Пептидные экстракты лекарственных растений: изучение состава и противоопухолевой активности
На правах рукописи
Тепкеева Инна Ивановна
ПЕПТИДНЫЕ ЭКСТРАКТЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ:
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
Специальности 03.00.05 – ботаника (биологические наук
и)
03.00.04 – биохимия (биологические науки)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук Астрахань – 2009
Работа выполнена в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Научные руководители:
доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Демушкин Владимир Петрович доктор биологических наук, профессор Бакташева Надежда Мацаковна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Бойко Оксана Витальевна доктор биологических наук, доцент Сагалаев Вадим Александрович
Ведущая организация:
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН, г. Москва
Защита состоится 23 июня 2009г. в 12 часов в актовом зале на заседании диссертационного совета Д 212.009.10 при Астраханском государственном университете по адресу: 414056, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, факс (8512) 22-82-64, E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Астраханского государственного университета.
Автореферат разослан «21» мая 2009г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент Федотова А.В.
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Онкологические заболевания – одни из самых распространенных заболеваний в мире. Наиболее распространены рак молочной железы, рак простаты, рак легкого и рак желудка и прямой кишки. В настоящее время в мире насчитывается более 20 миллионов человек, которым поставлен диагноз «рак», при этом ежегодно во всем мире регистрируется более 10 миллионов новых случаев заболевания раком [http://www.cancer.org/downloads/STT]. К сожалению, согласно прогнозам Всемирной организации здравоохранения, в ближайшее время количество онкологических заболеваний будет продолжать расти. Поэтому, поиск новых лекарственных препаратов для борьбы с раком является одним из наиболее актуальных и приоритетных направлений научных исследований. Механизмы этиологии и патогенеза раковых заболеваний окончательно не выяснены из-за большой сложности и многообразия молекулярных механизмов, происходящих при этом процессов.
Многолетний опыт применения различных медицинских препаратов (свыше 200) позволил выявить их позитивные стороны, однако, имеются и серьезные недостатки - токсические влияния на нормальные органы и ткани, что постоянно стимулирует поиск новых более безопасных лекарственных средств.
Анализ информации о существующих и новых препаратах для терапии раковых заболеваний показал, что наибольшее внимание в последнее время уделяется белкам и пептидам. Кроме того, обнаружено, что препараты пептидной природы могут предотвращать возникновение рака (профилактика рака) и защищать нормальные клетки (в том числе стволовые клетки костного мозга) при проведении стандартной химио- и радиотерапии.
Исследования показали, что у некоторых пептидных препаратов, полученных из растительного сырья, имеется выраженная противоопухолевая активность (Goransson U., et al., 1993;
Dutton J.L., et al., 1994;
Jennings C., et al., 2001;
Daly N.L., et al., 2002;
Rosengren K.J., et al., 2003;
Gara O.G., et al., 2006), поэтому дальнейшие работы в этом направлении весьма перспективны.
В стандартной медицине используется целый ряд лекарственных растений, обладающих противоопухолевой активностью. Поэтому представлялось целесообразным изучение противоопухолевой и цитостатической активности пептидных экстрактов, выделенных из этих растений.
Цель исследования. Разработка методики получения экстрактов из растительного сырья, содержащих пептиды (далее пептидные экстракты), исследование их состава, противоопухолевой и цитостатической активности, а также оценка перспективности их использования для создания препаратов для терапии онкологических заболеваний человека.
Задачи исследования:
1. На основе сбора и анализа литературных данных выбрать перспективный растительный материал.
2. Разработать рациональную методику экстракции пептидов из растений.
3. Исследовать полученные пептидные экстракты по аминокислотному составу и количеству компонентов, входящих в пептидный экстракт растения (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс спектроскопическим анализом методом матричной лазерной десорбционной ионизации (МАЛДИ)).
4. По разработанной методике получить пептиды в количествах, необходимых для проведения биологических испытаний по изучению их активности in vitro и in vivo;
5. Изучить противоопухолевую активность на животных моделях рака молочной железы и лимфолейкоза и цитотоксическое действие на стандартных клеточных линиях рака легких, рака молочной железы и рака шейки матки человека.
Научная новизна 1. Разработана новая методика экстракции пептидов растений.
2. Впервые на основе разработанной методики получены пептидные экстракты лекарственных растений, разрешенных Фармакопеей РФ.
3. Определена противоопухолевая активность пептидных экстрактов зверобоя продырявленного и смеси растений (девясила высокого, хвоща полевого, чистотела большого и гриба чаги) на спонтанных и перевиваемых мышиных моделях РМЖ и перевиваемой модели Т-лимфолейкоза.
4. Определена цитостатическая активность следующих экстрактов: чая зеленого, смеси растений на клеточных линиях рака легкого человека А549 и Н1299, и клеточной линии рака шейки матки человека HeLa. Выявлена цитотоксическая активность экстрактов гриба чаги и чая зеленого на клетках линии Н1299 немелкоклеточного рака легких человека.
5. На клеточных линиях рака молочной железы (РМЖ) человека MCF-7 и MCF-10 и фибросаркомы человека HT1080 показана цитостатическая активность пептидных экстрактов чистотела большого, зверобоя продырявленного, девясила высокого и вышеуказанной смеси растений.
Научно-практическая значимость исследования состоит в том, что материалы диссертации могут быть использованы для последующих этапов разработки лекарственных препаратов, обладающих противоопухолевым действием (оптимизация прототипа, опытное производство, доклинические и клинические испытания). При положительных результатах испытаний возможно внедрение пептидных экстрактов в клинической медицине качестве лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана новая методика получения пептидных экстрактов растений.
2. По разработанной методике выделены и изучены пептидные экстракты лекарственных растений.
3. Изучена противоопухолевая активность ряда пептидных экстрактов.
4. Экстракт смеси растений (чистотела большого, хвоща полевого, девясила высокого и гриба чаги) обладает широким спектром противоопухолевой активности, как на моделях in vivo, так и in vitro.
Апробация работы. Диссертация обсуждена на заседании научного коллоквиума лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. ак. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва, 2008г.) и заседании кафедры ботаники и зоологии естественно-математического факультета Калмыцкого Государственного Университета (г. Элиста, 2008г.).
