30 минут.
Нижний передел обнаружения, г/л Экотокси ПДК, г/л БЭ на основе клеток БЭ на основе клеток -кант Chlorella sp. T. weissflogii Zn2+ (6,5±0,2)10-5 (5,2±0,3)10-6 5,010- Hg2+ (1,4±0,1)10-5 (1,0±0,1)10-5 3,410- Cu2+ (6,4±0,1)10-6 (1,3±0,1)10-5 1,910- атразин (6,5±0,2)10-5 (1,3±0,1)10-5 1,010- диурон (7,0±0,3)10-6 (7,0±0,3)10-6 1,010- паракват (7,7±0,4)10-5 (7,7±0,2)10-6 1,010- Результаты показали, что предложенные БЭ позволяют также определять присутствие ионов тяжёлых металлов и гербицидов в весьма широком диапазоне концентраций в условиях протока. Для большинства исследованных соединений этот диапазон составил 110-6 110-3 г/л, причем предел обнаружения оказался в большинстве случаев на 1,0 – 2, порядка ниже величины ПДК, известной для данных соединений. Таким образом, разработанные БЭ на основе клеток МВ полностью отвечали целям данной работы.
Следует отметить, что с помощью полученных для БЭ характеристик линейных зависимостей «концентрация экотоксиканта – аналитический сигнал» может быть определена концентрация того или иного экотоксиканта в водной среде, если известно, что в ней присутствует один вид загрязнителя, влияющего на уровень флуоресценции клеток МВ.
Разработка и исследование операционных свойств образцов 2.
биочувствительных элементов в виде клеток фотобактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта Были получены образцы БЭ в виде гранул с иммобилизованными клетками фотобактерий с различным содержанием влажной биомассы клеток (в интервале 0,01-10%) в составе носителя (средняя масса гранулы 0,30±0,001 г, концентрация раствора ПВС, взятого для приготовления гранул - 13%). Величина концентрации внутриклеточного АТФ в клетках фотобактерий свидетельствует о высоком уровне жизнеспособности клеток в образцах гранул криогеля ПВС с содержанием биомассы в диапазоне 0,1 10% (таблица 3).
Таблица 3 – Влияние исходной концентрации иммобилизованной в криогель ПВС биомассы фотобактерий P. phosphoreum на удельную концентрацию их внутриклеточного АТФ.
Содержание 10 5 1 0,1 0, биомассы, масс % [АТФ], моль/г гран. (3,0±0,2) (1,4±0,1) (2,9±0,2) (2,9±0,3) (1,7±0,2) с иммоб. клетками 10-9 10-9 10-10 10-11 10- Было исследовано влияние концентрации биомассы клеток в составе разрабатываемого БЭ на его чувствительность. Для этого образцы с разной концентрацией иммобилизованных клеток (0,01 – 10 масс. %) подвергались воздействию заведомо избыточных концентраций экотоксикантов (ионов меди и малатиона). Чувствительность иммобилизованных клеток фотобактерий к наличию экотоксикантов оценивалась по уровню их остаточной интенсивности биолюминесценции после инкубирования в течение 30 минут (рисунок 3).
Результаты исследований показали, что присутствие в среде высоких концентраций (10-3 М) ионов меди или малатиона приводит к значительному снижению уровня биолюминесценции только в случае образцов, содержащих в своем составе биомассу клеток в низких концентрациях: 0,01 и 0,1%. Образец БЭ с концентрацией биомассы 0,01% характеризовался пониженным удельным содержанием АТФ в клетках иммобилизованных фотобактерий, что говорило о наличии в БЭ менее жизнеспособных клеток. На основании исследований был сделан вывод о том, что для БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий предпочтительным является введение в криогель ПВС клеток фотобактерий в концентрации 0,1%. Таким образом, была подобрана эффективная концентрация биомассы в гранулах криогеля ПВС разрабатываемого БЭ.
