Биомониторинг нефтяного загрязнения устья реки дон с использованием водных позвоночных
На правах рукописи
КАРМАЗИН
Антон Павлович
БИОМОНИТОРИНГ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
УСТЬЯ РЕКИ ДОН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ВОДНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ
Специальность 03.02.08 — экология
А В Т О Р Е Ф Е РА Т
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Краснодар — 2010
1
Работа выполнена на кафедре зоологии Государственного образователь ного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский госу дарственный университет»
Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Пескова Татьяна Юрьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Стрельников Виктор Владимирович;
кандидат биологических наук Замалетдинов Ренат Ирекович Ведущее учреждение: Институт экологии Волжского бассейна РАН
Защита диссертации состоится « 17 » декабря 2010 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.101.14 по биологическим наукам при ГОУ ВПО «Кубанский государственный университет» по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Кубанский государственный университет».
Автореферат диссертации размещён на сайте:
http://www.kubsu.ru.
Автореферат разослан « » 2010 г.
Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук В. В. Тюрин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Нефтяное загрязнение в настоящее время имеет глобальное распространение и затрагивает не только акватории морей и океа нов, но также участки суши, реки и пресные водоёмы [Данилова, 1990]. Нефте продукты относятся к числу наиболее распространённых и опасных веществ, загрязняющих поверхностные воды. Нефть и продукты её переработки пред ставляют собой смесь веществ — низко- и высокомолекулярные предельные, непредельные алифатические, нафтеновые, ароматические углеводороды, кис лородные, азотистые, сернистые соединения, ненасыщенные гетероцикличе ские соединения. Такой сложный состав обусловливает самые разнообразные эффекты влияния нефти на различных уровнях организации материи — от кле точного до популяционного.
Одним из важнейших аспектов проблемы загрязнения окружающей среды нефтью является токсикологический — выяснение влияния нефти на гидробион тов и раскрытие механизмов токсического действия растворённых углеводоро дов нефти. Биотестирование и биоиндикация являются основными элементами биологического мониторинга состояния окружающей среды. Биотестирование выполняет функцию оперативного контроля происходящего загрязнения, наце ленного на получение информации о токсичности того или иного загрязнителя.
Биоиндикация представляет собой выявление последствий загрязнения водного объекта по функциональным и морфологическим показателям его обитателей или по экологическим характеристикам сообщества. Изменения, зарегистриро ванные методами биоиндикации, являются результатом уже состоявшегося ра нее загрязнения [Киреева, Кабиров, Дубовик, 2007]. Таким образом, использо вание комплексного (биоиндикация + биотестирование) подхода позволяет ин тегрально оценить реальный уровень загрязнения изучаемого водоёма нефтью.
Цели и задачи исследования. Цель исследования — определить инди видуальные и популяционные показатели широко распространённых видов водных позвоночных для биомониторинга нефтяного загрязнения водоёмов.
Для достижения цели поставлены и решены следующие задачи:
1. Определить с помощью гидрохимического анализа уровень нефтяного загрязнения устья р. Дон.
2. Оценить показатели стабильности развития озёрной лягушки и сере бряного карася из различных рукавов р. Дон.
3. Дать интегральную оценку состояния биотопов в дельте р. Дон с ис пользованием видов-биоиндикаторов.
4. Экспериментальным путём оценить динамику основных физиологиче ских и биохимических показателей озёрной лягушки под влиянием нефтяного загрязнения.
5. Установить изменения параметров раннего онтогенеза озёрной лягуш ки под действием различных концентраций нефти.
6. Определить пороговые, эффективные и летальные концентрации неф ти для водных позвоночных.
Научная новизна. Впервые определены особенности влияния нефти на клеточном, организменном и популяционном уровнях организации водных по звоночных животных. Установлена динамика гематологических показателей озёрной лягушки под влиянием нефти в различных концентрациях. По пока зателям перекисного окисления липидов определён уровень окислительного стресса органов озёрной лягушки. Впервые установлены показатели бионако пления нефти в различных органах озёрной лягушки. Выявлены особенности раннего развития водных позвоночных в растворах нефти различных концен траций. Впервые изучено состояние (уровень нефтяного загрязнения) южных рукавов дельты р. Дон. Установлены показатели флуктуирующей асимметрии серебряного карася и озёрной лягушки, обитающих в устье р. Дон, и их связь с уровнем нефтяного загрязнения данной акватории. Дифференцированы адап тивные и патологические процессы, происходящие под влиянием нефти раз личных концентраций на клеточном, организменном и популяционном уровнях.
Теоретическая и практическая значимость результатов. Предложена система мониторинга экологического состояния рек с использованием поло возрелых особей двух фоновых видов позвоночных гидробионтов — озёрной лягушки и серебряного карася. В эксперименте установлены изменения основ ных цитогематологических и биохимических показателей озёрной лягушки под влиянием нефти в различных концентрациях. Рассмотрены особенности раз вития головастиков озёрной лягушки в растворах нефти. Выявлены адаптивные и патологические процессы, развивающиеся в организме под действием нефти.
Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе кафедр зоологии, водных биоресурсов и аквакультуры ГОУ ВПО Куб ГУ, а также при мониторинговых исследованиях лабораториями КрасНИИРХ, АзНИИРХ и ФГУ «Ростовский референтный центр Россельхознадзора».
Личный вклад соискателя. Автор в 2008—2010 гг. провёл полевые исследования в основных притоках устья р. Дон. Работы, связанные с каме ральной обработкой полевого материала, постановкой и проведением экспе риментов и интерпретацией полученных данных, а также с написанием текста диссертации, выполнены автором по плану, согласованному с научным руко водителем. Доля личного вклада соискателя в различных компонентах работы составляет 40—100 %.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Нефтяное загрязнение оказывает на водных позвоночных животных дозозависимое воздействие на клеточном и организменном уровнях.
2. Изменения стабильности развития озёрной лягушки и серебряного ка рася в устье р. Дон происходят под влиянием нефтяного загрязнения.
3. Индивидуальные характеристики озёрной лягушки такие как уровень бионакопления нефти, гематологические показатели, скорость перекисного окисления липидов могут быть использованы для биомониторинга нефтяного загрязнения водоёмов.
