Микробиологическая характеристика вермикомпостов

на правах рукописи

ЯКУШЕВ

Андрей Владимирович

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ВЕРМИКОМПОСТОВ

Специальность

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения

Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова доктор биологических наук

Научный руководитель:

Б.А. Бызов доктор биологических наук,

Официальные оппоненты:

профессор Н.П. Битюцкий кандидат биологических наук И.Н. Мозговая Учреждение Российской Ведущее учреждение:

академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Защита диссертации состоится в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на заседании Диссертационного Совета Д 501.002.13 при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан «»_2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова Актуальность Вермикомпост – это продукт физической и биохимической трансформации органических субстратов, образующийся при взаимодействии дождевых червей и микроорганизмов. Биологии вермикомпостирования посвящено много исследований. Часть из них направлены на характеристику состава микробного сообщества при вермикомпостировании (Терещенко, 2003;

Кузьмина, 2005;

Кубарев и др., 2005;

Anastasi et al., 2005;

Aira et al., 2006;

другие). Другие работы характеризуют микробную активность (Жигжитова, 1998;

Gomez-Brandon et al., 2008;

Lazcano et al., 2008;

Sen, Chandra, 2009;

Vivas et al., 2009), функциональные особенности (Терещенко, Бубина, 2007;

Vaz-Moreira et al., 2008;

Yasir et al, 2009), свойства ферментов (Masciandaro et a.l, 2000) или физиологическое состояние микроорганизмов в вермикомпостах (Aira et al., 2006;

Pramanik et al., 2008). Несмотря на противоречия в данных, связанные с разнообразием субстратов и условий вермикомпостирования, имеющаяся научная база свидетельствует о том, что вермикомпостирование – особый процесс, отличающийся от обычного компостирования. Таким образом, можно искать специфические микробиологические свойства вермикомпостов, связанные с активностью червей. Однако микробиологические стандарты качества (за исключением санитарных) и готовности вермикомпостов до сих пор не разработаны.

Важно представлять какие микроорганизмы, и с какой активностью проводят процессы трансформации органического вещества. Так как данные по таксономическому составу и обилию микроорганизмов в вермикомпосте противоречивы (вплоть до различного знака эффектов у разных авторов), представляется целесообразным построить микробиологическую характеристику вермикомпостирования на анализе экофизиологических особенностей микробного сообщества вермикомпостов, которые не зависят от конкретной таксономической структуры в силу наличия большого числа видов-дублеров (Звягинцев, 1985). Работа касается и проблемы источников плодородия вермикомпостов, которыми могут быть только свойства, характерные для разных по происхождению вермикомпостов.

Экофизиологические параметры, характеризующие активность микроорганизмов, кинетику роста, потребность в факторах роста и др., дополнят санитарные нормативы и должны уточнить особенности и механизмы взаимодействия микроорганизмов и дождевых червей.

Вермикомпосты оказывают большее положительное действие на рост растений, чем простые компосты. Причины этого явления не до конца вскрыты.

Цель Установить отличия вермикомпостов от компостов по экофизиологическим, биохимическим параметрам микробного сообщества и обилию микроорганизмов.

Задачи 1. Исследовать вклад деятельности дождевых червей и природы исходного сырья в формирование таксономической структуры бактериального комплекса вермикомпостов.

2. Исследовать изменение обилия отдельных групп микроорганизмов в процессе вермикомпостирования: длины мицелия грибов и актиномицетов, численности бактерий, микрофауны (нематод, инфузорий, коловраток).

3. Охарактеризовать функциональные (трофические) особенности и физиологическое состояние (активность) микроорганизмов в вермикомпостах.

4. Исследовать качественные изменения ферментов гидролаз и оксидо редуктаз под действием червей в вермикомпостах по сравнению с компостами.

5. Установить изменение при вермикомпостировании соотношения микроорганизмов К- и r- стратегов по сравнению с компостированием.

6. Определить время вермикомпостирования достаточное, чтобы микробиологические свойства, по которым вермикомпосты отличаются от компостов, достигли максимальных отличий.

Научная новизна Установлено, что микробное сообщество вермикомпостов отличается от микробного сообщества компостов по ряду характеристик. В вермикомпостах меняется стратегия микробного роста: увеличивается доля r стратегов;

трофическая характеристика сообщества: изменяется спектр ассимиляции органических соединений, происходит понижение удельной гидролазной активности, отмечается относительное снижение доли мицелия грибов. Впервые обнаружен эффект снижения сродства ферментов (эстераз, ферментной системы окисления глюкозы) к субстратам реакции в вермикомпостах. В качестве отличительных признаков вермикомпостов предлагается использовать следующие интегральные экофизиологические параметры: 1) сродство ферментов к субстратам (константа Михаэлиса Ментен), 2) параметры роста микроорганизмов, ответственных за формирование спектра ассимиляции, 3) параметр, отражающий удельную гидролазную активность, 4) отношение максимальной удельной скорости роста микробного сообщества на глюкозе к константе Михаэлиса-Ментен (µm/Ks), отражающее степень олиготрофности сообщества.