Рисунок 3 – Зависимость остаточной интенсивности Остаточная интенсивность биолюминесценции иммобили биолюминесценции, % зованных в криогель ПВС клеток фотобактерий от концентрации биомассы в составе БЭ при их Cu2+ взаимодействии с экотокси- малатион кантами в концентрации 10-3М (среда – 2% NaCl, температура -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1, lg [конц-я иммобилизованных клеток, %] 10±1°С).
В ходе исследований была проведена оценка влияния питательных сред различного состава, взятых как для приготовления раствора ПВС, так и для инкубации полученных препаратов иммобилизованных клеток, на конечные характеристики БЭ – относительный уровень их биолюминесценции (таблица 4). Условия иммобилизации клеток: состав гранул: 13% раствор ПВС, 0,1% биомассы клеток. Температура формирования криогеля -80С. Средняя масса гранулы 0,10±0,001 г. За 100% принималась максимальная интенсивность биолюминесценции, полученная в рамках данного эксперимента.
Таблица 4 – Зависимость уровня относительной биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий от состава среды формирования БЭ и среды инкубации иммобилизованных клеток.
Раствор полимера Уровень относительной Среда инкубации на основе: биолюминесценции, %.
Полная среда Фаргали Буферного 3± раствора* Буферный раствор 3± Полная среда Фаргали Среды Фаргали без 15± пептона Буферный раствор 15± Полная среда Фаргали Полной среды 97± Фаргали Буферный раствор 97± Буферный раствор: 0,1M Na-фосфатный буфер, 2% NaCl pH 7, * Согласно полученным результатам, ключевое влияние на уровень биолюминесценции разрабатываемого БЭ оказывала среда, использованная для приготовления раствора полимера. Установлено, что формирование БЭ на основе клеток фотобактерий P. phosphoreum в полной среде Фаргали с добавлением дрожжевого экстракта и пептона наиболее предпочтительно, поскольку уровень сигнала биолюминесценции по сравнению с другими использованными средами был в 6,5 – 32,3 раза выше. Инкубация гранул криогеля ПВС с иммобилизованными клетками фотобактерий, сформированных в одинаковых условиях, в питательных средах различного состава не приводила к изменению уровня биолюминесценции сформированного БЭ.
Исследование стабильности биолюминесценции иммобилизованных клеток фотобактерий при различных температурах формирования и хранения криогеля ПВС (-20°С и -80°С) позволило установить, что температура хранения -80°С является наиболее предпочтительной, так именно в этих условиях сохраняется более 80% биолюминесцентной активности БЭ при длительном хранении (более 60 недель). При температуре хранения -20°С БЭ сохраняется уровень биолюминесценции не менее 80% от исходного уровня всего в течение 35 суток.
Таким образом, были обоснованы биотехнологические параметры для формирования БЭ на основе клеток фотобактерий: исходная концентрация биомассы – 0,1%, концентрация раствора ПВС – 13%, среда формирования БЭ – полная среда Фаргали. Показана возможность длительного хранения такого БЭ без потери эффективности при температуре -80С.
Важной характеристикой БЭ является зависимость уровня остаточной биолюминесценции после 30-минутной инкубации свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий от температуры среды (рисунок 4). Было установлено, что при низких температурах (до 12 С) клетки, как в свободной, так и в иммобилизованной форме, демонстрируют одинаковую интенсивность биолюминесценции. При высоких температурах (более 15С) остаточная интенсивность свечения иммобилизованных клеток выше. Уровень биолюминесценции свободных клеток снижался практически на 25% по сравнению с их исходным уровнем свечения после 30-минутной инкубации при температуре 21°С, в то время как иммобилизованные клетки сохраняли исходный уровень интенсивности биолюминесценции. Иммобилизация клеток явно повышала стабильность биолюминесцентного сигнала, поэтому увеличение температуры сказывалось сильнее на активности суспензионных клеток.
Рисунок 4 – Интенсивность биолю минесценции клеток фотобактерий в зависи биолюминесценции, % мости от температуры Интенсивность среды экспонирования (время экспонирования – 30 минут, среда - 2% р-р свободные клетки (3106 кл/мл) NaCl).