Основные положения работы были изложены на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (г. Санкт-Петербург, 2005г.), IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2006г.), Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Сапожниковой Е.В. «Биология: теория, практика, эксперимент» (г. Саранск, 2007г.), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (г. Москва, 2008г.), III Международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (г. Бангкок, Таиланд, 2008г.), V Всероссийской межвузовской конференции молодых учёных (г. Санкт-Петербург, 2008г.), 42-ой ежегодной Всероссийской конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации» (г. Тюмень, 2008г.), Объединенном иммунологическом форуме - 2008 (г. Санкт-Петербург, 2008г.), Международной конференции «Наукоемкие химические технологии – 2008» (г. Волгоград, 2008г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, включая 4 статьи и 2 тезиса в научных журналах, рекомендуемых ВАК.
Благодарности. Автор выражает благодарности Моисеевой Е.В. и Чаадаевой А.В. (ИБХ РАН) за помощь в изучении противоопухолевой активности на животных моделях, Зборовской И.Б. и Аушеву В.Н. (НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н Блохина РАМН) за помощь в изучении цитостатической активности, Гаранину С.К. и Васьковскому Б.В. (ИБХ РАН) за помощь в выполнении анализа компонентов пептидных экстрактов и их аминокислотного состава, Ташлицкому В.H. (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ) за помощь в количественном определении углеводов.
Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям Владимиру Петровичу Демушкину и Надежде Мацаковне Бакташевой за неоценимую помощь и поддержку, ценные замечания и предложения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты проведенных исследований), выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы составляет 131 страница, содержит 7 таблиц и 55 рисунков. Список литературы включает 205 источников отечественных и зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ВВЕДЕНИЕ Во введении обозначены актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна, научно-практическая значимость исследования, сведения об апробации работы и основные положения, выносимые на защиту.
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР В главе дается обзор литературы данных о противоопухолевых препаратах известных в мировой практике. Противоопухолевые препараты сгруппированы по классам химических соединений. Дано описание основных этапов разработки лекарственных препаратов, а также методик экстракции биологически активных природных соединений.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Разработана рациональная методика экстракции пептидного материала. В качестве экстрактанта использовали водный раствор уксусной кислоты, поскольку в этих условиях практически нерастворимы подавляющее число полисахаридов, биофлавоноидов, стероидов, гликозидов, витаминов и др.
вещества природного происхождения (The Merk Index. An encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals. 14th Ed., 2006).
100 г растительного сырья растирали в фарфоровой ступке, замачивали в 500-600 мл 1М уксусной кислоты и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Суспензию периодически (3-5 раз через 10 мин) обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой бане. Далее суспензию нагревали на водяной бане при 100°С в течение 60 мин, охлаждали и центрифугировали в стаканах емкостью 250 мл на центрифуге J2-21 (Beckman, Германия), (ротор RPM, ser E3628) в течение 40 мин при 75000 g. К супернатанту добавляли ацетон в объемном соотношении 2:5 и оставляли на ночь в холодильнике при +4°С. Выпавший осадок отделяли центрифугированием в стаканах емкостью 50 мл на центрифуге J2-21 Beckman (ротор 17000 RPM, ser E21759) в течение 40 мин при 40000 g. Для улучшения растворимости пептидного экстракта в воде осадок растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и лиофилизовали. Операцию повторяли дважды, растворяя сухой остаток в 20-50 мл воды.
Длительная температурная обработка при 100 0С позволила получать экстракты, свободные от белков и других полипептидов. Соотношение по объему ацетон - супернатант (5:2) было выбрано таким образом, чтобы аминокислоты и другие низкомолекулярные соединения оставались в растворе.
Данная методика позволяет получать пептидные экстракты с хорошим выходом и в достаточных количествах для биологических испытаний in vivo и in vitro.
Все пептидные экстракты, полученные по разработанной методике, охарактеризованы методами аминокислотного анализа и обращено-фазной и ионообменной ВЭЖХ и масс-спектроскопическим анализом методом матричной лазерной десорбционной ионизации (МАЛДИ). Масс-спектры снимали на приборе Ultraflex Tof/Tof (Bruker, Германия).
Для проведения ОФ ВЭЖХ использовали хроматографическую систему Du Pont 8800 (Du Pont, США), УФ детекцию проводили при двух длинах волн – 226 нм (детектор Uvicord SII, Pharmacia) и 254 нм (детектор Du Pont 860).
Пептидные экстракты в количествах 0,5 – 2,5 мг растворяли в 50 мкл 0,1 %-ной трифторуксусной кислоты и наносили на колонку 4 х 250 мм Nucleosil 5/C- (Macherey-Nagel) или 4,6 х 250 мм Ultrashere ODS(PTH) (Altex), уравновешенную 0,1 %-ной трифторуксусной кислоты (буфер 1). Пептиды элюировали линейным градиентом буфера 2 (80 % -ном растворе ацетонитрила в буфере 1). Скорость элюции 1,0 мл/мин.
Ионообменную ВЭЖХ проводили на хроматографе LC 3000 (Biotronik, Германия) по методике, ранее разработанной в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН (Шваб О.В. и др., 1999).
Пептидные экстракты в количествах 0,5 – 2,5 мг растворяли в 20-60 мкл буфера, содержащего в 1 л 0,82 г ацетата натрия, 75 мл метанола, 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мкл каприловой кислоты и 10 % муравьиной кислоты так, чтобы концентрация пептидов составляла 10-100 мг/мл, и наносили на колонку 1 х 125 мм со смолой ВТ-2410 (Biotronik, Германия), уравновешенную буфером А.
Для элюции использовали: буфер А, содержащий в 1 л 8,2 г ацетата натрия, 75,0 мл метанола, 5,0 мл ледяной уксусной кислоты, 4,0 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 3,30;
буфер Б, содержащий в 1 л 4,0 г гидроксида натрия, 2,7 мл ледяной уксусной кислоты, 2,5 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 3,60;
буфер В, содержащий в 1 л 4,0 г гидроксида натрия, 2,7 мл ледяной уксусной кислоты, 2,5 мл муравьиной кислоты и 100 мкл каприловой кислоты, рН 4,90, и буфер Г, содержащий в 1 л 1,0 мл ледяной уксусной кислоты, 83 мМ тринатрий-фосфата, 1,0 г EDTA и 100 мкл каприловой кислоты, рН 10,50.
