бузулуков юрий петрович исследование биокинетики неорганических наночастиц в организме лабораторных животных при пероральном введении с использованием технологии меченых атомов
На правах рукописи
БУЗУЛУКОВ ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОКИНЕТИКИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ В ОРГАНИЗМЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ МЕЧЕНЫХ АТОМОВ 03.01.01 – радиобиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Национальном Исследовательском Центре «Курчатовский Институт»
Научный консультант: Соловьев Владимир Юрьевич доктор биологических наук, кандидат технических наук
Официальные оппоненты: Осипов Андреян Николаевич доктор биологических наук, ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И.
Бурназяна ФМБА России, заведующий лабораторией Романов Сергей Анатольович кандидат биологических наук, ФГУН Южно-Уральский институт биофизики ФМБА России, директор
Ведущая организация:
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр Прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита диссертации состоится «_14_» марта 2013 г. В _12 час. мин. на заседании диссертационного совета Д 462.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико-биологического агентства России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Живописная, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико биологического агентства России Автореферат разослан «_30_» января 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Шандала Наталия Константиновна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы Ускоренное развитие нанотехнологической отрасли в России создает новый источник потенциальной опасности для здоровья человека и среды обитания и ставит проблему обеспечения безопасности нанотехнологий и производимой с их помощью продукции.
Одним из ключевых вопросов при решении данной проблемы является изучение биокинетики (абсорбции, биораспределения, метаболизма и экскреции – ADME в англоязычной терминологии) нанопродуктов в организме животных и человека. В этом вопросе можно выделить самостоятельное звено – экспериментальное исследование биокинетики наночастиц (далее, НЧ) в организме лабораторных животных с целью последующей экстраполяции на человека.
В настоящее время имеются только фрагментарные исследования в этом направлении. Одним из наиболее перспективных методов исследования является метод меченых атомов, с помощью которого можно исследовать биокинетику широкого класса нерганических НЧ различного химического состава, формы и размеров.
Целью исследования является изучение биокинетики НЧ серебра, золота, двуокиси титана и селена в организме лабораторных животных (крыс) методами меченых атомов и нейтронно-активационного анализа.
Задачи исследования: 1. Разработка технологии создания радиоактивной метки в неорганических НЧ с помощью ядерно-физических методов 2. Разработка методики измерения биокинетических параметров НЧ в организме лабораторных животных с использованием технологии меченых атомов и нейтронной активации.
3. Экспериментальное исследование биокинетических характеристик (абсорбции, биораспределения, метаболизма и выведения) ряда неорганических НЧ в организме лабораторных животных - крыс-самцов линии Вистар) при их пероральном введении.
4. Исследование возможности преодоления функциональных барьеров (ЖКТ и гематоэнцефалического барьера) исследуемыми НЧ.
Научная новизна диссертационной работы В данной работе впервые в отечественной практике полностью отработана и реализована технология внесения радиоактивных меток в неорганические НЧ, содержащие атомы серебра, золота, селена, цинка и титана. Полученные меченые НЧ с радионуклидной меткой использовались для анализа биокинетики в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных. В том числе, впервые разработан и использован в экспериментальной практике метод введения радиоактивной метки в титаносодержащие НЧ их облучением быстрыми нейтронами и образованием в них радиоактивной метки в виде изотопов скандия.
Получены новые данные по биокинетическим характеристикам НЧ серебра, золота, селена и оксида титана в организме крыс-самцов линии Вистар при однократном пероральном введении, а также для НЧ серебра при длительном (28 суток) введении. Получены доказательства прохождения НЧ серебра гематоэнцефалического барьера.
Научно-практическая значимость диссертационной работы Разработаны методики измерения массы исследуемых НЧ в биологических образцах с использованием технологии меченых атомов и нейтронной активации. Материалы проведённых исследований использованы при выполнении государственных контрактов в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры в Российской Федерации на период 2008 - 2011 г.». Разработанные методики использованы в экспериментах по оценке биокинетических характеристик НЧ серебра, золота, селена и двоокиси титана (рутила). Данные о биокинетических характеристиках неорганических частиц необходимы при выявлении критических органов и оценке рисков искусственных НЧ в ходе токсиколого-гигиенических исследований их опасности для здоровья человека. Методика может быть также распространена на измерения массового содержания и концентрации изученных НЧ в жидких и твердых образцах искусственного происхождения.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
1. Технология создания радиоактивных меток на неорганических НЧ, содержащих золото, серебро, селен, цинк и титан, путем облучения потоком нейтронов и методика количественных измерений активности изотопа-маркера в биообразцах.
2. Экспериментально измеренные биокинетические характеристики НЧ серебра, золота, селена и двуокиси титана в организме лабораторных животных при их однократном пероральном введении.
3. Доказательства преодоления НЧ серебра гематоэнцефалического барьера в опытах на крысах-самцах линии Вистар при пероральном введении.
Внедрение результатов исследования в практику Материалы проведённых исследований использованы в нормативно методических документах, разработанных в рамках выполнения Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры в Российской Федерации на период 2008 - 2011 г.», а именно:
- Методика измерений «Методика измерений массовой концентрации НЧ, содержащих серебро или цинк, в различных средах и биологической матрице на основе ядерно-физической спектроскопии» (ФР 1.31.2011.10990).