иммобилизованные клетки (0,1%) 6 9 12 15 18 21 Температура, °С Для разработанного БЭ на основе иммобилизованных клеток фотобактерий был изучен спектр биолюминесценции (рисунок 5). В качестве объекта сравнения использовались свободные клетки того же штамма микроорганизма, взятые в виде суспензии в 2% водном растворе NaCl.
Иммобилизованные Суспензия клеток Рисунок Спектры 5 – клетки (пик - 478 нм) (пик - 485 нм) биолюминесценции свободных и иммобилизованных клеток биолюминесценции, % фотобактерий P. phosphoreum Интенсивность (среда – 2% NaCl, температура 15±1С, концентрация клеток фотобактерий в суспензии – кл/мл, приведенная концентрация клеток в криогеле ПВС – 3106 кл/мл (0,1% 460 480 500 520, нм биомассы)).
Благодаря проведенным исследованиям впервые было зафиксировано смещение пика интенсивности биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС исследованных клеток фотобактерий P. phosphoreum и V. harveyi по сравнению со свободными в сторону более коротких длин волн на 5 – 7 нм. Наиболее вероятно, что такое смещение было вызвано изменениями в структуре клеточной мембраны, возникающими в процессе иммобилизации клеток фотобактерий в криогель ПВС на стадии «замораживания-оттаивания». При этом могли образовываться новые водородные связи между липидами самой мембраны, которые фиксируют измененную под воздействием микрокристаллов льда конформацию мембраны и связанных с ней белков/ Установлено, что положение пика интенсивности биолюминесценции для клеток фотобактерий не зависит от их концентрации, а зависит только от формы (иммобилизованной или свободной) присутствия клеток в исследуемом образце.
Показано, что разработанный БЭ в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий сохраняет свою исходную интенсивность биолюминесценции в проточной среде в течение, как минимум, 10 суток. При этом предельная скорость протока для данной системы составляет 270 мл/ч.
Были изучены характерные отклики тушения биолюминесценции иммобилизованных клеток фотобактерий на присутствие различных экотоксикантов (ионы тяжелых металлов, производные фенола, фосфорорганические пестициды) в проточной аналитической системе при постоянной концентрации поступающего экотоксиканта. При этом наблюдался интегральный ответ БЭ, заключающийся в постоянном снижении уровня биолюминесценции под воздействием поступающего в аналитическую ячейку с протоком экотоксиканта. На примере взаимодействия клеток фотобактерий с ионами Cu2+ показано, что тушение биолюминесценции связано с уменьшением концентрации активных клеток фотобактерий вследствие биохимической реакции с экотоксикантом (рисунок 6).
С применением методов кибернетики было проведено математическое моделирование процесса, протекающего в проточной ячейке, при следующих начальных допущениях:
1. Каждая клетка фотобактерий имеет одинаковое число активных центров, определяющих проявление эффекта биолюминесценции.
2. Клетка фотобактерий перестает быть источником биолюминесценции, когда все ее активные центры угнетены экотоксикантами.
3. Соотношение количества молей экотоксиканта на клетку фотобактерий, приводящее к заданному тушению биолюминесценции клетки одинаково и постоянно в течение всего процесса биохимической реакции для одной и той же системы «клетки фотобактерий-экотоксикант».
4. Снижение интенсивности биолюминесценции клеток в ячейке пропорционально количеству клеток фотобактерий, угнетенных экотоксикантами. Явление биолюминесценции клеток прекращается (интенсивность биолюминесценции стремится к нулю), если все клетки фотобактерий, иммобилизованные в криогель ПВС, угнетены экотоксикантами.
5. Скорость протока водной среды не влияет на скорость протекания процесса биохимической реакции в иммобилизованных клетках фотобактерий.
Рисунок 6 – Зави симость концентрации Конценцтрация активных клеток, 106 кл/мл Интенсивность биолюминесценции, % активных клеток и 3, интенсивности биолю- 2,5 минесценции иммоби лизованных клеток 2, фотобактерий от 1, времени биохими- ческой реакции 1,0 (проточная система 0, (2% NaCl, 90 мл/ч, 10±1С) с постоянной 0, 0 10 20 30 40 50 концентрацией посту- Время, мин пающего экотокси канта (10 M Cu2+)).
