Биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных в санкт-петербурге

На правах рукописи

Черняева Екатерина Николаевна БИОХИМИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО КОМПЛЕКСА, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ 03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Частном научно-исследовательском учреждении «Биомедицинский центр» и Санкт-Петербургском государственном университете.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович, заведующий лабораторией, Институт экспериментальной медицины СЗО РАМН доктор биологических наук, профессор Подгорная Ольга Игоревна, ведущий научный сотрудник, Институт цитологии РАН

Ведущая организация: ФГБУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации

Защита диссертации состоится «_» _ 2012 года в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «_» 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Рост распространенности туберкулеза (ТБ) во многих странах мира является следствием социально-экономических потрясений, распространения ВИЧ инфекции, а также результатом изменений самого возбудителя, а именно, появления штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, устойчивых ко многим лекарственным препаратам.

Формирование лекарственной устойчивости микобактерий может быть обусловлено различными биохимическими механизмами: (i) снижением проницаемости клеточной стенки для препарата;

(ii) усиленным выведение препарата из бактериальной клетки;

(iii) ферментативной инактивацией препарата;

(iv) модификацией мишени препарата;

(v) инактивацией фермента, приводящего антибиотик в активную форму;

(vi) повышенной экспрессией белка-мишени лекарственного препарата (Wade et al., 2004). Данные механизмы резистентности к препаратам могут проявляться как в качестве природных свойств бактериальной клетки, так и возникать в результате селективного действия антибактериальных препаратов. Природная устойчивость бактерий к некоторым препаратам не является результатом возникших генетических изменений, в то время как приобретенная резистентность обусловлена генетически, а именно изменением нуклеотидной последовательности бактериальных генов или изменением уровня экспрессии собственных генов. Наиболее частой причиной возникновения устойчивости штаммов микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) к противотуберкулезных препаратам, являются спонтанные мутации бактериальных генов. Однако частота мутаций, связанная с развитием лекарственной резистентности, может различаться в зависимости от географического региона. Для эффективного применения молекулярно-биологических методов ускоренной диагностики лекарственной устойчивости необходимо знать частоту мутаций, связанных с резистентностью к препаратам, в конкретном регионе в данный момент времени.

Помимо лекарственной устойчивости, серьезную угрозу возникновения эпидемии представляет рост заболеваемости ТБ среди ВИЧ-инфицированных индивидов, лиц, находящихся в местах лишения свободы, бездомных и мигрантов.

В настоящее время существует достаточное количество работ, посвященных молекулярно-биологическим исследованиям штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных в различных регионах России (Kovalev et al., 2005;

Surikova et al., 2005;

Drobniewski et al., 2005(a);

Mokrousov et al., 2008). В большинстве работ изучается генетическое разнообразие штаммов МБТ, циркулирующих среди общей популяции больных ТБ (Kovalev et al., 2005;

Surikova et al., 2005;

Mokrousov et al., 2008). Незначительное количество работ посвящено изучению особенностей генома штаммов МБТ, распространенных среди заключенных (Kimerling et al., 1999;

Toungoussova et al., 2003;

Drobniewski et al., 2005(a)). Вместе с тем, молекулярно-биологические особенности штаммов МБТ, циркулирующих в группах риска, особенно среди таких как ВИЧ инфицированные и лица БОМЖ, не изучены. Поэтому изучение генетического разнообразия штаммов МБТ, распространенных среди пациентов из групп риска, представляет большой интерес.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования является изучение биохимических и молекулярно биологических особенностей штаммов микобактерий туберкулезного комплекса, распространенных на территории Санкт-Петербурга.

Задачи:

1. Сформировать коллекцию образцов геномной ДНК микробиологически охарактеризованных клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных Санкт-Петербурга.

2. Определить частоту характерных аминокислотных замен, ассоциированных с устойчивостью штаммов микобактерий туберкулезного комплекса к изониазиду, рифампицину и офлоксацину.

3. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам, а также обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

4. Сравнить генетическое разнообразие изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных у пациентов из различных групп риска.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Применены современные методы анализа ДНК, для молекулярного типирования штаммов микобактерий туберкулезного комплекса и обнаружения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов M.tuberculosis, выявленных среди больных туберкулезом жителей Санкт-Петербурга.

Проведена комплексная биохимическая и молекулярно-биологическая характеристика лекарственно-устойчивых и чувствительных к противотуберкулезным препаратам штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Санкт-Петербурге.

Впервые проведено молекулярно-биологическое сравнение штаммов M.

tuberculosis, выявленных среди пациентов из различных медико-социальных групп:

бездомных, ВИЧ-инфицированных, заключенных и общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Продемонстрировано доминирование штаммов M. tuberculosis Beijing во всех исследованных группах изолятов, а также значительное преобладание штаммов семейства Beijing среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы.

Детекция мутаций в генах katG и rpoB позволяет с высокой вероятностью предсказывать наличие лекарственной устойчивости петербургских штаммов M.

tuberculosis к изониазиду и рифампицину, соответственно.

Результаты работы показали, что мутации в области QRDR гена gyrA обнаруживаются только у 57% офлоксацин-устойчивых изолятов, включенных в исследование. Этот факт демонстрирует относительно невысокую значимость мутаций в гене gyrA для определения лекарственной устойчивости штаммов M.

tuberculosis к офлоксацину в Санкт-Петербурге по сравнению с другими регионами.