4. Озёрная лягушка адаптируется к концентрациям нефти 1 ПДК на всех стадиях онтогенеза, к концентрациям 1—10 ПДК адаптируются взрослые особи, в концентрациях 10 ПДК у лягушки отмечены только патологические процессы.
Апробация и публикации. Результаты исследований были представлены и обсуждались на конференциях различных уровней, в том числе: на ХХI, ХХII, XXIII Межреспубликанских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы экологии и охраны экосистем южных регионов России и сопредельных территорий», г. Краснодар, 2008—2010 гг.;
на Международной научно-практи ческой интернет-конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований — 2009», г. Одесса, 2009 г.;
на V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-хи мических методов для изучения окружающей среды, Ростов-на-Дону, 2009 г.;
на Международной научно-практической конференции «Региональные особен ности функционирования и взаимодействия предприятий рекреационной от расли и промышленного сектора», Туапсе, 2010 г.;
X Международном семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология), Ростов-на Дону, 2010 г.;
VII Международной конференции «Спектроскопия координаци онных соединений в науке, технике и экологии», Туапсе, 2010 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объём и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 20 рисунками и 17 таблицами. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, в котором приведено 189 источников, в том числе 19 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Анализ современного состояния проблемы по литературным источникам Глава посвящена анализу литературы по различным аспектам влияния не фтяного загрязнения на индивидуальные и популяционные показатели рыб и земноводных. Показаны особенности хронического и кратковременного влия ния нефти на биоразнообразие водоёмов, определены летальные, сублетальные и эффективные концентрации нефти для различных видов водных позвоночных.
Представлены сведения о возможности использования отдельных показателей позвоночных гидробионтов для биоиндикации нефтяного загрязнения водоёмов.
Глава 2. Материал и методы исследования 2.1. Материал Исследования проводили в устье р. Дон в 2008—2010 гг. Материалом для диссертационной работы послужили головастики и взрослые особи озёрной лягушки Rana ridibunda (Pal.), а также взрослые особи серебряного карася Carassius auratus gibelio (Bloch). Статистическую обработку полученных дан ных проводили стандартными биометрическими методами [Лакин, 1980].
2.2. Методы биоиндикации состояния водоёмов В течение 2008—2010 гг. весной, летом и осенью осуществляли отборы проб воды на содержание нефтепродуктов в 10 точках, расположенных в уз лах деления водотоков устья р. Дон. Места отбора проб указаны на рисунке 1.
Обследования акватории на участке пос. Донской — судоходное устье Старого Дона производили на арендованных судах типа КС-100 «Надежда» и «Ипомея», обследование проток, малых рек и гирл — на моторных лодках «Прогресс».
1 — р. Дон у пос. Донской;
2 — устье Нижнего Дона в районе косы Песчаной;
3 — устье Нижнего Дона в районе его впадения в Таганрогский залив;
4 — Мериново гирло в районе ответвления от Нижнего Дона;
5 — Мериново гирло в районе впадения в Таганрогский залив;
6 — проток Бирючий в районе ответвления от Нижнего Дона;
7 — проток Бирючий в районе впадения в Таганрогский залив;
8 — р. Азовка;
9 — р. Мокрый Кагальник;
10 — р. Кагальник Рисунок 1 — Места отбора проб в устье р. Дон Пробы воды отбирали с помощью батометра в водах прибрежной зоны и в центре водотока. Концентрацию нефтепродуктов в воде определяли комбини рованным спектрофотометрическим методом с использованием инфракрасного Фурье спектрометра «Инфралюм ФТ-02». Под нефтепродуктами подразумева ли сумму углеводородов алифатического, алициклического и ароматического рядов [Сборник методик …, 1996;
Другов, Родин, 2007;
Скрыпник, 2008].
Показатели флуктуирующей асимметрии анализировали у живых озёр ных лягушек и серебряных карасей из рукавов устья р. Дон согласно методике В. М. Захарова [1987]. Так как формирование меристических признаков обо их видов происходит во время личиночного развития, то сеголетки рыб дают возможность оценить текущую ситуацию в водоёме, а рыбы и земноводные старших возрастов — экологическую ситуацию в предыдущие годы [Методи ческие рекомендации …, 2003]. Оценку отклонения стабильности развития земноводных и рыб от условно нормального состояния проводили по соответ ствующим шкалам [Методические рекомендации …, 2003;
Пескова, Жукова, 2007]. Всего было исследовано 200 особей озёрных лягушек и 270 особей се ребряных карасей из 10 мест обитания в устье р. Дон.
2.3. Методы экспериментального изучения влияния нефти Озёрные лягушки для экспериментов были отловлены в Ботаническом саду ГОУ ВПО «Кубанский государственный университет». В общей сложно сти в эксперименте было исследовано 105 взрослых особей озёрной лягушки и 360 головастиков. Для проведения экспериментов была использована сырая нефть марки «Light».
Гематологические исследования проводили на половозрелых озёрных ля гушках, помещённых на 5 суток в нефть, в концентрациях соответствующих 0,2—10 ПДК. Основные показатели красной и белой крови определяли с по мощью стандартных методов фиксации, окраски мазков крови, их микроско пического исследования, а также подсчёта микроядер эритроцитов [Кост, 1973;
Давыдов и др., 2006].
Интенсивность процессов перекисного окисления липидов у половоз релых особей озёрной лягушки оценивали по перекисному числу липидов в таких органах как печень, мышцы, головной мозг и сердце. Определение со держания перекисных соединений в тканях проводили по стандартной методи ке [ГОСТ Р 51487-99, 2001]. Бионакопение нефти в мышцах, печени, почках, коже, лёгких, тонком кишечнике и гонадах озёрной лягушки определяли мето дом газовой хроматографии [Другов, Родин, 2000] на хроматомасс-спектроме тре Shimadzu, 2010.
Изучение влияния нефти (концентрации 0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мг/л) на ранние стадии онтогенеза озёрной лягушки проводили на головастиках, по лученных из икры, взятой из условно чистого водоёма. Эксперимент прово дили в лабораторных условиях по стандартной методике [Пястолова, 1989] до завершения метаморфоза или наступления смерти. Фиксировали смертность личинок, темпы их роста, дни достижения основных стадий развития и мета морфоза [Дабагян, Слепцова, 1975].
