Исследование процессов биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами
На правах рукописи
ШАМАЕВА АЛИЯ АЗАТОВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ И
ОБЪЕКТОВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЯНЫМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ
03.00.16 - Экология
03.00.23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа - 2007
Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет" Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна Доктор биологических наук Хазиахметов Рашит Мухаметович
Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Логинов Олег Николаевич Доктор биологических наук Кулагин Андрей Алексеевич
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов)
Защита диссертации состоится 14 ноября 2007 года в 14.00 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 69, тел.: (347) 235-53-62, е-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра Российской Академии Наук и на официальном сайте http://www.anrb.ru/inbio/dissovet/index.htm
Автореферат разослан _ октября 2007 года
Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, кандидат биологических наук Р.В. Уразгильдин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Нефтяные углеводороды являются одними из наиболее экологически опасных веществ, загрязняющих природную среду.
Загрязнение нефтью и нефтепродуктами вызывает значительные, преимущественно неблагоприятные, и трудно обратимые изменения в почвенных экосистемах. В Башкортостане, республике нефтедобычи и нефтепереработки, эта проблема является наиболее актуальной.
Физические, термические и химические методы разрушения нефтяных углеводородов, несмотря на то, что способствуют интенсификации их разложения, не обеспечивают полное удаление из почвенного слоя и могут являться дополнительным источником поступления загрязняющих веществ в окружающую среду (Купцов и др., 1983;
Bacraff, 1992;
Роев, 1998;
Menzie et al., 1992;
Федоров, 1993;
Абросимов, 2002).
Технологии мобилизации природных резервов почвенных экосистем, направленные на разложение нефти и нефтепродуктов, рассматриваются в настоящее время как наиболее перспективные и эффективные способы очистки.
Один из наиболее распространенных способов рекультивации – очистка почв и грунтов путем внесения специальных культур микроорганизмов. Однако многоступенчатость биохимических процессов разложения углеводородов разными группами микроорганизмов, осложняющаяся разнообразием химического состава нефти и нефтепродуктов, обусловливает сложность регуляции устойчивого процесса их разложения.
Концепция фиторемедиации привлекает большое внимание и является предметом многих публикаций (Wein, Bliss, 1978;
Meagher, 1995;
Leyval, Binet,1998;
Brizili et al., 2000;
Kramer, Chardonnes, 2000;
Pillon-Smits et al., 2005;
Турковская, Муратова, 2005;
Якушева, 2006). Растения ускоряют процессы очистки почвы и позволяют обеспечить стабильность процесса биологического распада при относительно невысокой стоимости затрат. Фиторемедиация не требует снятия плодородного слоя почвы, может применяться на больших площадях и способствует сохранению и улучшению окружающей среды, поскольку связана с обогащением почвы и повышением ее плодородия.
Корневая система растений способствует усилению газообмена глубинных слоев почвы и воды, развитию нефтеокисляющей микробиоты в естественной среде, подвергшейся нефтяному загрязнению, которая в обычных условиях характеризуется низкой температурой, недостатком биогенных элементов, недостатком кислорода, избыточной кислотностью.
Таким образом, исследование биологических процессов в нефтезагрязненных почвах и возможностей применения растений для рекультивации нарушенных почв в качестве активного мелиоративного фактора является одной из актуальных задач современной прикладной экологии и биотехнологии.
Целью диссертационной работы явилась оценка эффективности использования биопрепарата Бациспецин, органо-минерального удобрения Бионекс-Плюс, фитомелиорантов и растительных масс для биоремедиации почв и других объектов, загрязненных нефтяными углеводородами.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Исследовать эффективность способов стимуляции самоочищения нефтезагрязненных почв: фитомелиорации, внесения биопрепарата Бациспецин, удобрения Бионекс-Плюс и растительных масс.
2. Провести сравнительный анализ эффективности выращивания фитомелиорантов и внесения удобрения Бионекс-Плюс с целью рекультивации почв, загрязненных продуктами первичной переработки нефти.
3. Исследовать возможность применения опада и коры сосны обыкновенной для детоксикации грунтовых нефтешламов.
4. Оценить влияние продуктов сгорания попутного нефтяного газа на численность углеводородокисляющих микроорганизмов, активность ферментов, токсичность почвы и исследовать возможность использования костреца безостого для ускорения ее самоочищения.
Научная новизна. Впервые показано, что органо-минеральное удобрение Бионекс-Плюс ускоряет разложение нефтяных углеводородов. Впервые в условиях Башкортостана показана возможность фиторекультивации почв, загрязненных продуктами первичной переработки нефти и продуктами сгорания попутного нефтяного газа. Впервые в регионе показана возможность применения для ремедиации нефтезагрязненных почв и грунтовых нефтешламов коры и опада сосны. Проведено сравнение эффективности использования фитомелиорантов относительно других способов рекультивации (внесение биопрепарата Бациспецин и применение органо-минерального удобрения Бионекс-Плюс).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Загрязнение почв нефтяными углеводородами вызывает рост численности углеводородокисляющих микроорганизмов, повышает активность каталазы и липазы, увеличивает фито- и зоотоксичность. Токсическое воздействие нефтяных углеводородов на почвы находится в прямой зависимости от концентрации загрязнителя, вида поллютанта, времени его нахождения в почве и способности последней к самоочищению.
