Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина
На правах рукописи
Памирский Игорь Эдуардович АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА 03.00.13 – физиология 03.00.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Благовещенск – 2009 2
Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, Бородин Евгений Александрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Лукьянова Ольга Николаевна доктор биологических наук, профессор, Новгородцева Татьяна Павловна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится «12» ноября 2009 г. в 10-00 на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 005.008.03 при Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН по адресу: 690041, г.Владивосток, ул.Пальчевского, 17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.
Автореферат разослан « 1 » октября 2009 г.
Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, к.м.н. А.Ю. Горькавая
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Ферментативный гидролиз белков (протеолиз) лежит в основе регуляции важных физиологических процессов (переваривание белковых компонентов пищи, образование кровеносных сосудов, иммунный ответ, секреция) на разных уровнях организации (Seiki, Yana, 2003;
Chondrogianni, Gonos, 2008;
Skrko-Glonek, Sobiecka Szkatua, 2008). Протекание протеолиза обеспечивается большим количеством протеолитических ферментов (протеаз), которые способны функционировать внутри и вне клеток. Типичными представителями ферментов класса протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин, дуоденаза, катепсины. Протеолиз регулируется преимущественно белками-ингибиторами, составляющими мощный антипротеолитический потенциал организма. Белки-ингибиторы встречаются в организмах млекопитающих, червей, микробов и растений (Zavasnik-Bergant, 2008). Предотвращая преждевременную и чрезмерную активность, либо полностью блокируя работу протеолитических ферментов, ингибиторные белки участвуют в механизмах многих сопряженных с протеолизом процессов, таких как свертывание крови, распад фибринового сгустка, активация комплемента и других.
Функциональная деятельность ингибиторов не ограничивается влиянием на протеазы, они также могут препятствовать действию цитокинов, токсинов и ряда других биологически активных веществ (Зорин и соавт., 1995).
Особую группу белков-ингибиторов животного происхождения составляют серпины. Серпины ингибируют сериновые протеазы – ключевые ферменты, отвечающие за функционирование и взаимосвязь физиологических систем организма (пищеварение, иммунитет, гемостаз и др.). К характерным представителям данной группы белков относят гирудин, 1-антитрипсин, 2-макроглобулин и другие. Особый интерес представляет поливалентный ингибитор протеаз (апротинин), выделенный из органов крупного рогатого скота, который активно практикуется как регулятор протеолиза в организме человека. Аналоги белков ингибиторов животного происхождения обнаружены у таких растений как табак, горчица, картофель, пшеница, соя и другие (Дунаевский и соавт., 2005;
Мосолов, Валуева, 2005). В частности, к ним относятся ингибиторы из соевых бобов, способные препятствовать действию сериновых протеаз, подобно серпинам. К сожалению, вопрос о структурной и функциональной однотипности протеазных ингибиторов, присутствующих в организмах животных и растений, имеет существенные пробелы. Поэтому в качестве объектов сравнения были выбраны поливалентный ингибитор протеаз поджелудочной железы животных (апротинин) и соевый ингибитор трипсина. Кроме того, актуальность данного исследования обуславливается исключительно важной ролью регуляторов протеолиза в функционировании физиологических процессов.
Цель работы: проанализировать степень структурной гомологии и функциональную однотипность апротинина животного происхождения и соевого ингибитора трипсина (СИТ).
Задачи исследования:
1. Методами биоинформатики установить степень структурной гомологии, спектр биологической активности и определить потенциальные молекулы-мишени апротинина и СИТ из числа протеаз организма человека.
2. Определить трипсин-ингибиторную активность апротинина и СИТ в опытах in vitro.
3. Изучить влияние апротинина и СИТ на свертывание крови время, активированное частичное (протромбиновое тромбопластиновое время и тромбиновое время).
4. Определить влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (время фибринолиза).
5. Сравнить влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации).
6. Проанализировать влияние апротинина и СИТ на функциональное состояние системы комплемента (гемолитическая активность комплемента).