Практическая значимость Полученные данные могут быть полезны для разработки микробиологических стандартов качества и готовности вермикомпостов.

Результаты могут использоваться в лекционных курсах по общей экологии, экологии почвенных микроорганизмов, почвенной зоологии, биологии почв.

Апробация работы Результаты работы были представлены на 12 Российских и Международных научных конференциях, на заседаниях кафедры биологии почв (9 тезисов в материалах конференций).

По теме диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах («Микробиология», «Почвоведение», «Вестник Московского университета»).

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов и списка упоминаемых литературных источников. Работа изложена на 118 страницах текста, иллюстрирована рисунками, включает в себя 14 таблиц. Список литературы состоит из наименований, из них 68 зарубежные.

Автор благодарит В.В. Демина, Ю.А. Завгороднюю за помощь в химических и физических анализах;

С.А. Благодатского и А.М. Семёнова за консультации по микробиологическим методам анализа;

А.Б. Абдуразакова за предоставление червей, субстратов и за консультации.

Объекты и методы исследования Работа включала анализ промышленных вермикомпостов и лабораторное моделирование действия червей на микробное сообщество органических субстратов разной природы.

Модельные компосты и вермикомпосты. В качестве модельных субстратов вермикомпостирования и компостирования использовали перепревший навоз крупного рогатого скота (КРС), смесь равных по массе частей опавших листьев ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.), ивы козьей (Salix caprea L.) и березы пушистой (Betula pubescens Enrh.) или низинный торф. Для получения исходной компостной смеси на основе опада к листьям добавляли речной песок (36% по массе). Масса сухого вещества составляла 200 г для навозного и листового компостов и 400 г для торфа. В контрольных вариантах субстраты компостировали без червей. Микрокосмы инкубировали в 3 кратной повторности при температуре 16–19°С (температура компостирования промышленных вермикомпостов) и постоянной влажности 150% для навозных и листовых компостов и 100% для торфяных компостов. Изучение проводили в динамике на протяжении месяцев вермикомпостирования (время компостирования промышленных вермикомпостов). Респирометрические исследования проводили с вермикомпостами возраста 6 месяцев. Принятые в работе сокращения: ВКТ – вермикомпост из торфа;

КТ – компост из торфа;

ВКН – вермикомпост из навоза;

КН – компост из навоза;

ВКЛ – вермикомпост из листьев;

КЛ – компост из листьев.

Дождевые черви. В листовой и навозный вермикомпосты вносили красных калифорнийских червей Eisenia foetida andrei (Bouche, 1972) породы «Русский Московский гибрид» в количестве 100 особей/кг сухого вещества, соответствующем производственной норме (Терещенко, 2003). В торф вносили червей Aporrectodea caliginosa и A. rosea (в соотношении 1:1), отобранных на осушенном низинном торфянике, в количестве 75 особей/кг сухого вещества.

Промышленные вермикомпосты. Анализировали четыре партии готовых вермикомпостов, отобранных в 2006, 2007, 2009 гг. на вермиферме «Русский Биогумус». Вермикомпостирование проводилось с использованием червей E. foetida andrei, субстраты вермикомпостирования – перепревший навоз КРС (партии 2006-2007 гг.), конский навоз (2009 г.), продолжительность вермикомпостирования 6 месяцев. Три партии на основе навоза КРС различались процедурой подготовки корма для червей. Партия ВК I - из перепревшего навоза КРС;

ВК II – из навоза с добавлением 30% озерного сапропеля;

ВК III – из навоза высокой степени разложенности, для чего в него предварительно добавляли патоку.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) продуктов амплификации фрагментов генов 16SрРНК бактерий.

Таксономический состав (операционные таксономические единицы, ОТЕ) бактерий вермикомпостов определяли по положению полос ДНК на геле после электрофореза (Практикум по микробиологии, 2005). ДГГЭ позволяет разделить ДНК бактерий отдельных таксонов в градиенте денатурирующего агента мочевины и определить филогенетическое ДНК-разнообразие без культивирования на питательных средах. Количество бактерий оценивалось по интенсивности прокраски полос ДНК красителем, содержащим соединения серебра, а таксономическая принадлежность определялась по расстоянию, пройденному ДНК на геле во время электрофореза (Rf).

Метод Райта-Хобби для оценки параметров минерализационной активности и экофизиологической характеристики сообщества.

Параметры минерализационной активности микроорганизмов определяли по зависимости начальной интенсивности дыхания вермикомпостов от концентрации внесенного субстрата, используя модифицированный метод Райта–Хобби (Благодатский и др., 1994;

Wright, Hobbie, 1966). Данный метод также позволяет проводить определение микробной биомассы по методу субстрат индуцированного дыхания.

Кинетический метод определения биомассы микроорганизмов.

Данный метод применялся для определения кинетических параметров роста микроорганизмов: максимальной удельной скорости роста, коэффициента физиологического состояния, начальная скорость холостого и продуктивного окисления глюкозы (Паников, 1991). Модификация метода (Благодатская и др., 2003) применялась для расчета индекса ауксотрофности, отражающего потребность микроорганизмов в факторах роста.