2. Фиторекультивация способствует очищению почв, загрязненных нефтью, продуктами первичной переработки нефти, продуктами сгорания попутного нефтяного газа и нефтешламов. Динамика снижения содержания остаточных углеводородов и токсичности в почвах интенсивнее при применении фитомелиорантов, чем при других способах рекультивации.
Практическая значимость. Результаты исследований позволяют выработать рекомендации по выбору рекультивирующих агентов для восстановления почв и объектов, загрязненных различными видами нефтяных углеводородов. Дополнения, внесенные в методику определения липазы, дают возможность более объективно оценить уровень активности этого фермента, что позволяет с большей достоверностью проводить оценку биологической активности загрязненных почв. Предложена модификация методики оценки углеводородокисляющей активности микроорганизмов, что позволяет увеличить эффективность мониторинга микробиологического состояния нефтезагрязненной среды на 30%. Результаты исследований были применены в качестве рекомендаций при разработке технологии рекультивации углеводородсодержащих объектов на территории ООО "ХТЦ УАИ".
Личное участие автора. Автор провела аналитический обзор литературы, получила большинство экспериментальных данных и выполнила их математическую обработку, участвовала в написании статей и тезисов докладов.
Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены большим объемом лабораторных и полевых экспериментов с применением современных математических методов обработки, анализа и оценки полученных результатов.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно преобразованных экосистем» (Иркутск, 2001), на 6-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002), Стратегия природопользования биоразнообразия в XXI веке (Оренбург, 2004), на Всероссийских конференциях и съездах «Ботанические исследования в Азиатской России» (Новосибирск, 2003), «Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан» (Казань, 2003, 2004), «VII Докучаевские молодежные чтения» (Санкт-Петербург, 2004), на IV съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004), «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), «Актуальные проблемы экологии и охраны окружающей среды» (Уфа, 2004), «Университетская наука – Республике Башкортостан» (Уфа, 2004), на II съезде общества биотехнологов России (Москва, 2004), «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга» (Киров, 2004), «Экологическое разнообразие почвенной биоты и биопродуктивность почв» (Тюмень, 2005), «Популяции в пространстве и времени» (Н.Новгород, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего источников, в том числе 83 на иностранных языках, и приложений. Работа содержит 162 страницы основного текста, иллюстрирована 43 рисунками и включает 27 таблиц.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь и поддержку научным руководителям д.б.н., проф. Киреевой Н.А. и д.б.н. Хазиахметову Р.М., к.б.н. Бакаевой М.Д. за активное участие в обсуждении результатов, а также всем коллегам и соавторам публикаций.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Воздействие нефти и нефтепродуктов на почвенные экосистемы и вопросы их биоремедиации (аналитический обзор) Дана общая характеристика нефтяных углеводородов как одних из наиболее экологически опасных загрязнителей природной среды. Рассмотрены вопросы влияния нефти и нефтепродуктов на компоненты почвенных экосистем и сопряженные с этим проблемы рекультивации.
Глава 2. Объекты и методы исследований В лабораторных и полевых условиях в течение 2000-2006 гг. изучались процессы биоремедиации различных типов почв (серых лесных, дерново подзолистых, черноземов), загрязненных нефтяными углеводородами (нефтью, продуктами первичной переработки нефти: бензиновая фракция, вакуумный газойль, вакуумный остаток, продуктами неполного сгорания попутного нефтяного газа в факельной системе) и нефтесодержащих объектов (грунтовых нефтешламов).
В процессах биоремедиации загрязненных почв и объектов были использованы: биопрепарат Бациспецин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus sp. 739, (Патент РФ №1743019), органоминеральное удобрение Бионекс-Плюс (содержит азот, фосфор, калий, гумат) и предназначен для регенерации плодородия земель, загрязненных продуктами техногенного происхождения, улучшения структуры почвы (ТУ 2387-010 20672718-01), люцерна посевная Medicago sativa L., кострец безостый Bromopsis inermis Leys., кора и опад хвои сосны обыкновенной (Pinus sylvestris).
Критериями суждения о биологической активности почвы и ее способности к самоочищению служили следующие параметры: численность углеводородокисляющих микроорганизмов, ферментативная активность, фитотоксичность, зоотоксичность. Активность триацилглицерол-липазы определялась по модифицированному нами методу К.А. Козлова с соавт.