7. Изучить влияние приема изолята соевого белка, содержащего соевый ингибитор трипсина, на общую протеолитическую и трипсин ингибиторную активности в сыворотке крови людей.
Впервые методами Научная новизна исследования.
биоинформатики показана высокая структурная гомологичность белкового ингибитора протеаз животного происхождения апротинина и его растительного аналога – соевого ингибитора трипсина (СИТ).
Сравнение электронных структурных формул позволило выявить, что оба соединения являются ингибиторами ренина, а также ангиотензин превращающего и эндотелин-превращающего ферментов. Апротинин и СИТ не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью. Произведено построение электронных трехмерных третичных структур изученных соединений, что необходимо для расчета молекул-мишеней.
Впервые приведены доказательства, что апротинин и СИТ имеют не только структурное, но и функциональное сходство. Они в одинаковой степени ингибируют трипсин в опытах in vitro. При исследовании влияния на гемостатические показатели в опытах in vitro апротинин и СИТ препятствуют свертыванию крови (СИТ замедляет время свертывания по внутреннему и внешнему пути, а апротинин только по внутреннему) и блокируют фибринолиз. Оба соединения оказывают антиагрегационное действие, не различаясь между собой по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналин инициируемой агрегации. Растворы апротинина и СИТ в концентрации 0,01-1,0% не влияют на скорость и интенсивность комплемент-зависимого гемолиза.
Впервые получены данные, свидетельствующие, что двухмесячный прием соевого белка, содержащий активный СИТ, снижает общую протеолитическую и увеличивает трипсин-ингибиторную активность сыворотки крови.
Положения, выносимые на защиту:
1. На уровне первичной структуры белки апротинин и СИТ являются низкогомологичными соединениями. Наиболее высокий уровень сходства наблюдается между С-концевым участком полипептидной цепи СИТ и молекулой апротинина.
2. Апротинин и СИТ проявляют высокую степень функциональной однотипности в отношении трипсина и физиологических показателей гемостаза.
Теоретическая значимость. Получены новые знания о структурной гомологии и функциональной однотипности апротинина и соевого ингибитора трипсина. Эти данные расширяют недостаточно разработанные представления о физиологической роли апротинина и соевого ингибитора трипсина в регуляции функциональных процессов организма (свертывание крови, фибринолиз, работа системы комплемента, агрегация тромбоцитов).
Исследование дополняет современное знание о воздействии экзогенных ингибиторов протеаз растительного и животного происхождения на плазменные белки, обеспечивающие гемостатическую и защитную функции крови человека.
Результаты данного исследования позволяют глубже понять механизмы ряда физиологических процессов (гемостаза, неспецифических гуморальных и клеточных защитных механизмов), сопряженных с протеолизом.
Практическая значимость. В работе продемонстрирована адекватность использования ряда методов биоинформатики в исследовании гомологии белковых ингибиторов протеаз. Показана возможность перспективного использования соевого ингибитора протеаз в качестве регулятора протеолиза в организме, в частности процессов гемостаза. По результатам исследования оформлена приоритетная заявка на выдачу патента на изобретение «Способ коррекции общего уровня трипсин-ингибиторной активности сыворотки крови с помощью соевого печенья, обогащенного активным соевым ингибитором». Предложен метод исследования гемолитической активности комплемента in vitro.
Новые данные о структурно-функциональной гомологии белков ингибиторов протеаз, содержащихся в животных и растительных объектах, представляют интерес для поиска аналогов этих соединений с заданными биологическими свойствами.
Материалы диссертации включены в курс лекций кафедры биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Практические рекомендации:
1. Используемые нами электронные базы белков содержат актуальную и достоверную информацию и могут применяться в исследовании белковых ингибиторов как средство биоинформатики.
2. Употребляя изолят соевого белка, обладающий антипротеазной активностью, можно корректировать уровень общей протеолитической активности сыворотки крови.