Гидролазную активность определяли по реакции гидролиза диацетата флюоресцеина (ФДА) в нашей модификации (Якушев, Бызов, 2009).

Определение спектра ассимиляции органических субстратов микробным сообществом. На основе метода мультисубстратного тестирования Горленко и Кожевина (2005) с привлечением элементов оптического метода определения биомассы (Практикум по микробиологии, 2005) и положений синтетической хемостатной модели (СХМ) (Паников, 1992) нами был предложен собственный метод. На первом этапе потребление субстратов оценивали по кинетическим параметрам роста микроорганизмов в ячейках планшет. Оптическая плотность в ячейках (D) зависит от наличия в суспензии микробных клеток и красителя формазана, образующегося из трифенилтетразолия хлористого (ТТХ). Рост сообществ описывали логистическим уравнением вида:

Dmax D= D Do µ t 1 + max e max Do где t – время (ч), D – оптическая плотность в момент времени t, D0 – оптическая плотность в начальный момент, µmax – максимальная удельная скорость роста (1/ч), Dmax – максимальная оптическая плотность в ячейке за 50 часов инкубации (Якушев, Бызов, 2008).

В дальнейшем мы отказались от использования ТТХ (определяли рост только по изменению мутности) и перешли к описанию микробного роста уравнением синтетической хемостатной модели (СХМ), упрощенным для описания лаг-фазы и фазы экспоненциального роста микроорганизмов:

D = D0 (1 r0 + r0 e µmax t ) где t – время (ч), D – оптическая плотность в момент времени t, D0 – оптическая плотность в начальный момент, µmax – максимальная удельная скорость роста (1/ч), r0 – коэффициент физиологического состояния микроорганизмов в вермикомпосте (Паников, 1991).

Изучение микробного роста в вермикомпостах методом стекол обрастания Росси-Холодного. Исходная методика (Холодный, 1935;

Rossi, 1928) была дополнена прижизненной окраской акридином оранжевым и исследованиями обрастаний в динамике, фотодокументированием, компьютерным методом анализа изображения (TotalLab) и статистической обработкой данных. Это позволяет определить обилие, пространственное распределение и морфологическое разнообразие микроорганизмов.

Учет беспозвоночных. Нематод выделяли методом воронок Бермана и учитывали под микроскопом. Инфузорий и коловраток учитывали под микроскопом в суспензии.

Статистическая обработка данных. Все эксперименты проводились в двух и более повторностях по эксперименту и от 5 до 60 по измерениям опыта. Все данные подвергались статистической обработке данных включая дисперсионный анализ и многомерный методы анализа в программе Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Таксономическая структура бактериального сообщества. Имеется несколько работ по характеристике микробного сообщества вермикомпостов молекулярно-генетическими методами (Sen et al., 2008;

Sen, Chandra, 2009;

Vivas et al., 2009), однако никто не сравнивал вклад червей и природы сырья в формирование микробного сообщества вермикомпостов.

На рис. 1 представлены результаты анализа данных методом главных компонент, которые показывают, что таксономическая структура бактерий определяется, в основном, природой сырья. Однако влияние червей на таксономический состав бактерий прослеживается: изменяется состав операционных таксономических единиц (ОТЕ). Так, процент отличающихся видов для пары ВКН-КН=24%, ВКТ-КТ=31%, ВКЛ-КЛ=21%. Сходная разница обнаружена для сообществ бактерий в различных вермикомпостах:

ВКТ-ВКН=30%, ВКТ-ВКЛ=27%, ВКН-ВКЛ=18%. Это доказывает существенное влияние червей на состав бактерий.

Анализ параметров бактериального разнообразия не выявил изменений под действием червей (табл. 1).

Обилие большинства бактерий изменяется под действием червей, но только для 15 % ОТЕ знак эффекта совпадал для всех трёх вермикомпостов, что объясняет противоречивость данных по таксономической структуре вермикомпостов, полученных другими авторами. Таким образом, данные по обилию отдельных таксонов бактерий не могут использоваться в качестве стандартов качества и готовности вермикомпостов.

Рис. 1. Результаты сопоставления таксономической структуры эубактерий, полученных по ДГГЭ методом главных компонент. Корреляционные эллипсы ограничивают область с p=0. Таблица 1. Синэкологические параметры сообщества бактерий Параметр ВКН КН ВКТ КТ ВКЛ КЛ Сумма ДНК бактерий 43488 ± 43245 ± 31965 ± 27738 ± 48997 ± 43665 ± (интенсивность 47192 67187 20959 4681 36480 окраски) Число видов (ОТЕ) 94 ± 57 99 ± 88 80 ± 32 80 ± 50 93 ± 12 87 ± Индекс Шеннона 3.7±1.5 3.9±1.8 3.7±0.3 3.8±1.1 3,9±0.2 3,88±0. Индекс Бергера 0,11±0.14 0,11±0.10 0,06±0.02 0,08±0.09 0,05±0.02 0,08±0. Паркера Примечание: ± – доверительный интервал при n=2, р=0.95.

Длина мицелия грибов и актиномицетов, количество бактерий, нематод, инфузорий, коловраток.

