Действие пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы
на правах рукописи
ХОМЯКОВ
Никита Владимирович
ДЕЙСТВИЕ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ
НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Специальность
03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова доктор биологических наук
Научный руководитель:
Б.А. Бызов
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.П. Битюцкий доктор биологических наук А.В. Тиунов Институт физико-химических и Ведущее учреждение:
биологических проблем почвоведения РАН
Защита диссертации состоится в 15 часов 30 минут в аудитории на заседании Диссертационного Совета Д 501.002.13 при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.
Автореферат разослан «»_2009г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова Актуальность Дождевые черви – активные регуляторы жизни микробного сообщества почв.
Взаимодействия дождевых червей и микроорганизмов важны для протекания таких почвенных процессов как разложение и трансформация растительных остатков, образование гумуса, формирование пула питательных элементов и микробных сообществ. Широкий спектр этих взаимодействий позволяет говорить о тесной связи червей с микроорганизмами. Предполагается, что микроорганизмы являются основным источником пищи для червей (Edwards, Fletcher, 1988, другие).
Дождевые черви воздействуют на микроорганизмы косвенно, модифицируя среду обитания (Тиунов, 2007;
Persson, Lohm, 1977;
Petersen, Luxton, 1982;
Brussaard, 1998;
Lavelle, Spain, 2001;
Wardle, 2002). Но есть и прямой механизм. Это - пассаж почвы через пищеварительный тракт. Потребляя почву, дождевые черви регулируют рост почвенных микроорганизмов, выедая одни и создавая благоприятные условия для роста других микробных популяций в пищеварительном тракте и в экскрементах. При пассаже меняются состав, обилие и активность микроорганизмов (Третьякова и др., 1996;
Бызов, 2005;
Тиунов, 2007;
Parle, 1963;
Hanlon, 1981;
Fisher et al., 1995;
Schnholzer et al., 1999;
Tiunov, Scheu, 1999;
2000). Каков биохимический механизм воздействия пищеварительной среды червей на микробные популяции пока не известно.
В последние годы все больший интерес вызывают биологически активные вещества дождевых червей, влияющие на рост микроорганизмов. Они содержатся в целомической жидкости, поверхностном мукусе, в экстрактах из гомогенатов тканей. Выявлены антибактериальная, антигрибная и другие активности (Balamurugan et al., 2006;
Fiolka, 2006;
Shobha, Kale, 2006;
Zhenjun Sun et al., 2006).
Можно предположить, что и в пищеварительном тракте у червей есть вещества, действующие на микроорганизмы и являющиеся причиной изменения микробного сообщества при пассаже через пищеварительный тракт. Ранее в кишечной жидкости почвенных многоножек обнаружена селективная активность по отношению к бактериям и грибам. Показано, что переваривание микроорганизмов в кишечнике многоножек начинается с быстрой гибели клеток под действием специфических киллерных агентов, имеющих небелковую природу (Бызов, Рабинович, 1997;
Byzov et al., 1998). Подобных исследований для дождевых червей не проводилось. Эти знания полезны, так как селективный отбор микроорганизмов в кишечнике червей может быть значимым фактором формирования микробных сообществ в почве. С практической точки зрения важно знать, популяции каких микроорганизмов, полезных или вредных, получают преимущество в кишечнике червей.
Цель:
Определение особенностей воздействия пищеварительной жидкости дождевых червей на микроорганизмы.
Задачи:
1. Характеристика микробного сообщества и ферментативной активности пищеварительного тракта дождевых червей Aporrectodea caliginosa.
2. Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам.
3. Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червей.
Научная новизна Впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости дождевых червей. Предполагается, что это необходимо для эффективной утилизации червями микроорганизмов как пищи.
Обнаружена специфичность действия пищеварительной жидкости на микроорганизмы, проявляющаяся на штаммовом уровне, что является новым фактором регуляции биологического разнообразия в почвах.
Впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей. Доказано, что киллерный агент (ы) является низкомолекулярным органическим веществом небелковой природы.
По ряду характеристик (протеазная и дегидрогеназная активности, доля факультативно анаэробных бактерий) микробное сообщество пищеварительного дождевых тракта червей отличается от почвенного.
Практическая значимость Полученные данные могут быть использованы для поиска и выделения биологически активных природных соединений с антимикробным действием, для разработки препаратов против патогенных микроорганизмов. Результаты используются в лекционных курсах по общей экологии, экологии почвенных микроорганизмов, почвенной зоологии, биологии почв.
Апробация работы Результаты работы были представлены на 8-м Международном симпозиуме по экологии дождевых червей (Краков, 04-09 сентября 2006 г.), на заседаниях кафедры биологии почв.
По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых журналах («Микробиология» и «European Journal of Soil Biology»), труды в сборниках конференция и тезисы.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 111 страницах текста, иллюстрирована 12 рисунками, включает в себя 8 таблиц. Список литературы состоит из 152 наименований, из них зарубежные.
Автор благодарит В.В. Демина и Ю.А. Завгороднюю за помощь в химических анализах и интерпретации результатов, Т.Ю. Нечитайло, П.Н Голышина и Т.Г.