3. Полученные данные можно использовать при поиске и разработке новых регуляторов протеолиза в организме человека.
Апробация диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на VII и VIII региональных научно-практических конференциях «Молодежь 21 века» (Благовещенск, 2006, 2007), X Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006), IV Международном Российско-Китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2007) и XV Российско-Японском медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в журнале, включенном в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах компьютерного набора. Она содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, описание собственных результатов, обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 209 первоисточников, из них 58 отечественных и 151 зарубежных авторов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Объект исследования. Препараты апротинина («Контрикал», Германия) и соевого ингибитора трипсина («Reanal», Венгрия). Всего выполнено 684 пробы.
Биоинформационные методы (in silico). Для сравнения гомологии аминокислотных последовательностей использовали интернет-сервер BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и программу Bio Edit 5.0.9.
Спектр возможных биологических активностей определяли при помощи программ ISIS Draw 2.4 и PASS Professional. Для построения и визуализации электронных пространственных структур белков использовали программы Chem Office 5.0 и Yasara 6.2.5. Для работы с программами использовали файлы формата FASTA, MOL и PDB. С программами и сервером работали согласно прилагаемым инструкциям.
Также применяли базы данных белков (Protein Data Bank, Uni Prot и др.).
Определение протромбинового времени (метод Квика).
Протромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Техпластин-тест» («Технология Стандарт», Россия) в соответствии с прилагающейся инструкцией. Опытные образцы плазмы с трипсином и ингибиторами предварительно инкубировали на водяной бане в течение минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.
Определение тромбинового времени. Тромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Тромбин-тест» («Ренам», Россия).
Определение проводили в соответствии с инструкцией к тест-набору.
Плазму с трипсином или ингибиторами инкубировали 5 минут на водяной бане при 370С. Всего выполнено 48 проб.
Определение активированного частичного тромбопластинового времени. Активированное частичное тромбопластиновое время свертывания крови определяли с помощью тест-наборов «Коагуло-тест» («Ренам», Россия). Образцы плазмы с трипсином и ингибиторами инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.
Определение времени фибринолиза. Время фибринолиза определяли с помощью тест-наборов «Фибринолиз-тест» («Технология Стандарт», Россия) по прилагаемым инструкциям. Образцы опытной плазмы с трипсином или ингибитором предварительно инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 370С. Всего выполнено 48 проб.
Исследование агрегации тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов в плазме исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов AP («Солар», Беларусь), совмещенного с ПЭВМ, по методу указанному в инструкции к прибору. Опытную плазму с трипсином или ингибиторами предварительно инкубировали в термостате в течение 5 минут при 370С.
Всего выполнено 116 проб.
Определение трипсин-ингибиторной активности. Определение трипсин-ингибиторной активности исследуемых ингибиторов проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Трипсин ингибиторную активность определяли в сыворотке крови добровольцев (60 проб), солянокислых растворах исследуемых ингибиторов (80 проб) и растворах изолята соевого белка (60 проб).
Определение протеолитической активности. Определение общего уровня протеолитической активности в сыворотке крови проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Выполнено 60 проб.
Определение гемолитической активности комплемента. Для исследования гемолитической активности комплемента in vitro нами был разработан способ реконструкции анализатора агрегации тромбоцитов SOLAR AP 2110, а также методика проведения эксперимента. Принцип метода заключается в регистрации изменений светопропускания раствора в процессе гемолитического распада эритроцитов. Метод позволяет наблюдать и контролировать ход измерений в динамике, а также хранить данные в виде электронных файлов. Всего выполнено 116 проб.
Исследование влияния приема соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность крови человека. Исследование проводилось с участием врачей М.А. Штарберга и И.Г. Белоглазовой. Легитимность испытания на людях подтверждена Этическим комитетом ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» (выписка из протокола от 23 сентября 2007 г.). В экспериментальную группу вошли 28 взрослых (средний возраст 50 лет) практически здоровых людей. Среди них было 16 женщин и 12 мужчин.