- С учетом начальных допущений для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке предложено использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. На основе обработки массива данных получено кинетическое уравнение, описывающее изменение концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке при протекании такой реакции:
E, где:
E= 1 + E0 k t E0 – исходная концентрация клеток, кл/мл (3·106 кл/мл в данной работе);
E- текущая концентрация активных клеток, кл/мл;
k – константа скорости реакции тушения биолюминесценции, (кл/мл)-1с-1;
t – время, с.
Показано, что все исследованные системы «клетки фотобактерий экотоксикант» описываются данным уравнением с коэффициентом корреляции R2 не менее 0,993.
Для разработанного БЭ были определены константы скорости биохимической реакции экотоксикантов с клетками фотобактерий, удельные количества экотоксикантов, вызывающие снижение интенсивности биолюминесценции, и нижние пределы обнаружения при проведении анализа в проточном режиме для трех классов экотоксикантов:
ионов тяжелых металлов, производных фенола, фосфорорганических пестицидов, а также удельные концентрации этих экотоксикантов, вызывающие снижение интенсивности биолюминесценции на 15%, то есть, минимально определяемые удельные концентрации экотоксикантов (таблица 5).
Таблица 5 – Кинетические параметры взаимодействия БЭ с экотоксикантами в условиях проточной системы (2% NaCl, 90 мл/ч, 10±2С) при постоянной концентрации экотоксикантов.
Константа скорос Удельное количество Нижний ти k ((кл/мл)-1с-1) активных молей предел биохимической Экотоксикант ПДК, г/л экотоксиканта, обнаружения, реакции иммоби приводящее к угнетению г/л лизованных клеток клетки, моль/имм. кл.
с экотоксикантами Zn2+ (3,3±0,2)10-6 5,010-5 8,7010-11 7,510- Co2+ (1,1±0,1)10-4 1,010-5 1,6110-11 3,010- Cu2+ (1,9±0,2)10-6 2,010-3 1,7810-10 4,510- 2,6 (3,7±0,2)10-6 2,110-3 1,7110-10 4,510- диметилфенол пентахлорфенол (1,6±0,1)10-6 3,510-6 3,4410-10 9,010- (4,4±0,2)10-5 9,910-4 8,3210-11 3,010- 2,4-Д кумафос (1,8±0,2)10-5 1,010-3 1,1410-10 7,510- хлорпирифос (1,1±0,1)10-5 1,110-5 2,7810-10 4,510- малатион (3,3±0,2)10-6 4,910-5 2,3610-10 1,510- Показано, что методика определения экотоксикантов в проточной водной среде более чувствительна по сравнению с дискретным методом анализа присутствия экотоксикантов. Было установлено, что с помощью разработанного БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий возможно определение присутствия в проточной среде различных типов экотоксикантов в весьма широком диапазоне их концентраций. Наиболее широкий диапазон определяемых концентраций (1·10-8 1·10-4 М) был установлен при определении ионов тяжелых металлов.
Нижние пределы обнаружения экотоксикантов в условиях проточной среды, зафиксированные для иммобилизованных клеток, оказались в большинстве случаев на 1 – 2 порядка чувствительнее, чем аналогичные диапазоны, установленные для иммобилизованных клеток фотобактерий при проведении дискретного анализа. Это свидетельствует о значительном повышении эффективности предложенной методики анализа.
Установлено также, что разные представители экотоксикантов характеризуются своим удельным количеством молей, которые вызывают одинаковое снижение интенсивности биолюминесценции на 15% от исходной величины. Именно этим объясняются разные пределы обнаружения разных экотоксикантов. Показано, что скорость протока в интервале 45 – 180 мл/ч не влияет на удельное количество активных молей экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клеток фотобактерий. Показано, что повышение чувствительности клеток фотобактерий к экотоксикантам достигается за счет уменьшения удельного количества активных молей экотоксикантов, вызывающих одну и ту же степень тушения биолюминесценции.