Добровольскую за идентификацию бактерий.
Объекты и методы исследования Почва. Использовали окультуренную дерново-подзолистую почву под бобово злаковой растительностью с многолетнего опыта кафедры агрохимии МГУ имени М.В.Ломоносова (Московская область, Почвенно-экологический центр МГУ “Чашниково”). Содержание общего углерода в почве - 1,72 %, азота - 0,13 %, pH водной вытяжки - 5,7. В 1989 году была применена известь в дозах, достаточных, чтобы нейтрализовать гидролитическую кислотность. Почва получала в течение 1990-1993 40 т/га органических удобрений (навоз) и минеральные удобрения N100P500K500 в год. В течение 1994-1999 она получила в среднем N100 P40K100 в год.
Дождевые черви. В работе использовались черви трех экологических групп:
компостные - Eisenia fedida (Savigny, 1826), почвенные - Aporrectodea caliginosa (Savigny, 1826) и норные - Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758. Основным объектом был A. caliginosa, обитающий в горизонте 0-20 см почвы. Червей содержали в почве при 12-150 С.
Микроорганизмы. В работе были использованы бактерии, выделенные из почвы, кишечника и экскрементов червей. Всего выделено 638 штаммов. Бактерии были идентифицированы путем секвенирования фрагментов бактериальных генов 16S рДНК с последующим филогенетическим анализом (работа проведена Т.Ю.
Нечитайло в Биотехнологическом центре Брауншвейга, Германия). Они были отнесены к Alphaproteobacteria, Betaproteobateria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Bacilli, Sphingobacteria, Flavobacteria. Микроскопические исследования проводили с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, полученными из коллекции кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.
Выращивание бактерий. Бактерии выращивали в пенициллиновых флаконах в жидкой среде R2A следующего состава: дрожжевой экстракт – 0,5 г;
пептон – 0, г;
казаминовые кислоты – 0,5 г;
глюкоза – 0,5 г;
крахмал – 0,5 г;
пируват натрия – 0,3 г;
двузамещенный фосфорнокислый натрий – 0,3 г;
сернокислый магний – 0, г;
дистиллированная вода, на качалке при 180 об./мин в течение 18-20 часов при температуре 20-220 С. Суспензии отмывали от среды 2-х кратном центрифугированием при 12000 об./мин в стерильной водопроводной воде.
Протеолитическая активность. Культуры из почвы, кишечника и экскрементов червей пересеивали точечной инокуляцией на среду R2A-агар с 2% желатина. На 3-е сутки измеряли величину зоны просветления в результате гидролиза желатина.
Наличие факультативных анаэробов. Для проверки использовали методику Хью-Лейфсона, адаптированную к потоковому анализу. При ферментации глюкозы в анаэробных условиях образуется молочная кислота, рН среды снижается.
Закисление среды выявляется по изменению окраски индикатора. В нашем варианте определение происходит в 96-луночных планшетах при соотношении среды Хью-Лейфсона к вазелиновому маслу = 1:2. Инокулировали ночные культуры из разведения 1:100.
Получение пищеварительной жидкости. Определяли выживаемость бактерий в пищеварительной жидкости червей. Червей предварительно содержали либо в почве, либо в простерилизованном автоклавированием песке для выяснения влияет ли субстрат, попадающий в пищеварительный тракт, на активность пищеварительной жидкости. Для выделения пищеварительной жидкости червей умерщвляли, погружая в кипяток на 1 сек. Червь размещался на морозильном столике (элемент Пельтье), где охлаждался до минус 160 С за несколько минут. Во время размораживания производили вскрытие червя, извлекали кишечник и/или его содержимое из среднего (сразу за пояском) и заднего отделов кишечника. При этом не допускали повторного замораживания материала. Извлеченную массу центрифугировали при 12000 об./мин в течение 5 мин для осаждения содержимого и частичной стерилизации. Посев супернатанта на R2A-агар не выявил бактерий.
Таким образом, была получена пищеварительная жидкость из среднего и заднего отделов кишечника, либо очищенного от почвы, либо заполненного почвой.
Кишечную жидкость хранили при -180 C.
Определение выживаемости бактерий. Обезжиренные предметные стекла прожигали над горелкой, помещали в чашки Петри и заливали средой R2A-агар так, чтобы толщина слоя составляла 1,5 - 2 мм. После застывания среды стекло вырезали из чашки и помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашку Петри.
Готовили разведения суспензий бактерий 10-3 и 10-4, из них производился посев. На агаризованное стекло наносили по 1 мкл суспензии клеток. На высохшие капли культур наносили 2 мкл пищеварительной жидкости при помощи шаговой пипетки Eppendorf. Пищеварительная жидкость впитывалась в агар в течение 20- сек. В контроле на суспензию клеток наносили стерильную водопроводную воду.