Эксперимент длился 2 месяца, на протяжении которых добровольцы употребляли изолят соевого белка (ежедневно по 30 г на человека). Кровь для исследований брали до и после 2-х месяцев приема изолята. В сыворотке крови определяли общий уровень протеолитической и трипсин ингибиторной активности.
Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ «StatPlus Professional 4.3.0.0» и «StatSoft Statistica 6.0». Различия между группами устанавливались по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение Обзор электронных баз данных белков В Интернете нами было найдено более 100 баз данных с информацией о различных веществах. Белкам посвящено около 50 баз (список приводится в диссертации), среди которых только 9 (табл. 1) содержат информацию об апротинине и СИТ, представленную в виде электронных файлов специального формата.
Таблица Базы белков, содержащие информацию об апротинине и СИТ Идентификационный код в базе Название и электронный данных адрес базы данных Апротинин СИТ UniProt-Swiss-Prot BPT1_BOVIN ITRA_SOYBN http://www.expasy.org/ (P00974) (P01070) Blocks http://www.ebi.ac.uk/ P00974 IPR COG P00974;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NP_001001554;
GTOP btau0:ENSBTAG0000 ?atha0:At1g http://spock.genes.nig.ac.jp/ 0017328 60. iProClass P00974/BPT1_BOVI http://pir.georgetown.edu/ N;
PIRSF LIGAND – LIGAND 50059016;
3809839;
http://www.pasteur.fr/ bta:616039;
MMDB P00974 (Precursor);
1AVU http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 1QLQ PDB http://www.rcsb.org/ 1OA6 1AVU;
1BA MEROPS I02.001 I03. http://merops.sanger.ac.uk/ Определение степени гомологии аминокислотных последовательностей апротинина и СИТ in silico В ходе исследования установлено, что полипептидные цепи данных ингибиторов гомологичны на 10% (рис. 1).
Сравнение отдельных аминокислотных областей данных белков показало более высокий уровень гомологии (рис. 2). Наиболее гомологичными (35%) оказались С-концевая область СИТ (участок цепи 132-181) и молекула апротинина без 6 последних С-концевых аминокислот.
Рис. 1. Результаты подсчета гомологии апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI) в Bio Edit 5.0.9 (черным цветом выделены идентичные аминокислоты, серым – химически подобные).
Рис. 2. Результаты определения гомологичных областей полипептидных цепей апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI).
Согласно представлениям классической протеомики, эволюционно родственные белки, независимо от количества аминокислот, входящих в их состав, и различий третичной структуры, имеют консервативные области (домены), определяющие свойства белков. Например, в родственных глутамилэндопептидазах бактерий неизменны только пять аминокислотных остатков из 215 (Степанов, 1998). Поэтому полученные нами данные указывают на гомологию полипептидных цепей апротинина и СИТ.
Определение и сопоставление спектров биологической активности апротинина и СИТ in silico Нами были построены электронные структурные формулы апротинина и СИТ формата MOL для программы PASS (рис. 3).
Рис. 3. Полипептидная цепь апротинина.
В окне «Residues» приведена таблица обозначений аминокислот.
Выявлено 4 вида активности для апротинина и 3 для СИТ (рис. 4).
Программа показала, что данные белки являются ингибиторами ренина, ангиотензин- и эндотелин-превращающего ферментов.
Возможность проявления (drug-likeness) перечисленных эффектов практически одинакова у обоих ингибиторов. Также установлено, что исследуемые ингибиторы не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью.
Рис. 4. Спектр биологической активности апротинина и СИТ «Drug-Likeness» – вероятность проявления эффекта;
Pa – вероятность наличия активности;
Pi – вероятность отсутствия активности.
Построение электронных трехмерных третичных структур апротинина и СИТ in silico В исследовании механизма действия и биологических функций белковых соединений большую ценность представляет их трехмерная структура (Blundell et al., 2006;
Pazos, Bang, 2006;
Silveira et al., 2007).