Методика аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009.
- Методические рекомендации «Порядок и методы определения органотропности и токсикокинетических параметров искусственных наноматериалов в тестах на лабораторных животных». МР 1.2.0048-11.
Разработаны совместно с ФГБУ НИИ питания РАМН и ФГБУ ИНБИ им.
А.Н.Баха РАН. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.
Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научно-технической конференции «Нанотехнологии функциональных материалов» (НФМ’2012), 2012, Санкт Петербург;
Научной сессии НИЯУ МИФИ-2012 “Функциональные и ультрадисперсные (нано-) материалы”, 2012, Москва;
V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», (ТКМФ-5), 2012, Троицк;
IV Международном форуме по нанотехнологиям Роснано 2011;
Российской научной конференции «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Санкт-Петербург, 2011 г.;
Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», 2011 г.;
2-ой Международной школе "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина", Москва, 2011 г.;
на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010», Москва;
Международной конференции Nanotechnology conference and exebition NanotechEurope 2009, Berlin.
Публикации По теме диссертации опубликовано 12 работ [1-12], в том числе статей в научных рецензируемых журналах [1, 2, 3, 4, 5], рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, а также два нормативно-методических документа, изданных Роспотребнадзор [11] и Росстандарт [12 ].
Личный вклад соискателя Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач и интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 102 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 16 таблицами, состоит из введения, трех разделов, выводов, списка литературы, содержащего 132 источников (35 на русском и 97 на английском языке).
Основное содержание работы Обеспечение безопасности использования продукции нанотехнологических производств для здоровья человека и среды обитания является одной из важнейших задач развития нанотехнологической отрасли.
В этой проблеме можно выделить одно из ключевых звеньев, которым является исследование биокинетических характеристик НЧ, а именно их абсорбции, биораспределения, метаболизма и экскреции в организме, т.е совокупности характеристик, обозначаемых в англоязычной литературе аббревиатурой ADME (далее по тексту – биокинетические характеристики).
Данная задача является также весьма актуальной для фармацевтики, пищевой промышленности и многих других прикладных областей.
На настоящий момент отсутствуют универсальные методы, решающие задачу в общей форме и для всех видов НЧ. В данной работе рассмотрены теоретические основы и практическая реализация методик измерения биокинетики НЧ неорганического происхождения в биологических образцах с использованием технологии нейтронной активации НЧ.
Применение радиоактивных меток имеет ряд преимуществ при решении задачи определения массового содержания НЧ в биологических образцах, поскольку введение изотопной метки не меняет химических и биологических свойств НЧ, а чувствительность и точность ядерно физической спектроскопии позволяет проводить измерения с чувствительностью и точностью, сравнимой с масс-спектрографическим анализом. Введение радиоактивной метки в исследуемые НЧ может осуществляться различными способами. Наиболее простым способом является облучение исходных НЧ в потоке тепловых нейтронов (nth) [1-3].
При этом в результате ядерной реакции (nth,) из исходного изотопа образуется изотоп с тем же атомным номером (и с теми же химическими свойствами), но с атомной массой на единицу больше. Для большого числа элементов такие изотопы являются гамма-излучателями с характеристиками, позволяющими с высокой точностью измерять их активность с помощью гамма-спектрометрической аппаратуры. Для ряда элементов, например титана, активация тепловыми нейтронами не позволяет получить изотопы с ядерно-физическими характеристиками, пригодными для обычной гамма спектрометрии. Для этих случаев в работе предложено использование ядерной реакции (n,p) на быстрых нейтронах. При взаимодействии быстрых нейтронов с протонами (р) в значительном числе элементов средней части таблицы Менделеева образуются изотопы другого химического элемента с атомным номером на единицу больше и имеющие ядерно-физические характеристики, пригодные для обычной гамма-спектрометрии [4-5].
Для измерения активности изотопа-метки в исследуемых образцах предложена методика селективного (по энергии) измерения активности на гамма-спектрометрической аппаратуре [12]. Измеряемая активность метки сравнивается с эталонным источником, содержащим точно известное количество исследуемых НЧ и облученного в тех же условиях, что и образцы. Такой подход не требует перехода от непосредственно измеряемых детектором величин скорости счёта радиоактивных распадов к абсолютной активности и позволяет избежать ряда систематических погрешностей. При этом процедура пересчета измеренной скорости счёта распадов радиоактивной метки в массу НЧ, содержащих метку, становится значительно более простой простой и прозрачной.