Чашки инкубировали в экскикаторе при температуре 20-220 C. Количество микроколоний подсчитывали через сутки в световом микроскопе при увеличениях х32 и х125. Для вычисления погрешности при нанесении суспензии было проведено тестирование пипетки. Культура бактерий из соответствующего разведения наносилась на стекла в 12-кратной повторности. Ошибка среднего по количеству колоний не превышала 7%.
Расширяя круг тестируемых бактерий, использовали более стандартизированную и точную методику определения жизнеспособности бактерий по их дегидрогеназной активности. В качестве индикатора роста микроорганизмов использовали 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). Под действием анаэробных дегидрогеназ бесцветный растворимый в воде ТТХ восстанавливается в нерастворимый в воде 2,3,5-трифенилформазан, имеющий красный цвет. Активность окраски определяли на микропланшетном фотометре Tecan Sunrise при длинах волн 492 или 620 нм. Для сравнения активности культур между собой использовали удельную дегидрогеназную активность (УДА). Это отношение светопоглощения варианта с формазаном к суспензии без индикатора.
Микроскопия клеток. Оценивали морфологические изменения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae на воздействие пищеварительной жидкости.
Дрожжи выращивали на жидком сусле (1:4 = сусло:вода) в течение 18-20 часов.
Клетки отмывали водопроводной водой центрифугированием, наносили их суспензию на предметное стекло, добавляли пищеварительную жидкость и через минут экспозиции с жидкостью фотографировали.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. Для характеристики веществ, входящих в состав кишечной жидкости, был использован метод гель фильтрации в варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии на Хроматографе Agilent 1100 series, колонка - TSK2000 SW 7,5 мм x 60 см с диодно матричным детектором. Рабочие пределы колонки – 15-32 мин, = 280 нм, V пробы = 0,5 мл, 0,1 М фосфатный буфер, 0,1% азид натрия, pH 7,0. Разделение комплекса веществ на компоненты при помощи этого метода позволяет установить их молекулярные массы, концентрацию, долю в составе и получить ультрафиолетовый спектр компонентов.
Фракционирование кишечной жидкости. Было проведено фракционирование кишечной жидкости червей A. caliginosa и для сравнения жидкости из среднего отдела кишечника многоножки Pachyiulus flavipes (C.L.
Koch, 1847) методом гель-хроматографии нормального давления на геле сефадексе G-25. V пробы = 200 мкл + 3 мл 0,1 М фосфатного буфера. В первой фракции сходят белки с массами 1000 Da, с 1 по 8 фракции – с массами от 1000 до 300 Da, далее сходят вещества, вступавшие в адсорбционные взаимодействия с матрицей геля.
Определение белка по Бредфорду. Проведено определение белка в каждой фракции по Бредфорду (на наличие пептидной связи). Индикатор - бриллиантовый синий, в качестве стандарта использовали человеческий альбумин, V пробы = мкл. Определение проводили на спектрофотометре Specord 50 Analytik Jena, = 590 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика микробного сообщества и ферментативной активности пищеварительного тракта дождевых червей Aporrectodea caliginosa. Известно, что в кишечнике червей есть зоны с анаэробными условиями (Karsten, Drake, 1997), поэтому все кишечные изоляты были проверены на способность к факультативно анаэробному росту. Из 360 протестированных штаммов 263 оказались способны к росту в этих условиях (73%). Это косвенно подтверждает возможность наличия ассоциированных с кишечным трактом бактерий.
Для характеристики кишечных бактерий провели сравнительный анализ их протеолитической активности. Предполагали, что если черви питаются микроорганизмами, их пищеварительная среда должна содержать активные протеолитические бактерии, которые используют белковые продукты разрушенных микробных клеток. Из бактерий, выделенных из почвы (91 штамм, таксона), активностью обладают 14 штаммов (15%), наиболее активны представители класса Bacilli. Среди кишечных бактерий (315 штаммов, 43 таксона) активностью обладают 99 штаммов (31%), наиболее активны бациллы и не идентифицированные штаммы. Среди бактерий, выделенных из свежих экскрементов червей (105 штаммов, 39 таксонов) активностью обладают штаммов (18%), наиболее активны бациллы. Таким образом, среди кишечных бактерий больше всего активных протеолитиков. 60% штаммов образую зону более 11 мм (табл. 1). Это может иметь значение для симбионтного пищеварения организма-хозяина – переваривания.
Проверяли дегидрогеназную активность как характеристику общей активности микробных клеток. Установлено, что почвенные изоляты бактерий (267 штаммов) обладают средней удельной дегидрогеназной активностью 2,5 ± 0,5, а кишечные изоляты (201 штамм) и изоляты из экскрементов (170 штаммов) соответственно 3, ± 0,3 и 4,0 ± 0,7, т.е. почти в 2 раза выше, чем почвенные бактерии.