Поэтому с целью более тщательного изучения функциональности и выявления молекул-мишеней, нами были построены электронные пространственные структуры апротинина и СИТ (рис. 5).
Рис. 5. Электронные трехмерные модели третичных структур апротинина и СИТ (построено в программе Chem Office 5.0).
Произвести поиск молекул-мишеней методами биоинформатики не удалось из-за отсутствия необходимых программ в свободном доступе. В целом, полученные методами биоинформатики данные показали статистически достоверную степень структурной и функциональной однотипности апротинина и СИТ, что явилось предпосылкой дальнейших исследований in vitro и in vivo.
Трипсин-ингибиторная активность апротинина и СИТ in vitro Результаты определения активности отображены на рисунках 6 и 7.
Для сравнения мы определили активность синтетических ингибиторов.
Установлено, что трипсин-ингибиторная активность снижается в следующей последовательности: апротинин (141,1±13,3 ИЕ/мг), СИТ (61,4±0,9 ИЕ/мг), D-лизин (1,31±0,02 ИЕ/мг), -аминокапроновая кислота (1,36±0,04 ИЕ/мг). Таким образом, активность апротинина при данном способе расчета более чем в 2 раза выше таковой СИТ (р0,0002).
Рис. 6. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (1), СИТ (2), -аминокапроновой кислоты (3) и D-лизина (4) в ингибиторных единицах (ИЕ) на 1 мг вещества.
Рис. 7. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (1) и соевого ингибитора трипсина (2) в ингибиторных единицах (ИЕ) на 1 нмоль вещества.
Ингибиторная активность синтетических низкомолекулярных ингибиторов на 2 порядка ниже, чем у апротинина, и в 40 раз ниже, чем у СИТ. Учитывая, что молекулярная масса СИТ (20 100) в 3 раза выше, чем у апротинина (6 514), при расчете на моль ингибитора активность первого будет несколько выше (см. рис. 7).
Исследование системы свертывания крови и фибринолиза in vitro В условиях in vitro нами было проведено исследование воздействия апротинина, СИТ и трипсина на ряд показателей свертывания крови и противосвертывающей системы. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на показатели свертывания крови и фибринолиза in vitro Время, сек Плазма Плазма + Плазма + Плазма + Показатель (контроль) 0,1% р-р 1,0% р-р 1,0% р-р трипсина апротинина СИТ (1) (2) (3) (4) Протромбиновое 13±0,9 21±0,9 31±0, 20±0, время Р1-20,0001 Р1-30,05 Р1-40, 3±0,9 113±1,8 105±2, АЧТВ 36±1, Р1-20,0001 Р1-30,0001 Р1-40, Тромбиновое 2,5±0,5 24±0, * 16±0, время Р1-20,0001 Р1-30, Лизиса Лизиса Время 182± сгустка не сгустка не 400±34, фибринолиза Р1-20, происходило происходило Примечание. * – в некоторых пробах наблюдалось слабое помутнение через 300 секунд. АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время.
Установлено, что протромбиновое время уменьшается на 33 35% при воздействии 0,1% раствора трипсина, незначительно возрастает (не более 5%) при воздействии 1,0% раствора апротинина и увеличивается практически вдвое при воздействии 1,0% раствора СИТ. АЧТВ снижается в 10-12 раз при воздействии 0,1% раствора трипсина, возрастает в 3 раза при воздействии 1,0% раствора апротинина или 1,0% раствора СИТ.
Образование сгустка под действием тромбина (тромбиновое время) усиливается на 85% в присутствие 0,1% раствора трипсина, замедляется на 50% в присутствие 1,0% раствора апротинина и не происходит в присутствие 1,0% раствора СИТ. Фактор XII-калликреинзависимый фибринолиз ускорятся на 50-60% при воздействии 0,1% раствора трипсина и не протекает в присутствие 1% растворов апротинина или СИТ. Результаты исследования указывают на однотипность биологического воздействия апротинина и ингибитора трипсина из соевых бобов в отношении изученных физиологических процессов.