Грибы и актиномицеты представляют не только систематические группы, но и экологическую и физиологическую группу гидролитиков.

Имеются данные о подавление роста фитопатогенных грибов под действием вермикомпостов (Бубина, 2008;

Szczech, 1999;

Edwards, Arancon, 2003).

Инфузории, нематоды и коловратки представляют собой следующую ступень пищевой пирамиды после грибов и бактерий. Они выступают по отношению к ним как контролирующие агенты (хищники). Среди нематод могут быть фитопатогенные виды. Следовательно, по нано- и микро- фауне можно оценивать изменения в микробном блоке и действие червей на почвенную биоту.

Дисперсионный анализ выявил снижение длины грибного мицелия в вермикомпосте и отсутствие изменений в длине гиф актиномицетов и численности бактерий для всех трех исследуемых модельных вермикомпостов по сравнению с компостами (рис. 2-4). Вероятно, подавление роста грибного мицелия является причиной снижения заболеваемости сельскохозяйственных растений фитопатогенными грибами при использовании вермикомпостов (Edwards, Arancon, 2003). Кроме подавления грибного роста обнаружена тенденция к изменению состава грибов: уменьшается обилие Cladosporium spp. и появляется Trichoderma spp., известный как антагонист фитопатогенных микроорганизмов.

Количество КОЕ грибов при этом оставалось без изменения (106 КОЕ/г).

Рис. 2. Динамика длины грибного мицелия в процессе созревания вермикомпоста на стеклах обрастания. Доверительный интервал при р=0.95.

Повторность эксперимента 3, n=60.

Рис. 3. Динамика длины мицелия актиномицетов в процессе созревания вермикомпоста на стеклах обрастания. Доверительный интервал при р=0.95.

Повторность эксперимента 3, n=60.

Рис. 4. Динамика численности бактерий в процессе созревания вермикомпоста на стёклах обрастания. Доверительный интервал при р=0.95.

Повторность эксперимента 3, n=60.

Численность нематод, коловраток и инфузорий снижалась в вермикомпостах (рис. 5). Снижение численности нематод и уровня поражения ими растений при применении вермикомпостов наблюдали и ранее (Игошина, Наумова, 2003;

Edwards, Arancon, 2003;

Monroy et al., 2008). Наши данные подтверждают перспективность применения вермикомпостов для контроля численности нематод.

Рис. 5. Численность нематод (а), коловраток (б), инфузорий (в) в вермикомпостах и компостах. Доверительные интервалы при р=0.95.

Повторность эксперимента 3, n=60.

Физиологические особенности микробного сообщества вермикомпостов. Дискриминантный анализ спектров ассимиляции микробных сообществ модельных (3 субстрата, 5 сроков) и 4 промышленных вермикомпостов и компостов показал отличие большинства микробных сообществ вермикомпостов от компостов по параметрам роста на субстратах (рис. 6). Это свидетельствует о функциональных (трофических) отличиях микробного сообщества вермикомпостов вне зависимости от исходного сырья и вида червя, используемого для вермикомпостирования.

Рис. 6. Сравнение с помощью дискриминантного анализа спектров ассимиляции микробных сообществ различных вермикомпостов (ВК) и аналогичных компостов (К), а также образцов дерново-подзолистой почвы, свежих копролитов червей и кишечного тракта червей E. foetida andrei (П).

Каждая точка отражает спектр ассимиляции микробного сообщества из одного компоста. Корреляционные эллипсы ограничивают область с p=0.95.

Наибольшее различие между вермикомпостами и компостами наблюдалась при использовании в дискриминантном анализе всех параметров роста, получаемых при аппроксимации кривых роста. В данном методе непосредственным объектом исследования являются микроорганизмы, развивающиеся на определённом субстрате при инокуляции исследуемой компостной суспензией. Мы допускаем, что в экспоненциальной фазе происходит не лимитированный и почти гомогенный рост микроорганизмов на средах (метод посева показал рост бактерий только 2-3 морфотипов).

Отдельные популяции не конкурируют и ведут себя как одна культура. Тогда мы можем применить СХМ (Паников, 1991), усредняя свойства отдельных популяций, и использовать при анализе данных её параметры: коэффициент физиологического состояния микроорганизмов r0 (характеризующего по Н.С.

Паникову соотношение между первичными и вторичными метаболитами до попадания микроорганизмов на питательную среду, что определяет продолжительность лаг-фазы) и максимальную удельную скорость роста µmax. У микроорганизмов в зрелом вермикомпосте (после 6 месяцев вермикомпостирования) на основе навоза и листьев по сравнению с компостными микроорганизмами отмечено увеличение параметра r0, что указывает на относительную активизацию микроорганизмов под действием червей (рис. 7).

Рис. 7. Сравнение значений коэффициента r0 (медиана, верхний и нижний квартиль) для микроорганизмов вермикомпостов и компостов, участвующих в формирование спектра ассимиляции для модельных субстратов (а) и промышленного вермикомпоста (ВК пром.) на основе конского навоза (б).

Повторность эксперимента 4, для каждого варианта n=60-70.