(1968). Каталазная активность определялась газометрическим методом (Хазиев, 2005). Оценку степени фитотоксичности остаточных нефтепродуктов биотестами с помощью проростков редиса (Raphanus sativus), сорт Красный с белым кончиком, проводили по Гродзинскому (1991). Степень зоотоксичности остаточных нефтепродуктов на разных стадиях биоремедиации оценивали биотестом с помощью коллембол Folsomia candida (Ханисламова, 1995).
Определение численности углеводородокисляющих микроорганизмов и видового состава грибов и бактерий, в том числе образцов ризосферы растений проводили в соответствии с общепринятыми методами (Методы почвенной..., 1991). Для учета численности УОМ и оценки углеводородокисляющей активности микроорганизмов использовали модифицированный нами метод "нитроцеллюлозных фильтров", предложенный С.Б. Петрикевичем с соавт.
(2003).
Определение содержания остаточных нефтепродуктов в почве проводили горячей экстракцией хлористым метиленом (McGill, Rowell, 1980).
Статистическая обработка результатов производилась на ЭВМ с применением программ Statistica V 6.0., Microsoft Excel-2000. При оценке статистической достоверности средних полученных данных использовали t критерий Стьюдента на 5% уровне значимости.
Глава 3. Изучение возможности использования различных методов для рекультивации почв, загрязненных нефтью Использование для рекультивации нефтезагрязненной почвы (НЗП) как биопрепарата Бациспецин, так и комплексного удобрения Бионекс-Плюс, способствовало разложению углеводородов. Наиболее интенсивно процесс убыли нефтяных углеводородов протекал в первые два месяца после постановки эксперимента (рис. 1) и совпадал с высокой численностью углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) (рис. 2). В последующие месяцы процесс очистки замедлялся. Это обусловлено, вероятно, как уменьшением в составе остаточного загрязнения парафиновых фракций, доступных для усваивающих углеводороды микроорганизмов, так и истощением минеральных ресурсов почвы или обеднением видового разнообразия экосистемы.
Остаточные углеводороды, г/100г 4 Численность УОМ, lg 3 2 1 0 0 30 60 90 120 150 180 0 30 60 90 120 150 Время отбора проб, сут Время отбора проб, сут Рис.1. Содержание остаточной нефти в Рис. 2. Динамика численности УОМ в серой серой лесной почве в лабораторных лесной почве, загрязненной нефтью (5%) в условиях, г / 100 г почвы лабораторном эксперименте, lg числа жизнеспособных клеток Несмотря на стимуляцию естественной нефтеокисляющей микробиоты в результате применения удобрения Бионекс-Плюс, интродукция в загрязненную нефтью активных УОМ биопрепарата была более эффективной, о чем свидетельствуют данные по биодеградации углеводородов. В варианте опыта с внесением Бациспецина за шесть месяцев произошло удаление из субстрата при первоначальных концентрациях нефти до 5% около 80% углеводородов, при загрязнении 10 и 15% - от 60 до 50%. Снижение содержания остаточных нефтепродуктов при рекультивации с применением Бионекса шло менее интенсивно и составило при начальном содержании нефти 5% - 55%, при 10 и 15% - 40% от начальной концентрации. В загрязненной почве без внесения рекультивирующих факторов содержание остаточной нефти в почве составило 70 – 80% от исходных значений.
Внесение Бациспецина и Бионекса в нефтезагрязненную почву способствовало интенсификации липолитической активности (рис. 3), которая в связи со сходством ферментных систем биодеградации липидов и нефти (Margesin et al., 1999), была использована в качестве показателя степени загрязнения и активности процессов восстановления. В целом, уровень активность почвенной липазы при внесении Бионекса был значительно ниже, чем при использовании Бациспецина.
Активность липазы, мл 0,1 н КОН / г почвы 0 30 60 90 120 150 Время отбора проб, сут Рис. 3 Активность липазы в серой лесной почве, загрязненной нефтью (5%), мл 0,1 н КОН на 1 г почвы Нефть в исследованных концентрациях оказывала сильное угнетающее действие на выживаемость тестерных видов коллембол. На третий день после загрязнения почвы нефтью в дозе 1% выжила лишь третья часть особей. При увеличении дозы нефти (от 5% и выше) погибало 100% особей. Рекультивация внесением биопрепарата позволила увеличить в два раза, как выживаемость, так и продолжительность жизни коллембол. Особенно наглядно это проявилось при концентрациях поллютанта до 5% включительно, где удалось почти полностью нейтрализовать токсичность загрязненной почвы для ногохвосток.
При загрязнении почв высокими концентрациями нефти (10 и 15%) рекультивирующий эффект Бациспецина не сказывался на выживаемости коллембол. Частичное восстановление этого показателя наблюдалось лишь к окончанию срока инкубации. Внесение Бионекса в меньшей степени, чем биопрепарата способствовало снижению зоотоксичности почвы, загрязненной нефтью.