Таблица 1. Протеолитическая активность бактерий, выделенных из почвы1, кишечника2 и экскрементов3 дождевых червей Класс Общее Количество штаммов с желатиназной количество активностью, размер зоны (мм) проверенных 0 1-10 11-20 21- штаммов 221/222/ Actinobacteria 19/20/12 0/2/2 3/0/0 0/0/ Alphaproteobacteria 7/9/4 5/9/2 1/0/2 0/0/0 1/0/ Bacilli 30/20/34 22/14/23 2/5/5 5/0/5 1/1/ Betaproteobacteria 6/13/8 6/12/7 0/1/1 0/0/0 0/0/ Flavobacteria 0/3/2 0/2/2 0/1/0 0/0/0 0/0/ Gammaproteobacteria 26/60/43 25/56/40 0/4/3 0/0/0 1/0/ Sphingobacteria 0/4/0 0/4/0 0/0/0 0/0/0 0/0/ Не идентифицированные 0/184/0 0/99/0 0/24/0 0/59/0 0/2/ Всего проверено штаммов 91/315/105 77/216/86 14/99/ Активные штаммы, % 85/69/82 15/31/ Одним из возможных источников питания для червей могут быть гуминовые вещества. Известно, что полифенолоксидазы могут участвовать как в разложении, так и в синтезе гуминовых веществ. Однако полимеризация считается побочным процессом (Тейт 3, 1991). Наличие полифенолоксидаз в пищеварительном тракте может свидетельствовать о способности червей к перевариванию гуминовых веществ. Установлено, что тела червей, кишечник которых очищен от почвы, имеют активность полифенолоксидазы почти в 2 раза меньшую (4,20 ± 0,74 мг пурпургаллина/г биомассы червя в сут.), чем черви, питающиеся почвой (7,62 ± 0,78 мг пурпургаллина/г биомассы червя в сут.). Активность же фермента в кишечной жидкости намного меньше, чем в теле червя (0,95 ± 0,15 мг пурпургаллина/особь в сут.). Итак, собственный вклад пищеварительных ферментов червей в разложение гуминовых веществ невелик, в этом процессе велико участие бактерий, попадающих в кишечник с почвой.
Таким образом, пищеварительная среда червей обладает особенностями по сравнению с почвой. Возможно существование сообщества бактерий кишечного тракта червей. На это указывает высокий процент факультативных анаэробов среди кишечных изолятов;
повышенная протеазная и дегидрогеназная активности кишечных изолятов;
малый вклад самих червей, и больший - почвенных микроорганизмов, вошедших с пищей, в поддержании полифенолоксидазной активности, и, как следствие, в модификации гуминовых веществ.
Оценка биологической активности пищеварительной среды червей по отношению к микроорганизмам. Методом агаровых пленок оценивали реакцию почвенных изолятов бактерий на воздействие пищеварительной жидкости.
Обнаружены три типа реакции.
1) Культуры, погибающие в результате кратковременного воздействия кишечной жидкости (менее 20 сек.) - численность бактерий падала в несколько раз, а иногда даже на несколько порядков. Это - Arthrobacter sp. (2 штамма), Alcaligenes sp., Bacillus megaterium (2 штамма), Kluyvera ascorbata, Microbacterium sp.
Pseudomonas reactans.
2) Большинство проверенных бактерий слабее или нейтрально реагировали – численность микроколоний не менялась. Это - Aeromonas sp. (2 штамма), Agromyces cerinus, Agromyces sp. (2 штамма), Alcaligenes sp., Aminobacter aminovorans (2 штамма), A. niigataensis, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter sp., A.
oxydans, Bacillus subtilis (2 штамма), B. licheniformis, B. mojavensis, B. pumilus ( штамма), B. megaterium, Bacillus sp., Bordetella sp., Brevundimonas diminuta, Delftia acidovorans, Kocuria palustris (2 штамма), Nocardioides sp., Paenibacillus sp. ( штамма), Pseudomonas proteolytica, P. reactans (3 штамма), P. reactans (2 штамма), Rhodococcus opacus, Streptomyces sp. (2 штамма), Pseudomonas sp. (4 штамма), Staphylococcus aureus, Sphingopyxis witflariensis.
3) Некоторые бактерии даже увеличивали численность КОЕ после действия кишечной жидкости, вероятно, играет роль эффект диспергирования клеток под действием поверхностно активных веществ или стимулирования прорастания клеток (Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 2 штамма). В кишечной жидкости заднего отдела активности не обнаружено.
Таким образом, численность некоторых бактерий падает, но в популяции могут содержаться выжившие клетки, получающие преимущество в сообществе заднего отдела. Провели тестирование культур на выживаемость с более длительным периодом инкубации, сравнимым со временем прохождения субстрата по пищеварительному тракту червей: 2 часа. В результате был выявлен целый ряд чувствительных к воздействию культур, среди которых можно видеть представителей разных таксонов и даже групп. Снова обнаруживается разнообразная реакция от сильного подавления до практического отсутствия воздействия (Рис. 1).
Микроколонии, % контроля А 0 20 40 60 80 100 120 Rhodococcus opacus 404- Pseudomonas reactans 383- Aminobacter sp. 411- Bacillus licheniformis 414- Paenibacillus sp. 412- Bacillus subtilis 386- Aminobacter sp. 408- Nocardioides sp. 410- Arthrobacter globiformis 333- Количество микроколоний Pseudomonas sp. 329- Б Bordetella 341- sp.