Результаты работы могут иметь значение для решения ряда прикладных задач современной клинической микробиологии и эпидемиологии туберкулезной инфекции, и являются достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания кандидатной субъединичной вакцины против туберкулеза, а также диагностических тест-систем.

Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнена в рамках финансирования ЧНИУ «Биомедицинский центр» по гранту Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследование в области ВИЧ и туберкулеза» (№ RUB1-7000-ST-08).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на нескольких международных конференциях (4-й Международной конференции по инфекционным заболеваниям в Пекине (Китай) в 2010 г.;

16-й, 18-й и 19-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2007, 2009 и 2010 гг., Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва (Россия) в 2009 г., Международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва (Россия), 2009 г., Конференции по Иммунодиагностике туберкулеза, Вирджиния Бич (США), 2008 г.

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в публикациях (2 статьи в рецензируемых журналах, 1 заявка на изобретение, тезисов и сообщений на конференциях).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 25 рисунков. Состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», который включает 274 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы. Материалами исследования послужили изоляты геномной ДНК, выделенной из чистых культур M. tuberculosis, выращенных на плотной селективной среде Левенштейна-Йенсена с применением метода абсолютных концентраций (Laszlo et al., 1997). Клинический материал и данные по устойчивости к противотуберкулезным препаратам были предоставлены бактериологической лабораторией Городского противотуберкулезного диспансера (ГПТД) Санкт-Петербурга в рамках совместного проекта. Также ГПТД г. Санкт-Петербурга были предоставлены социально-демографические данные о пациентах, от которых производился забор клинического материала для последующего генотипирования.

Для сравнительного генетического анализа штаммов МБТ, выявленных у больных ТБ лиц из разных групп риска, случайным образом отбирали культуры M. tuberculosis, полученные от пациентов БОМЖ;

ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих в Санкт-Петербурге;

заключенных из двух следственных изоляторов Санкт-Петербурга. В качестве контрольной группы анализировали штаммы МБТ, выявленные у ВИЧ негативных больных ТБ, зарегистрированных на территории Санкт-Петербурга, не относящихся к перечисленным группам риска (далее – «общая популяция больных ТБ»).

Для сравнительного генетического анализа штаммов МБТ, обладающих лекарственной устойчивостью, случайным образом отбирали 30 культур M. tuberculosis устойчивых к офлоксацину, 41 культуру с МЛУ, а также 30 культур чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам.

Генетический материал 30 устойчивых к офлоксацину и 3 чувствительных к данному препарату штаммов МБТ анализировали на наличие мутаций в коротких областях генов gyrA и gyrB. Для определения частоты мутаций в гене katG, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду (INH), среди данной выборки образцов отбирали 45 устойчивых и 5 чувствительных к INH изолятов. Также было отобрано образца устойчивых и 8 чувствительных к рифампицину (RIF) изолята МБТ, для анализа частоты мутаций в гене rpoB.

Генетический анализ штаммов M.tuberculosis. Очистка ДНК M. tuberculosis проводили методом фенольной экстракции. Для анализа нуклеотидных последовательностей генов katG, rpoB, gyrA и gyrB проводили амплификацию фрагментов названных генов методом ПЦР. Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили методом терминирующих аналогов трифосфатов по Сэнджеру на автоматическом секвенаторе MegaBACE 500 с помощью набора “DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit” (Amersham Biosciences).

Сравнительный анализ геномов штаммов МБТ, выявленных в различных группах пациентов и штаммов с различными паттернами лекарственной устойчивости, проводили методом сполиготипирования. Анализ данных сполиготипирования проводили c использованием программы Microsoft Excel. Для расчета индекса сходства Танимото – Кt– сравнивали результаты сполиготипирования изолятов МБТ, выраженных в бинарной системе исчисления. Построение филогенетических деревьев осуществляли с использованием метода невзвешенного попарного среднего (UPGMA) и программы Neighbor пакета программ Phylip 3.68. Филогенетические деревья представляли с помощью программы TreeView v.1.6.0. Графически результат анализа представляли в виде горизонтальной древовидной диаграммы или дендрограммы. Принадлежность к семействам сполиготипов определяли с использованием онлайн сервиса SPOTCLUST (http://tbinsight.cs.rpi.edu/run_spotclust.html). Принадлежность сполиготипа к одному из кодов международной базы данных SpolDB4 определяли с использованием открытой базы данных Института Пастера Гваделупы, доступной по адресу http://www.pasteur guadeloupe.fr81/SITVITDemo/.

Анализ «регионов различия» генома, описанный ранее (Parsons et al., 2002), использовали для дифференциации видов микобактерий туберкулезного комплекса, сполиготипы которых не были идентифицированы.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов сполиготипирования проводили на компьютере с применением статистического программного пакета R. Достоверность отличий оценивалась методом 2. Н0 (нулевая гипотеза) об отсутствии достоверных различий принималась при p-value0,05;

Н (альтернативная гипотеза) о наличие достоверных различий принималась при p value0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к изониазиду.