Аналогичные закономерности выявлены в полевых условиях.
Посев фитомелиорантов, особенно люцерны, на нефтезагрязненной почве, также как и внесение биопрепарата и удобрения, способствовал ускорению процессов деструкции углеводородов (рис. 4) за счет создания оптимальных условий для развития УОМ. Максимальная численность УОМ отмечена в ризосфере, что свидетельствует об интенсификации растениями протекания микробиологических процессов (рис. 5).
Остаточные углеводороды, Численность УОМ, lg г/100 г 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150 Время отбора проб, сут Время отбора проб, сут Рис.4. Содержание остаточной нефти в серой лесной почве в лабораторных условиях под посевами люцерны, г / 100 г почвы Рис. 5. Динамика численности УОМ в серой лесной почве, загрязненной нефтью (5%) под посевами люцерны, lg числа жизнеспособных клеток Анализ динамики численности УОМ при рекультивации с внесением Бациспецина и Бионекса, а также в случае использования фитомелиорантов показал, что в почвах под растениями отмечена стабилизация численности УОМ на более высоком уровне на протяжении всего эксперимента.
Выращивание фитомелиорантов стимулировало липолитическую активность загрязненной нефтью почвы. По сравнению с вариантами опыта, где были использованы Бациспецин, и Бионекс динамика изменения активности липазы в почве под растениями имела более сглаженный характер.
Активность каталазы, участвующей в окислительно-восстановительных процессах в почве, под посевами растений также значительно выше, чем в нерекультивируемых (табл. 1), что может быть связано не только с изменением общей биологической активности почв в результате нефтяного загрязнения (Алиев, Гаджиев, 1977), но и с появлением субстратов в результате разложения углеводородов (Михайловская, 1978).
Таблица Относительная активность каталазы в серой лесной почве, загрязненной различными концентрациями нефти Время Концентрации нефти, % взятия проб, 0 1 5 сутки Нефтезагрязненная почва 3,696±0,013 1,314± 0,012 0,640±0,001 0,497±0, 3,111±0,005 2,666±0,003 4,500±0,019 2,033±0, 3,911±0,007 0,803± 0,002 0,590±0,002 0,704±0, 180 3,619±0,007 0,565± 0,001 0,285±0,001 0,309±0, Нефтезагрязненная почва под посевами люцерны 2,470±0, 30 5,000±0,015 3,128±0,002 1,766±0, 60 4,757±0,010 8,500±0,019 5,730±0,010 2,543±0, 90 4,712±0,013 7,866±0,020 7,150±0,010 2,992±0, 180 4,955±0,004 3,911±0,007 3,619±0,007 2,564±0, Использование фитомелиорантов в качестве рекультивирующего фактора способствовало снижению зоотоксичности. Так, уже через месяц после постановки опыта в нефтезагрязненной почве увеличилась выживаемость ногохвосток и продолжительность их жизни на 5% при высоких концентрациях и на 20% при средних в сравнении с нерекультивируемыми образцами. В дальнейшем, с увеличением продолжительности фиторекультивации, токсичность загрязненных почв для коллембол падала.
В целом, анализируя содержание остаточных углеводородов в почвах, показатели активности ферментов и токсичности, можно сделать вывод о большей эффективности применения в качестве фитомелиоранта люцерны в сравнении с кострецом.
Полученные в лабораторных экспериментах результаты нашли свое подтверждение в условиях полевых опытов.
Внесение опада хвои сосны обыкновенной в загрязненную нефтью почву в лабораторных условиях способствовало снижению содержания углеводородов (рис. 6), прежде всего, за счет увеличения численности УОМ (рис. 7). Высокая численность УОМ сохранялась, начиная с 30 суток и на протяжении последующих трех месяцев. К окончанию эксперимента численность УОМ снизилась, вероятно, в связи с уменьшением доступного субстрата.
Остаточные углеводороды, Численность УОМ, lg г/100 г 1 3 30 60 90 3 30 60 90 Время отбора проб, сут Время отбора проб, сут Рис.6. Содержание остаточной нефти в Рис. 7. Динамика численности УОМ в серой серой лесной почве в лабораторных лесной почве, загрязненной нефтью (5%) при условиях при внесении опада хвои внесении опада хвои сосны, сосны, г / 100 г почвы lg числа жизнеспособных клеток Внесение опада способствовало интенсификации процессов липолиза в почве, загрязненной нефтью в концентрациях до 5% масс. включительно (рис.
8). Нефтяное загрязнение в концентрации 10 и 15 % первоначально оказывало ингибирующее воздействие на активность фермента. Через год во всех образцах было отмечено повышение активности липазы в сравнении с началом эксперимента Активность липазы, мл 0,1 н КОН/г почвы 0 30 60 90 120 150 Время отбора проб,сут Рис. 8 Активность липазы в серой лесной почве, загрязненной нефтью (5%) с внесением соснового опада, мл 0,1 н КОН на 1 г почвы Внесение соснового опада в почву, загрязненную нефтью, снижало ее зоотоксичность.