Arthrobacter sp. 392- Arthrobacter oxydans 304-2 0 100 Bacillus subtilis 385- Agromyces cerinus 347- Pseudomonas putida 429- Delftia acidovorans 335- Streptomyces sp. 389- A Pseudomonas sp. 607- Pseudomonas proteolytica 599- Pseudomonas putida 304- Pseudomonas sp. KL28 309- Bacillusmegaterium 413- C Kocuria palustris 405- Pseudomonas sp. 387- Bacillus mojavensis 317- Brevundimonas diminuta 384- Pseudomonas sp. 399- D Pseudomonas reactans 394- Pseudomonas putida 348- Pseudomonas putida 428-1 Streptomyces sp. 406- Kocuria palustris 405- B Pseudomonas reactans 400- Bacillus mojavensis 317- Pseudomonas sp. 309- Paenibacillus sp. 412-2 Aminobacter sp. 411- D Aminobacter sp. 408- Sphingopyxis witflariensis 397- Arthrobacter oxydans 304- Kluyvera ascorbata 303- Arthrobacter sp. 430- Arthrobacter sp.430- Pseudomonas reactans 387- Bacillus megaterium 413- B Bacillus megaterium 401- Microbacterium sp. 423- Pseudomonas sp. 310- Alcaligenes faecalis 345- Нейтральные Погибающие Стимулирующиеся Рис. 1. Реакция бактерий на воздействие кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa в зависимости от времени действия. А – 30 сек.;
Б – 2 часа.
Для того чтобы доказать, что биологическая активность связана с веществами кишечником, а не с почвой, червей кормили стерильным песком и нестерильной почвой. Затем выделяли кишечную жидкость и тестировали ее активность по отношению к бактериям, проявившим 3 типа реакции: погибающие, нейтральные, растущие. Существенных отличий в действии жидкости червей, питавшихся почвой и песком, не обнаружено. Следовательно, биологическая активность связана с веществами пищеварительного тракта червей (табл. 2).
Чтобы окончательно исключить почву как один из факторов, влияющих на жизнеспособность микроорганизмов в кишечнике, смешивали стерильную почву с культурой дрожжей и кишечной жидкостью и затем определяли жизнеспособность клеток. Почва не оказала влияния на наличие и степень эффекта, что говорит об отсутствии или очень незначительной степени сорбции активных веществ кишечной жидкости или химических реакциях между ними и почвой (табл. 3).
Таблица 2. Реакция бактерий на действие кишечной жидкости дождевых червей Aporrectodea caliginosa, содержащихся в почве и на стерильном песке (КОЕ/мкл;
З.О.- жидкость заднего отдела кишечника;
П.О.- жидкость переднего отдела кишечника) Бактерии Контрол Песок Почва ь З.О. П.О. З.О. П.О.
Alcaligenes sp. 345-1* 1500 1400 18 1480 Arthrobacter sp. 430-1 520 506 48 512 Kluyvera ascorbata 303-1 146 153 21 158 Pseudomonas sp. 329-1 560 1450 960 1500 Pseudomonas putida 348-1 550 1380 467 1340 Pseudomonas sp. 387-1 60 107 65 111 Arthrobacter sp. 392-1 156 172 145 162 Arthrobacter globiformis 333-1 468 453 445 451 Bordetella sp. 341-1 175 210 154 140 Delftia acidovorans 335-1 268 258 254 248 Pseudomonas sp. 399-2 200 115 176 159 Pseudomonas sp. 309-2 98 102 92 106 * - жирным шрифтом - чувствительные к действию жидкости из переднего отдела Таблица 3. Влияние почвы на активность кишечной жидкости на примере реакции дрожжей Saccharomyces cerevisiae Вариант КОЕ/чашку Почва + стерильная вода 0,77 ± Почва + стерильная вода + S. cerevisiae 393 ± Кишечная жидкость + почва + S. cerevisiae 0,11 ± 0, Кишечная жидкость + S. cerevisiae Затем мы использовали более стандартизированную и точную методику определения жизнеспособности бактерий по дегидрогеназной активности. Наличие киллерного эффекта подтвердилось. Наблюдается тенденция к подавлению роста всех групп бактерий. Активность обнаруживается как в переднем, так и в заднем отделе. Круг тестируемых бактерий был расширен. На Рис.2 представлены средние значения дегидрогеназной активности при воздействии кишечной жидкости для 638-и штаммов. В основном, наблюдается подавление роста всех проверенных таксонов, за исключением представителей Alphaproteobacteria (Рис. 2).
Рис. 2. Изменения удельной дегидрогеназной активности бактерий из разных классов под воздействием кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa (протестировано 638 штаммов).
Внутри классов наблюдаются различные типы реакций: от подавления активности до стимуляции (Рис. 3).
Отдельного внимания заслуживают различия в реакции бактерий, проявляющиеся на штаммовом уровне (Рис. 3, 4). Механизм не известен, но можно предположить, что действующее вещество (ва) взаимодействует с мембраной, имеющей разный состав у разных штаммов бактерий. Аналогичное показано ранее на примере многоножек и мокриц (Бызов, 2005).