Исследование нуклеотидных последовательностей фрагмента гена katG позволило показать, что 93% исследованных нами INH-устойчивых изолятов МБТ, выявленных в Санкт-Петербурге, имеют мутации в данном регионе. Все исследованные образцы имели единственную мутацию – S315T (рис.1).

Чувствительные изоляты МБТ не имели мутаций, в исследованной области гена.

Таким образом, показано, что мутация S315T является надежным маркером устойчивости штаммов МБТ к INH, распространенных в Санкт-Петербурге. В нашей работе не было получено данных о других мутациях в гене katG, которые могли бы коррелировать с резистентностью микобактерий к INH.

А Б Рис.1. Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей фрагмента гена katG штамма M. tuberculosis H37Rv и мутантного штамма, несущего замену S315T, приводящую к возникновению устойчивости к INH. В строчке, соответствующей мутантной последовательности (katG-S315T) показана нуклеотидная замена GC (А), присутствующая в устойчивых штаммах МБТ, приводящая к замене S315T (Б).

Описанная нами ассоциация мутации S315T в гене katG с возникновением лекарственной устойчивости МБТ к INH характерна как для России (Mokrousov et al., 2002 (b);

Marttila et al., 1998), так и для других регионов земного шара. Однако частота встречаемости мутаций в данном регионе генома может быть ниже.

Исследование изолятов МБТ, устойчивых к INH, проведенное в Бразилии выявило замену S315T в 60,4% случаев (Hofling et al., 2005). При этом, как было показано, частота мутаций в 315 кодоне гена katG может варьировать от 60% до 87,1% в различных городах Бразилии (Silva et al., 2003). Изучение мутаций в гене katG среди изолятов, распространенных в Китае показало, что мутация S315 может встречаться у 55 – 60% INH-резистентных изолятов(Wu et al., 2006;

Jiao et al., 2007).

Анализ мутаций, ассоциированных с устойчивостью микобактерий к рифампицину.

Для анализа частоты мутаций в гене rpoB, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к RIF было исследовано 42 изолята МБТ, устойчивых к RIF, и изолятов чувствительных к данному препарату. В нашей работе была проанализирована нуклеотидная последовательность короткой области rpoB размером 81 п.о. несущей большинство известных мутаций устойчивости к RIF. В случае если устойчивые к RIF изоляты МБТ не имели мутаций в данном регионе, мы проводили анализ другого участка гена rpoB на наличие более редкой замены V176F. Результаты секвенирования фрагмента гена rpoB показали, что 88% исследованных RIF-устойчивых изолятов имели мутации в исследованной области генома (рис.2). Большинство мутаций (64%) было обнаружено в кодоне 531, приводящих к замене серина на лейцин (S531L). Также в данной области гена были обнаружены мутации в кодонах 516, 522 и 526. Пять изолятов устойчивых к RIF, не имеющих названых мутаций, были проанализированы на наличие мутации в кодоне гена rpoB, однако замены V176F в нашем исследовании обнаружено не было. В проведенной работе, среди изолятов МБТ чувствительных к RIF не было обнаружено мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью.

А Б Рис.2. Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей фрагмента гена rpoB штамма M. tuberculosis H37Rv и мутантных штаммов, несущих нуклеотидные замены, приводящие к возникновению устойчивости к RIF. В строчках, соответствующих мутантным последовательностям гена rpoB (S531L, H526D, H526N, H526Y, D516V, D516Y, S522L) показаны замены нуклеотидов (А), приводящие к соответствующим заменам аминокислот (Б).

Мутации резистентности к RIF, выявленные в нашем исследовании, были описаны в аналогичных работах, проведенных ранее в России и за рубежом.

Например, в исследовании, проведенном в России в 1998-2001 гг. мутации в гене rpoB были обнаружены у 92% изолятов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Большинство мутаций было обнаружено в кодонах 516, 526 и 531, но также были детектированы мутации в кодонах 511, 513, 522, и 533 (Lipin et al, 2007).

Данные ряда исследований свидетельствуют о том, что детекция мутации V176F гена rpoB в некоторых популяциях МБТ может повысить специфичность молекулярно-генетических тестов по определению устойчивости к RIF (Heep et al, 2000;

Rigouts et al, 2007;

Pietzka et al., 2008). Не смотря на то, что мутация V176F в нашем исследовании не была обнаружена, нельзя считать, что данная аминокислотная замена не встречается в популяции RIF-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза в Санкт-Петербурге. В нашем исследовании только пять образцов не имело стандартных мутаций в гене rpoB, ассоциированных с резистентностью к RIF. Поэтому анализ области гена rpoB, кодирующей 176 кодон, был проведен только для этих пяти изолятов. Таким образом, исследование было ограничено маленькой выборкой.

Анализ мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к офлоксацину в генах gyrA и gyrB.

Исследование генов gyrA и gyrB офлоксацин-устойчивых штаммов M.

tuberculosis, распространенных в Санкт-Петербурге, показало, что анализ небольшого региона гена gyrA позволяет обнаружить, по крайней мере, половину (56,6%) случаев устойчивости к офлоксацину (OFL). Исследованные офлоксацин устойчивые изоляты имели точечные мутации в области QRDR гена gyrA в кодонах 90, 91 и 94 (рис.3). Самая распространенные мутации D94G и D94A, были обнаружены у 30% исследованных изолятов. Ген gyrA у трех изолятов МБТ из нашей выборки, устойчивых к OFL, нес мутацию A90V. В большинстве исследований была продемонстрирована корреляция между данной мутацией и устойчивостью в офлоксацину.