Для проведения анализа почв на основе использования метода определения «биодоступных» экотоксикантов был использован быстрый (30 минут) одностадийный метод пробоподготовки путем экстракции экотоксикантов из почвы с помощью 3% раствора этанола в 2% растворе NaCl. При проведении анализа содержания ионов тяжелых металлов и пестицидов в таком почвенном экстракте в проточном режиме анализа нижние пределы обнаружения оказались существенно ниже, чем в случае дискретного режима (таблица 6).
Таблица 6 – Нижние пределы обнаружения ионов тяжелых металлов и пестицидов в почве и величины ПДК, установленные для этих экотоксикантов.
Нижний предел обнаружения, мг/кг ПДК в Экотоксикант Дискретный Анализ в проточном почве, мг/кг анализ режиме Pb2+ 0,038±0,007 0,012±0,002 0, 2+ Co 0,0071±0,0005 0,00025±0,0002 0, 2+ Cu 0,0062±0,0004 0,00019±0,00001 0, метил 0,012±0,003 0,00045±0,00005 0, паратион малатион 0,32±0,02 0,012±0,003 диметон-S н/н* 0,029±0,007 0,0014±0, метил кумафос н/н* 0,32±0,02 0,011±0, *н/н – не нормирована В обоих режимах проведениия анализа с использованием разработанного БЭ нижние пределы обнаружения экотоксикантов были меньше (в количественном выражении на 1-2 порядка) по сравнению с известными величинами ПДК, установленными для некоторых из этих соединений в почве. При этом достигнутые пределы обнаружения в проточном режиме оказались значительно ниже соответствующих величин ПДК, установленных для содержания этих ионов в почве (таблица 6).
Возможность практического применения разработанного БЭ была исследована при анализе проб воды из Каспийского моря и реки Куры, а также проб почвы Московского региона. В случаях, когда в исследуемых пробах содержались экотоксиканты, БЭ на основе клеток фотобактерий также демонстрировал значительное снижение интенсивности биолюминесценции.
Разработанный БЭ на основе клеток фотобактерий был использован для определения цитотоксичности органических веществ – производных ионола. На основе данной оценки были даны рекомендации оп использованию разработанных препаратов в качестве антимикробных агентов.
Для предложенного БЭ была также построена калибровочная кривая зависимости аналитического сигнала от концентрации в среде метилфосфоновой кислоты, продукта разложения фосфорорганических отравляющих веществ. Экспериментально показано, что с помощью разработанного БЭ возможно проводить контроль процесса деградации реакционных масс, получаемых при уничтожении боевых отравляющих веществ, по степени экотоксичности сточных вод, получаемых в результате процесса.
ВЫВОДЫ 1. Разработан новый способ получения биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС) клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii для анализа присутствия экотоксикантов в проточных водных системах.
Полученные образцы БЭ обладают стабильностью операционных характеристик, в том числе при высоких скоростях протока (до 360 мл/ч) при детекции ионов тяжелых металлов (Zn2+, Hg2+, Cu2+) и гербицидов (атразина, диурона, параквата) как в пресноводных, так и в морских водных проточных средах.
Установлено, что в сравнении с известными аналогами разработанные БЭ в виде иммобилизованных клеток микроводорослей характеризуются высокими аналитическими характеристиками для детекции представительных образцов экотоксикантов в количествах ниже величины ПДК.
2. Разработан способ получения нового биочувствительного элемента в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий Photobacterium phosphoreum для определения присутствия экотоксикантов в стационарных и проточных системах, а также для скрининга и оценки токсичности новых органических веществ. Полученный БЭ обладает расширенным диапазоном температур эффективного функционирования (6-21°С) в сравнении с суспензионными клетками (6-15 °С), длительно сохраняет свои основные операционные характеристики в протоке без экотоксикантов и обеспечивает определение экотоксикантов (ионов тяжелых металлов (Zn2+, Со2+, Cu2+), фосфорорганических соединений (кумафоса, хлорпирифоса, малатиона, метилфосфоновой кислоты) и производных фенола (2,6-диметилфенола, пентахлорфенола, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты)) в водных проточных средах в концентрациях значительно ниже величин ПДК этих соединений.