Высокая проникающая способность гамма-излучения позволяет пренебречь погрешностью его самопоглощения в биообразцах и упростить пробоподготовку и интерпретацию результатов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследуемые НЧ. В работе использовали следующие виды НЧ, представленных в виде водных суспензий: НЧ Ag (средний размер 35 нм, стабилизированные поливинилпирролидоном, произодства НПЦ Вектор Вита, Россия), НЧ TiO2 (кристаллы рутила в форме наностержней с средними размерами 7,5 нм и длиной 45 нм, нестабилизированные, производства фирмы «Sigma-Aldrich», Германия) [3, 4, 5], НЧ Au (средний диаметр 8 нм, стабилизированные лимонной кислотой, производства ИНБИ РАН), НЧ Se (средний диаметр 65 нм, нестабилизированные), производства лаборатории макрокинетики волновых процессов ИОФ РАН [3,5]. На этапе разработки технологии создания радиоактивной метки использовались также НЧ оксида цинка с диаметром около 30 нм, стабилизированные бычьим альбумидом, производства фирмы «Сигма-Олдрич» [1,2]. Размеры НЧ золота и селена, используемых для введения животным измеряли методами фотон-корреляционной спектроскопии (динамическое рассеяния света) Размеры НЧ двуокиси титана измерялись с помощью электронной микроскопии. Размеры НЧ серебра измерялись обоими методами.
Результаты оценок распределения размеров НЧ представлены на рис.1- (микрофотографии на рис. 2, 3 получены в лаборатории профессора Дзантиева Б.Б., Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН).
После приготовления суспензий НЧ и измерения их размеров, суспензии подвергались интенсивной обработке ультразвуком в течение 15 мин. (250 Вт звуковой мощности,частота 44 кГц).
Ядерно-физические свойства использованных в экспериментах НЧ серебра, Рис. 1. Распределение по числу частиц от диаметра НЧ золота, селена и титана, в водной суспензии НЧ серебра, используемых в которые существенны для эксперименте. Измерено методом динамического последующей нейтронной рассеяния света.
активации, приведены в таблице 1.
Рис 2. Изображения НЧ серебра, Рис. 3. Изображения НЧ двуокиси титана полученные методом трансмиссионной и их агрегатов, метод ТЭМ.
электронной микроскопии (ТЭМ).
Важно отметить, что все представленные в таблице изотопы имеют период полураспада от единиц до нескольких сотен дней (что важно с точки зрения возможности проведения гамма-спектрометрических измерений), энергию гамма-квантов от сотен до тысяч кэВ (что исключает необходимость введения поправок на самопоглощение в пробе) и достаточно высокое сечение реакций активации тепловыми нейтронами. Относительно малое сечение реакции (n,p) на титане компенсировалось высокой интенсивностью нейтронного излучения, генерируемого на бериллиевой мишени циклотрона.
Таблица 1 - Характеристики исходных и активированных изотопов Ag, Se, Ti, Au, Zn, используемых для создания радиоактивных меток в исследуемых НЧ Исходный стабильный изотоп Радиоактивный изотоп Содержание Радиоактивный, НЧ T1/2, Изотоп в природной изотоп -метка E,МэВ сут 10 см - смеси, % 109 110m Серебро Ag 48,2 4,4 Ag 249,8 0,6577;
0, Селен 0,2647;
0, 74 Se 0,9 48,0 Se 119, Sc 1,1211;
0, Ti 8,3 0,01 83, Двуокись Sc титана 0,1594;
0, Ti 7,4 0,01 3, 197 Золото Au 100 98,7 Au 2,7 0, Обозначения: – сечение захвата нейтрона, T1/2 – период полураспада ядра изотопа, E энергия -излучения изотопа;
M – атомная масса изотопа Облучение НЧ серебра, золота и селена потоком тепловых нейтронов проводили в исследовательском ядерном реакторе ИР-8. На основании предварительных расчетных оценок выбирали оптимальное время экспозиции суспензий НЧ в канале исследовательского ядерного реактора от 3 до 48 ч. Для получения меченых НЧ TiO2 использовали ядерную реакцию 46 на быстрых нейтронах (n,p) на ядрах стабильных изотопов Ti и Ti, с 46 получением изотопов Sc и Sc. Образующиеся в реакции ядра 46 радиоактивного Sc и Sc замещают часть ядер атомов титана в кристаллической решетке диоксида титана и имеют приемлимые времена жизни и энергии излучаемых гамма-квантов.
Ввиду технических трудностей при использовании экспериментальных каналов ядерного реактора с высокой плотностью быстрых (1,85 МэВ) нейтронов, облучение ультрадисперсного порошка двуокиси титана проводили на циклотроне во вторичном пучке быстрых нейтронов, генерируемых при облучении бериллиевой мишени пучком протонов с энергией 20 МэВ.
Лабораторные животные. Эксперименты на лабораторных животных были проведены совместно с ФГБУ «НИИ питания» РАМН. В качестве лабораторных животных использовали белых крыс-самцов линии Вистар массой тела 250-380 г. Всего использовано особей животных. В период перед Рисунок 4 - Процесс перорального экспериментами и в ходе их проведения введения крысам водной суспензии НЧ через зонд. животные получали полусинтетический рацион, приготовленный в соответствии с методическими указаниями МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» и воду в режиме неограниченного доступа. Сразу после введения препаратов животным их помещали в индивидуальные клетки, позволяющие осуществлять раздельный сбор фекалий и мочи.