У 28 из 30 OFL-резистентных изолятов была обнаружена замена S95T, являющаяся естественным полиморфизмом M. tuberculosis, не связанная с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Мутации в кодонах 74 и 88, описанные ранее в литературе (Ginsburg et al., 2005;

Duong et al., 2009;

Mokrousov et al., 2008;

Sun et al., 2008), в данном исследовании обнаружены не были. Все обнаруженные в исследовании мутации в гене gyrA были описаны для OFL-резистентных изолятов M. tuberculosis ранее (Mokrousov et al., 2008;

Shi et al., 2006). Однако частота мутаций в участке QRDR среди исследованных изолятов отличается от полученных ранее данных, которые проводились на других выборках.

В аналогичных исследованиях мутации в области QRDR гена gyrA были обнаружены у 72-94% среди OFL-устойчивых изолятов МБТ (Mokrousov et al., 2008;

Antonova et al., 2008;

Alcaide, Telenti, 1997), тогда как в исследованной нами выборке только 56,6% OFL-устойчивых изолятов имели мутации в проанализированном регионе гена gyrA. Относительно низкая частота мутаций в гене gyrA (менее 50%) среди изолятов МБТ устойчивых к фторхинолонам была обнаружена в Индии (Siddiqi et al., 2002;

Sulochana et al., 2007). При этом мутаций в гене gyrB в данных исследованиях обнаружено не было.

А Б Рис.3.Сравнение нуклеотидных (А) и аминокислотных (Б) последовательностей области QRDR гена gyrA штамма M. tuberculosis H37Rv и мутантных штаммов, несущих нуклеотидные замены, приводящие к возникновению устойчивости к OFL. В строчках, соответствующих мутантным последовательностям гена gyrA (D94G, D94A, S91P, A90V) показаны замены нуклеотидов (А), приводящие к соответствующим заменам аминокислот (Б). На рисунке А прямоугольником обозначен естественный полиморфизм гена gyrA, приводящий к замене S95T, не связанный с устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Возможно, исследуемая нами популяция офлоксацин-устойчивых изолятов M. tuberculosis обладает мутациями, расположенными в других областях гена gyrA, оказывающих влияние на конформацию хинолонового кармана. Кроме того на формирование устойчивости к препаратам хинолонового ряда могут влиять другие механизмы резистентности. В первую очередь, активное выведение препарата с помощью эффлюксного насоса (Singh et al., 2011).

В проведенном нами исследовании офлоксацин-устойчивых изолятов МБТ, выявленных в Санкт-Петербурге, не было обнаружено мутаций в коротком фрагменте гена gyrB, ассоциированных с лекарственной устойчивостью.

Отсутствие мутаций в регионе gyrB в исследованной популяции штаммов МБТ снижает возможности молекулярно-биологического определения устойчивости к офлоксацину.

Анализ сполиготипов офлоксацин-устойчивых штаммов M. tuberculosis, штаммов обладающих множественной лекарственной устойчивостью и штаммов, чувствительных ко всем противотуберкулезным препаратам.

Геномная ДНК, выделенная из изолятов M.tuberculosis с различным спектром лекарственной чувствительности была использована для сравнения генотипов микобактериальных штаммов. Для генетического анализа мы применяли метод сполиготипирования изолятов МБТ, обладающих устойчивостью к офлоксацину, с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и чувствительностью ко всем противотуберкулезным препаратам.

В результате генетического анализа штаммов МБТ, обладающих устойчивостью к офлоксацину, была показана высокая однородность сполиготипов среди офлоксацин-устойчивых изолятов. В данной группе образцов было выявлено всего 7 различных сполиготипов (табл.1).

Таблица 1.

Сполиготипы M. tuberculosis с различным спектром лекарственной устойчивости.

Семейство Восьмеричный код Код сполиготипа Количество % сполиготипа в SpolDB4 изолятов SPOTCLUST SpolDB Чувствительные ко всем препаратам 000000000003371 ST265 1 3,33 Beijing Beijing 000000000003661 ST1651 2 6,67 Beijing Beijing 000000000003671 ST255 1 3,33 Beijing Beijing 000000000003771 ST1 10 33,33 Beijing Beijing Нет нет Beijing 000002000003661 2 6, Beijing 000002000003771 ST1184 1 3,33 U Нет нет Beijing 000002000103771 1 3, 177777657760771 ST1255 1 3,33 T1 T 777777777760771 ST53 2 6,67 T1 T Нет нет 777777777700001 1 3,33 T Нет 711041003760661 1 3,33 LAM9 NA Нет 711041007740661 1 3,33 LAM9 NA Нет 777741000160771 1 3,33 LAM9 NA 777777607760771 ST42 1 3,33 LAM9 LAM нет Нет 777777644020771 1 3,33 H нет Нет Beijing/ 000000000503771 1 3, нет Нет 377737670000000 1 3, 35 U 777000000000371 ST560 1 3, Обладающие множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) 000000000003661 ST1651 4 9,76 Beijing Beijing 000000000003671 ST255 1 2,44 Beijing Beijing 000000000003771 ST1 28 68,29 Beijing Beijing нет нет 000002000003671 1 2,44 Beijing 000002000003771 ST1184 1 2,44 Beijing U нет нет 774002000760771 1 2,44 T нет нет 777761007763771 1 2,44 T нет нет 777574200376071 1 2,44 777777607763771 ST1247 1 2,44 33 MANU нет нет 777477607700771 1 2,44 LAM LAM3 and 000000007760771 ST4 1 2,44 S /convergent Устойчивые к офлоксацину 000000000003371 ST265 3 10 Beijing Beijing 000000000003771 ST1 22 73,33 Beijing Beijing 000000000003661 ST1651 1 3,33 Beijing Beijing 000000000000771 ST269 1 3,33 Beijing Beijing-like нет Т1 нет 775777777450771 1 3, нет Т1 нет 357777777760771 1 3, Т4 Т 775740003760771 ST266 1 3, К пекинскому семейству (Beijing family) относилось 90% исследованных изолятов. Этот факт, скорее всего, является следствием доминирования данного семейства на территории Санкт-Петербурга, описанного в литературе ранее (Surikova et al., 2005;