Пептиды элюировали последовательно буферами А (30,5 мин при 40°С), Б (7,5 мин при 60°С), В (12 мин при 60°С) и Г (27 мин при 60°С). Скорость элюции 0,2 мл/мин. Для визуализации использовали раствор нингидрина, содержащий 20 г нингидрина, 0,6 г гидриндантина, 50 мл фенола, 550 мл монометилового эфира этиленгликоля и 400 мл 4 М ацетата натрия (рН 5.5).
Детекцию проводили при 440 и 570 нм.
Для изучения биологической активности пептидных экстрактов выполнили несколько серий экспериментов на животных. Использовали мышей следующих линий: CBRB-Rb(8.17)1Iem, BLRB-Rb(8.17)1Iem, BALB/cJCitMoise с перевитым и спонтанным РМЖ, а также мышей линии A/WySnJCitMoise с перевитым Т-лимфолейкозом (Т-ЛЛ). Линии мышей зарегистрированы в международном перечне лабораторных животных (Moiseeva E.V., et al., 1989;
Festing M.F.W., et al., 1990;
International index of laboratory animals, 1993;
Festing M.F.W., et al., 1999), модели рака молочных желез и лимфолейкоза подробно описаны (Моисеева Е.В., Российский биотерапевтический журнал, 2008). В каждой опытной и контрольной группах было не менее 7 мышей одного пола и возраста. Модели различались по (1) времени применения препарата относительно начала роста опухолей (стартовые модели – лечение сразу после перевивки или обнаружения спонтанной опухоли, и терапевтические модели – воздействие на развившуюся опухоль), (2) месту перевивки (подкожные – п.к., интраперитонеальные – и.п.), (3) степени прививаемости опухолей (50%-й и 100%-й прививаемостью), (4) скорости проявления и роста пальпируемых опухолей до их видимого проявления и (5) скорости роста опухолей после их видимого проявления (медленно- и быстрорастущие).
В соответствии с выбранными параметрами моделей, на день 0 всем реципиентам перевивали опухолевые клетки (ОК) стандартно в дозе 106 ОК.
Перевивку ОК производили подкожно в область правой подмышечной впадины. В некоторых экспериментах проводили и.п. перевивку ОК.
На следующий день опытным животным однократно локально в область перевивки вводили пептидные экстракты растений в дозе 1 мг в 0,1 мл физиологического раствора на мышь. Контрольным животным вводили аналогичным образом одновременно лишь физиологический раствор в том же объеме. Введение препаратов на следующий день после перевивки ОК (так называемая «нулевая» модель) рекомендовано известными онкологическими центрами (РОНЦ РАМН, Москва, РФ и Национальным институтом рака, Бетезда, США). В ряде опытов инъекции были многократными, в зависимости от схемы эксперимента.
Противоопухолевую активность препаратов оценивали по динамике проявления пальпируемого и скорости роста видимого перевитого РМЖ и Т ЛЛ мышей. О локальном противоопухолевом действии экстракта судили по угнетению скорости роста опухолей и о системном - по увеличению продолжительности жизни леченых реципиентов по сравнению с контрольными животными. Видимые глазом опухоли (размером более 4 мм) регистрировали у каждой мыши еженедельно путем измерения трех взаимно перпендикулярных размеров опухоли. На основании полученных результатов вычисляли средний диаметр опухоли для каждого реципиента на данный момент времени по формуле D = (a + b + h)/3, где a – максимальная длина, b – максимальная ширина, h – средняя высота опухоли. Средний диаметр индивидуальной опухоли является адекватным критерием для представления данных о различиях в скорости роста опухоли при экспериментальных воздействиях. Средний диаметр опухоли коррелирует с весом опухоли и является визуально более наглядным способом представления данных по сравнению с объемом (Vodovozova E.L. et al., 2000).
Для оценки противоопухолевого действия анализируемых растительных экстрактов использовали следующие клеточные линии: рака молочных желез человека MCF-7 и MCF-10, фибросаркомы HT1080 человека, немелкоклеточного рака легких человека А549 и Н1299, аденокарциномы шейки матки HeLa. Биологическую активность пептидных экстрактов выявляли, используя МТТ – [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолий бромида], по методике количественного определения выживаемости клеток (МТТ - анализ) (Mossmann T., 1983). Данный этап исследования был выполнен совместно с НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.
Блохина РАМН, г. Москва.
Для обработки данных и оценки достоверности результатов применяли t критерий Стьюдента и U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Для обработки результатов использовали программный продукт Microsoft Office Excel 2007.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Раздел I. Получение и анализ состава пептидных экстрактов В результате сбора и анализа литературных данных были выбраны растения, разрешенные Фармакопеей РФ для использования в качестве лекарственных препаратов и рекомендуемых народной медициной для лечения онкологических заболеваний. В качестве объектов исследования выбрали девясил высокий (Inula helenium L.), зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.), крушину ломкую (Frangula alnus Mill.), лавр благородный (Laurus nobilis L.), чистотел большой (Chelidonium majus L.), чай зеленый (Camellia sinensis Kuntze), хвощ полевой (Equisetum arvense L.) и березовый гриб – чагу (Inonotus obliquus L.). Данное растительное сырье заготавливается фирмами, которые имеют разрешения Фармакологического комитета Министерства здравоохранения РФ, что гарантирует стандартную процедуру получения сырья.
Разработанная методика позволяет получать пептидные экстракты с воспроизводимым компонентным составом. Аминокислотный состав изучаемых растений существенно различается (табл. 1). Так, например, экстракт из девясила содержит значительное количество аргинина (69,24 % от пробы). Гидролизаты экстрактов зверобоя продырявленного, чистотела большого, хвоща полевого и чаги и смеси растений богаты аспарагиновой и глутаминовой кислотами – более 40 % кислых аминокислот от общей массы пробы. Таблица 1.
Аминокислотный состав пептидных экстрактов из растительного сырья (% содержания аминокислот в пробе) Амино- Пептидные экстракты кислот девяси крушин чистоте смесь зверобой лавр чай хвощ чага л а л раст.