Условия проведения экспериментов. Индивидуальные дозы НЧ варьировались в различных сериях измерений в зависимости от вида НЧ в пределах 0,5–1 мл суспензии, содержащей исследуемые НЧ с активностью индивидуальной дозы около 50 кБк на момент введения. Суспензию вводили однократно в желудочно-кишечный тракт крыс через специальный зонд (рис.
4). Для изучения биокинетических характеристик НЧ золота, серебра, селена и двуокиси титана образцы органов и тканей отбирали через 24, 48 и 72 ч после введения препаратов в условиях, исключающих перекрестную контаминацию образцов и их загрязнение экскретами животных в соответствии с методическими указаниями МУ 1.2. 2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных». Были отобраны следующие образцы: головной мозг, сердце, легкие, печень, селезенка, поджелудочная железа, почки, семенники, кровь и остаточная тушка (далее, каркас). Кроме этого, осуществляли сбор и анализ активности экскрементов и мочи на 24, 48 и 72 ч после введения (см. табл. 2 5). Все органы животных взвешивали и упаковывали в герметичные сосуды (флаконы) из высокочистого полиэтилена. Измерения активности образцов производили на низкофоновых спектрометрических комплексах. Для повышения точности измерения, в образцах ассиметричной формы измерения проводили несколько раз, с последовательным разворотом измеряемого образца вдоль вертикальной оси пробирки и последующим усреднением, а форма и размеры эталонных образцов (несколько вариантов) максимально соответствовали форме и габаритным размерам исследуемых образцов. Эталонные образцы создавались на основе вводимых животным препаратов. Общее количество измеренных на гамма-спектрометре биологических образцов в опытах по исследованию биокинетических характеристик НЧ в организме лабораторных составляет 896 проб.
Использование нейтронно-активационного анализа. В ходе эксперимента также реализован и другой способ получения данных по биокинетике НЧ – использование нейтронно-активационного анализа.
Принципиально этот способ отличается тем, что подопытным животным вводятся исследуемые НЧ без радиоактивной метки, а уже после отбора образцов органов и тканей они облучаются нейтронами. Таким образом исследовано содержание НЧ серебра в органах крыс после 28-суточного введения препарата НЧ серебра в виде добавки к корму.
Измерения образцов. Активность биологических образцов измеряли на низкофоновом гамма-спектрометрическом комплексе в каждом образце путем селективных измерений одной или нескольких гамма-энергетических линий, свойственных конкретному изотопу. Активность образцов рассчиывали по стандартному алгоритму [4] путем сравнения с эталонным образцом, содержащим известную массу НЧ [7, 9]. При расчете активности крови по активности образца крови, её фактическую массу считали равной 6% от массы тела.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенного исследования получены биокинетические характеристики распределения НЧ Ag, Au, Se, TiO2 в органах подопытных животных. Основные результаты приведены в таблицах 2-6.
Таблица 2 - Содержание НЧ TiO2 в органах крыс после однократного внутрижелудочного введения, результат указан в % от введенной дозы.
Анализируемый Время после введения, ч орган/ткань/биосубстрат 24 48 ЖКТ 80±10 1,7±0,2 0,12±0, Кал 21±10 98,3±0,2 99,9±0, Каркас 0,06±0,02 0,04±0,02 0,02±0, 2.10- Печень не обнаружено не обнаружено 2.10- Кровь не обнаружено не обнаружено Полученные результаты свидетельствуют, что для НЧ TiO2 характерна очень низкая степень проникновения через барьер ЖКТ. Небольшие (менее 0,06%) количества метки, зарегистрированные в каркасе, могли быть, в частности, следствием загрязнения калом кожи вокруг анального отверстия.
По истечении первых суток очень малые (порядка 0,002%) количества изотопа Sc были зарегистрированы в печени и крови животных, что означает содержание НЧ TiO2 в этих биосубстратах порядка 0,8 мкг. В селезенке, поджелудочной железе, гонадах, почках, лёгких, сердце, головном мозгу, а также в моче активность меченых НЧ TiO2 не была выявлена (что означает, содержание НЧ в этих биосубстратах мене 0,002%). Результаты исследования биокинетики НЧ серебра приведены в таблице 3 и на графике рис.5.
Таблица 3 - Среднее содержание НЧ серебра в органах крыс после однократного внутрижелудочного введения, результат указан % от введенной дозы.
Анализируемый Время после введения, ч орган/ткань/биосубстрат 24 48 ЖКТ+кал (в сумме) 98 98 Каркас 0,36±0,17 0,6 0,23±0, Печень 0,6±0,2 0,8±0,3 0,18±0, Почки 0,014±0,002 0,029±0,008 0,007±0, Кровь* 0,13±0,05 0,20±0,05 0,05±0, Лёгкие 0,009±0,003 0,016±0,003 0,006±0, Сердце 0,004±0,002 0,006±0,002 0,0032±0, Поджел. железа 0,008±0,002 0,012±0,005 0,004±0, Селезенка 0,05±0,02 0,06±0,03 0,010±0, Гонады 0,016±0,003 0,033±0,007 0,010±0, Головной мозг 0,003±0,001 0,012±0,002 0,005±0, Моча 0,012±0,002 0,032±0,009 0,048±0, Анализ полученных результатов свидетель ствует о том, что более 98% введенных перорально НЧ серебра локализуется в ЖКТ и далее выводится с калом. Всасывание НЧ из ЖКТ у всех животных на протяжении экспери Рисунок 5 - Содержание серебра в органах крыс после однократного перорального введения НЧ серебра мента не превышает в совокупности 2% от введенной дозы. Из табл. 3 и рис. 5 видно, что основным органом, накапливающим НЧ Ag, оказывается печень, величина активности в которой близка по порядку величины к суммарному содержанию метки во всех остальных органах и тканях. Далее в порядке убывания следуют периферическая кровь, селезенка и гонады.