Глава 3. Уровень кумуляции нефти в воде устья р. Дон и органах озёрной лягушки 3.1. Содержание нефтепродуктов в рукавах устья р. Дон Дельта р. Дон — уникальное в своём роде природное образование, име ющее большое значение для функционирования экосистемы всего бассейна р. Дон, Таганрогского залива и в целом Азовского моря. Бассейн Нижнего Дона отличается равнинным характером рельефа со значительной расчленён ностью. Каждый рукав (проток) дельты р. Дон представляет собой большую плёсовую лощину, относительно более глубокую, чем ограничивающие её с обоих концов развилочные перекаты. Эта особенность характерна и для боль ших рукавов, и для малых мелких зарастающих протоков. Одной из характер ных деталей дельтовых перекатов Дона являются небольшие острова, тяготе ющие к одному из берегов русла [Жукова и др., 2009].
Мы в течение весны, лета и осени 2008—2010 гг. ежемесячно отбира ли пробы воды в 10 точках устья р. Дон (см. рисунок 1). Места отбора проб выбраны так, что 5 точек расположены в судоходной части устья по которой перемещаются крупномерные суда, остальные 5 — в сравнительно неглубоких рукавах, по которым передвигаются только маломерные суда.
Результаты токсикологического анализа воды за период с 2003 г. по 2010 г.
по основным устьевым створам р. Дон свидетельствуют об отсутствии в воде реки других токсикантов, кроме нефти. В рукавах дельты Дона нефтепродукты встречается в различных состояниях: растворённая в воде нефть, молекуляр ная плёнка, плёнка толщиной до нескольких миллиметров («слик»), эмульсии «вода в нефти» и «нефть в воде», донные отложения и нефтяные агрегаты. В последние 5 лет содержание нефтепродуктов в воде снижается, однако, оно всё ещё превышает ПДК как для воды, так и для грунта.
В 2008—2010 гг. мы определяли содержание нефти в основных рукавах южной части устья р. Дон. Достоверных сезонных и годовых различий в со держании нефти в воде одной и той же точки нами не обнаружено. За три года исследований средние показатели содержания нефти в исследованных водото ках составляли от 1 до 1,8 ПДК. Максимальное количество нефти было отме чено весной 2010 г. в точках 2 (5,6 ПДК), 4 (4,6 ПДК), 6 (4,2 ПДК), 7 (4,0 ПДК) и 8 (4,4 ПДК) и летом 2009 г. в точках 2 (6,2 ПДК), 7 (4,4 ПДК) и 8 (4,2 ПДК).
При этом сравнение средних величин содержания нефти в различных точках в один и тот же год и/или сезон достоверно не различается. Таким образом, хотя интенсивность движения и размеры проходящих по исследованным рука вам дельты Дона судов различаются, уровень нефтяного загрязнения исследо ванных водотоков одинаковый. Объяснить это можно тем, что при отсутствии крупных выбросов нефтепродуктов в воду, нефтяное загрязнение воды поддер живается за счёт вымывания тяжёлых фракций нефти из донных отложений [Кармазин, Буков, Пескова, 2010].
Компоненты нефти подразделяют на три основных псевдофракции — лёгкие, средние и тяжёлые [Дембицкий и др., 2003;
Земков, Журавлева, 2004].
Нефтепродукты, загрязняющие воды устья р. Дон, относятся к первой и второй группам. Они представлены моторными бензинами, судовыми дизельными то пливами и лёгкими мазутами [Кармазин, Буков, Пескова, 2010].
В лаборатории химического факультета ГОУ ВПО «Кубанский государ ственный университет» был проведён анализ нефти марки Light, который пока зал, что в исследуемой нефти преобладают указанные выше компоненты первой и второй группы. На основании хроматографического анализа состава нефти мы сочли возможным использовать её в лабораторном эксперименте с животными.
3.2. Кумуляция нефти в тканях озёрной лягушки Озёрная лягушка является аккумулирующим биомонитором, для неё характерен достаточно высокий уровень кумуляции различных токсикантов, таких как пестициды, тяжёлые металлы [Пескова, 2001;
Мисюра, 2006б;
Кар мазин, Пескова, 2010]. В известной нам литературе нет сведений об особен ностях накопления в органах озёрной лягушки нефти. Поэтому мы изучили уровень кумуляции углеводородов нефти у озёрных лягушек после 10 дней пребывания в растворах нефти концентраций 0, 0,05 и 0,5 мг/л (рисунок 2).
Печень Лёгкие Почки Тонк. кишечник Гонады Кожа Мышцы — 0 мг/л — 0,05 мг/л — 0,5 мг/л Рисунок 2 — Уровень кумуляции нефти (мкг/мг) в органах озёрной лягушки в зависимости от содержания нефти в воде У контрольных особей озёрной лягушки в печени и мышцах количество углеводородов достоверно ниже, чем в других исследованных органах. На по рядок выше содержание нефти в лёгких, коже, гонадах, тонком кишечнике и почках. При сравнительно низком содержании нефти в воде (0,05 мг/л) досто верно не изменяется содержание нефти в печени, мышцах, коже, почках и тон ком кишечнике по сравнению с контролем, а в лёгких и гонадах оно достовер но повышается. Кроме того, при данной концентрации нефти в воде, в гонадах и лёгких количество углеводородов достоверно больше, чем в почках и тонком кишечнике. При повышении содержания нефти в воде в 10 раз увеличивается накопление нефти в печени и почках;
в коже, тонком кишечнике и мышцах оно остаётся постоянным. В лёгких и гонадах уровень содержания углеводородов снижается по сравнению с их накоплением в тех же органах после пребывания в растворе нефти меньшей концентрации.
Можно говорить о том, что количество углеводородов нефти в органах озёрной лягушки изменяется в зависимости от концентрации нефти в воде.
Так, в печени и почках, являющихся основными органами детоксикации в ор ганизме, количество нефти увеличивается по мере увеличения концентрации её в воде. В почках нефти накапливается в 3,8—5,5 раз больше, чем в печени, так что основным органом, аккумулирующим углеводороды нефти, у озёрной лягушки являются почки.