Kovalev et al., 2005).

Доминирование семейства Beijing было также показано среди исследованных нами изолятов МБТ с МЛУ и изолятов чувствительных ко всем препаратам. В результате сполиготипирования изолятов МБТ с МЛУ было выявлено 11 сполиготипов, при этом более 85% изолятов относились семейству Beijing (табл.1).

Сполиготипирование изолятов МБТ, чувствительных ко всем препаратам, позволило обнаружить 18 различных генетических паттернов в данной группе образцов. К семейству Beijing относилось 60% чувствительных к препаратам изолятов МБТ.

Штаммы микобактерий туберкулеза, принадлежащие генетическому семейству Beijing, обнаруживаются во многих странах мира и нередко являются причиной вспышек ТБ. В начале 1990-х годов штаммы с МЛУ, относящиеся к данному семейству, вызвали вспышки ТБ в США (Hewlett et al., 1991;

Agerton et al., 1999;

Bifani et al., 1996). В 1995 году большое число изолятов, геном которых имел сходный генетический паттерн, было обнаружено в Пекине. Изоляты семейства Beijing были выявлены и в других регионах (van Soolingen et al., 1995).

Сполиготипирование данных штаммов показало, что семейство Beijing обладает характерным генетическим профилем: в области прямых повторов данная группа штаммов содержит только спейсеры с 35-го по 43-й. Сходным профилем сполиготипирования обладает генетическая группа M. tuberculosis, названная “Beijing-like” (Beijing-подобная).

Распространение штаммов M. tuberculosis семейства Beijing в России и других регионах бывшего СССР было обнаружено в предыдущие годы и обнаруживается до сих пор (Kruuner et al., 2001;

Toungoussova et al., 2002;

Toungoussova et al., 2003;

Mokrousov et al. 2008;

Kubica et al., 2005).

По сравнению с результатами более ранних исследований в Северо западном регионе России, в проведенном нами исследовании доля изолятов, относящихся к семейству сполиготипов Beijing, увеличилась как среди образцов, обладающих лекарственной устойчивостью (OFL и МЛУ), так и среди чувствительных к противотуберкулезным препаратам изолятов. При этом, чем шире был спектр лекарственной устойчивости микобактерий, тем чаще мы обнаруживали изоляты, относящиеся к семейству Beijing.

В проведенной нами работе мы показали достоверную ассоциированность штаммов семейства Beijing с лекарственной устойчивостью к OFL и МЛУ (тест на независимость). Обнаруженная нами закономерность о том, что для штаммов МБТ семейства Beijing характерна достоверная ассоциированность с лекарственной устойчивостью, особенно с МЛУ, хорошо согласуется с литературными данными, полученными по всему миру (Kubica et al., 2004;

Kruuner et al., 2001;

Kovalev et al., 2005;

Toungoussova et al., 2002;

Surikova et al., 2005;

Caminero et al., 2001;

Chan et al., 2001;

Lavender et al., 2005;

Drobniewski et al., (a);

vanSoolingen et al, 2009).

Анализ сполиготипов M. tuberculosis, обнаруженных у пациентов, принадлежащих к различным группам риска.

В ходе работы был проведен генетический анализ 150 изолятов микобактерий туберкулезного комплекса, выявленных среди различных групп риска заболевания ТБ (бездомные, ВИЧ-инфицированные, заключенные) и общей популяции больных ТБ Санкт-Петербурга. Процентное соотношение сполиготипов семейства Beijing среди указанных групп составило56%, 77%, 83% и 60%, соответственно (табл. 2).

Как было отмечено ранее, доминирование семейства Beijing среди всех исследуемых групп согласуется с литературными данными. В более ранних исследованиях было показано, что доля семейства Beijing в России составляет более 50% (Kovalev et al., 2005;

Surikova et al., 2005;

Drobniewski et al., 2005 (a)).