Исследование агрегации тромбоцитов in vitro Исследование проводили на АДФ- и адреналин-инициируемой типах агрегации. Результаты представлены в таблице 3 и на рисунках 8 и 9.
Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на агрегацию тромбоцитов in vitro Контроль Плазма + Плазма + Плазма + Тип агрегации (плазма) Апротинин СИТ Трипсин (1) (2) (3) (4) Обрат. (Адф) 22±1,8 14±0,9 Р1-20,01 15±0,9 Р1-30,01 34±0,9 Р1-40, МА 55±4,7 55±4,7 Р1-20,3 55±4,7 Р1-30,3 65±15 Р1-40, ТМА Двухфаз.(Адф) Первая фаза 48±1,8 35±0,9 Р1-20,01 34±1 Р1-30,01 57±3 Р1-40, МА 85±4,7 68±10,5 Р1-20,001 70±9 Р1-30,005 80±10 Р1-40, ТМА Вторая фаза 70±2 56±2 Р1-20,02 58±1 Р1-30,05 99±1 Р1-40, МА 350±9,2 325±9,2 Р1-20,001 320±9,3 Р1-30,001 310±9,2 Р1-40, ТМА Необрат.(Адф) 49±0,9 33±0,9 Р1-20,02 29±0,9 Р1-30,02 100 Р1-40, МА 400±18 410±9,3 Р1-20,04 Р1-30,04 210±26,4 Р1-40, ТМА 410±9, Двухфаз.(адр) Первая фаза 23±0,9 16±1,8 Р1-20,02 16±1,8 Р1-30,02 32±0,9 Р1-40, МА 110±9,3 125±13,1 Р1-20,001 125±13 Р1-30,001 130±9,3 Р1-40, ТМА Вторая фаза 47±2,4 44±2 Р1-20,05 44±1,8 Р1-30,05 55±0,9 Р1-40, МА 390±9,3 430±18 Р1-20,0001 430±18 Р1-30,0001 435±16 Р1-40, ТМА П р и м е ч а н и е. МА – максимальный уровень агрегации (процент светопропускания), ТМА – время достижения максимального уровня агрегации в секундах, адр – адреналин, Обрат. – обратимая агрегация, Необрат. – необратимая агрегация, Двухфаз. – двухфазная агрегация.
Рис. 9. Типичные агрегатограммы влияния апротинина, СИТ и трипсина на адреналин-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (адреналина 25 мкмоль). 1 – контроль;
2-3 – СИТ 1,0% (апротинин 1,0%);
4 – трипсин 0,1%.
Рис. 8. Типичные агрегатограммы влияния апротинина, СИТ и трипсина на АДФ-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (АДФ 15 мкмоль). 1 – контроль;
2 – апротинин 1,0%;
3 – СИТ 1,0%;
– трипсин 0,1%.
Ингибиторы факторов свертывания являются на сегодняшний день основным объектом исследования в работах, посвященных регуляции агрегации тромбоцитов (Klauss, Spannagl, 2006;
Jennings, Saucedo, 2008). В литературе имеются данные об успешном применении некоторых серпинов как регуляторов агрегации (Rothman, 2005;
Nutescu, Shapiro, Chevalier, 2006;
Lepor, 2007;
Fareed et al., 2008a, 2008b;
Hoppensteadt et al., 2008). Мы поставили перед собой задачу исследовать влияние апротинина и СИТ на процесс агрегации тромбоцитов. В ходе исследования было установлено, что апротинин и СИТ тормозят процесс агрегации тромбоцитов in vitro, а трипсин оказывает обратный ингибиторам эффект.
Антиагрегационные свойства исследуемых ингибиторов протеолитических ферментов практически не отличаются.