а PE-Hp PE-Ln PE-Cs PE-Ea PE-Io PE-Ih PE-Fa PE-Cm PE-Pm Asp 7,36 15,84 14,13 11,64 12,18 20,91 14,24 28,14 16, Glu 5,10 26,98 11,51 14,01 14,17 20,43 20,69 34,59 25, Thr 0,03 2,92 3,59 5,46 4,69 4,94 5,11 1,69 4, Ser 0,02 3,34 5,38 4,92 4,73 4,08 5,15 3,87 4, Pro 6,60 8,54 4,82 16,89 6,83 5,67 7,32 1,47 6, Gly 1,12 7,43 6,49 5,59 3,87 6,86 6,40 6,75 6, Ala 0,02 3,62 5,81 4,39 5,92 4,61 5,38 1,47 2, Val 0,03 1,98 1,72 3,70 1,61 3,49 3,85 0,81 2, Met 0,03 0,06 0,93 0,87 0,91 1,14 1,46 0,04 0, Ile 0,03 0,32 0,72 2,16 0,61 2,25 2,36 0,03 0, Leu 0,03 1,16 2,68 3,51 2,59 3,05 3,40 0,03 1, Phe 0,04 0,07 4,83 1,39 4,74 0,17 1,53 0,04 0, Tyr 0,04 0,07 3,93 4,62 3,51 0,22 3,41 0,05 0, His 1,89 1,99 4,28 2,90 4,39 0,29 0,45 2,12 1, Lys 3,43 6,39 5,79 10,21 5,48 6,06 5,34 5,38 6, Arg 69,24 4,29 9,47 2,71 12,14 2,82 1,90 3,69 11, Гидролизаты пептидных экстрактов крушины ломкой, лавра благородного, чая зеленого и смеси растений содержат как основные, так и кислые аминокислоты.
По данным количественного анализа аминокислот в пептидных экстрактах содержание пептидного материала составляет 85-95 %. Содержание углеводных компонентов в экстрактах по данным анализа углеводного состава (Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им.
М.В. Ломоносова) составляет 5-10 %.
Масс-спектроскопический анализ экстрактов показал, что молекулярные массы компонентов находятся в основном, в диапазоне 400-700 Да и не превышают 1500 Да.
Результаты анализов обращено-фазной ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) и ионообменная ВЭЖХ для экстрактов зверобоя продырявленного PE-Hp и смеси растений PE-PM представлены в виде хроматограмм (рис. 1 и 2).
А А Б Б Рис. 1. Данные хроматографии пептидного Рис. 2. Данные хроматографии пептидного экстракта зверобоя продырявленного. экстракта смеси растений.
А – данные ОФ ВЭЖХ;
А – данные ОФ ВЭЖХ;
Б – данные ионообменной ВЭЖХ Б – данные ионообменной ВЭЖХ Для всех выделенных экстрактов было показано, что использование ионообменной ВЭЖХ более эффективно, чем при использовании обращено фазной ВЭЖХ. Поэтому для характеристики состава пептидных экстрактов использовали ионообменную ВЭЖХ.
Было показано, что наименьшее число компонентов – 3 содержит экстракт чаги, наибольшее – экстракты крушины ломкой – 26, чистотела большого – 23. Другие экстракты также содержат значительное количество пептидов – экстракты хвоща полевого, смеси растений и зверобоя продырявленного по 20 пептидов, девясила высокого и чая зеленого – 17, лавра благородного – 16.
Раздел II. Изучение противоопухолевой активности пептидных экстрактов на мышиных моделях РМЖ и Т-лимфолейкоза in vivo Сравнительный анализ противоопухолевых активностей (при однократных инъекциях) пептидных экстрактов на медленнорастущей подкожной мышиной модели CBRB РМЖ. Исследуемые препараты отличались по степени и продолжительности проявленной противоопухолевой активности, оказав краткосрочное (первая неделя) или долгосрочное действие (вплоть до третьей недели после перевивки опухоли). В первую неделю после перевивки задержка появления опухолей была выявлена для всех пептидных экстрактов.
Пальпируемые опухоли были обнаружены у 33 % леченых пептидными экстрактами мышей, в то время как в контроле опухоли пальпировались у 60 % мышей. Во второй неделе после перевивки задержку появления опухолей наблюдали только в группах, однократно обработанных пептидными экстрактами зверобоя продырявленного PE-Hp и смеси растений PE-Pm.
Пальпируемые опухоли были обнаружены у 67 % леченых мышей, в то время как в контроле опухоли пальпировались у 100 % мышей.
Таким образом, однократные инъекции пептидными экстрактами PE-Fa и PE-Ln оказали краткосрочное влияние на динамику появления опухолей.
Наиболее длительную задержку появления опухолей наблюдали у мышей, обработанных пептидными экстрактами смеси растений PE-Pm и зверобоя продырявленного PE-Hp.
контр PE-Hp PE-PM Диаметр опухоли (мм) 3, 2, 1, 0, 0 1 2 3 Недели Рис. 3. Рост опухолей РМЖ у мышей CBRB, однократно обработанных пептидными экстрактами растений Достоверное замедление роста опухолей на 20 и 25 % на четвертую неделю после перевивки наблюдали только для пептидов зверобоя продырявленного PE-Hp и смеси растений PE-Pm, соответственно (рис. 3). Под действием пептидных экстрактов крушины ломкой PE-Fa и лавра благородного PE-Ln рост опухолей практически не отличался от контроля (данные не представлены).
Из результатов сравнительного анализа следует, что выраженной противоопухолевой активностью после локальной однократной инъекции РМЖ мышей линии CBRB обладали экстракты зверобоя продырявленного PE-Hp и смеси растений PE-PM. Поэтому дальнейшее изучение активности PE-Pm и PE Hp на панели мышиных моделей РМЖ представляется весьма перспективным направлением.
Изучение противоопухолевой активности пептидного экстракта смеси растений PE-Pm на быстрорастущей подкожной мышиной модели BLRB РМЖ.