Actinobacteria УДА 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1 2 3 4 5 6 7 8 Bacilli УДА 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1 2 3 4 5 6 7 8 Gammaproteobacteria 10 УДА 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Штаммы Actinobacteria Bacilli Gammaproteobacteria 1. Agromyces sp. 415-1 1. Bacillus licheniformis 414-2 1. Kluyvera ascorbata 303- 2. Agromyces sp. 423-2 2. B. licheniformis 415-2 2. Pseudomonas migulae 398- 3. Arthrobacter globiformis 396-1 3. B. licheniformis 416-1 3. P. putida 401- 4. A. globiformis 395-2 4. B. megaterium 401-1 4. P. putida 402- 5. A. globiformis 419-1 5. B. megaterium 407-2 5. P. putida 325- 6. A. oxydans 304-2 6. B. megaterium 413-1 6. P. putida 429- 7. Arthrobacter sp. 392-1 7. B. megaterium 413-2 7. P. putida 428- 8. Arthrobacter sp. 391-2 8. B. megaterium 318-2 8. P. putida 396- 9. Kocuria palustris 404-1 9. B. mojavensis 326-2 9. P. putida 304- 10. K. palustris 405-2 10. B. mojavensis 317-1 10. P. putida 306- 11. K. palustris 417-1 11. B. mojavensis 326-1 11. P. putida 309- 12. K. palustris 417-2 12. B. pumilus 403-1 12. P. putida 558- 13. K. palustris 416-2 13. B. pumilus 403-2 13. P. putida 328- 14. K. palustris 424-2 14. B. pumilus 427-1 14. P. reactans 387- 15. K. palustris 420-2 15. B. pumilus 427-2 15. P. reactans 394- 16. K. palustris 393-2 16. B. pumilus 302-2 16. P. reactans 400- 17. K. palustris 409-2 17. B. simplex 565-2 17. Pseudomonas sp. 399- 18. Microbacterium sp. 423-1 18. B. simplex 567-1 18. Pseudomonas sp. 309- 19. Nocardioides sp. 385-1 19. B. simplex 567-2 19. Pseudomonas sp. 310- 20. Nocardioides sp. 410-1 20. B. simplex 422-2 20. Pseudomonas sp. 310- 21. Nocardioides sp. 421-1 21. Bacillus sp. 414-1 21. Pseudomonas sp. 329- 22. Nocardioides sp. 421-2 22. B. subtilis 386-1 22. Pseudomonas sp. 387- 23. Rhodococcus opacus 404-2 23. B. subtilis 386-2 23. Pseudomonas sp. 311- 24. Streptomyces griseus 588-2 24. B. subtilis 385- 25. S. lateritius 579-2 25. Paenibacillus amylolyticus 425- 26. Streptomyces sp. 389-1 26. Paenibacillus sp. 412- 27. Streptomyces sp. 406-2 27. Paenibacillus sp. 412- Рис. 3. Реакция почвенных изолятов бактерий на воздействие кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa. Белые столбики – контроль;
черные – после действия кишечной жидкости из среднего отдела;
серые - после действия кишечной жидкости из заднего отдела.
Рис. 4. Штаммовые различия в реакции бактерий (удельная дегидрогеназная активность) под действием кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa.
Проверяли зависимость скорости действия кишечной жидкости от степени ее разбавления. Оказалось, что жидкость теряет свойства быстрого киллерного эффекта при разбавлении больше чем в 2 раза. Это может являться косвенным доказательством небелковой природы действующего вещества, т.к. на активность ферментов такая степень разбавления существенного влияния не должна оказывать. Исчезновение эффекта при разбавлении характерно также для действия детергентов. Под действием жидкости изменяется морфология клеток: размеры и внутреннее содержимое.
Рис. 5. Зависимость скорости гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae от степени разбавления кишечной жидкости. Морфология живых и мертвых клеток.
Эта гипотеза была проверена на нескольких чувствительных штаммах бактерий. Кишечная жидкость была подвержена термической обработке, после чего денатурировавшую массу осадили центрифугированием. Это позволило получить пищеварительную жидкость, условно очищенную от белков. Оказалось, что очищенная от белков жидкость также обладает данным эффектом (табл. 4).
Можно предположить, что активность связана с небелковыми соединениями, как и у многоножек (Бызов, 2005).
Таблица 4. Проверка наличия термостабильных микробоцидных веществ в кишечной жидкости Eisenia fetida (log КОЕ/мл) Flavobacterium sp. Promicromonospora sp.
Контроль 10,2 10, Нативная кишечная жидкость 2,3 2, Прогретая кишечная жидкость 2,7 2, Таким образом, впервые обнаружен эффект быстрой гибели почвенных бактерий в пищеварительной жидкости дождевых червей. Кишечная жидкость дождевых червей агрессивна по отношению к микроорганизмам. Реакция бактерий различна - от гибели до стимуляции роста. Реакция бактерий проявляется на штаммовом уровне. Активность обнаружена и в пищеварительной жидкости червей Lumbricus terrestris и Eisenia fetida (данные приведены в диссертации).