Содержание НЧ серебра в сердце не превышает 3-6% от их содержания в крови и может быть связано, частично, с её остаточными количествами в коронарных сосудах по условиям проведения эксперимента. Общее содержание НЧ в почках, лёгких и поджелудочной железе также оказывается незначительным. Следует отметить, что наибольшее (после печени) количество НЧ достигается в селезенке. Наименьшее количество НЧ обнаружено в головном мозге. Факт их обнаружения может свидетельствовать о проникновении некоторых количеств НЧ серебра через гематоэнцефалический барьер, однако этот факт может быть интерпретирован и как обнаружение НЧ, задерживающихся в кровеносных сосудах мозга и отсутствующих в тканях мозга. Дополнительные эксперименты (см. ниже, стр.21-22), показали, что содержание крови в мозге 110m обуславливает менее 17% его активности по Ag. Это обстоятельсьво подтверждает факт проникновения НЧ серебра через гематоэнцефалический барьер в ходе вышеописанного эксперимента.
Таблица 4 - Среднее содержание НЧ золота в органах крыс после однократного внутрижелудочного введения, указан % от введенной дозы.
Анализируемый Время после введения, ч орган/ткань/биосубстрат 24 48 ЖКТ 64±7 6±3 0,20±0, Кал 31±11 89±8 100± Каркас 0,15±0,06 0,008±0,007 0,005±0, Печень 0,018±0,003 0,05±0,04 0,004±0, Почки 0,17±0,03 0,11±0,09 0,07±0, Кровь 0,037±0,003 0,04±0,02 0,004±0, Лёгкие 0,007±0,001 0,004±0,003 0,005±0, Сердце 0,0023±0,0006 0,003±0,001 0,0016±0, Поджел. железа 0,003±0,001 0,002±0,001 0,002±0, Селезенка 0,010±0,002 0,009±0,007 0,009±0, Гонады 0,009±0,003 0,004±0,003 0,003±0, Головной мозг 0,0004±0,0002 0,0007±0,0003 0,0002±0, Моча 0,012±0,002 -* -* * Измерения не были проведены по техническим причинам Исследованные НЧ золота характеризуются очень низким всасыванием при внутрижелудочном ведении (так же, как и НЧ Ag и TiO2), см. табл. 4 и рис. 6. Суммарное содержание метки в кале и ЖКТ через 24 и 48 ч после введения превосходит 95%, а через 72 ч в пределах ошибки применяемого метода не отличается от 100%, т.е., подавляющая часть НЧ Au экскретируется с калом. Экскреция с мочой оказывается крайне незначительной, составляя в первые сутки менее 0,02% от введенного количества. Вместе с тем, биокинетика и органотропность НЧ Au во многом отличает их от НЧ Ag, несмотря на то, что оба этих элемента относятся к металлам, являющимся химически инертными при физиологических условиях.
Органом, в котором зарегистрировано наибольшее количество НЧ Au, являются почки. Далее, в порядке уменьшения активности метки следуют кровь, печень и селезенка. Накопление метки во всех остальных органах крайне невелико по абсолютной величине и не 10- превышает % от введённого количества.
Остаточные количества меченых НЧ Au в каркасе оказываются, по видимому, существенно меньшими, чем в случае НЧ Ag.
Рисунок 6 - Содержание золота в органах крыс после однократного перорального введения НЧ Обращает на себя золота.
внимание тот факт, что для весьма незначительных количеств НЧ Au, выявляемых в поджелудочной железе, лёгких и гонадах, характерна определенная «консервация», т.е., их количества в данных органах через 72 ч не проявляют в пределах ошибки определения тенденции к снижению, в сравнении с 48 ч. Наиболее высокое содержание этих НЧ отмечается в почках, превосходя на порядок величины следующий по этому показателю орган - селезенку.
В головном мозгу через 24 ч после введения общее количество и концентрация НЧ оказываются на порядок величины меньшими, чем в крови. Это не позволяет исключить, что на ранних сроках эксперимента вся или почти вся метка Au, фиксируемая в области головного мозга, в действительности может быть обусловлена НЧ, содержащимися в просвете кровеносных сосудов этого органа. Однако через 72 ч концентрации НЧ в крови и мозгу различаются уже менее чем в 2 раза. Ввиду этого можно предположить, что некоторая небольшая часть НЧ Au способна к проникновению через гематоэнцефалический барьер. Однако количественно оценить степень проникновения на основании полученных в настоящем эксперименте данных не представляется возможным.