После обнаружения значительного противоопухолевого эффекта PE-PM на медленнорастущей модели, было начато изучение действия PE-PM на модели, характеризующейся агрессивным инвазивным ростом с макроскопическими метастазами в легкие, печень, почки и селезенку. При испытаниях на быстрорастущей модели, использовали перевиваемую подкожную модель РМЖ мышей линии BLRB при многократном п.к. введении PE-PM вокруг опухоли. В данном эксперименте сингенным самкам провели подкожную перевивку в дозе 106 ОК на мышь. Инъекции PE-PM в дозе 1 мг на мышь проводили п.к. с интервалом в 48 часов, (5 инъекций на курс лечения, дни 1, 3, 5, 7, 9 после перевивки). Противоопухолевую активность препарата оценивали по торможению роста опухоли, уменьшению количества микроскопических метастазов в легких и улучшению выживания леченых мышей по сравнению с мышами контрольной группы.
Многократное (5 инъекций) лечение привело к значительному замедлению роста опухоли у леченых мышей по сравнению с контролем (начиная со второй недели и до одного месяца после перевивки ОК) (рис. 4).
Максимальное торможение роста опухоли наблюдали на 16 сутки после перевивки - 45,2 %.
контроль PE-PM Диаметр опухоли, мм -1 0 5 10 15 20 25 Дни Рис. 4. Рост перевитых опухолей у мышей BLRB леченных пептидным экстрактом смеси растений PE-Pm Эксперимент был прекращен на 44 день после перевивки при 80% выживании мышей в леченой группе, тогда как все контрольные животные погибли. Вскрытие показало, что у мышей из экспериментальной группы было меньше очагов метастазирования в легких, кроме того селезенки этих животных при отсутствии метастазов имели вес в три раза больше, чем селезенки контрольных мышей.
Таким образом, экстракт смеси растений PE-PM проявил выраженное долгосрочное локальное и системное противоопухолевое действие на быстрорастущей подкожной BLRB модели РМЖ, возможно, благодаря вовлечению иммунных механизмов защитного действия.
Изучение противоопухолевой активности пептидного экстракта смеси растений PE-Pm на мышиной модели ASF-LL Т-ЛЛ. Испытание противоопухолевой активности пептидного экстракта PE-Pm проводили на и.п.
летальной модели Т-ЛЛ. На день 0 сингенным самкам A/WySnJCitMoise в возрасте 6 месяцев провели и.п. перевивку ОК из п.к. опухоли ASF-LL в дозе 106 жизнеспособных ОК на мышь. Пептидный экстракт вводили и.п. дважды, на 11-ый и 20-ый день после перевивки ОК в дозе 1 мг на мышь. Мышей осматривали ежедневно для оценки состояния здоровья и выживания.
Данные двух экспериментов (осень и весна) по привесам на 20-й день после перевивки ОК на перевиваемой и.п. модели демонстрируют воспроизводимость результатов вне зависимости от времени года (рис. 5 А).
Наблюдали сходные тенденции действия пептидного экстракта в этих опытах.
Далее представлены результаты одного из двух экспериментов.
Животные из контрольной группы погибали практически одновременно на 27-28 день эксперимента (СПЖ 27,5 ± 0,5 дней) при тенденции к увеличению СПЖ самок из опытной группы (29,5 ± 7,5 дней). Таким образом, в леченой группе 50 % животных были живы на время гибели реципиентов в контроле (рис. 5 Б).
Анализ динамики выживания мышей из опытной группы по сравнению с СПЖ мышей в контроле (рис. 5 Б) выявил разнонаправленное распределение индивидуальных параметров выживания леченных животных, а именно: часть леченой группы мышей погибла раньше контроля, демонстрируя ухудшение выживания (рис. 5 Б, В, подгруппа 1);
некоторые погибли в сходные с контролем сроки (рис. 5 Б, В, подгруппа 2);
а оставшиеся животные выжили лучше контроля (рис. 5 Б, В, подгруппа 3).
Косвенные доказательства стимуляции роста опухоли в подгруппе (ухудшение выживания) и угнетении роста в подгруппе 3 (улучшение выживания) были получены путем анализа данных по средним привесам леченых самок на 20-й день после перевивки ОК (рис. 5 Г). Леченые самки, погибшие в те же сроки, что и контрольные (подгруппа 2), демонстрировали привесы (8,3 %), сходные с показателем в контроле (9,9 %). Вес как коротко (подгруппа 1), так и долго выживших леченых самок (подгруппа 2) уменьшился в сравнении с контрольным показателем. Исходя из особенностей и.п. модели Т-ЛЛ, уменьшение веса реципиента в ходе прогрессии опухолевого роста может свидетельствовать об истощении организма самки-реципиента (подгруппа 1, в пользу этого предположения свидетельствует ухудшение выживания), или замедлении скорости роста опухоли (подгруппа 3, в пользу этого предположения свидетельствует улучшение выживания).
12, 9,9 осень в есна Относительный вес,% 10,0 7, 27, 8, 22, 6, СПЖ, дни 4, 2, 0, опыт 2 опыт -1, -2, 1 -2,1 контроль 1 2 -4, опытные подгруппы В А 9, 90 1 8, Относительный вес, % 50 % конроль - -3, - 11 16 21 26 31 36 -4, - дни опытные подгруппы Б Г Рис. 5. Действие пептидного экстракта смеси растений PE-Pm на рост опухоли и выживание.
А - Сравнение привесов в опыте (серые столбики) и контроле (белые столбики), как показатель роста опухоли у леченых животных по сравнению с контрольными;
Б – Действие PE-Pm на динамику выживания контрольной группы (пунктирная линия) и леченой группы (сплошная линия). В опытной группе выделены подгруппы с выживанием хуже контроля (1, серый столбик), с выживанием, сходным с выживанием контрольных животных (2, черный столбик), с выживанием лучше контроля (3, заштрихованный столбик);
В – Средняя продолжительность жизни (СПЖ), СПЖ контрольной группы животных (белый столбик), СПЖ леченных животных подгрупп: 1 - серый столбик, 2 - черный столбик, -заштрихованный столбик;
Г – Средние привесы леченых животных по подгруппам: 1 - серый столбик, 2 - черный столбик, 3 -заштрихованный столбик, по сравнению с контролем (белый столбик) Динамика выживания в случае лечения пептидным экстрактом смеси растений PE-Pm позволяет предполагать его непрямое воздействие на опухоль.
Согласно литературным данным при аналогичных ситуациях считается, что эффект вызван опосредованным действием препарата через иммунную систему реципиента.