Действие пищеварительной жидкости, вероятно, связано с веществами небелковой природы. Специфическая реакция почвенных бактерий на пребывание в пищеварительной среде может являться фактором регуляции микробных сообществ.
Характеристика действующих компонентов пищеварительной жидкости червя Aporrectodea caliginosa и Pachyiulus flavipes. Ранее на многоножках показано, что в активной фракции кишечной жидкости преобладает вещество небелковой природы с массой 351 Да (Бызов, 2005). Был использован метод гель фильтрации в варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Разделение комплекса веществ на компоненты при помощи этого метода позволяет установить их молекулярные массы, концентрацию, долю в составе и получить ультрафиолетовый спектр компонентов. На Рис. 6 представлена зависимость оптической плотности при 280 нм от времени схода компонента. Площадь под пиком - это количество вещества в смеси, высота пика это его концентрация. В начале сходят вещества с высокими молекулярными массами. Центр распределения масс лежит в области 58000, 18000, 3000 Да. По характеру их спектров в ультрафиолетовой области можно заключить, что это белковые соединения, т.к. такой тип спектра определяется наличием в их составе тирозина, триптофана и фенилаланина. Позже сходят более низкомолекулярные соединения с массами около 550 и 200 Da, и спектры их далеки по характеру от спектров предыдущих компонентов. О точной массе веществ, сходящих в этой области, ничего сказать нельзя, т.к. они находятся на границе рабочих возможностей колонки. Эти пики являются адсорбционными. По характеру ультрафиолетовых спектров двух самых крупных из них можно заключить, что это вещества небелковой природы, при этом концентрация их в составе жидкости максимальна.
Для дальнейшего исследования было проведено фракционирование кишечной жидкости червей и многоножки методом гель-хроматографии нормального давления, на геле сефадекс G-25. В первой фракции сходят белки с массами Da, с 1 по 8 – с массами от 1000 до 300 Da, далее сходят вещества, вступавшие в адсорбционные взаимодействия с матрицей геля. Получено 20 фракций кишечной жидкости.
Проведено определение белка в каждой фракции по Бредфорду (на наличие пептидной связи). Каждая фракция была выпарена и протестирована на дрожжах Saccharomyces cerevisiae. На Рис. 7 показана зависимость содержания белка и скорости действия кишечной жидкости. По оси X отложены номера фракций.
Пунктиром отмечены области 100% гибели клеток (в поле зрения). При действии жидкости из переднего отдела червя область 100% гибели клеток находится в зоне отсутствия белков, а пик скорости воздействия приходится на 12-ую фракцию.
Жидкость заднего отдела - область 100% гибели клеток включает в себя фракции, содержащие полипептидные цепи. Пик скорости воздействия приходится на 6-ую фракцию. Жидкость среднего отдела кишечника многоножки - область 100% гибели клеток размыта и занимает с 3 по 16 фракции. Обнаружено две области высоких скоростей гибели, с максимумами в 6 и в 12 фракциях.
Таким образом, наблюдаются общие закономерности в действии кишечной жидкости для червя и многоножки. Высокой активностью обладают одни и те же фракции, не содержащие белка.
Рис. 6. Фракционирование кишечной жидкости червя Aporrectodea caliginosa и многоножки Pachyiulus flavipes методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. А - жидкость из переднего и среднего отделов кишечника A.
caliginosa;
Б - жидкость из заднего отдела кишечника A. caliginosa;
В – жидкость из среднего отдела кишечника P. flavipes.
Для подтверждения сходного характера воздействия жидкостей червя и многоножки был протестирован ряд почвенных изолятов бактерий. Для более подробного изучения тестировали как молодые, так и культуры большего возраста.
Оказалось, что шесть из них реагируют похожим образом. Пять, напротив, проявляют противоположную реакцию.
В целом, можно отметить, что кишечная жидкость многоножки проявляет себя гораздо более агрессивно. А в жидкости червя у некоторых штаммов происходила стимуляция роста.
Возможно, такая разница в реакции обусловлена комплексным воздействием действующих веществ у многоножки. У червя действие веществ разнесены пространственно по отделам пищеварительного тракта, возможно для облегчения выживания сообщества кишечного тракта.
Рис. 7. Гибель клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae в зависимости от наличия белка (оптическая плотность при 520 нм) во фракциях кишечной жидкости разных отделов кишечника червя Aporrectodea caliginosa и многоножки Pachyiulus flavipes. Скорость гибели - отношение времени выживания клеток без кишечной жидкости и в ее присутствии (900 сек./t) Aporrectodea caliginosa Pachyiulus flavipes Штаммы бактерий Штаммы бактерий 3-х суточные Суточные Суточные 3-х суточные культуры культуры культуры культуры 1 2 3 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Стимуляция роста Подавление роста Рис. 8. Сравнение активностей кишечных жидкостей червя Aporrectodea caliginosa и многоножки Pachyiulus flavipes по отношению к бактериям (на примере 16 не идентифицированных почвенных изолятов). Отсутствие столбиков – не определяли.