Значения параметра r0 не увеличивалось в вермикомпосте на основе торфа (рис. 7), но значение r0, определённые по кинетическому методу определения биомассы возрастает в 30 раз под действием дождевых червей.

Для компостов из навоза наблюдается противоположная тенденция (табл. 2).

Величина общей микробной биомассы (метод СИД, кинетический метод) и растущей биомассы (кинетический метод), а также метаболический коэффициент не однозначно реагируют на присутствие червей (табл. 2).

Снижение производного от биомассы физиологического показателя удельной гидролазной активности qФДА = Vmax ФДА / Cmicr указывают на снижение доли гидролитиков ФДА в микробной биомассе вермикомпостов, что, возможно, связано с сокращением обилия активных грибов (табл. 2).

Таблица 2. Величины микробной биомассы и активности микроорганизмов в зрелых (6 месяцев) вермикомпостах и компостах Параметр ВКТ КТ ВКН КН Биомасса, метод СИД (Сmicr), 3104 ± 396 1130 ± 52 672 ± 65 657 ± мкг С/г Общая биомасса, 1151 ± 117 218 ± 97.0 223 ± 78 235 ± кинетический метод (X0), мкг С/г Растущая биомасса, 3.48 ± 1.15 0.028 ± 0.008 0.16 ± 1.2 2.21 ± 1. кинетический метод (X0), мкг С/г Интенсивность 10.5 ± 2.4 14.1 ± 0.5 5.3 ± 1.2 5.4 ± 0. продуцирования СО2 (Vbasal), мкг С–СО2/(г ч) Метаболический (3.4 ± 2.4) (12.5 ± 3.3) (7.9 ± 2.3) (8.2 ± 2.7) коэффициент (qСО2), мкг С– –3 –3 – 10– 10 10 СО2/(мкг Сmicr ч) Удельная гидролазная (1.6 ± 1.2) (3.0 ± 0.2) (8.6 ± 0.2) (21.3 ± 0.2) активность (qФДА), 10–5 10–5 10–5 10– мкмоль флюоресцеина/(мкг Сmicr ч) Доля углерода микробной биомассы в общем 1.1 ± 0.8 0.4 ± 0.2 0.3 ± 0.5 0.3 ± 0. органическом углероде (Сmicr/Сорг), % (1 ± 0.3) 10–4 (7.2 ± 2.4) Коэффициент (30 ± 6.4) (93.7 ± 12.3) физиологического состояния 10–4 10– 10– микроорганизмов (r0) Примечание: ± – доверительный интервал при n=20 р=0.95.

Возможно именно активизация микроорганизмов (оценено по r0) приводит к усилению минерализации вермикомпоста для самого легко минерализуемого вермикомпоста – листового (рис. 8, а).

Рис. 8. Интенсивность минерализации вермикомпостов и компостов в процессе созревания (а). Обогащение органического вещества азотом в процессе созревания вермикомпоста (б).

В готовом промышленном вермикомпосте происходит накопление нитратов, что резко отличает его от компостов. Это, по-видимому, связано с активизацией нитрификации под действием червей. Повышенное содержание нитратов сохраняется и при изъятии червей из готового вермикомпоста при его хранении во влажном состоянии (рис. 9). Присутствие червей не снижает содержание азота в органическом веществе (рис. 8, б). Увеличение содержания нитратов наблюдалось ранее (Терещенко, 2003;

Atiyeh et al., 2000;

Sen Chandra, 2009).

1, N03 N03 1, 1, Концентрация, мг/г 0, 0, NH4+ NH4+ 0, N03 0, 0, Вермикомпост ВК + 2 месяца Case 2 Case 3 Компост Case Case 4 хранения Рис. 9. Содержание минеральных форм азота в промышленном вермикомпосте на основе навоза КРС ВК III, доверительные интервалы при р=0.95, n=5.

В заключение раздела следует заметить, что активизацию микроорганизмов (увеличение значения r0, активизация минерализации), можно расценивать как положительное явление, поскольку более активные микроорганизмы потенциально могут более активно проводить процессы гумификации и минерализации вермикомпоста (Жигжитова, 1998) и при внесении вермикомпоста лучше распространяться в почве.

Активизация процессов минерализации сокращает время созревания, что тоже немаловажно. Снижение удельной гидролазной активности - тоже положительное явление, так как среди гидролитиков могут быть потенциальные фитопатогены. Способность микробного сообщества вермикомпостов накапливать минеральные формы азота может способствовать улучшению азотного питания растений.