В тонком кишечнике и коже отмечена обратная картина — снижение со держания нефти в органах при увеличении её количества в воде. Указанные органы служат для выведения токсикантов из организма. Видимо, их работа интенсифицируется по мере роста концентрации нефти в окружающей среде, и её концентрация в них снижается.
Обращает на себя внимание низкое и одинаковое содержание нефти в мышцах и печени, оно на порядок ниже, чем в других исследованных органах.
Если для мышц это ожидаемо, т. к. они не участвуют ни в выведении, ни в де токсикации загрязнителей, то для печени данное явление ранее в литературе не отмечалось. Видимо, в этом проявляется специфическое воздействие нефти.
Глава 4. Особенности развития водных позвоночных в условиях нефтяного загрязнения среды 4.1. Биоиндикация состояния устья р. Дон по показателям стабильности развития фоновых видов позвоночных гидробионтов Для оценки экологического состояния различных рукавов дельты р. Дон мы определяли показатели стабильности развития фоновых видов водных по звоночных, обитающих в устье реки — озёрной лягушки и серебряного карася.
В таблице 1 приведена балльная оценка состояния указанных водотоков, бази рующаяся на показателях флуктуирующей асимметрии (частоты асимметрич ного проявления на особь) озёрной лягушки и серебряного карася.
Судя по данным таблицы 1, экологическая обстановка в исследованных рукавах устья Дона стабильно тяжёлая. Большинство рукавов характеризуется 4 (существенное отклонение от нормы) и 5 (критическое состояние) баллами по шкале оценки отклонения стабильности развития от условной нормы.
В 2010 г. мы отлавливали половозрелых особей озёрной лягушки, их ин дивидуальное развитие (и нарушения его стабильности, соответственно) про исходили в 2008—2009 гг. Наименьший уровень нарушений у лягушек отме чен нами в Мериновом гирле, р. Кагальник и Мокрый Кагальник. Мы объясня ем это сравнительно небольшими глубинами указанных рукавов, по которым курсируют только маломерные суда.
В 2010 г. в точках отбора проб мы отлавливали также разновозрастных особей серебряного карася. Его сеголетки характеризуют текущее состояние изученных рукавов Нижнего Дона, для которого отмечено увеличение пока зателей флуктуирующей асимметрии и, следовательно, ухудшение экологиче ской обстановки на этих водотоках. Действительно, в 2010 г. показатели хими ческого анализа регистрировали увеличение максимальных величин содержа ния нефти в воде.
Таблица 1 — Балльная оценка состояния исследованных водотоков из устья р. Дон по показателям флуктуирующей асимметрии озёрной лягушки и сере бряного карася в 2004—2010 гг.
Серебряный карась Озёрная 2—3 4—5 6— лягушка сего Точки отбора летние летние летние (2008— летки (2008— (2006— (2004— 2009 гг.) (2010 г.) 2009 г.) 2007 г.) 2005 г.) 4 5 5 5 р. Дон у пос. Донской —точка 4 5 5 5 Устье Нижнего Дона — точка 4 5 5 5 Устье Нижнего Дона — точка 3 5 4 5 Мериново гирло —точка 3 5 4 5 Мериново гирло —точка 4 5 5 5 Проток Бирючий — точка 4 5 5 5 Проток Бирючий — точка 4 5 4 4 р. Азовка — точка 3 4 4 5 р. Мокрый Кагальник — точка 3 4 4 4 р. Кагальник — точка 2-х и 3-х летние караси, как и особи озёрной лягушки, характеризуют состояние рукавов Нижнего Дона в 2008—2009 гг. Сравнение данных, полу ченных по двум видам позвоночных гидробионтов, указывает на сравнительно меньшую чувствительность земноводных по сравнению с рыбами. «Нормаль ный» уровень отклонения развития у земноводных выше, чем у рыб, поэтому, несмотря на более высокие абсолютные величины показателей флуктуирую щей асимметрии озёрной лягушки, ей соответствуют меньшие баллы по шкале [Методические рекомендации …, 2003;
Пескова, Жукова, 2007].
Судя по величине флуктуирующей асимметрии 4—7-летних серебряных карасей экологическое состояние южной части устья р. Дон в 2004—2007 гг., можно оценить как критическое или близкое к нему состояние.
Таким образом, исходя из оценки показателей стабильности развития во дных позвоночных, можно говорить о некотором улучшении экологической обстановки на Нижнем Дону. Данные химического анализа содержания нефти в воде показывают значительное снижение абсолютных максимальных вели чин (при сохранении средних), однако в воде обычно определяется содержа ние только лёгких и средних фракций нефтепродуктов. Для определения обще го экологического состояния водоёма необходимо учитывать также тяжёлые фракции нефтепродуктов, которые быстро кумулируются донными илами, а затем постепенно высвобождаются, превращаясь в формы других фракций нефтепродуктов. Использование гидробионтов-биоиндикаторов даёт возмож ность получения комплексной оценки степени загрязнения водоёмов нефтью.
4.2. Влияние различных концентраций нефти на личиночное развитие озёрной лягушки В экспериментальных условиях было изучено влияние некоторых (0,01— 0,5 мг/л) концентраций нефти на личиночное развитие головастиков озёрной лягушки. Динамика гибели головастиков озёрной лягушки в контроле и рас творах нефти различных концентраций на протяжении опыта показана на ри сунке 3. Видно, что гибель головастиков возрастает в изученном нами гради енте токсической нагрузки.
Процент погибших головастиков 1 5 9 16 27 33 39 46 52 57 64 День наблюдения — контроль — 0,01 мг/л — 0,05 мг/л — 0,1 мг/л — 0,25 мг/л — 0,5 мг/л Рисунок 3 — Смертность головастиков озёрной лягушки в контроле и в присутствии нефти различных концентраций В самых низких концентрациях нефти — 0,01 и 0,05 мг/л — кривые гибели головастиков сходны — сначала смертность нарастает постепенно, затем проис ходит некоторое её торможение — наблюдается плато длительностью в 6— дней, после чего гибель продолжает нарастать. Однако в обеих исследованных концентрациях 100%-ная гибель не достигнута. Данные кривые соответствуют линейной регрессии, что подтверждено теоретически вычисленными уравнени ями регрессии. В более высоких исследованных концентрациях нефти (0,25 и 0,5 мг/л) гибель головастиков происходит иначе;
отмеченного для более низких концентраций плато не наблюдается. Кривая гибели в концентрации 0,1 мг/л имеет промежуточную форму между кривыми, описанными выше для менее и более высоких концентраций, — до 22 дня гибнет 40 % головастиков, затем наблюдается торможение гибели, длящееся около 10 дней, после чего погибает большинство особей. Все кривые гибели головастиков озёрной лягушки в более высоких концентрациях нефти описываются с помощью нелинейной регрессии, теоретически вычисленные уравнения регрессии являются квадратичными.