Причины выявленных существенных различий в органотропности НЧ серебра и золота недостаточно ясны. В вводимом животным препарате НЧ на их поверхности имеется непрочно связанный адсорбционный слой молекул-стабилизаторов (поливинилпирролидона или лимонной кислоты, соответственно), который, в ходе поступления НЧ во внутреннюю среду организма, по-видимому, замещается на оболочку («корону») из собственных белков животного. Можно предположить, что способность НЧ серебра и золота связывать различные белки плазмы крови оказывается различной, что, в свою очередь, определяет различную степень их удержания клеточными рецепторами таких органов, как печень и почки.
Данное предположение, однако, нуждается в отдельной экспериментальной проверке.
Биокинетика НЧ селена существенно отличается от описанных выше НЧ двуокиси титана, серебра и золота. Как видно из табл. 5 и рис. 7, обращает на себя внимание высокая степень всасывания НЧ селена, составляющая уже в 1 сутки после введения около 64%. В дальнейшем около 40% всего введённого в составе НЧ Se экскретируется с калом и около 55% - с мочой.
Органами, аккумулирующими наибольшие количества селена из НЧ, оказываются кровь и печень, а наибольшая концентрация зарегистрирована в почках. Значительные количества меченого селена (4-5%) выявлены также в каркасе. Во всех изученных биосубстратах, за исключением головного мозга, максимум концентрации меченого селена достигается между 24 и ч. после введения, а далее, к 72 ч. опыта происходит определённая «консервация» содержания экзогенного меченого Se или даже, как это имеет место для крови, гонад и поджелудочной железы, новое возрастание её количества.
Таблица 5 - Среднее содержание НЧ селена в органах крыс после однократного внутрижелудочного введения, указан % от введенной дозы.
Анализируемый Время после введения, ч орган/ткань/биосубстрат 24 48 ЖКТ 32±4 5,2±1,7 1,2±0, Кал 5±2 34±3 37± Каркас 5,2±0,7 4,3±0,4 4± Печень 3,3±0,2 2,6±0,3 2,6±0, Почки 1,50±0,08 1,3±0,2 1,2±0, Кровь* 4,1±0,2 3,2±0,4 3,7±0, Лёгкие 0,21±0,01 0,21±0,02 0,19±0, Сердце 0,093±0,008 0,077±0,008 0,06±0, Поджел. железа 0,11±0,01 0,06±0,01 0,088±0, Селезенка 0,27±0,04 0,22±0,03 0,22±0, Гонады 0,28±0,03 0,27±0,01 0,29±0, Головной мозг 0,035±0,003 0,05±0,01 0,032±0, Моча 51±3 55±2 57± Содержание меченого селена в головном мозге является наименьшим среди всех органов и не превышает 1-2% от содержания в крови.
При этом степень снижения удельной активности Se в головном мозге к 72 ч после Рисунок 7 - Содержание селена в органах крыс введения оказывается после однократного перорального введения НЧ наиболее заметной. Это селена.
может означать фиксацию активности метки в остаточной крови капилляров головного мозга и отсутствие проникновения через гематоэнцефалический барьера НЧ селена или продуктами их биотрансформации в значимых количествах.
В совокупности приведенные результаты позволяют предположить, что в отличие от НЧ Ag и Au, проникающие во внутреннюю среду организма НЧ Se подвергаются в значительной степени биотрансформации и метаболизму, и содержащийся в них селен включается в обменные процессы. Наибольшая его часть экскретируется с мочой и лишь незначительное количество депонируется в печени и почках. Следует отметить, что эксперимент был проведен на животных, нормально обеспеченных селеном, поступающим естественным путем вместе с пищей. Соответственно, тканевые белки насыщены селеном, поступившим с рационом. Известно, что у эукариот процесс ко-трансляционного включения селена в белки в форме селеноцистеина резко интенсифицируется при селеновой недостаточности и, напротив, тормозится при его адекватной обеспеченности или избытке.
Основная часть не включившегося в биосинтетические процессы селена метилируется и экскретируется с мочой, что, по-видимому, и наблюдалось в данном случае.
В дополнение к методу меченых атомов в его «классической» форме с введением животному меченых радиоактивных НЧ и последующим получением биообразцов был предложен и реализован метод, при котором животному вводятся нерадиоактивные НЧ, затем (через предусмотренное схемой опыта время) отбираются образцы органов и тканей, которые позже облучаются в потоке нейтронов. При этом радиоактивная метка генерируется в исследуемых НЧ в процессе облучения биообразца, уже содержащего исследуемые НЧ. Одновременно, облучаются эталонные образцы с известным содержанием наночастиц, необходимые для последующих сравнительных измерений. Этот метод имеет определенное преимущество перед методикой введения меченых НЧ, особенно при хроническом введении, т.к. в организм животного вводятся НЧ без радиоактивной метки.
Кроме того этот метод позволяет одновременно оценивать содержание в образцах эндогенных эссенциальных элементов Fe, Zn, Se, активируемых в составе биологического образца одновременно с исследуемыми НЧ.