Таким образом, использование соснового опада в качестве рекультивирующего агента более эффективно при начальных концентрациях поллютанта 1 – 5% и может быть рекомендовано для применения в качестве начального этапа для детоксикации почв, загрязненных нефтью в концентрации 10%.
В целом можно отметить, что в рекультивируемых серых лесных почвах за весь период проведения экспериментов наблюдались более высокие значения активности почвенной липазы и каталазы, численности УОМ и зоотоксичности. Использование биопрепарата Бациспецин, органо минерального удобрения Бионекс-Плюс, люцерны, костреца и соснового опада наиболее эффективно на почвах, загрязненных нефтью в концентрациях до 5% масс. включительно. Применение люцерны, в сравнении с другими способами рекультивации способствовало поддержанию в исследуемых образцах более высокой численности УОМ и повышенной активности каталазы и липазы.
Эффективность применения бобовых растений, вероятно, обусловлена тем, что биологический азот, фиксируемый ризосферными микроорганизмами из атмосферы, оказывает значительное влияние на скорость процессов микробиологической деструкции нефтепродуктов в почве.
Глава 4. Биологическая активность почв, загрязненных продуктами вакуумной перегонки нефти и способы их рекультивации Реакция почвенной микробиоты на внесение нефтяных углеводородов, отличающихся по молекулярному весу, была различна. Токсичность продуктов вакуумной перегонки нефти возрастала в следующем ряду: вакуумный остаток (ВО) вакуумный газойль (ВГ) бензиновая фракция (БФ).
Внесение в загрязненную нефтяными фракциями почву удобрения Бионекс-Плюс, несколько изменило характер динамики численности УОМ. Не было отмечено выраженного токсического действия углеводородов, характеризующегося угнетением численности УОМ. При фитомелиорации наблюдалось значительное увеличение численности УОМ в сравнении с нерекультивируемыми образцами почв, особенно в ризосферной зоне (рис.9).
А Численность УОМ, lg контроль 6 БФ БФ+Бионекс БФ+Люцерна (ризосфера) 30 40 50 60 70 80 Время отбора проб, сут Б Численность УОМ, lg контроль 6 ВГ ВГ+Бионекс ВГ+Люцерна (ризосфера) 30 40 50 60 70 80 Время отбора проб, сут В Численность УОМ, lg контроль 6 ВО ВО+Бионекс ВО+Люцерна (ризосфера) 30 40 50 60 70 80 Время отбора проб, сут Рис. 9. Динамика численности УОМ в почвах, загрязненных продуктами первичной переработки нефти (5%), lg числа жизнеспособных клеток Отмечено, что выращивание люцерны в сравнении с кострецом в большей степени стимулировал развитие в загрязненной почве углеводородокисляющей микрофлоры.
Использование для восстановления почвы комплексного удобрения Бионекс-Плюс и посев фитомелиорантов способствовали более интенсивному разложению нефтяных углеводородов в почве. Так, при внесении удобрения за три месяца подверглось деградации около 40 и 50% при начальном загрязнении 1 и 5% соответственно. При фитомелиорации произошла деградация около 60% углеводородов при начальной концентрации загрязнителя в почве 5%.
Загрязнение почв продуктами первичной переработки нефти первоначально вызвало значительное ингибирование активности липазы.
Наибольшим ингибирующим воздействием на активность липазы обладала бензиновая фракция, наименьшим – вакуумный остаток. Липолитическая активность в загрязненных почвах с внесением удобрения и под посевами трав, была выше на 30%, чем в нерекультивируемых.
Фитотоксичность почвы, загрязненной продуктами первичной переработки нефти, по отношению к семенам редиса была пропорциональна концентрации поллютанта и снижалась со временем. Использование фитомелиорантов приводило к снижению токсического воздействия продуктов первичной переработки нефти на почвы. При внесении Бионекса снижения фитотоксичности почвы не происходило. В почвах, загрязненных вакуумным остатком и вакуумным газойлем в концентрации 5% к окончанию эксперимента было отмечено увеличение этого показателя.
Глава 5. Изучение биологической активности грунтовых нефтешламов и возможности их биоремедиации В лабораторных и полевых условиях изучали возможности ускорения биологической утилизации четырех образцов грунтовых нефтешламов с использованием растительных масс – коры и опада хвои сосны обыкновенной.
Исходная концентрация нефти составляла в нефтешламе I – 12,72%, II – 9,68%, III – 15,91%, IV – 20,44%.