По мнению Т. Ю. Песковой [2001], гибель головастиков, как правило, на чинается не сразу после помещения их в раствор токсиканта, так как необходи мо время для накопления этого токсиканта в организме животных. При низких концентрациях токсиканта гибнут особи с наиболее высокой индивидуальной чувствительностью к нему, а при повышении концентрации число погибших увеличивается за счёт гибели более резистентных особей.
День начала гибели головастиков в различных концентрациях нефти, по на шим данным, не изменяется. 50%-ная гибель в концентрации 1 ПДК — 0,05 мг/л наступает значительно позже, чем в более высоких концентрациях. Во всех иссле дованных концентрациях нефти, кроме максимальной, 100 % гибель не достигну та и часть головастиков (от 13,3 до 40 %) метаморфизирует. По нашему мнению, это свидетельствует о возможности выживания личиночных стадий земноводных в природных условиях, где мы отмечали концентрации нефти до 0,28 мг/л.
В сравнительно низких концентрациях нефти — 0,02 и 0,05 мл/л и контро ле число головастиков, завершивших метаморфоз, составляет в среднем 80 % [Пескова, Жукова, Белоконь, 1998], причём сроки метаморфоза головастиков в растворах нефти сдвигаются. Более высокие концентрации нефти, исследован ные нами, действуют аналогично, сдвигая эти сроки, но при этом количество головастиков, закончивших развитие, также изменяется. Метаморфоз в раство рах нефти начинается на 13—31 день позднее по отношению к контролю.
Анализ сроков наступления наиболее важных стадий развития у головасти ков озёрной лягушки в контроле и опытных растворах нефти показан в таблице 2.
Таблица 2 — Дни достижения основных стадий развития личинками озёрной лягушки в контроле и в присутствии нефти Стадия развития Концентрация 47-я — хорошо 51-я — хорошо 54-я — конец мета нефти, мг/л развитые задние развитые передние морфоза конечности конечности Контроль — 0 27—46 39—57 39— 0,01 27—52 39—52 52— 0,05 33—52 46—57 52— 0,1 39—64 52—64 57— 0,25 46—64 52—70 64— 0,5 46—52 52—57 —* Примечание — * — все головастики погибли В контроле и самой низкой концентрации нефти 47-я и 51-я стадии разви тия происходят одновременно. Более высокие концентрации нефти отодвигают дни наступления 47-й стадии на 6—19, а 51-й — на 7—13 дней, соответственно.
Таким образом, отмечено замедление развития головастиков озёрной лягушки в присутствии нефти в концентрациях от 1 до 10 ПДК по сравнению с контролем и самой низкой из исследованных концентраций нефти. Нарастание отставания в сроках достижения 47-й и 51-й стадий развития происходит дозозависимо.
Метаморфоз у контрольных головастиков растянут более чем на 30 суток.
Видимо, это связано с большим абсолютным числом метаморфизирующих в кон троле особей. В низких концентрациях нефти (0,01 и 0,05 мг/л) метаморфоза до стигает 30—40 % особей, они проходят эту стадию в сжатые сроки — за 5— дней. Под действием концентрацийх нефти, увеличенных в 10 раз по сравнению с предыдущими, метаморфизирует только 6,7—13,3 % головастиков. В концен трации нефти 0,5 мг/л до стадии метаморфоза не дожил ни один головастик.
Одним из проявлений хронической интоксикации личинок амфибий яв ляется удлинение личиночного развития [Пескова, 2001]. По нашим данным, большинство исследованных концентраций нефти замедляют развитие голова стиков озёрной лягушки: позднее наступают 47-я и 51-я стадии развития, позд нее происходит и метаморфоз, однако головастики в большинстве вариантов опыта проходят эти стадии в более сжатые сроки.
Все головастики (контроль и опыты) были одинаковых размеров: длина тела колебалась в пределах 24—30 мм. Замедление темпов их роста наступало не сразу, а через месяц после начала опыта, когда головастики находились на 46-й стадии развития (зачатки задних конечностей). При этом различий в средних линейных размерах головастиков из вариантов опыта с различными концентрациями нефти, не обнаружено. Аналогичные данные были получены для головастиков озёрной и остромордой лягушек и дальневосточной жерлянки, развивавшихся в низких концентрациях нефти [Данилова, 1990;
Пескова, Жукова, Белоконь, 1998]. У осе тровых рыб, наоборот, к 2—4 месяцу от начала наблюдений в растворах нефти был отмечен скачкообразный прирост длины тела [Обухов, Крючков, 2004].
Таким образом, данные, полученные при анализе комплекса показателей личиночного развития, свидетельствуют о том, что концентрации нефти в диа пазоне 0,01—0,05 мг/л не оказывают токсического действия на головастиков озёрной лягушки. Концентрации 0,1—0,25 мг/л являются эффективными, то есть делают выживание головастиков затруднительным, но возможным, снижая их численность за счёт наиболее чувствительных особей. При этом достаточно ре зистентные особи могут существовать и в таких условиях. Только концентрация нефти 0,5 мг/л (10 ПДК) является для личинок озёрной лягушки летальной. В ней происходит 100%-ная гибель головастиков до достижения ими метаморфоза.
Глава 5. Изменения некоторых физиологических и биохимических характеристик озёрной лягушки под действием нефти 5.1. Гематологические показатели озёрной лягушки под действием различных концентраций нефти Были рассмотрены изменения показателей красной и белой крови озёр ных лягушек под действием следующих концентраций нефти — 0 (контроль), 0,05, 0,1 и 0,5 мг/л, результаты приведены на рисунке 4.