Изменение сродства ферментов к субстратам реакции под действием дождевых червей. Изучали ферментативную кинетику эстераз из класса гидролаз (по реакции гидролиза ФДА) и окисления глюкозы из класса оксидо-редуктаз (метод Райта-Хобби). Оценка проводилась по изменению значений константы полунасыщения Km Михаэлиса-Ментен. Она характеризует сродство ферментов к субстрату ферментативной реакции и численно равна концентрации субстрата, при которой достигается максимальной скорости реакции Vmax. Vmax достоверно не изменялось в присутствии червей. Как видно из рис. 10 и табл. 3 сродство ферментов оксидо-редуктаз и эстераз к субстратам реакций снижалось в присутствии червей, о чем свидетельствует увеличение Km. Промышленный вермикомпост также отличается пониженным сродством гидролитических ферментов к субстратам (рис. 11). Заметим, что высушивание - реувлажнение вермикомпоста, вызывающее по определению «омоложение» микробной системы, приводит к необратимому снижению константы Km до уровня обычного компоста. Это указывает на то, что особое значение константы полунасыщения не является неотъемлемым свойством вермикомпоста как субстрата, а является пролонгированным последействием червей. Поэтому важно не пересушивать готовую продукцию вермикомпостов. Таким образом, можно использовать значения константы Михаэлиса для диагностики вермикомпоста.

Рис. 10. Изменение константы Михаэлиса-Ментен для пула эстераз в процессе созревания промышленного вермикомпоста. Условные обозначения как на рис. 1. Повторность эксперимента 3, n=15, доверительный интервал при р=0. Таблица 3. Экофизиологические параметры, получаемые с помощью метода Райта-Хобби Параметр ВКТ КТ ВКН КН Сродство ферментов к глюкозе (Ks), 400.0 ± 295 33.2 ± 32 176 ± 342 54 ± мкг С–глюкозы/г Количество природного легкодоступного субстрата (Sn), 59.0 ± 160 52.6 ± 52 273 ± 433 84.7 ± мкг Сорг/г Потенциал минерализации глюкозы 64.0 ± 9.9 23.0 ± 1.3 8.9 ± 1.85 8.7 ± 1. (Vmax),мкг С–СО2/(г ч) Примечание: объём выборки 15 ± – доверительный интервал при р=0.95.

Рис. 11. Значения константы Михаэлиса-Ментен для эстераз в нативном промышленном вермикомпосте и после высушивания – реувлажнения.

Изменение соотношения r- и K-стратегов в микробном сообществе вермикомпостов. Мы предполагаем, что соотношение r- и K-стратегов важная характеристика вермикомпостирования. Известно, что микроорганизмы с r-стратегией характеризуются более высокой удельной скоростью роста в условиях избытка субстрата (µmax), отсутствием лимитирования и менее эффективной способностью усваивать субстраты, чем K-стратеги (Andrews, Harris, 1986). K-стратеги, ферментные транспортные системы которых обладают высоким сродством к субстрату, оказываются в более выгодных условиях, когда рост микроорганизмов ограничен из-за недостатка ресурсов (Паников, 1991). В связи с этим для характеристики ростовых стратегий целесообразно использовать величину константы насыщения Km, определяющую сродство ферментных систем почвенных микроорганизмов к субстрату. Сравнительно низкие ее значения (высокое сродство) характеризуют организмы с К-стратегией, а высокие присущи r-стратегам. В вермикомпостах обнаружено снижение эффективности работы исследуемых ферментов, что, вероятно, связано с перестройкой в микробном блоке вермикомпостов - увеличением доли r стратегов с неэффективной ферментной системой (рис.10, табл. 3).

Возможно, это связано с большей доступностью органического вещества для микроорганизмов (больше Сmicr/Сорг (табл. 2)) и некоторым увеличением содержания легкодоступного субстрата Sn (табл. 3).

Другим важным параметром является максимальная удельная скорость роста µmax, которая по определению выше у r-стратегов. Для микроорганизмов, ответственных за формирование спектра ассимиляции в ячейках (рис. 12) и in situ (табл. 4) не наблюдается увеличение µmax в вермикомпостах. Есть, тем не менее, тенденция к увеличению µmax в менее разложившихся субстратах (ВКЛ, КЛ, корм - конский навоз), потенциально содержащих больше доступных для микроорганизмов веществ и содержащих больше r-стратегов (рис. 12).

Рис. 12. Максимальная удельная скорость роста (µmax) микробных группировок, ответственных за формирование спектра ассимиляции для модельных субстратов (а) и промышленного вермикомпоста (ВК пром.) на основе конского навоза (б). Повторность эксперимента 4, для каждого варианта n=60-70.

Более информативным (по сравнению с предыдущим) ростовым показателем, учитывающим как удельную скорость роста (µm), так и величину константы полунасыщения (Ks) представляется отношение µm/Ks (Kovarova–Kovar, Egli, 1998). Это отношение, снижающиеся в вермикомпосте, свидетельствует об относительном увеличении доли r стратегов в вермикомпостах (ВКН и ВКТ) по сравнению с компостами (КН и КТ) (табл. 4).

Оценить потребность микробного сообщества в факторах роста, т.е. его ауксотрофность, позволяет индекс ауксотрофности (Ia=µm/µyeast), где µyeast максимальная удельная скорость роста на дрожжевом экстракте (Blagodatsky et al., 2004). Его значения для компостов и вермикомпостов были близки – 0.69-0.85 (табл. 4), наибольшие их значения – в навозном вермикомпосте.

Индекс ауксотрофности для почвенных условий бывает обычно меньше единицы, что означает наличие лимитации по факторам роста. Наши результаты свидетельствуют о том, что микроорганизмы в вермикомпостах и компостах также испытывали недостаток в факторах роста, однако это лимитирование оказалось меньшим, чем в почве, для которой характерны значения Ia=0.4-0.5 (Благодатский и др., 2008).