В лабораторных условиях через шесть месяцев содержание остаточных углеводородов в нефтешламах I и II составило 60 – 65% от исходного количества при добавлении сосновой коры и 50-55% в образцах с добавлением соснового опада. При содержании нефтяных углеводородов в пределах 15% масс. на начало эксперимента, в результате биоремедиации произошла деструкция 30% углеводородов. В IV нефтешламе произошло незначительное снижение содержание углеводородов. Вероятно, в разложении углеводородов принимают участие не только аборигенная микробиота нефтешлама, активизированная нами, но и микроорганизмы, входящие в состав этих рекультивирующих факторов.
Внесение добавок уже через месяц после начала эксперимента способствовало увеличению численности УОМ (рис. 10).
Углеводородокисляющие грибы, были представлены видами Fusarium sp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, углеводородокисляющие бактерии относились к родам Pseudomonas, Rhodococcus.
А Б Численность УОМ, lg Численность УОМ, lg 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150 Время, сутки Время, сутки Рис. 10. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтешламе II с внесением соснового опада в лабораторных условиях (А) и в условиях полевого эксперимента (Б), lg числа жизнеспособных клеток В образцах нефтешламов, обработанных корой и опадом хвои сосны отмечено повышение активности липазы по сравнению с фоновыми (рис. 11).
А Б 1,6 1, Относительная активность Относительная активность 1,2 1, липазы липазы 0,8 0, 0,4 0, 0 0 30 60 90 120 150 180 0 30 60 90 120 150 Время, сутки Время, сутки Рис. 11. Относительная активность липазы в нефтешламе II с внесением соснового опада в лабораторных условиях (А) и в условиях полевого эксперимента (Б), мл 0,1 н КОН на 1 г почвы Можно сказать, что при внесении опада происходит наиболее существенная интенсификация активности липазы в сравнении с образцами с внесением сосновой коры, что, по-видимому, связано с тем, что микроорганизмы опада изначально обладают более мощным липолитическим ферментным комплексом.
Анализируемые нефтешламы обладали высокой токсичностью по отношению к ногохвосткам. Выживаемость коллембол в необработанных образцах не превышала 25%. Внесение растительных масс способствовало значительному (до 53,4%) снижению их смертности и увеличению продолжительности жизни (в 2-3).
Фитотоксичность контрольных образцов на протяжении всего эксперимента оставалась высокой и составила до 100% в нефтешламе IV. После проведенных мероприятий токсическое воздействие нефтешламов на всхожесть семян редиса снизилось, что свидетельствует о деструкции токсичных компонентов. Всхожесть семян в образцах I и II увеличилась с 20% до 70%.
Наименьшей фитотоксичностью обладали образцы с внесением соснового опада.
Таким образом, примененный способ детоксикации грунтовых нефтешламов с применением коры и опада сосны является перспективным для использования в качестве первоначального этапа ремедиации. Дальнейшую очистку, обработанного сосновой корой или опадом, нефтешлама предполагается проводить с использованием фитомелиорантов.
Глава 6. Изучение возможности фиторекультивации выщелоченного чернозема, загрязненного продуктами сгорания попутного нефтяного газа Загрязнение почвы выбросами продуктов сгорания попутного нефтяного газа на исследуемом участке происходило на протяжении 20 лет. Осаждение загрязняющих веществ наблюдалось на определенном расстоянии от источника загрязнения в соответствии со скоростью, направлением ветра и относительной молекулярной массой веществ. Таким образом, на протяжении многих лет сформировалась следующая картина загрязнения: максимальная концентрация углеводородов отмечена с северной и восточной сторон (в соответствие с преобладающим направлением ветра) на расстоянии 50 -100 м от факела.
На основе полевых исследований почвы, загрязненной продуктами неполного сгорания природных и попутных газов на факельных системах, можно заключить, что этот комплексный поллютант способствовал увеличению численности углеводородокисляющих бактерий и микромицетов пропорционально поступлению (r=0.752, при р=0.95 и r=0,714 при р=0,95).
В то же время загрязненная почва обладала фитотоксическим действием:
угнетающе влияла на количество проросших семян, длину корней проростков, степень развития корневых волосков.
Посев костреца способствовал ускорению процесса деструкции нефтяных углеводородов (табл. 2).
Таблица Содержание остаточных углеводородов в почве, загрязненной продуктами неполного сгорания попутного нефтяного газа, при фитомелиорации кострецом, г/100 г Участок Сроки отбора проб, сут 3 30 60 Ризосфера 1 (север) 6,24±0,05 5,78±0,10 4,68±0,08 1,87±0, 2 (восток) 6,01±0,08 5,76±0,07 4,57±0,07 1,69±0, Эдафосфера 1 (север) 5,81±0,05 5,64±0,03 5,02±0,09 4,59±0, 2 (восток) 5,68±0,07 5,51±0,08 5,08±0,04 4,76±0, Микробиологический анализ показал, что выращивание костреца положительно сказывалось на численности УОМ. При этом в ризосфере растений была отмечена более высокая численность УОМ в сравнении с нерекультивируемой почвой на протяжении всего эксперимента, тогда как в эдафосфере эти различия не так заметны (рис. 12).