Гемоглобин Эритроциты Лейкоциты — контроль — 0,01 мг/л — 0,05 мг/л — 0,5 мг/л Рисунок 4 — Количество гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов в крови озёрной лягушки при экспозиции в различных концентрациях нефти (в % по отношению к контролю) По нашим данным, количество гемоглобина в крови озёрной лягушки во всех исследованных концентрациях нефти достоверно выше, чем в контроле — в 1,1, 1,3 и 1,45 раза соответственно, причём, это возрастание происходит до зозависимым образом. Аналогичная картина отмечена и для числа эритроцитов, их количество статистически достоверно возрастает в 1,1, 1,2 и 1,5 раза. Увели чение кислородной ёмкости крови у амфибий при постоянном обитании в водо ёмах, загрязнённых поллютантами, можно считать адаптивным [Пескова, 2001].
В литературе есть сведения, что под действием нефти как у земноводных, так и у рыб отмечен достоверный эритроцитоз, а содержание гемоглобина мо жет колебаться как в сторону его повышения, так и понижения [Абдуллаева, 2007;
Габибов, Курбанова, 2008;
Каниева, 2002;
Пескова, Шарпан, 2007]. Су ществует мнение, что у водных позвоночных, уровень гемоглобина не являет ся характерным показателем токсикоза [Житенева, Макаров, Рудницкая, 2004].
В мазках мы обнаруживали микроядра эритроцитов. В контроле и концен трации нефти 0,01 мг/л у озёрной лягушки количество эритроцитов с микро ядрами одинаковое. При повышении градиента концентрации нефти процент клеток с микроядрами достоверно возрастает с 1,7/1 000 клеток в контроле до 5,3/1 000 клеток в растворе нефти самой высокой концентрации (tфакт = 5, при t05 = 1,96). В крови рыб в растворе нефти концентрации, равной 10 ПДК, было отмечено 7,3/1 000 клеток [Абдулаева, 2007].
Общее количество лейкоцитов, по нашим данным, максимально у лягу шек в контроле (рисунок 4), а во всех вариантах опыта отмечена статистически достоверная лейкопения. Степень лейкопении разная: в самой низкой концен трации нефти число лейкоцитов в 1,2 раза ниже, чем в контроле, а в самой высокой концентрации нефти — ниже почти вдвое (в 1,85 раза). Трёхсуточное пребывание в нефти концентраций от 0,0005 до 0,2 мг/л вызывает у лягушек существенный и возрастающий по мере увеличения концентрации токсиканта лейкоцитоз в 1,9—8,3 раза [Пескова, Шарпан, 2007]. Можно говорить о том, что при кратковременном воздействии токсиканта проявляется лейкоцитоз, свидетельствующий о защитной функции организма. При более длительном содержании лягушек в тех же концентрациях нефти происходит снижение за щитной функции крови.
Известно, что показатель содержания лейкоцитов неполноценен без ана лиза соотношения числа различных их типов. В целом, кровь озёрной лягушки, по нашим данным, имеет лимфоидный характер, как это отмечалось и в других исследованиях [Жукова, 1987;
Чернышева, Старостин, 1994;
Жукова, Песко ва,1999;
Романова, 2005б]. Количество лимфоцитов достоверно увеличивается во всех вариантах опытов по сравнению с контролем в 1,4 раза (рисунок 5).
0 0,01 0,05 0, — лимфоциты — моноциты Рисунок 5 — Относительное количество агранулоцитов в крови озёрных лягушек под действием нефти различных концентраций Уровень лимфоцитоза, по нашим данным, не зависит от величины исследо ванной концентрации нефти. При трёхсуточной экспозиции лягушек в концен трациях нефти 0,01 и 0,05 мг/л уровень числа лимфоцитов не менялся по сравне нию с контрольными животными [Пескова, Шарпан, 2007]. Следовательно, лим фоцитоз появляется при увеличении продолжительности воздействия нефти.
В крови озёрной лягушки во всех исследованных концентрациях нефти до стоверно и резко (в 10 раз) снижено содержание моноцитов по сравнению с кон тролем. Моноцитопения озёрных лягушек в присутствии нефти, по нашему мне нию, является признаком патологии. У пресноводных рыб загрязнение воды неф тью вызывало увеличение количества моноцитов, сохраняющееся как в остром, так и хроническом опытах [Абдуллаева, 2007;
Габибов, Курбанова, 2008], а в другом эксперименте (с морскими видами рыб) — моноцитопению [Котов, 1976].
В крови опытных лягушек под влиянием нефти различных концентраций изменяется также и количество клеток гранулоцитного ряда: нейтрофилов, ба зофилов и эозинофилов (рисунок 6).
0 0,01 0,05 0, — палочкоядерные нейтрофилы — сегментоядерные нейтрофилы — базофилы — эозинофилы Рисунок 6 — Относительное количество гранулоцитов в крови озёрных лягушек под действием нефти разных концентраций Базофилы — самая редкая группа гранулоцитов в периферической крови и кроветворных органах, выполняющая дезинтоксикационную функцию в ор ганизме [Житенева, Макаров, Рудницкая, 2004]. В наших исследованиях среди лейкоцитов контрольных озёрных лягушек базофилы были единичны, а у под опытных лягушек базофилы вообще не были обнаружены.
Эозинофилы проявляют ту же тенденцию, что и базофилы — в самой низкой концентрации нефти их количество снижено в 20 раз по сравнению с контролем, а в более высоких концентрациях они вообще не встречены. Отсут ствие эозинофилов в крови лягушек после трёхдневного пребывания в нефти и эозинофилопения у рыб при хронических стрессах и тяжёлых токсикозах различной природы отмечено в литературе [Житенева, Макаров, Рудницкая, 2004;
Пескова, Шарпан, 2007].
У лягушек из всех исследованных концентраций нефти по сравнению с контрольными особями отмечено достоверное снижение количества сегмен тоядерных нейтрофилов и возрастание количества палочкоядерных нейтро филов. При этом общее число нейтрофилов также несколько снижено. Расчёт индекса сдвига ядер нейтрофилов показал, что у лягушек во всех вариантах опыта происходил сдвиг влево, увеличивающийся по мере возрастания кон центрации нефти (индекс сдвига ядер 0,79, 1,02 и 2,27 против 0,10 в контроле).
Известно, что перемещение картины крови влево, т. е. увеличение числа моло дых, незрелых нейтрофилов является одним из важнейших признаков наличия в организме инфекционного процесса или токсикоза [Тодоров, 1968].