Исследование влияния апротинина, СИТ и трипсина на систему комплемента in vitro Ингибиторы протеаз участвуют в различных протеолитических каскадах организма, в том числе в активации комплемента (Silverman et al., 2004;
Richardson, Viswanathan, Lucas, 2006). Поэтому одним из объектов данного сравнительного исследования биологической активности панкреатического ингибитора протеаз и соевого ингибитора мы выбрали систему комплемента как протеолитическую систему (рис.
10, табл. 4).
Рис. 10. Типичные кривые влияния апротинина, СИТ и трипсина на гемолитическую активность комплемента in vitro.
Таблица Влияние апротинина, СИТ и трипсина на скорость гемолиза эритроцитов в присутствии системы комплемента in vitro Общее время Время лагфазы, мин гемолиза включая лагфазу, мин Контроль (1) 3,5±0,5 8,5±1, Апротинин (1,0%) (2) 3,2±0,15 Р1-20,05 7,25±0,25 Р1-20, (3) 3,2±0,15 Р1-30,05 7,25±0,25 Р1-30, СИТ (1,0%) Трипсин (0,01%) (4) 4,25±0,25 Р1-40,02 15,5±0,5 Р1-40, Мы предполагали, что исследуемые ингибиторы смогут препятствовать работе комплемента, тем самым увеличив время гемолиза.
Однако было установлено, что скорость гемолиза не изменяется при воздействии апротинина и СИТ. Такой эффект ингибиторов можно объяснить их специфичностью к протеазам. Трипсин угнетает активность комплемента, возможно, потому что компоненты последнего гидролизируются трипсином.
Влияние приема изолята соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность в сыворотке крови В рамках исследования протеолиза, затрагивающего систему крови, мы поставили перед собой задачу выяснить, как длительное употребление в пищу продуктов, содержащих активные ингибиторы протеолитических ферментов, может влиять на протеазно-ингибиторную систему организма человека. В качестве такого продукта был выбран изолят соевого белка, обладающий антипротеолитической активностью. В процессе приготовления изолята соя подвергается термической обработке, в ходе которой биологически активные компоненты могут инактивироваться, в том числе и ингибиторы. Известно, что около 20% соевого ингибитора трипсина обладают термостабильностью (Kennedy, 1998). Поэтому для корректной оценки показателей общей активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови, было определено содержание ингибиторов в изоляте соевого белка. Определение показало, что 1 мг изолята соевого белка содержит 1,4±0,1 ингибиторных единиц (ИЕ).
Установлено, что прием изолята соевого белка на протяжении месяцев сопровождался статистически достоверным снижением общей протеолитической активности сыворотки крови на 18% (р0,05) и увеличением трипсин-ингибиторной активности на 21% (р0,01) (табл. 5).
Таблица Уровень протеолитической и трипсин-ингибиторной активности в сыворотки крови людей, употреблявших изолят соевого белка Показатели сыворотки крови Время Общая протеолитическая исследования Трипсин-ингибиторная активность сыворотки активность (ИЕ/мл) (относительные единицы) До приема 0,343±0,010 113±3, После приема 0,282±0,008 р0,05 137±5,3 р0, Полученные данные позволяют предполагать, что употребление активных ингибиторов в составе пищевых продуктов может оказывать влияние на физиологические процессы, сопряженные с протеолизом.
ВЫВОДЫ Первичные структуры и спектры биологической активности 1.
апротинина и СИТ гомологичны in silico.
СИТ и апротинин обладают одинаковой трипсин-ингибиторной 2.
активностью in vitro.
СИТ и апротинин в равной степени препятствуют свертыванию 3.
крови, фибринолизу и агрегации тромбоцитов. СИТ замедляет время свертывания, протекающего по внешнему и внутреннему пути, а апротинин – только по внутреннему пути.
Оба ингибитора полностью блокируют фибринолиз.
4.
Апротинин и СИТ обладают антиагрегационными свойствами. Они не 5.
отличаются по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналин инициируемой агрегации тромбоцитов.
Растворы СИТ и апротинина в концентрациях 0,01-1,0% не влияют на 6.
скорость и степень комплемент-зависимого гемолизиса in vitro.