Мы предположили следующий механизм действия киллерного вещества на клеточную мембрану. Киллерное вещество представляет собой детергент следующего вида: гидрофобная цепь с полярными группировками на концах.
Агент проникает через поры в клеточной стенке, встраивается в мембрану и разрушает её за счет гидрофобного взаимодействия и расклинивающего действия (Рис. 9).
Рис. 9. Гипотетический механизм действия киллерного вещества на клеточную мембрану. Киллерное вещество проникает через поры в клеточной стенке и разрушает мембраны за счет гидрофобного взаимодействия и расклинивающего действия (предположительным киллерным агентом жидкости среднего отдела кишечника многоножки Pachyiulus flavipes является гидроксисульфопальмитиновая кислота -SO3-O-(CH2)15-COO-, Бызов, 2005).
Таким образом, впервые исследован групповой состав микробоцидных веществ в пищеварительной среде дождевых червей. Действующим веществом жидкости переднего отдела кишечника червя является органическое соединение (я) небелковой природы. Действующими компонентами жидкости заднего отдела, возможно, являются вещества, ассоциированные с полипептидами. Наличие биологической активности у фракций небелковой природы возможно связано с их поступлением из переднего отдела. Характер и структурная композиция действующих веществ у червя и многоножки позволяет говорить, что они имеют одинаковую природу.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Пищеварительный тракт дождевых червей – особая среда обитания бактерий.
Большинство кишечных изолятов – факультативные анаэробы. Протеолитическая и дегидрогеназная активность кишечных изолятов выше в сравнении с почвенными.
Таким образом, возможно существование сообщества бактерий кишечного тракта червей. Собственный вклад червей в разложение гумусовых веществ несравнимо мал по сравнению с ассоциированными с ними микроорганизмами.
Впервые обнаружен эффект быстрой гибели почвенных бактерий в пищеварительной жидкости дождевых червей. Кишечная жидкость дождевых червей агрессивна по отношению к микроорганизмам. Реакция бактерий различна от гибели до стимуляции роста. Реакция бактерий проявляется на штаммовом уровне. Действие пищеварительной жидкости, вероятно, связано с веществами небелковой природы.
Впервые исследован групповой состав микробоцидных веществ в пищеварительной среде дождевых червей. Действующим веществом жидкости переднего отдела кишечника червя является органическое соединение (я) небелковой природы.
ВЫВОДЫ 1. Функциональная характеристика кишечных изолятов доказывает существование сообщества бактерий кишечного тракта дождевых червей.
2. Впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости червей, что представляется необходимым для эффективной утилизации микробов как пищи.
3. Обнаружена специфичность действия жидкости на микроорганизмы, что является новым фактором регуляции биологического разнообразия в почвах.
4. Впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей.
5. Доказано, что киллерный агент является низкомолекулярным органическим веществом (ми) небелковой природы.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Хомяков Н.В., Харин С.А., Нечитайло Т.Ю., Голышин П.Н., Кураков А.В., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Реакция микроорганизмов на воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей // Микробиология. 2007. Том. 76, № 1, с. 55–65.
2. Byzov B. A., Khomyakov N.V., Kharin S.A., Kurakov A.V. Fate of soil bacteria and fungi in the gut of earthworms // European Journal of Soil Biology, 2007, Vol. 43, pp.
149-156.
3. Byzov B.A., Khomyakov N.V. The sensitiveness of soil bacteria at the digestive fluid in the gut of the earthworm Aporrectodea caliginosa // Abstracts the 8th International Symposium on earthworm ecology, 4th-9th September 2006, Krakov, Poland, p. 118.
4. Хомяков Н.В. Киллерная активность пищеварительной жидкости дождевых червей по отношению к почвенным микроорганизмам // Тез. докл. Второго Всероссийского конкурса научных студенческих работ к 200-летию Московского общества испытателей природы “Биотехнология – охране окружающей среды”.
Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Издательство ООО “Графикон - принт”, Москва – 2005 г. с. 352-358.
5. Хомяков Н.В., Добровольская Т.Г. Нечитайло Т.Ю. Голышин П.Н, Бызов Б.А.
Судьба бактерий в кишечнике дождевых червей // Материалы Международной научной конференции к 90-летию Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону. 21-22 апреля 2005 г.). “Экология и биология почв”. Изд-во “Ростиздат”. Ростов-на-Дону 2005 г. с. 523-529.
6. Хомяков Н.В., Бызов Б.А. Микробоцидная активность пищеварительных экстрактов дождевых червей // Тез. докл. 4-го (14) Всероссийского совещания по почвенной зоологии. “Экологическое разнообразие почвенной биоты и биопродуктивность почв”. 2005. с. 280-28.
7. Khomyakov N.V., Byzov B.A. The microbicidal activity of the earthworm gut extracts // Abstracts XIVth International Colloquium on Soil Zoology and Ecology. At the Universite de ROUEN – Mont Saint Aignan. France, 2004. pp. 120.