В целом, лейкограмма крови озёрной лягушки под действием нефти по казывает достоверное увеличение числа лимфоцитов и палочкоядерных ней трофилов при очень сильном снижении количества моноцитов, менее суще ственном — сегментоядерных нейтрофилов и исчезновении эозинофилов и базофилов. Если принять во внимание, что общее количество лейкоцитов у лягушек уменьшается, то имеет место истинная нейтропения, моноцитопения, базопения и эозинопения.
Описанного комплекса изменений лейкоцитарной формулы крови земно водных не было отмечено ни в одном из предыдущих исследований, где рас сматривалось влияние других токсикантов. Следовательно, в этом проявляется специфичность действия нефти как вещества, загрязняющего среду обитания амфибий.
Действие исследованных концентраций нефти на кровь озёрной лягушки проявляется в появлении морфологических изменений клеток красной и белой крови. В мазках крови озёрной лягушки из контроля наблюдается обратимая агглютинация эритроцитов. У части эритроцитов имеется вакуолизированная цитоплазма. Под действием различных концентраций нефти отмечена вакуоли зация, пойкилоцитоз, инвагинация и токсическая зернистость цитоплазмы эри троцитов, увеличивающие степень своего проявления в градиенте концентраций нефти. Часто эритроциты имеют фестончатые контуры, что свидетельствует о нарушении их осмотической резистентности, наблюдается гипохромазия — по светление окраски цитоплазмы и её неравномерное окрашивание. В концентра ции 0,5 мг/л нефти в белой крови земноводных наблюдается явный агранулоци тоз: подавляющее большинство лейкоцитов представлено лимфоцитами.
5.2. Интенсивность перекисного окисления липидов в тканях озёрной лягушки под действием нефти Процессы перекисного окисления липидов, играя важную роль в нор мальном функционировании клетки, выступают и как ранние ключевые звенья ответной реакции организма на стрессорные состояния. Для водных позвоноч ных установлено, что изменения интенсивности перекисного окисления липи дов, происходящие под действием токсикантов, являются надёжным индика торным признаком загрязнения водоёма [Руднева, 2005].
Мы определяли интенсивность процессов перекисного окисления липи дов в тканях озёрной лягушки в контроле и под влиянием нефти различных концентраций по содержанию одного из первичных продуктов окисления ли пидов — перекисей. Результаты опытов приведены в таблице 3.
Наибольшая активность перекисных процессов из исследованных нами органов характерна для почек и сердца озёрной лягушки. В литературе показа но, что наибольшая интенсивность процессов перекисного окисления липидов характерна для сердца земноводных [Айвазян, 2008].
Таблица 3 — Перекисное число липидов различных тканей земноводных по сле экспозиции в растворах нефти (мМоль О/кг) Концентрация нефти, мг/л Орган 0 0,05 0, 187,5 ± 12,34 288,9 ± 20,68 199,3 ± 16, Печень 155,9 ± 10,20 166,7 ± 13,46 76,0 ± 8, Мышцы 944,4 ± 28,50 416,7 ± 20,42 500,0 ± 18, Почки 264,7 ± 11,32 650,0 ± 14,87 384,6 ± 10, Сердце 80,1 ± 10,83 75,0 ± 9,78 43,6 ± 6, Тонкий кишечник Процессы перекисного окисления липидов в разных органах, по нашим данным, имеют различную динамику. Так, в печени и сердце лягушек, находив шихся в растворе нефти концентрации 0,05 мг/л в течение 10 дней, происходит увеличение интенсивности перекисных процессов по сравнению с контролем (в 1,5 и 2,5 раза соответственно), в почках, наоборот, отмечено снижение в 2, раза, а содержание перекисей в мышечной ткани и тонком кишечнике не ме няется. У лягушек, находившихся в более концентрированном растворе нефти (0,5 мг/л), количество перекисей в печени возвращается к контрольным пока зателям, в мышцах, почках и тонком кишечнике снижается по сравнению с контролем (в 1,8—2,0 раза), а в сердце увеличивается в 1,5 раза.
Необходимо отметить, что наиболее лабильной является система окис ления липидов в органах мезодермального происхождения (сердце и почках).
В целом можно говорить о том, что концентрация нефти, равная 1 ПДК, вы зывает усиление интенсивности процессов перекисного окисления липидов по сравнению с контролем, а концентрация в 10 ПДК — угнетает.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нефть является комплексным токсикантом сложного строения. Обычно в момент поступления в водоём большая часть нефтепродуктов сосредоточена в плёнке на поверхности воды. Затем происходит перераспределение между её основными формами, направленное в сторону повышения доли растворённых, эмульгированных и сорбированных нефтепродуктов. Последние являются наиболее опасными, т. к. служат источником хронического загрязнения водо ёма нефтью.
Определение уровня нефтяного загрязнения рукавов устья р. Дон с помо щью химико-токсикологического анализа свидетельствует о сравнительно не высоком уровне содержания нефтепродуктов в воде — в пределах до 5,6 ПДК, тогда как биоиндикация по показателям флуктуирующей асимметрии позво ночных гидробионтов показала достаточно сильное влияние нефтепродуктов на гидробионтов из рукавов устья р. Дон. Однако, устойчивые виды водных позвоночных животных, такие как серебряный карась и озёрная лягушка, мо гут поддерживать своё существование на всех этапах онтогенеза в данных ус ловиях.
Динамика некоторых изученных физиологических и биохимических по казателей является специфичной для действия нефти. Только после пребыва ния в растворах нефти у озёрных лягушек была обнаружена лейкопения, а так же отсутствие базофилов и эозинофилов. Также отмечено отсутствие значи мого вклада печени в процессы накопления и детоксикации нефти. Основная роль в кумуляции углеводородов нефти принадлежит почкам.
Под действием нефти увеличивается смертность головастиков, однако вариабельность скорости роста и развития, отмеченная под действием других токсикантов, не меняется по сравнению с контрольными особями.