3. Впервые установлен факт смещения пика интенсивности биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС исследованных штаммов клеток фотобактерий в концентрациях 0,1 – 10% на 5 – 7 нм в сторону более коротких длин волн по сравнению со свободными клетками.
4. Впервые при использовании иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий для детекции экотоксикантов определены кинетические параметры (константы скорости биохимической реакции клеток фотобактерий с экотоксикантами, удельное количество активных молей различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции одной клетки в условиях проточной системы).
Показано, что скорость протока в интервале 45 – 180 мл/ч не влияет на удельное количество активных молей экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клеток фотобактерий.
5. На основе применения методов кибернетики предложено для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. Получено кинетическое уравнение изменения концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке в ходе биохимической реакции с экотоксикантом.
6. На основе разработанного БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий был предложен оригинальный подход к определению экотоксикантов в почвах методом экстракции «биодоступных» экотоксикантов из почвы с последующим анализом экотоксичности экстракта. Показано, что переход от проведения анализа экотоксичности экстракта в дискретном режиме к анализу в условиях проточной системы позволяет повысить чувствительность метода.
7. Показана эффективность использования БЭ на основе клеток фотобактерий для экомониторинга образцов проб воды, отобранных из реки Кура и прибрежных зон Каспийского моря, образцов почвы, отобранных в Московском регионе. Показана возможность определения присутствия в водной среде метилфосфоновой кислоты, являющейся продуктом разложения реакционных масс боевых отравляющих веществ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Ефременко Е.Н., Завьялова Н.В., Гудков Д.А., Лягин И.В., Сенько О.В., Гладченко М.А., Сироткина М.С., Холстов А.В., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. Хим. Журн. 2010. Т. LIV (4), с. 19-24.
2. Никольская А.Б., Холстов А.В., Лягин И.В., Мамедова Ф.Т., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения задач альтернативной энергетики и экологии // Междунар. Журн.
«Альтернативная энергетика и экология». 2010. №4, с. 95-100.
3. Ефременко Е.Н., Сенько О.В., Куц В.В., Исмаилов А.Д., Холстов А.В., Аленина К.А. Люминесцентный биокатализатор для определения экотоксикантов // Патент РФ на изобретение №2394910, Бюл. (20.07.2010).
4. Ефременко Е.Н., Холстов А.В., Воронова Е.Н., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Биосенсор на основе клеток микроводорослей для определения тяжелых металлов и гербицидов в водных системах // Патент РФ на изобретение №2426779, Бюл. 23 (20.08.2011).
5. Сенько О. В., Холстов А. В., Ефременко Е. Н. Биосенсор на основе иммобилизованных диатомовых водорослей для определения различных токсикантов // II Международная конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 28 – 30 октября 2008 г., Ростов на-Дону, Южный федеральный университет, с. 142-143.
6. Холстов А. В., Сенько О. В., Воронова Е. Н., Погосян С. И., Ефременко Е. Н., Рубин А. Б. Разработка биосенсорного элемента для индикации экотоксикантов в природных водах // VIII ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», – 13 ноября 2008 г., Москва, c. 234.
7. Конюхов И. В., Погосян С. И., Яковлева О. В., Рубин А. Б., Ефременко Е. Н., Сенько О. В., Холстов А. В. Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации состояния природных вод // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы», 8 – 10 декабря 2008 г., Москва, с. 103-104.
8. Холстов А. В., Сенько О. В., Исмаилов А. Д., Ефременко Е. Н.
Разработка биосенсора на основе иммобилизованных клеток для обнаружения экотоксикантов в водных средах // 6-я Международная конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов», 8 – апреля 2009 г., Харьков, с. 237-239.