Двухмесячный прием изолята соевого белка, содержащего активный 7.
СИТ, снижает общую протеолитическую активность на 18% и увеличивает трипсин-ингибиторную активность на 21% в сыворотке крови человека.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Аникин С.В., Памирский И.Э., Горин А.А., Чекмарев М.В., 1.
Димова Е.А. Разработка лекарственного препарата ингибитора протеаз с использованием методов протеомики и биоинформатики // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VII региональной научно практической конференции, посвященной 150-летию основания г.Благовещенска. 16-17 мая 2006 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд во БГПУ, 2006. Книга 2. С. 10-11.
Памирский И.Э., Блоцкий Р.А., Штарберг М.А. Отечественные и 2.
зарубежные компьютерные программы в создании и прогнозировании свойств новых лекарственных средств // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VII региональной научно-практической конференции, посвященной 150-летию основания г.Благовещенска. 16 17 мая 2006 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2006. Книга 2. С. 215-216.
Памирский И.Э. Отечественные и зарубежные компьютерные 3.
программы в создании и прогнозировании свойств новых лекарственных средств // X Международной молодежной школы конференции по актуальным проблемам химии и биологии: Тез. докл.
12-19 сентября 2006 г., Владивосток. Владивосток: Изд-во ДВО РАН, 2006. С. 34.
Памирский И.Э., Блоцкий Р.А., Штарберг М.А. Сравнительное 4.
исследование ингибирования трипсина фармацевтическим препаратом «Гордокс» и ингибитором из бобов сои // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VIII региональной научно-практической конференции. 17-18 мая 2007 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2007. Книга 1. С. 228.
Памирский И.Э., Блоцкий Р.А., Штарберг М.А. Проблемы 5.
моделирования первичной структуры белков // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VIII региональной научно-практической конференции. 17-18 мая 2007 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2007. Книга 2. С. 110.
Borodin E., Pamirski I., Shtarberg M., Gorin А., Anikin S., 6.
Beloglazova I. Proteolysis, protease inhibitors and soya. In: Studies on Drugs Used in Traditional Therapy // IV Russia and China Medical Forum: Book of Abstract. 10-12 september 2007, Blagoveshchensk. Blagoveshchensk:
ASMA, 2007. P. 31-35.
Pamirski I.E., Shtarberg M.A., Beloglazova I.G., Borodin Е.А. The 7.
influence of soy bean trypsin inhibitor on some biologically relevant proteolitic processes in vitro and in vivo // Book of Abstract, Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance of Japan-Russia Medical Exchange Foundation (1992-2007): Book of Abstract. 21-22 september 2007, Blagoveshchensk. Blagoveshchensk:
ASMA, 2007. P. 82.
Памирский И.Э., Штарберг М.А., Белоглазова И.Г., Бородин Е.А.
8.
Влияние трипсина и ингибитора трипсина соевых бобов на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента in vitro // Дальневосточный медицинский журнал. 2008. № 1. С. 98-100.
Выражаю благодарность заведующему кафедры биохимии АГМА, д.м.н., профессору Бородину Евгению Александровичу за руководство и приобретенный опыт, заведующему кафедры физиологии, д.м.н., профессору Григорьеву Роману Николаевичу и к.м.н., доценту Матыцину Анатолию Петровичу за научные консультации, с.н.с. ЦНИЛ АГМА, к.м.н., Штарбергу Михаилу Анатольевичу, к.м.н., Тиханову Виктору Ивановичу, Белоглазовой Ирине Геннадьевне, Корпушиной Людмиле Петровне, Шильниковой Тамаре Михайловне за помощь в проведении лабораторных исследований, Памирскому Эдуарду Павловичу за предоставление необходимой литературы.
Памирский Игорь Эдуардович АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 20.09.2009. Бумага «Снежинка».
Ризография. Тираж 100 экз. Зак. 732.
Отпечатано в типографии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации 675000, Благовещенск, ул. Горького,