Изменения физиолого-биохимических параметров озёрной лягушки мо гут быть как адаптивными, так и патологическими. К первым относятся лим фоцитоз, эритроцитоз, увеличение кислородной ёмкости крови, увеличение скорости перекисного окисления липидов под действием сравнительно низких концентраций нефти, ко вторым — моноцитопения, сдвиг нейтрофилов влево, исчезновение базофилов и эозинофилов, угнетение перекисных процессов в более высоких концентрациях нефти.
Сдвиг равновесия между адаптационными и патологическими процесса ми, происходящий в организме водных позвоночных в ту или иную сторону, зависит от концентрации нефти в воде. При действии низких концентраций нефти (специфичных для отдельных видов позвоночных гидробионтов) на клеточном, организменном и популяционном уровнях преобладают адаптив ные процессы, а при более высоких — патологические.
ВЫВОДЫ 1. Максимальный уровень нефтяного загрязнения устья р. Дон в период исследований составлял 0,31 мг/л (6,2 ПДК), а средние величины колеблись в пределах 0,03—0,09 мг/л, что соответствует 0,6—1,8 ПДК.
2. Биоиндикация тех же водотоков по показателям флуктуирующей асим метрии меристических признаков озёрной лягушки и серебряного карася сви детельствует о глубоких нарушениях стабильности развития, оцениваемых 4—5 баллами по шкале отклонений.
3. Концентрации нефти в диапазоне 0,01—0,5 мг/л вызывают смертность 60—100 % головастиков озёрной лягушки. Головастики 46-й стадии развития (хорошо развитые задние конечности) и 57-й стадии развития (хорошо разви тые передние конечности) в различных вариантах опыта меньше контрольных на 10,7—11,9 мм. Наступление данных стадий происходит позже, чем в кон троле на 6—19 дней и 7—13 дней соответственно.
4. Под действием концентраций нефти в диапазоне 0,01—0,5 мг/л у озёр ной лягушки отмечен дозозависимый эритроцитоз и возрастание количества гемоглобина (в 1,1—1,5 раз), а также увеличение количества микроядер в эри троцитах (в 3,0 раза). На фоне общей лейкопении (в 1,2—1,8 раз) достоверно увеличивается относительное число лимфоцитов и палочкоядерных нейтро филов при снижении количества моноцитов и сегментоядерных нейтрофилов и полном исчезновении базофилов и эозинофилов.
5. Под действием нефти в концентрации 0,05 мг/л максималь ная интенсивность процессов ПОЛ отмечена в сердце озёрной лягушки (650,0 мМоль О/кг), в концентрации 0,5 мг/л — в почках (500,0 мМоль О/кг).
Минимальная интенсивность ПОЛ в обоих случаях характерна для тонкого ки шечника (43,6 и 75,0 мМоль О/кг).
6. Озёрная лягушка является аккумулирующим биомонитором по отно шению к нефти. При концентрации нефти в воде 0,05 мг/л наиболее интенсив но накапливают нефть лёгкие, почки и гонады (26,1—49,3 мг/кг), а при кон центрации в 0,5 мг/л — только почки (38,8 мг/кг). Уровень кумуляции нефти в печени озёрной лягушки минимален во всех вариантах опыта и составляет 4,7—10,0 мг/кг.
7. Концентрация нефти в 0,01 мг/л является для водных позвоночных пороговой, концентрации в пределах 0,01—0,5 мг/л (0,2—10 ПДК) оказыва ют токсический эффект на взрослых особей водных позвоночных, при этом максимальная из изученных концентраций (0,5 мг/л) — летальна для личинок водных позвоночных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1.* Кармазин А. П. Использование гематологических показателей озёр ной лягушки Rana ridibunda (Pallas, 1771) для определения зоны токсического действия нефти / А. П. Кармазин, Т. Ю. Пескова // Современная герпетология.
2010. № 1/2. С. 3—7.
2.* Буков Н. Н. К проблеме мониторинга минорных концентраций антро погенных поллютантов в водных экосистемах / Н. Н. Буков, К. В. Ларионов, В. Т. Панюшкин, А. П. Кармазин, Л. А. Костылева, Т. Ю. Пескова // Экология и промышленность России. 2010. № 6. С. 35—37.
3.* Кармазин А. П. Обследование загрязнения нефтепродуктами при брежной зоны Таманского полуострова / А. П. Кармазин, Н. Н. Буков, Т. Ю. Пе скова // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион.
Естественные науки. 2010. № 5. С. 19—21.
4. Кармазин А. П. Загрязнения вод и придонного грунта устья Дона / А. П. Кармазин, Л. А. Костылева, Н. Н. Буков // Новые технологии и прило жения современных физико-химических методов для изучения окружающей среды. Ростов н/Д, 2009. С. 179—180.
5. Костылева Л. А. Пестицидные загрязнения вод и придонного грунта восточного района Азовского моря / Л. А. Костылева, А. П. Кармазин, В. Т. Па нюшкин, Н. Н. Буков // Современные направления теоретических и приклад ных исследований — 2009. Одесса, 2009. С. 72—73.
* — работа опубликована в издании, рекомендованном ВАК РФ 6. Буков Н. Н. Мониторинг антропогенных поллютантов в водных эко системах Краснодарского края / Н. Н. Буков, К. В. Ларионов, В. Т. Панюшкин, А. П. Кармазин, Л. А. Костылева, Т. Ю. Пескова // Региональные особенности функционирования и взаимодействия предприятий рекреационной отрасли и промышленного сектора. Туапсе, 2010. С. 119—120.
7. Кармазин А. П. Сравнение различных типов организмов-биомонито ров антропогенного загрязнения среды / А. П. Кармазин, Т. Ю. Пескова // Ре гиональные особенности функционирования и взаимодействия предприятий рекреационной отрасли и промышленного сектора. Туапсе, 2010. С. 129—131.
8. Кармазин А.П. Динамика перекисного окисления липидов озёрной ля гушки под действием нефти / А. П. Кармазин // Молодой учёный. 2010. № 8.
С. 188—190.
Кармазин Антон Павлович БИОМОНИТОРИНГ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ УСТЬЯ РЕКИ ДОН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОДНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ Автореферат Подписано в печать 10.11.2010 г. Формат 6084 1/16.
Бумага тип 1. Гарнитура Таймс Нью Роман. Печать цифровая.
Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 0123. Тираж 100 экз.
Кубанский государственный университет.
350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.
Типография Кубанского государственного университета.
350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149.