9. Kholstov A.V., Senko O.V., Efremenko E.N., Ismailov A.D. Development of biosensor, based on immobilized cells of Photobacterium phosphoreum for detection of ecotoxic agents in water sources // International conference Biocatalysis-2009: Fundamentals & applications, 19 – 24 June 2009, Arkhangelsk, p. 117-118.
10. Холстов А. В., Ефременко Е. Н., Погосян С. И., Воронова Е. Н., Рубин А. Б. Криотропные гели как носители для иммобилизованных клеток микроводорослей // III Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 1 – октября 2009 г., Ростов-на-Дону, Южный федеральный университет, с. 31-32.
11. Конюхов И. В., Воронова Е. Н., Погосян С. И., Рубин А. Б., Ефременко Е. Н., Сенько О. В., Холстов А. В. Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации состояния природных вод // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2012 годы», 25 – 27 ноября 2009 г., Москва, с. 20-21.
12. Холстов А. В., Исмаилов А. Д., Куц В. В., Сенько О. В., Ефременко Е.
Н. Биологическая система на основе иммобилизованных клеток фотобактерий для обнаружения пестицидов в проточных водных средах // IX ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН ВУЗы «Биохимическая физика», 9 – 11 ноября 2009 г., Москва, с. 257-258.
13. Холстов А.В., Ефременко Е.Н., Исмаилов А.Д., Куц В.В., Погосян С.И., Воронова Е.Н., Конюхов И.В. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов для детекции экотоксикантов в водных системах // Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», посвящённый двум юбилейным датам: 120-летию со дня рождения основателя кафедры микробиологии и её первого заведующего профессора Е.Е. Успенского и 125-летию со дня рождения заведующего кафедрой (1938-1967) академика В.Н. Шапошникова, 24 – 27 декабря 2009 г., Москва, с. 143.
14. Холстов А.В., Ефременко Е.Н. Микробиологические системы мониторинга состояния водных объектов на наличие экотоксикантов // Московская международная научно-практическая конференция "Биотехнология: экология крупных городов", 15 – 17 марта 2010 г., Москва, с. 430-431.
15. Холстов А.В., Исмаилов А.Д., Ефременко Е.Н. Определение фосфорорганических соединений различных классов в водных средах с использованием иммобилизованных клеток фотобактерий // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 19 – 23 апреля 2010 г, с. 295-296.
16. Холстов А.В., Молотилин Т.Ю., Мустафаев Р.М., Ефременко Е.Н.
Биологическая система на основе иммобилизованных клеток фотобактерий для обнаружения пестицидов в проточных водных средах // X ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», 8 – 10 ноября 2010 г., Москва, с. 252-254.
17. Холстов А.В., Ефременко Е.Н. Определение различных классов пестицидов в водных средах с использованием иммобилизованных клеток фотоабктерий в качестве биорецепторов // Международная научно практическая конференция «Юность за экологический прогресс», 11 – ноября 2010 г., Баку, с. 45-47.
18. Холстов А.В., Молотилин Т.Ю., Мустафаев Р.М., Ефременко Е.Н.
Мониторинг присутствия ионов тяжелых металлов в проточных водных средах с помощью биосенсора на основе иммобилизованных клеток фотобактерий // Международная выставка и конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов», 23 – 25 февраля 2011 г., Харьков, с. 134-135.
19. Мамедов Ф.Т., Холстов А.В., Ефременко Е.Н. Биолюминесцентный экспресс-детектор загрязненности вод в проточных системах // III Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях», июня – 1 июля 2011 г., Москва, с. 109-111.
20. Холстов А.В., Ефременко Е.Н. Экомониторинг присутствия экотоксикантов в почвах с использованием иммобилизованных клеток фотобактерий // XI ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», 9 – 11 ноября 2011 г., Москва, с. 252-254.
Список сокращений, использованных в работе:
АТФ – аденозинтрифосфат;
БИ – биоиндикатор;
БЭ – биочувствительный элемент;
МВ – микроводоросли;
ПВС – поливиниловый спирт;
ПДК – предельно допустимая концентрация;
ФСА – фотосинтетический аппарат;
2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.