Описанный выше метод был использован в эксперименте с длительным введением крысам НЧ серебра с кормом. В эксперименте крыс кормили рационом с НЧ серебра без радиоактивной метки. Эксперимент длился суток, суточная доза НЧ, вводимых с кормом, составляла 100 мкг серебра на кг веса животного. На 29 сутки были взяты образцы внутренних органов и крови от пяти подопытных крыс. После этого образцы облучались потоком тепловых нейтронов на ядерном реакторе. Данная процедура представляет собой классический нейтронно-активационный анализ. При измерении облученных образцов наряду с спектральными гамма-линиями серебра, регистрировались также спектральные линии изотопа Fe, что позволило оценить количество остаточной крови в образцах головного мозга.
Особенность данного эксперимента состояла в том, что после облучения нейтронами образцы имели высокое содержания изотопа Na с интенсивными линиями излучения с энергиями 1,369 МэВ и 2,754 МэВ. Эти значения превышают энергии характерных линий изотопа-метки 110mAg и создают сильный фон комптоновского гамма-излучения, затрудняющий измерении активности метки 110mAg. Короткий период полураспада 24Na (14, ч) позволил провести точные измерения через 10 суток после окончания облучения нейтронами, после распада большей части этого изотопа, Полученные результаты представлены на графике рис.8 и табл. 7. На рис. 8 количества НЧ Ag, определенные в органах и тканях, выражены в единицах массовой концентрации, в единицах [нг/г массы ткани].
Из представленных данных видно, что Содержание Ag, нг/г ткани наибольшая концентрация НЧ серебра отмечается в печени, а следующая (в порядке убывания) – в селезенке, где она оказывается в два раза меньшей.
Третьим органом по порядку убывания Рисунок 8 - Массовая концентрация [нг/г] НЧ серебра концентраций НЧ в органах крыс после 28-суточного внутрижелудочного серебра оказывается введения в дозе 100 мкг/на кг веса животного.
головной мозг. Данные табл. 7 позволяют оценить количество остаточной крови в образце головного мозга крыс и затем вычленить долю активности метки 110mAg в мозге, обусловленную остаточной кровью в головном мозге и выяснить активность 110mAg в тканях мозга.
Таблица 7 - Результаты оценки содержания железа в головном мозге по данным измерения активности изотопа железа 59Fe в мозге и крови подопытных животных.
№ Масса Общая Удельная Общая Масса Кровь в крысы образца активность активнос активность крови в мозге в % ть 59Fe в крови Fe в образце Fe в мозге, от общей крови крови мозге массы крови [имп/с на [г], не [% ], не [г] [имп/с] [имп/с] грамм] более более 16 7,85 68,51 8,73 1,38 0,158 1, 17 6,56 59,76 9,11 1,12 0,123 0, 19 7,59 74,15 9,77 0,97 0,099 0, 20 1, 8,64 77,46 8,97 1,24 0, Среднее 0, 7,66 69,97 9,14 1,18 0, В основе оценки лежит предположение, что все железо в мозгу обусловлено гемоглобином крови. В реальности это не так и истинная масса остаточной крови в мозге несколько меньше, чем расчетное значение, поэтому указанное в таблице значение массы остаточной крови в мозгу трактуется как верхняя граница оцениваемой величины.
Используя значение среднего содержание НЧ серебра в крови головного мозга при однократном пероральном введении из табл. (максимальные значения, 48 ч после введения), получаем оценку количества НЧ в остаточной крови в образце мозга не более 17%, аналогичный расчет для длительного введения НЧ серебра (рис. 8) дает цифру не более 6%.
Таким образом, показано, что активность тканей мозга, обусловленная 110m НЧ, меченными Ag, составляет не менее 83% от его полной активности в мозге. С учетом того, что естественное содержание серебра в мозгу в контрольных измерениях ниже чувствительности метода (что совпадает с литературными данными), можно считать доказанным факт наличия метки 110m Ag в тканях головного мозга и преодоления гематоэнцефалического барьера НЧ серебра, перорально введенными в организм, как однократно, так и при длительном введении.
ВЫВОДЫ 1. Разработана методика измерений массовой концентрации неорганических наночастиц (НЧ) в биологической матрице на основе ядерно-физической спектроскопии и соответствующая технология формирования НЧ с радиоактивными метками. Методика апробирована при исследовании биокинетических характеристик НЧ Ag, Au, Se, ZnO, TiO2 в опытах на лабораторных животных и аттестована в соответствии с ГОСТ Р 8.563-2009.
2. Проведенные исследования на лабораторных животных (крысах самцах линии Вистар) выявили несколько вариантов «поведения» неорганических НЧ при их пероральном поступлении в организм. Для НЧ TiO2 характерна крайне низкая степень всасывания из ЖКТ и почти 100%-я экскреция с калом, величина коэффициент ретенции через 48 ч после введения – менее 0.1%. Для НЧ Ag и Au характерно проникновение через стенку кишечника и накопление в органах и тканях, соответствующие коэффициенты ретенции составляют 2% и 5% соответственно. При этом, профили органотропности для этих двух видов НЧ существенно различны.
Что касается НЧ Se, то можно отметить весьма высокую степень их всасывания (коэффициент ретенции 66%), сопровождаемую, как можно предположить, значительной биотрансформацией.