Раздел III. Изучение цитостатической активности пептидных экстрактов на стандартных трансформированных клеточных линиях in vitro Цитостатическая активность пептидных экстрактов лекарственных растений на трансформированных клеточных линиях A 549, H1299 и HeLa человека. Активность пептидных экстрактов исследовали на клеточных линиях рака легких человека А549 и H1299 и линии рака шейки матки человека HeLa.
Посев клеток в 96-луночном планшете проводили с разной плотностью, условно обозначенной как «высокая» (около 100 % конфлюэнтности через сутки после посадки), «средняя» (50-70 %) и «низкая» (20-50 %). Концентрации пептидных экстрактов следующие: 0,05 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,5 мкг/мкл (по 3 повтора для каждой концентрации). Выживаемость клеток в контрольной и обработанных экстрактами группах определяли через 72 ч инкубации.
Клеточную среду в плашке заменяли на среду с MTT (0,5 мг/мл, 100 мкл на лунку). Клетки инкубировали в CO2-термостате в течение 1 часа, затем среду удаляли, а клетки лизировали добавлением 100 мкл раствора 0,04 М соляной кислоты в изопропаноле (Mossmann T., 1983). Оптическую плотность измеряли при длине волны 590 нм с помощью спектрофотометра «Bio-Rad Benchmark Plus». Далее приводятся и обсуждаются только результаты при средней плотности посева клеток.
При средней плотности клеток линии А549 ингибирующим действием обладали экстракты смеси растений (рис. 6 А, PE-Pm), чая зеленого (рис. 6 А, PE-Cs) и гриба чаги (рис. 6 А, PE-Io) при различных концентрациях пептидов.
При повышении концентрации пептидов показано увеличение ингибирование пролиферации клеток. Пептидные экстракты зверобоя продырявленного и лавра благородного не оказали существенного действия на клеточную линию А549 (рис. 6 А, PE-Hp и PE-Ln).
0,05 0,25 0,5 мкг/мкл 0,05 0,25 0,5 мкг/мкл Ингибирование пролиферации Ингибирование пролиферации 100 80 клеток, % клеток, % 60 40 20 0 PE-PM PE-Cs PE-Io PE-Hp PE-Ln PE-PM PE-Cs PE-Io PE-Hp PE-Ln Б А Рис. 6. Ингибирование пролиферации клеток пептидными экстрактами (МТТ - анализ 72 часа, средняя плотность посева клеток).
А - линия рака легких человека А549;
Б - линия немелкоклеточного рака легких человека Н Наибольшее влияние рост клеток линии Н1299 оказали экстракты гриба чаги – 97 % ингибирования пролиферации клеток (рис. 6 Б, PE-Io) и чая зеленого – 70 % (рис. 6 Б, PE-Cs), смеси растений – 65 % ингибирования (рис. 6 Б, PE-Pm), при концентрации пептидов 0,5 мкг/мкл. На данной клеточной линии также наблюдали тенденцию увеличение процента ингибирования пролиферации с ростом концентрации пептидных экстрактов в лунках. Пептидные экстракты зверобоя продырявленного и лавра благородного не оказали существенного влияния на рост клеток линии H1299 (рис. 6 Б, PE-Hp и PE-Ln).
0,05 0,25 0,5 мкг/мкл пролиферации клеток, % Ингибирование PE-PM PE-Cs PE-Io PE-Hp PE-Ln Рис. 7. Ингибирование пролиферации клеток линии HeLa рака шейки матки пептидными экстрактами (МТТ - анализ 72 часа, средняя плотность клеток) На клетки линии HeLa при средней плотности посева наибольшее влияние оказали экстракты гриба чаги PE-Io – более 70 % ингибирования роста клеток, смеси растений PE-Pm – 45 % ингибирования пролиферации клеток и чая зеленого PE-Cs – более 50 %, при концентрациях 0,5 мкг/мкл (рис. 7).
Пептидные экстракты зверобоя продырявленного и лавра благородного не оказывали существенного влияния на рост клеток (рис. 7, PE-Hp и PE-Ln).
Таким образом, выявлено цитостатическое действие пептидных экстрактов из смеси растений: чистотела большого, девясила высокого, хвоща полевого и гриба чаги, а также экстракта чая зеленого на рост трансформированных линий клеток A549, H1299 и HeLa. Пептидный экстракт чаги обладал наиболее выраженным цитотоксическим эффектом на клетках линии Н1299. Экстракты лавра благородного и зверобоя продырявленного не проявили биологической активности на рассматриваемых культурах опухолевых клеток.
Цитостатическая активность пептидных экстрактов на клеточной линии MCF-7 и MCF-10 РМЖ и HT1080 фибросаркомы человека. Для экспериментов с клеточными линиями MCF-7, MCF-10 и HT1080 посев клеток проводили только при «средней» плотности. В экспериментах с клеточными линиями MCF-7, MCF-10 и HT1080 через 12 часов после посева в лунки добавляли растворённые в среде пептидные экстракты в концентрациях 0,05 мкг/мкл, 0,1 мкг/мкл, 0,15 мкг/мкл, 0,2 мкг/мкл, 0,25 мкг/мкл, 0,3 мкг/мкл (по 3 повтора для каждой концентрации). Выживание клеток определяли через 72 ч МТТ методом.
При средней плотности клеток линии MCF-7 пептидный экстракт чистотела большого PE-Cm при концентрациях 0,25 мкг/мкл и 0,3 мкг/мкл проявлял максимальную активность ингибирования роста клеток MCF-7.
Тенденция усиления цитостатического действия также наблюдалась при увеличении концентрации пептидного экстракта PE-Cm в лунке (рис. 8 А).
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 мкг/мкл 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 мкг/мкл 100 Ингибирование пролиферации 90 Ингибирование пролиферации 80 клеток, % клеток, % PE-Cm PE-Hp PE-In PE-PM PE-Cm PE-Hp PE-In PE-PM А Б Рис. 8. Ингибирование пролиферации клеток РМЖ человека пептидными экстрактами (МТТ - анализ 72 часа, средняя плотность посева клеток).
А - линия MCF-7;
Б - линия MCF- Экстракт зверобоя продырявленного PE-Hp максимально ингибировал пролиферацию клеток при концентрации 0,25 мкг/мкл – 66 %, а при концентрации 0,3 мкг/мкл наблюдалось уменьшение действия – 58 % (рис. 8 А).