Штаммы M.tuberculosis, принадлежащие семейству Beijing часто обнаруживаются в России, как среди общей популяции граждан России, так и среди заключенных. В исследовании штаммов МБТ, обнаруженных среди больных ТБ заключенных, проведенном в 2001 году в Архангельске, было показано, что 76% изолятов относились к семейству Beijing (Toungussova et al., 2003). В работе Шемякина и коллег, проведенной в 2001 году, было показано, что среди заключенных также преимущественно распространяются штаммы M. tuberculosis, принадлежащие семейству Beijing. В данном исследовании более 50% выявленных изолятов МБТ с МЛУ принадлежали пекинскому семейству, при этом сполиготип ST1 был обнаружен у 49% исследованных изолятов (Shemyakin et al., 2004). Стоит отметить, что в исследовании, проведенном в тюрьме Серпухова, 29% исследованных изолятов принадлежало группе семейств LAM, в то время как в нашем исследовании только 2 изолята можно отнести к данной группе сполиготипов.

Помимо семейства Beijing, среди образцов, включенных в наше исследование, обнаруженных у пациентов из социально дезадаптивных групп населения и общей популяции жителей Санкт-Петербурга, были обнаружены изоляты, принадлежащие семействам сполиготипов Beijing-like, LAM9, LAM3, T1, T3, T4, T5, T5_RUS1, Haarlem (H)1, H2, H3, MANU2, а также семействам 33, 34, 35, 36. Семейства Beijing, Beijing-like, LAM, Haarlem, T относятся к наиболее часто встречающимся семействам по всему миру (Brudey et al., 2006). Генетические семейства – Haarlem, LAM и T – наиболее часто встречаются в Африке, Центральной Америке, Европе и Южной Африке. Изоляты МБТ, принадлежащие генетической линии Haarlem часто встречаются в Европе. За пределами Европы штаммы семейства Haarlem обнаруживают в Центральной Америке и в странах Карибского бассейна, что предположительно указывает на распространение данного штамма в эпоху колонизации Америки. Группа LAM является наиболее распространенной в Южной Америке, в странах Средиземноморья и Карибского бассейна. Генетическое семейство «Т» считают плохо определенным, тем не менее данная группа штаммов широко распространена во многих странах (Brudey et al., 2006). Генетическая группа “Manu” является относительно новой и состоит из трех семейств MANU1, MANU2 и MANU3. Принадлежность к семействам сполиготипов 33, 34, 35 и 36 нескольких исследованных изолятов были определены с помощью программы SPOTCLUST, данные семейства не включены в базу данных SpolDB4.

Таблица 2.

Сполиготипы M. tuberculosis, выявленные в различных группах пациентов.

Семейство Восьмеричныйкод Код сполиготипа Количество % сполиготипа в SpolDB4 изолятов SPOTCLUST SpolDB Изоляты, выявленные среди бездомных пациентов 000000000003371 ST265 1 2,94 Beijing Beijing 2, 000000000003661 ST1651 1 Beijing Beijing 47, 000000000003771 ST1 16 Beijing Beijing нет нет 000002000003671 1 2,94 Beijing нет нет 515047607760661 1 2,94 LAM нет нет 777477607700771 1 2,94 LAM нет нет 777741003760771 1 2,94 LAM 5, 777761007760771 ST766 2 LAM9 T 777777607760771 ST42 1 2,94 LAM9 LAM 774777777423771 ST1481 1 2,94 33 MANU 777777607763771 ST1247 1 2,94 33 MANU 777777777760771 ST53 1 2,94 T1 T 177777657760771 ST1255 1 2,94 T1 T нет нет нет 777777777770000 1 2, нет нет 777737677420731 1 2,94 H нет нет нет 774002000760771 1 2, нет нет 777761007763771 1 2,94 T 777777774020771 ST47 1 2,94 H1 H Изоляты, выявленные среди ВИЧ-инфицированных пациентов 000000000003371 ST265 3 5,36 Beijing Beijing 000000000003661 ST1651 5 8,93 Beijing Beijing 000000000003671 ST255 4 7,14 Beijing Beijing 000000000003771 ST1 30 53,57 Beijing Beijing нет нет 000002000003661 1 1,79 Beijing нет нет 775741003760771 1 1,79 LAM нет нет 711041003760661 1 1,79 LAM нет нет 711041007740661 1 1,79 LAM 777777607760771 ST42 1 1,79 LAM9 LAM 777777777760771 ST53 1 1,79 T1 T нет нет 711007676420621 1 1,79 H 774777777420771 ST262 1 1,79 NA H нет 775147677700000 1 1,79 T2 NA 777760007760771 ST254 1 1,79 T4 T5_RUS нет нет 777777644020771 1 1,79 H нет 777777704020771 ST283 1 1,79 H 777000000000371 ST560 1 1,79 35 U нет нет 377737670000000 1 1,79 Изоляты, выявленные среди пациентов из общей популяции жителей СПб 000000000003371 ST265 1 3,33 Beijing Beijing 000000000003661 ST1651 4 13,33 Beijing Beijing нет 000000000003601 1 3,33 Beijing NA 000000000003771 ST1 8 26,67 Beijing Beijing 000002000003771 ST1184 3 10,00 Beijing U 000000000000771 ST269 1 3,33 Beijing Beijing-like нет 555047607760661 1 3,33 LAM9 NA нет 777761007760651 1 3,33 LAM9 NA 777477607760771 ST252 1 3,33 LAM9 LAM нет 515047636760661 1 3,33 T1 NA нет 515047236760661 1 3,33 T1 NA 777777777760771 ST53 1 3,33 T1 T нет нет 757737777420771 1 3,33 H нет нет 570000636760601 1 3,33 T нет 506044034000461 1 3,33 H1 NA нет 775743003763771 1 3,33 33 NA 777777777723771 ST1634 1 3,33 33 MANU 777402000000171 NA 1 3,33 35 NA Изоляты, выявленные среди заключенных пациентов 000000000003671 ST255 2 6,67 Beijing Beijing 000000000003771 ST1 18 60,00 Beijing Beijing 000002000003771 ST1184 2 6,67 Beijing U Нет 000002000003671 3 10,00 Beijing NA 777777607760771 ST42 1 3,33 LAM9 LAM Нет нет нет 777677777720771 1 3, Нет нет 774777737423731 1 3,33 LAM3 and S 000000007760771 ST4 1 3,33 /convergent Нет нет 000000000503771 1 3,33 В проведенном нами исследовании для нескольких образцов не было определено соответствие определенным семействам сполиготипов. Однако анализ областей различия генома показал, что все изоляты принадлежат виду M.