Численность УОМ, lg Численность УОМ, lg 8 контроль Уч. 1 (север) Уч. 2 (восток) 3 30 60 3 30 60 Время отбора проб, сут Время отбора проб, сут А Б Рис.12. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов при фитомелиорации кострецом, lg числа жизнеспособных клеток А – ризосфера, Б - эдафосфера Фиторекультивация посевом и выращиванием костреца способствовала значительному снижению фитотоксичности по отношению к семенам редиса (рис. 13), что особенно проявилось в почве ризосферы растений. Это связанно не только с деструкцией углеводородов (через три месяца убыль углеводородов составила в ризосфере около 70%, в эдафосфере – 20%), но и с уменьшением численности углеводородокисляющих грибов, в том числе и фитотоксичных видов.
Фитотоксичность, УКЕ Фитотоксичность, УКЕ 1200 1000 контроль 800 Уч. 1 (север) 600 Уч. 2 (восток) 400 200 0 0 30 60 90 0 30 60 Время отбора проб, сут Вряемя отбора проб, сут А Б Рис.13. Фитотоксичность загрязненных почв при фитомелиорации кострецом, УКЕ мг/л А – ризосфера, Б - эдафосфера В течение всего эксперимента наблюдалось стимулирование активности почвенной липазы по сравнению с фоновой почвой. Наиболее интенсивно процесс липолиза происходил в ризосфере растений (увеличение активности липазы составило около 50%).
Анализ результатов работы позволяет сделать вывод, что одним из наиболее перспективных, интересных и многообещающих экологически безопасных методов очистки почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами, является использование для рекультивации фитомелиорантов.
Выращивание растений способствует очистке почв и позволяет обеспечить стабильность процесса биологического распада при относительно невысокой стоимости затрат.
На рисунке 14 представлена схема, обобщающая результаты сравнительного анализа эффективности различных методов биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами, по показателям снижения содержания остаточных углеводородов и токсичности.
Условные обозначения:
БЦ – Бациспецин, БН – Бионекс-Плюс ФМЛ – фитомелиорант люцерна, ФМК – фитомелиорант кострец СО – сосновый опад, СК – сосновая кора Рис. 14. Эффективность применения различных способов для биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами ВЫВОДЫ 1. Внесение биопрепарата Бациспецин, удобрения Бионекс-Плюс, опада хвои сосны и посев фитомелиорантов на нефтезагрязненной почве ускорило разложение углеводородов, повысило численность углеводородокисляющих микроорганизмов, активность липазы и каталазы, снизило фито- и зоотоксичность почвы в диапазоне концентрации нефти до 10% включительно.
По эффективности рекультивирующие факторы можно расположить следующим образом: Бациспецин = Люцерна посевная = Опад хвои сосны Кострец безостый Бионекс-Плюс.
2. Использование фитомелиорантов в большей степени способствовало снижению токсического воздействия продуктов первичной переработки нефти на почвы и удалению нефтяных углеводородов по сравнению с внесением органо-минерального удобрения Бионекс-Плюс.
3. Применение коры и опада сосны эффективно для детоксикации нефтешламов и позволяет снизить содержание остаточных углеводородов до 40% от исходного количества и уменьшить фито- и зоотоксичность на 50 % за шесть месяцев.
4. В почве, загрязненной продуктами неполного сгорания попутного нефтяного газа, численность углеводородокисляющей микробиоты, активность ферментов и фитотоксичность типичны для нефтезагрязненных почв. Эффективным является способ ее фиторекультивации с применением костреца безостого.
5. Активность липазы является индикатором биодеградации углеводородов в почвах и других объектах и может быть рекомендована как метод агроэкологического мониторинга в качестве показателя степени загрязнения и активности процессов восстановления.
6. На основе анализа микробиологических и биохимических процессов, протекающих в ризосфере растений, показана целесообразность использования фитомелиорантов для рекультивации почв, загрязненных нефтяными углеводородами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Тарасенко Е.М., Новоселова Е.И., Валиуллина А.А., Онегова Т.С.
Использование ферментативной активности для диагностики антропогенной трансформации почв. // Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем. Матер. межд. конф. Иркутск, 2001. С. 156.
2. Тарасенко Е.М., Валиуллина А.А. Влияние нефтяного загрязнения на комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов. // Сб. тезисов 6 ой Пущинской школы – конф. молодых ученых. Пущино. - 2002. – Т.3. С. 160.