3. Максимальное содержание НЧ серебра, селена и диоксида титана, 109 75 46, регистрируемое по радиоактивным меткам Ag, Se и Sc в органах крыс наблюдается в период 24-72 ч после перорального введения. В точке Ag и 75Se (или его метаболитов) в органах максимума распределение НЧ по массе уменьшается в соответствии со следующей последовательностью:
печень почки селезенка поджелудочная железа сердце кровь головной мозг. Для НЧ золота отмечается иное распределение максимумов содержания: почки печень селезенка поджелудочная железа сердце кровь головной мозг.
4. Показано, что при пероральном введении в организм НЧ серебра (после всасывания в ЖКТ и попадания в кровь) преодолевают гематоэнцефалический барьер. Количество НЧ, проникающих в мозг при однократном пероральном введении, составлет величину порядка 10-4 от введеного количества. При длительном (28 суток) введении доля НЧ серебра, преодолевающих гематоэнцефалический барьер составляет величину порядка 10-3 от вводимого суточного количества НЧ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Распопов Р.В., Бузулуков Ю.П., Марченков Н.С., Соловьев В.Ю., Демин В.Ф., Калистратова В.С., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Изучение биодоступности НЧ оксида цинка методом радиоактивных индикаторов // Вопросы питания, 2010, №6. С. 32-38.
2. Котенко К.В., Беляев И.К., Бузулуков Ю.П., Бушманов А.Ю., Демин В.Ф., Жорова, Е.С., Калистратова В.С., Марченков Н.С., Нисимов П.Г., Распопов Р.В., Соловьев В.Ю. Экспериментальное исследование биокинетики НЧ окиси цинка в организме крыс после однократного перорального введения с использованием технологии меченых атомов // Медицинская радиология и радиационная безопасность, 2011, Т.56, №2. С. 5-10.
3. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов Р.В., Демин В.Ф., Соловьев В.Ю., Кузьмин П.Г., Шафеев Г.А., Хотимченко С.А. Изучение абсорбции и биораспределения НЧ некоторых неорганических веществ, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс, с использованием метода радиоактивных индикаторов // Медицинская радиология и радиационная безопасность, 2012, 57, №3. С. 5-12.
4. И.В.Гмошинский, С.А.Хотимченко, В.О.Попов, Б.Б.Дзантиев, А.В.Жердев, В.Ф.Демин, Ю.П.Бузулуков. Наноматериалы и нанотехнологии: – методы анализа и контроляиии//Успехи химии -2013.-82(1) -С. 48-76.
5. Kotenko K.V., Belyaev I.K., Yu.P. Buzulukov, Bushmanov A.V., Demin V.F., Gmoshinski I.V., Zhorova E.S., Kalistratova V.S., Marchenkov N.S., Nisimov P.G., Raspopov R.V., Soloviev V.Yu. Experimental Research of Zinc Oxide-labeLed Nanoparticles Biokinetics in Rats’ Organizm after Single Oral Administration // Med. Radiol. and Radiation Safety. 2012, 57, №5, С 5-10.
6. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В. Демин В.Ф., Марченков Н.С., Распопов Р.В.
Экспериментальные исследования фармакокинетики наночастиц в организме лабораторных крыс методом радиоактивных индикаторов // III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010», Сборник материалов, Москва, 2010, Т. 3, С 238-239.
7. Бузулуков Ю.П., Демин В.Ф., Н.С. Марченков Н.С., Соловьев В.Ю. // Применение метода меченых атомов для количественной характеристики процессов всасывания, распределения по организму, накопления и экскреции при пероральном введении лабораторным животным наночастиц окиси цинка и серебра // Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2011 г, С 58.
Бузулуков Ю.П., Левин А.Д., Нагаев А.И., Творогова С.А., Демин В.А., 8.
Бузулуков Ю.П. Разработка стандартных образцов наночастиц для биомедицинских приложений // 2-я Международная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина", Сборник материалов Школы, Москва, 2011 г., С 26-27.
9. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Демин В.Ф., Соловьев В.Ю.
Экспериментальное исследование биокинетики неорганических наночастиц в организме лабораторных животных с использованием технологии меченых атомов // V Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», (ТКМФ-5), 2012, Троицк, Т 2, С 32-34.
10. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Демин В.А, Демин В.Ф., Кашкаров П.К.
Нейтронно-активационные методы детектирования и измерения массы наночастиц/наноматериалов в различных средах // Международная научно техническая конференция «Нанотехнологии функциональных материалов», Сборник трудов конференции, Санкт-Петербург, 2012 г., С. 615 – 618.
11. «Порядок и методы определения органотропности и токсикокинетических параметров искусственных наноматериалов в тестах на лабораторных животных», Методические рекомендации МР 1.2.0048-11, Методические рекомендации МР 1.2.2566-09, «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2011 г.
12. «Методика измерений массовой концентрации НЧ, содержащих серебро или цинк, в различных средах и биологической матрице на основе ядерно физической спектроскопии» // Методика измерений, ФР 1.31.2011.10990, Москва, 2011.