tuberculosis (рис.4), т.к. области RD1, RD4, RD9, RD10 и RD12 были обнаружены у всех проанализированных изолятов. Мы предполагаем, что случаи выявления неидентифицированных сполиготипов МБТ, ранее не встречавшихся в международной базе данных SpolDB4, могут быть случаями двойной инфекции, когда индивид заражается штаммами МБТ, относящихся к различным семействам.

Однако данная гипотеза требует изучения и подтверждения с помощью методов с более высокой дискриминирующей способностью.

Анализ генетического разнообразия штаммов М.tuberculosis, выявленных в различных группах риска показал, что наименьшее разнообразие обнаружено среди заключенных. В данной группе пациентов были обнаружены штаммы, представленные девятью различными сполиготипами. Среди исследованных изолятов M. tuberculosis, выявленных среди пациентов из групп «БОМЖ», «ВИЧ+» и «общей популяции» было обнаружено по 18 сполиготипов. Статистический анализ показал, что группы риска, состоящие из лиц БОМЖ, ВИЧ инфицированных пациентов не отличаются от общей популяции больных ТБ города Санкт-Петербурга (пациентов, не относящихся ни к одной из групп риска) по доле представленности сполиготипов семейства Beijing.

Электрофореграмма результатов Электрофореграмма результатов ПЦР области RD1 ПЦР области RD 123 4 1 400 п.о.

300 п.о.

200 п.о.

100 п.о.

Размер продуктов ПЦР 150 п.о. Размер продуктов ПЦР 343 п.о.

свидетельствует о том, что все свидетельствует о том, что все образцы содержат регион RD1 образцы содержат регион RD Электрофореграмма результатов Электрофореграмма результатов ПЦР области RD ПЦР области RD 1 2 3 45 1 2 34 56 300 п.о. 300 п.о.

Размер продуктов ПЦР 308 п.о.

Размер продуктов ПЦР 306 п.о.

свидетельствует о том, что все свидетельствует о том, что все образцы содержат регион RD образцы содержат регион RD Электрофореграмма результатов ПЦР области RD 1 23 4 5 1. Маркер “GeneRuler 100bp DNA Ladder” (Fermentas).

2. Изолят № 3. Изолят № 4. Изолят № 5. Изолят № 6. Положительный контроль 300 п.о.

7. Отрицательный контроль Размер продуктов ПЦР 312 п.о. Рис.4. Электрофореграммы результатов ПЦР областей свидетельствует о том, что все различия микобактерий туберкулезного комплекса образцы содержат регион RD Сравнение генетического разнообразия штаммов МБТ, выявленных в различных группах, показало, что наименьшее генетическое разнообразие наблюдалось в группе пациентов из мест лишения свободы. Данная группа риска достоверно отличается от общей популяции больных ТБ Санкт-Петербурга и от группы бездомных пациентов по доле представленности семейства Beijing. По сравнению со всеми исследуемыми группами риска, заключенные – наиболее замкнутая и обособленная группа, физически отделенная от остального населения. Заражение штаммами M. tuberculosis семейства Beijing может происходить внутри данной группы, независимо от общей популяции больных ТБ в Санкт-Петербурге. В связи с этим, не вызывает сомнений тот факт, что разнообразие представленности различных семейств сполиготипов МБТ среди заключенных минимальное.

Сходство генотипов штаммов МБТ, циркулирующих в общей популяции жителей Санкт-Петербурга, а также среди бездомных и ВИЧ-инфицированных, позволяет сделать вывод о большом влиянии пациентов из данных социально дезадаптивных групп на распространение ТБ среди граждан города. Этот факт, скорее всего, обусловлен недостаточностью профилактических противотуберкулезных мероприятий в группах риска, а также низкой приверженностью к лечению ТБ бездомных и ВИЧ-инфицированных пациентов, что приводит к высокой заболеваемости и активному распространению ТБ.