3. Тарасенко Е.М., Киреева Н.А., Ханисламова Г.М., Валиуллина А.А., Федотов А.В. Подбор биодиагностических показателей для оценки токсичности нефтезагрязненных и рекультивируемых почв. // Итоги биологических исследований. 2001 г. Выпуск 7.: Сб. научн. трудов. Уфа: РИО БашГУ. - 2003. - С. 112-113.
4. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Бакаева М.Д., Валиуллина А.А.
Токсическое действие нефтяных углеводородов на рост и развитие люцерны (Medicago sativa L.). // Ботанические исследования в Азиатской России. Матер. XI Съезда РБО. Новосибирск. - 2003. - С.230-231.
5. Тарасенко Е.М., Бакаева М.Д., Валиуллина А.А. Экологический мониторинг нефтезагрязненных почв в процессе биорекультивации. // Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан: Матер.
Республ. научн. конф. – Казань: Отечество. - 2003. - С. 245-246.
6. Киреева Н.А., Новоселова Е.И., Валиуллина А.А. Использование липазной активности для биомониторинга деградации нефти и нефтепродуктов в почве. // Почвы – национальное достояние России:
Матер. IV съезда Докучаевского общества почвоведов. Новосибирск. 2004. – Т. 1. - С. 630.
7. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Ханисламова Г.М., Валиуллина А.А.
Использование ногохвосток (Collembola) для оценки токсичности нефтезагрязненных почв. // Токсикологический вестник. – 2004 - №3. – С.34-37.
8. Кабиров Т.Р., Шамаева А.А. Активность почвенной липазы как индикатор процесса биодеградации нефти в почве. // Сб. тезисов Всерос.
конф. «VII Докучаевские молодежные чтения», С.Пб. - 2004. - С. 80.
9. Шамаева А.А., Кабиров Т.Р. Использование люцерны (Medicago sativa L.) для фитомелиорации нефтезагрязненных почв. // Сб. тезисов XI междунар. конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004». Секция почвоведение. М.: МГУ, 2004. С. 180-181.
10. Федотов А.В., Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Шамаева А.А., Кабиров Т.Р. Создание биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Итоги биологических исследований. 2004 г.
Выпуск 8.: Сб. научн. трудов. - Уфа: РИО БашГУ. - 2004. - С. 42 –46.
11. Шамаева А.А., Тарасенко Е.М., Бакаева М.Д. Видовое разнообразие углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах Башкортостана // Актуальные проблемы экологии и охраны окружающей среды: Тезисы докл. Всеросс. конф. молодых ученых и студентов – Уфа:
РИО БашГУ. - 2004. - С. 87-88.
12. Киреева Н.А., Шамаева А.А., Бакаева М.Д. Углеводородокисляющие микроорганизмы нефтезагрязненных почв и их использование в биоремедиации // Университетская наука – Республике Башкортостан:
Том I. Естественные науки: Матер. научн.-практ. конф., посвящ. 95-летию основания БашГУ– Уфа: РИО БашГУ. - 2004. - С.138-139.
13. Киреева Н.А., Онегова Т.С., Шамаева А.А. Комплексная биотехнология очистки и детоксикации нефтезагрязненных почв с использованием биопрепарата // Матер. второго съезда общества биотехнологов России. – Москва – 2004. – С. 129-131.
14. Киреева Н.А., Шамаева А.А. Биоиндикация токсичности нефтезагрязненных и рекультивируемых почв // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика.
Сб. материалов Всеросс. научн. школы. Выпуск II. Киров. - 2004. – С. 213-214.
15. Киреева Н.А., Бакаева М.Д., Шамаева А.А., Салахова Г.М. Изменение фитотоксичности нефтезагрязненных почв при биоремедиации // Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан. тезисы докл. IV научн. конф. - Казань. – 2004. – С. 113.
16. Киреева Н.А., Шамаева А.А., Салахова Г.М. Опыт создания биопрепарата на основе углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв Башкортостана // Стратегия природопользования биоразнообразия в XXI веке. Матер. 2ой Междун.
научн. конф. – Оренбург. – 2004. – С. 46-46.
17. Киреева Н.А., Ханисламова Г.М., Шамаева А.А. Влияние загрязнения почвы нефтью на выживаемость коллембол // Экологическое разнообразие почвенной биоты и биопродуктивность почв. Матер.
IV (XIV) Всеросс. совещ. по почвенной зоологии. Тюмень. – 2005. – С. 122-124.
18. Киреева Н.А., Шамаева А.А., Салахова Г.М. Видовое разнообразие углеводородокисляющих микроорганизмов в почвах Башкортостана при нефтяном загрязнении и их применение при рекультивации // Популяции в пространстве и времени. Сб. матер. VIII Всеросс. популяц. семинара. Н.Новгород. – 2005. – С. 145-146.
19. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Шамаева А.А., Новоселова Е.И. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на активность липазы. // Почвоведение. – 2006. - №8. – С.1005-1011.