Таблица 4. Ростовые характеристики микробного сообщества in situ Параметр ВКТ КТ ВКН КН Максимальная удельная 0.59 ± 0.42 ± 0.46 ± 0.04 0.9 ± 0. скорость роста на 0.16 0. глюкозе (µm), 1/ч Максимальная удельная 0.69 ± 0.61 ± скорость роста на 0.62 ± 0.23 1.31 ± 0. дрожжевом экстракте 0.10 0. (µyeast ), 1/ч Индекс ауксотрофности 0.85 ± 0.69 ± 0.73 ± 0.26 0.69 ± 0. (Ia) 0.19 0. (1.1 ± 0.4) (27.0 ± 2.3) (3.4 ± 0.8) (7.8 ± 1.3) µm /Ks, г/(мкг С– 10–3 10–3 10–3 10– глюкозы ч) Примечание: ± – доверительный интервал при р=0.95.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить относительное увеличение доли r-стратегов в вермикомпостах. Подобная активизация r-стратегов характерна для таких местообитаний как ризосфера и ризоплана (Blagodatsky et al., 2004) и увеличение их доли в микробном сообществе вермикомпостов следует рассматривать как положительное для растений явление. Вероятно, внедрение быстрорастущих антагонистов фитопатогенов растений будет более успешным в вермикомпосты, чем в компосты.

Время вермикомпостирования, достаточное для формирования отличительных признаков микробного сообщества. Важным аспектом микробной характеристики вермикомпостов является то время, за которое исследуемые экофизиологические параметры формируются в вермикомпостах. Спектр ассимиляции микробного комплекса вермикомпостов становится отличным от микробного комплекса компостов через 2 недели для листовых и торфяных вермикомпостов и через 1.5 месяца - для навозного вермикомпоста. Время же стабилизации спектра лучше всего определять по усредненному для всех тест-субстратов параметру Dmax.

Данный параметр стабилизируется через 2 месяца вермикомпостирования вне зависимости от природы субстрата вермикомпостирования и присутствия червей. Через 1.5 месяца прекращается повышение Km гидролитических ферментов (рис. 13). Примерно за это же время стабилизируется длина грибного мицелия в вермикомпостах (см. рис. 2). Таким образом, можно считать, что 1.5-2 месяца является достаточным временем для формирования исследуемых отличительных микробиологических признаков вермикомпостов, при условии, что компостирование идёт при оптимальной влажности и комнатной температуре.

Рис. 13. Изменение параметра Dmax (медиана, квартили) в процессе созревания вермикомпоста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данное исследование направлено на микробиологическую характеристику вермикомпостов. Только общие для всех вермикомпостов микробиологические свойства, не зависящие от конкретных условий вермикомпостирования, могут считаться особыми отличительными признаками вермикомпостов. Именно поэтому в работе наряду с промышленными анализировались модельные вермикомпосты, позволяющие исключить влияние побочных факторов. Ряд микробиологических свойств модельных и промышленных вермикомпостов совпадают вне зависимости от исходного сырья, что даёт основание считать их отличительными признаками вермикомпостов.

В настоящем исследовании применены как традиционные методы, так и современные интегральные экофизиологические подходы оценки состояния микробных сообществ. В таблице 5 отражено влияние исследуемых факторов на микробиологические параметры по данным дисперсионного анализа (процент дисперсии). Видно, что такие показатели как константа полунасыщения ферментов субстратом реакции (Кm), длина грибного мицелия, коэффициент физиологического состояния микроорганизмов (r0), спектр ассимиляции, отношение µm/Ks, удельная гидролазная активность достоверно отличаются и поэтому могут использоваться при разработке микробиологических стандартов качества и готовности вермикомпоста.

Микробиологические свойства вермикомпостов стабилизируются через 2 месяца;

для получения стандартной продукции вермикомпостов необходимо использовать стандартное сырьё;

чтобы сохранить микробиологические свойства вермикомпостов нельзя высушивать готовую продукцию.

Таблица 5. Исследование роли червей в формирование микробиологических свойств компостов (данные дисперсионного анализа результатов исследования, % дисперсии) Метод исследования Исследуемый параметр Влияние Влияние Влияние червей сырья времени сумма ДНК эубактерий не значимо 1 н.о.

индекс Шеннона не значимо не значимо н.о.

Денатурирующий индекс Бергера-Паркера не значимо 2.8 н.о.

градиентный гель число видов не значимо 0.3 н.о.

электрофорез «обилие» конкретного ОТЕ 29 53 н.о.

(средние арифметическое для всех 143 ОТЕ) коэффициент физиологического состояния 5 1 н.о.

r Dmax не значимо 0.6 Спектр ассимиляции µm не значимо 1 органических соединений D0 1 5 функциональный индекс не значимо 0.2 0. Шеннона Кт 6 не значимо Гидролиз ФДА Vmax не значимо 22 Vmax/ Кт не значимо 16 длина грибных гиф 2 17 Метод Росси-Холодного длина актиномицетных гиф не значимо 1 численность бактерий не значимо 14 численность нематод 30 50 н.о.