ВЫВОДЫ 1. Секвенирование фрагментов генома санкт-петербургских изолятов M.tuberculosis показало:

- точечные мутации, обнаруженные в генах katG и rpoB среди 93 и 88% INH- и RIF-устойчивых изолятов, соответственно, являются надежными маркерами устойчивости к данным препаратам;

- детекция мутаций в области QRDR гена gyrA позволяет обнаружить не менее 50% OFL-устойчивых изолятов;

- область QRDR гена gyrB не имела мутаций, ассоциированных с устойчивостью к OFL, в исследованной группе изолятов.

2. Генотипирование штаммов M. tuberculosis на основе полиморфизма области прямых повторов выявило доминирование генетического семейства Beijing во всех исследованных группах изолятов. Исследованные штаммы семейства Beijing достоверно чаще (p0,05) обладали МЛУ, устойчивостью к OFL, а также значительно чаще преобладали среди пациентов, находящихся в местах лишения свободы, чем штаммы других генотипов.

3. Впервые показано распространение генетически сходных изолятов M.tuberculosis среди бездомных, ВИЧ-инфицированных и пациентов из общей популяции жителей Санкт-Петербурга. Сравнение сполиготипов исследованных штаммов МБТ обнаружило более низкое генетическое разнообразие бактериальных штаммов, выявленных среди заключенных, а также среди OFL-устойчивых изолятов.

4. Сформирована коллекция образцов геномной ДНК клинических штаммов M.tuberculosis, полученных от больных туберкулезом жителей Санкт Петербурга, необходимая для создания кандидатного вакцинового препарата, направленного на профилактику и лечение туберкулезной инфекции. Данная коллекция образцов может быть использована для разработки тест-систем по обнаружению лекарственно-устойчивых штаммов МБТ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Chernyaeva E., Dobrynin P., Pestova N., Matveeva N., Zhemkov V. and Kozlov A. / Molecular-genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis strains spread in different patient groups in St.Petersburg (Russia) // Eur J Clin Microbiol Infect Dis, DOI:

10.1007/s10096-011-1497-2.

2. Черняева Е.Н., Добрынин П.В., Пестова Н.Е., Матвеева Н.Г., Жемков В.Ф., Козлов А.П. / Обнаружение мутаций, ассоциированных с устойчивостью к офлоксацину в генах gyrA и gyrB, и молекулярно-генетический анализ офлоксацин-устойчивых изолятов M. tuberculosis, выявленных в Санкт-Петербурге в 2008 г. // Вестн. С. Петерб. ун-та. Сер. 3. 2010. Вып. 4. С. 117–125.

3. Заявка на изобретение RU 2008149821 A, Июнь 2010. Вакцина для профилактики и лечения туберкулезной инфекции, рекомбинантный слитый белок FAE, рекомбинантная плазмидная ДНК pFAE для его получения. А.П. Козлов, Н.А.

Климов, Б.В. Мурашев, И.В. Духовлинов, Р.И. Аль-Шехадат, Е.Н. Черняева.

4. E. Chernyaeva, N. Pestova, P. Dobrynin, N. Matveeva, V. Zhemkov, A. Kozlov / Molecular-genetic analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in St.Petersburg (Russia). // International Journal of Infectious Diseases, Volume 14, Supplement 2, July 2010, P. S23.

5. Черняева Е., Пестова Н., Матвеева Н., Жемков В., Козлов А. / Мутации в генах katG и rpoB и генетическое разнообразие штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, распространенных в Санкт-Петербурге // Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, Том 14, №1(29), 2010, С. 39.

6. Черняева Е., Пестова Н., Матвеева Н., Жемков В., Козлов А. / Изучение генетического разнообразия штаммов M. tuberculosis, обнаруженных в группах риска в Санкт-Петербурге в 2007-2008 гг. // Сборник тезисов III Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Октябрь 2009 г.

Том 1, с. 19.

7. Dobrynin P., Chernaeva E., Matveeva N.,,Zhemkov V. and Kozlov A. / Study of Point Mutations in gyrA and gyrB Genes, Asossiated with OfloxacinResisstance, in Cultures of M. tuberculosis Revealed in St.Petersburg in 2008 // Rus J AIDS, Cancer and Public Health, V. 13 (2), May 2009, P. 58.

8. Pestova N., Chernaeva E., Matveeva N.,,Zhemkov V. and Kozlov A / Study of M.

tuberculosis spoligotypes among high-risk groups in St.Petersburg in 2007-2008 // Rus J AIDS, Cancer and Public Health, V. 13 (2), May 2009, P.72.

9. Добрынин П.В., Черняева Е.Н. / Изучение точечных мутаций в гене gyrA, связанных с устойчивостью к офлоксацину штаммов Mycobacterium tuberculosis, обнаруженных в Санкт-Петербурге в 2008 году // Материалы конференции «Ломоносов – 2009», Апрель 2009, секция «Биология», подсекция «Микробиология», с. 5.

10. Пестова Н.Е., Черняева Е.Н. / Молекулярно-эпидемиологическое исследование штаммов микобактерий туберкулезного комплекса в группах риска в Санкт Петербурге в 2007-2008 гг. // Материалы конференции «Ломоносов – 2009», Апрель 2009, секция «Биология», подсекция «Микробиология», с. 16.

11. Mutations in katG, rpoB and embB genes in drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in St.Petersburg in 2007. Materials of Int Conference on TB Immunodiagnostics. September 2008, Virginia Beach, VA, USA.