Наибольшее цитостатическое действие для пептидного экстракта из девясила высокого PE-In наблюдали при концентрации 0,2 мкг/мкл – 56 %, при повышении концентрации 0,25 и 0,3 мкг/мкл – 44 % (рис. 8 А). Для пептидного экстракта из смеси растений PE-PM в концентрациях от 0,05 до 0,2 мкг/мкл обнаружилось незначительное увеличение степени ингибирования пролиферации клеток от 60 до 66 %. При увеличении концентраций до 0,25 и 0,3 мкг/мкл наблюдалось уменьшение цитостатического влияния на рост трансформированных клеток линии MCF-7 РМЖ человека (рис. 8 А).
При изучении влияния пептидных экстрактов на пролиферацию клеток линии MCF-10 РМЖ человека было показано, что наибольшим эффектом обладал пептидный экстракт девясила высокого PE-In при концентрации 0,2 мкг/мкл – 76 % ингибирование роста клеток (рис. 8 Б).
Ингибирующие действие на пролиферацию клеток линии MCF-10 оказал пептидный экстракт зверобоя продырявленного PE-Hp – 70 % (0,15 мкг/мкл).
Однако, при повышении концентрации от 0,2 до 0,3 мкг/мкл наблюдалось незначительное уменьшение эффекта от 64 до 52 % (рис. 8 Б). Пептидный экстракт смеси растений PE-Pm наибольшую активность 61 % и 64 % проявил при следующих концентрациях: 0,15 мкг/мкл и 0,2 мкг/мкл (рис. 8 Б). Экстракт чистотела большого PE-Cm при всех значениях концентраций не оказал существенного влияния на рост клеток линии MCF-10.
На клетках линии НТ1080 фибросаркомы человека пептидные экстракты чистотела большого PE-Cm и смеси растений PE-PM проявили небольшую цитостатическую активность – около 30 % при всех значениях концентраций (рис. 9). Для экстракта девясила высокого наблюдалось около 20 % ингибирования роста клеток линии НТ1080 (при 0,15 и 0,2 мкг/мкл).
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 мкг/мкл Ингибирование пролиферации клеток, % PE-Cm PE-Hp PE-In PE-PM Рис. 9. Ингибирование пролиферации клеток линии НТ1080 фибросаркомы человека пептидными экстрактами (МТТ - анализ 72 часа, средняя плотность посева клеток) Таким образом, выявлено цитостатическое действие пептидных экстрактов девясила высокого, зверобоя продырявленного и смеси растений на пролиферацию клеток рака молочной железы человека линий MCF-7 и MCF-10.
Экстракт чистотела большого проявил цитостатическое действие на клетки линии MCF-7. Пептидные экстракты чистотела и смеси растений ингибировали рост клеток фибросаркомы человека линии НТ1080.
Заключение Проведено изучение противоопухолевой активности полученных экстрактов на широкой панели моделей как in vivo, так и in vitro.
Рис. 10. Пептидные экстракты, проявившие противоопухолевую (сплошная линия) и цитостатическую (пунктирная линия) активности Обнаружено, что пептидные экстракты чистотела большого PE-Cm, чая зеленого PE-Cs, гриба чаги PE-Io, зверобоя продырявленного PE-Hp и смеси растений PE-Pm, обладают противоопухолевой и цитостатической активностью (рис. 10).
При изучении состава пептидных экстрактов данные анализа ионообменной хроматографии фиксировали в виде хроматограмм (рис.1-2) с помощью самописца и в виде пептидограмм (в автореферате не представлены), полученных с помощью специально созданной компьютерной программы «PepChromAn», разработанной в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН.
Пептидограммы построены из данных хроматограмм в виде зависимости времени выхода пика и его площади в логарифмической шкале, что позволяет проводить сравнительный анализ различных пептидных экстрактов, выявляя сходные и различные по хроматографическим данным компоненты.
В результате такого сравнительного анализа пептидных экстрактов выявили, что лишь 6 фракций характерны только для экстрактов смеси растений PE-PM и зверобоя продырявленного PE-Hp (рис. 11). Можно предположить, что именно совпадающие по подвижности при хроматографии компоненты определяют противоопухолевую активность данных двух препаратов.
Рис. 11. Индивидуальные фракции характерные только для пептидных экстрактов смеси растений и зверобоя продырявленного На основании проведенных исследований, представляются перспективными дальнейшие разработки в этом направлении, возможно создание на основе пептидных экстрактов терапевтических препаратов для лечения онкологических заболеваний человека. Например, для лечения РМЖ человека перспективна разработка препарата на основе экстрактов смеси растений и зверобоя продырявленного, а для лечения рака легких человека – на основе чая зеленого и гриба чаги.
Выводы 1. Разработана методика получения пептидных экстрактов растений, заключающаяся в уксуснокислой экстракцию с последующим осаждением пептидной фракции добавлением ацетона.
2. На основе скрининга растительного сырья, обладающего противоопухолевой активностью, выбраны растения, разрешенные Фармакопей РФ в качестве лекарственных препаратов.
3. По разработанной методике экстракции выделены и охарактеризованы пептидные экстракты лекарственных растений, а также смеси растений и гриба (PE-Pm).
4. Показана противоопухолевая активность пептидных экстрактов зверобоя продырявленного и смеси растительного сырья (девясила высокого, хвоща полевого, чистотела большого и гриба чага) на мышиных трансплантированных и спонтанных моделях РМЖ и трансплантированной модели Т-лимфолейкоза.
5. Показано цитостатическое действие пептидных экстрактов чая зеленого, гриба чаги и смеси растений (девясила высокого, хвоща полевого, чистотела большого и гриба чаги) на трансформированных клеточных линиях А549 и Н1299 рака легких человека, и линии HeLa рака шейки матки человека.
6. Обнаружена цитостатическая активность экстрактов чистотела большого, зверобоя продырявленного и девясила высокого на клетках линий MCF-7 и MCF-10 РМЖ, HT1080 фибросаркомы человека.
7. Широким спектром противоопухолевой активности, как на моделях in vivo, так и in vitro обладает экстракт смеси растений (чистотела большого, хвоща полевого, девясила высокого и гриба чаги).
Список публикаций по теме диссертации Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Тепкеева, И.И. Оценка противоопухолевой активности пептидных 1.