Прямой счёт численность коловраток 37 4 н.о.

численность инфузорий 13 23 н.о.

КS 32 21 н.о.

Vmax(биомасса СИД) 2 52 н.о.

Метод Райта-Хобби и Vbasal 1 15 н.о.

кинетический метод µm/Ks 24 20 н.о.

определения биомассы qСО2 2 23 н.о.

qФДА 16 14 н.о.

Примечание: н.о. - не определялось, уровень значимости р=0. ВЫВОДЫ 1. Основные отличия микробных сообществ вермикомпостов от компостов установлены по следующим параметрам: константа полунасыщения ферментов субстратом реакции (Кm), длина грибных гиф, спектр ассимиляции органических соединений микробным сообществом. Эти параметры могут быть апробированы при разработке микробиологических стандартов качества и готовности вермикомпоста.

2. Установлено снижение сродства к субстратам эстераз и окислительно востановительных ферментов под действием червей по значению µm/Ks константы Михаэлиса-Ментен, что наряду с параметром свидетельствует об увеличении в микробном блоке вермикомпостов доли r-стратегов с неэффективной ферментной системой.

3. В вермикомпостах снижается длина грибного мицелия, обилие бактерий и актиномицетов не изменяется;

снижается численность нематод.

4. Анализ спектра ассимиляции субстратов микробным сообществом с помощью многомерных методов статистики позволяет говорить о функциональной (трофической) обособленности вермикомпостов от компостов.

5. Обнаружена активизация микроорганизмов (коэффициент физиологического состояния r0 возрастает) в вермикомпостах по сравнению с аналогичными компостами.

6. В вермикомпостах подтверждено усиление накопления нитратов и активизация минерализации (для вермикомпоста из листьев).

7. Таксономическая структура бактериального сообщества вермикомпостов определяется в существенно большей степени природой сырья, а не деятельностью дождевых червей.

8. Микробиологические свойства, по которым вермикомпосты отличаются от компостов, достигают максимальных отличий за 1,5-2 месяца вермикомпостирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Якушев А.В., Бызов Б.А. Микробиологическая характеристика вермикомпостирования методом мультисубстратного тестирования // Почвоведение. 2008. №11. С. 98–104.

2. Якушев А.В., Бызов Б.А. Гидролазная активность как показатель состояния микробного сообщества вермикомпоста // Вестн. Моск. ун–та Сер.17 Почвоведение. 2009. №2 С.

41–46.

3. Якушев А.В., Благодатский С.А., Бызов Б.А. Действие дождевых червей на физиологическое состояние микробного сообщества при вермикомпостирование // Микробиология. 2009. Т.78. №4. С. 565-574.

4. Якушев А.В. Развитие метода микробных пейзажей и ферментативного гидролиза диацетата флюоресцеина на примере вермикомпоста // Тезисы докладов ХIV международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007», секция Почвоведение М.: МАКС Пресс, 2007, с. 88-90.

5. Якушев А.В., Бызов Б.А. Микробиологическая характеристика вермикомпоста методами микробных пейзажей и по общей микробиологической активности.

//Сборник научных трудов конференции "Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в ХХI веке: проблемы перспективы, достижения" Минск, 2007, с 50-52.

6. Якушев А.В. Микробиологическая характеристика вермикомпостирования // Тезисы докладов XV международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008», секция «Почвоведение» (8-12 апреля 2008 г., Москва). / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев.

[Электронный ресурс] — М.: Издательство МГУ;

СП МЫСЛЬ, 2008. С. 144-145 [Адрес ресурса в сети интернет: http://www.lomonosov-msu.ru/2008/].

7. Якушев А.В., Бызов Б.А. Применение метода мультисубстратного тестирования для оценки качества микробного сообщества вермикомпостов // Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям:I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием;

23- апреля 2008 г.;

Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения:

Тезисы докладов / Сост. Макаров О.А., Кулачкова С.А.-М.: МАКС Пресс. 2008. С. 320 321.

8. Якушев А.В. Бызов Б.А. Микробиологическая и физико-химическая характеристика вермикомпостирования //Материалы V съезда Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева, 18-23 августа 2008 г./ Ростов-на-Дону: ЗАО «Ростиздат». С. 9. Якушев А.В. Микробиологическая особенность вермикомпостов //Актуальные аспекты современной микробиологии: IV молодежная школа-конференция с международным участием. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Москва, 20- октября 2008 г.: Тезисы. - М.: МАКС Пресс. 2008. С. 124-126.

10. Якушев А.В. Влияние дождевых червей на интегральные параметры микробного сообщества// Проблемы почвенной зоологии (Материалы XV всероссийского совещания по почвенной зоологии) / Под ред. Б.Р. Стригановой. М.: т-во научных изданий КМК. 2008. С 249-250.

11. Якушев А.В. Характеристика микробного сообщества вермикомпостов // Тезисы докладов ХVI международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2009», секция Почвоведение М.: МАКС Пресс, 2009, с. 180-181.