экстрактов растений в перевиваемой модели рака молочной железы на мышах линии CBRB-Rb(8.17)1lem [Текст] / И.И. Тепкеева, Е.В.
Моисеева, А.В. Чаадаева, Е.В. Жаворонкова, Ю.В. Кесслер, С.Г.
Семушина, В.П. Демушкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – № 4 (145). – С. 446-448.
2. Тепкеева, И.И. Пептидные экстракты из лекарственного растительного сырья и первичные испытания in vivo на мышиной модели рака молочной железы [Текст] / И.И. Тепкеева, Ю.В. Кесслер // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМОС. – 2008. – № 47. – С. 28-36.
3. Тепкеева, И.И. Цитостатическая активность пептидных экстрактов лекарственных растений на трансформированных клеточных линиях A 549, H1299 и HeLa [Текст] / И.И. Тепкеева, В.Н. Аушев, И.Б. Зборовская, В.П. Демушкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – № 1(147). – С. 50-54.
4. Тепкеева, И.И. Противоопухолевая активность пептидного экстракта лекарственных растений PE-Pm на новой мышиной модели Т – лимфолейкоза [Текст] / А.В. Чаадаева, И.И. Тепкеева, Е.В. Моисеева, Е.В.
Свирщевская, В.П. Демушкин // Биомедицинская химия. – 2009. – № 1 (55). – С. 81-88.
Тезисы в журналах, рекомендованных ВАК 5. Тепкеева, И.И. Пептидный экстракт PE-PM: противоопухолевое действие по методике «точечных» экспериментов на мышиных моделях рака молочной железы [Текст] / И.И. Тепкеева, А.В. Чаадаева, Ю.В.
Кесслер, Е.В. Моисеева, В.П. Демушкин // Тезисы Объединённого иммунологического форума. Санкт-Петербург. Российский иммунологический журнал. – 2008. – № 2-3 (Т. 2(11)). – С. 315.
6. Тепкеева, И.И. Кратность применения пептидного экстракта PE-PM на новой мышиной модели CD4+CD25+ лимфолейкоза: обращение эффекта от угнетения до стимуляции роста [Текст] / А.В. Чаадаева, И.И. Тепкеева, Ю.В. Кесслер, Е.С. Свирщевская, В.П. Демушкин, Е.В. Моисеева // Тезисы Объединённого иммунологического форума. Санкт-Петербург.
Российский иммунологический журнал. – 2008.. – № 2-3 (Т. 2(11)). – С. 316.
Статьи в журналахи региональных изданиях 7. Tepkeyeva, I.I. Antitumour effect of plant peptide extract PE-PM: preliminary in vivo testings in mouse models of brest cancer [Text] / I.I. Tepkeyeva, E.V.
Moiseyeva, A.V. Chaadayeva, Yu.V. Kessler, S.G. Semushina, L.Yu. Telegin, V.P. Demushkin // European journal of Natural History. – 2008. – № 2. – P. 73-75.
8. Шапшукова1 (Тепкеева), И.И. Противоопухолевая активность пептидных экстрактов растений на мышиных моделях рака молочной железы и лимфомы человека [Текст] / Е.В. Моисеева, И.И. Шапшукова (Тепкеева), А.В. Чаадаева, А.А. Шашкова, Ю.Г. Демидова, В.П.
Демушкин, В.Т. Иванов // Тезисы докладов II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. – СПб. – 2005. – С. 90.
Шапшукова* (Тепкеева), И.И. Противоопухолевая активность 9.
пептидных экстрактов из растительного сырья на мышиных моделях рака молочной железы и лимфомы человека [Текст] / Е.В. Жаворонкова, Е.В.
Моисеева, И.И. Шапшукова (Тепкеева), А.А. Шашкова, А.В. Чаадаева, В.П. Демушкин // Тезисы докладов и стендовых сообщений VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. – Москва – Пущино.
– 2006. – С. 64.
10. Тепкеева, И.И. Сравнительный анализ пептидных компонентов растений, используемых для лечения раковых опухолей [Текст] / И.И.
Тепкеева, Б.В. Васьковский, С.К. Гаранин, Е.В. Жаворонкова, В.П.
Демушкин // XX зимняя международная молодежная научная школа В 2005 году фамилия автора изменена с Шапшуковой на Тепкееву.
«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». – М. – 2008. – С. 77.
11. Тепкеева, И.И. Изучение противоопухолевого действия пептидных экстрактов PE-PM и PE-Hp на мышиной модели лимфолейкоза ASF-LL [Текст] / А.В. Чаадаева, Е.В. Моисеева, И.И. Тепкеева, Ю.А. Кесслер, А.М. Сапожников, В.П. Демушкин // XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико химической биологии и биотехнологии». – М. – 2008. – С. 119.
12. Тепкеева, И.И. Оценка противоопухолевой активности пептидных экстрактов PE-PM и PE-Hp in vivo в сублетальной перевиваемой модели рака молочной железы BLRB [Текст] / И.И. Тепкеева, Е.В. Моисеева, А.В. Чаадаева, Е.В. Жаворонкова, Ю.В. Кесслер, С.Г. Семушина, В.П.
Демушкин // Биология: Теория, практика, эксперимент: материалы Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения доктора биол. наук, проф. Сапожниковой Е. В. / В 2-х кн. / редкол.: Р.В. Борченко и др. – Саранск. – 2008. – Кн. 2. – С. 211-214.
13. Тепкеева, И.И. Оценка противоопухолевого действия растительных пептидных экстрактов на мышиной модели ASF-LL лимфолейкоза [Текст] / И.И. Тепкеева, А.В. Чаадаева, Е.В. Моисеева, В.П. Демушкин // Материалы 42-й Всероссийской конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации».
– Тюмень: ООО «Печатник». – 2008. – С. 202-203.
14. Тепкеева, И.И. Технология получения пептидных экстрактов из растительного сырья и перспективы создания лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний [Текст] / И.И. Тепкеева, Б.В.
Васьковский, С.К. Гаранин, Е.В. Моисеева, А.В. Чаадаева, В.П.
Демушкин // Наукоемкие химические технологии-2008: Тезисы докладов XII Международной научно-технической конференции. – ВолГТУ. – Волгоград. – 2008. – С. 153-154.