Биологически активные вещества шлемника байкальского (scutellaria baicalensis georgi) при интродукции и в условиях in vitro
На правах рукописи
ОКЛАДНИКОВА Наталия Николаевна
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО
(SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) ПРИ ИНТРОДУКЦИИ
И В УСЛОВИЯХ IN VITRO
03.00.12. – физиология и биохимия растений
03.00.05. – ботаника
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Томск – 2007
Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии и в лаборатории лекарственных растений Сибирского ботанического сада ГОУ ВПО «Томский государственный университет»
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Карначук Раиса Александровна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Харина Татьяна Георгиевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Олонова Марина Владимировна кандидат биологических наук, доцент Минич Ирина Борисовна
Ведущая организация: Центральный Сибирский ботанический сад, г. Новосибирск
Защита состоится «1» марта 2007 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.09 при Томском государственном университете по адресу:
634050 г. Томск, просп. Ленина, 36.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Томского государственного университета Автореферат разослан « » января 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук В.П. Середина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время растительное сырьё служит источником более трети всех лекарственных средств (Завражнов, 1993).
Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) семейства яснотковых (Lamiaceae Lindl.) – одно из древнейших растений традиционной медицины Китая, Монголии, Японии, Кореи, Дальнего Востока (Базарон и Асеева, 1984;
Минаева, 1991;
Kopp, a. o., 2003). Ареал данного вида сокращается, а в Приморье, Читинской области и Республике Саха (Якутия) шлемник байкальский включен в региональные Красные книги. В связи с тем, что лекарственным сырьем S. baicalensis являются корни, происходит уменьшение численности данного вида. Надземная часть шлемника байкальского изучена недостаточно, несмотря на то, что именно в ней происходят первичные этапы синтеза биологически активных веществ (БАВ) и их предшественников.
Существует несколько путей получения ценного и дефицитного лекарственного сырья: интродукция и создание искусственных плантаций;
метод культуры тканей и клеток лекарственных растений. Промышленные культуры, по сравнению с ресурсными заготовками гарантируют компактность размещения площадей, получение лекарственного растительного сырья стандартного качества, значительное увеличение биомассы растений в сочетании с высокой концентрацией БАВ. Технология in vitro позволяет получать экологически чистое сырьё круглый год, независимо от климатических условий и трудностей сбора сырья, увеличивать выход БАВ, регулируя их накопление в культуре. Учитывая особенности данных путей получения БАВ, представляет интерес исследование фитохимических особенностей S. baicalensis при интродукции и в культуре in vitro.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование морфобиологических особенностей и динамики накопления биологически активных веществ S. baicalensis при интродукции и в культуре in vitro. Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
1. Исследовать ритм роста и развития разновозрастных растений S. baicalensis;
2. Определить степень изменчивости и взаимосвязи морфологических признаков при исследовании надземной части шлемника байкальского в условиях интродукции;
3. Изучить некоторые особенности репродуктивной биологии S. baicalensis при интродукции: длительность цветения соцветия и цветка, фертильность пыльцы;
семенную продуктивность (СП) и качество эремов, как показателей степени адаптации семенного размножения данного вида к конкретным условиям;
4. Получить каллусную культуру шлемника байкальского, исследовать динамику роста каллусной культуры S. baicalensis на модифицированных питательных средах;
5. Выявить сезонную динамику накопления БАВ S. baicalensis (аскорбиновой кислоты, углеводов, флавоноидов и дубильных веществ) по морфологическим группам сырья;
6. Изучить динамику накопления аскорбиновой кислоты и флавоноидов в каллусной культуре S. baicalensis.
Защищаемые положения.
1. Обоснование возможности возделывания и перспективности S. baicalensis как ценного лекарственного растения в результате изучения ритмологических, морфологических, репродуктивных особенностей вида в условиях интродукции.
2. Накопление биологически активных веществ в надземной части шлемника байкальского является основой рационального использования лекарственного сырья данного вида.
3. Каллусная культура S. baicalensis – продуцент биологически активных веществ. Физиологически активные вещества (фитогормоны и гуминовые кислоты) значительно влияют на рост каллусной культуры шлемника байкальского и накопление в ней флавоноидов и аскорбиновой кислоты.
Научная новизна. Впервые изучены адаптационные возможности S. baicalensis при интродукции на юге Томской области и выявлены ритмологические, антэкологические и морфобиологические особенности данного вида в новых условиях произрастания. Проведено комплексное исследование динамики накопления аскорбиновой кислоты, сахаров, флавоноидов и дубильных веществ, которое позволит расширить их физиологической роли. Впервые изучена динамика накопления аскорбиновой кислоты и влияние фитогормонов на её содержание в каллусной культуре шлемника байкальского.
Практическая значимость. Результаты настоящей работы могут быть использованы при разработке ресурсосберегающих методов сбора лекарственного сырья S. baicalensis в естественных местообитаниях и технологии возделывания его на юге Томской области. На основе анализа морфологических признаков и показателей семенной продуктивности были отобраны особи для создания высокопродуктивной агропопуляции. Результаты фитохимического исследования S. baicalensis свидетельствуют о возможности комплексного и рационального использования как надземной, так и подземной части растения для нужд фармацевтической промышленности. Каллусная культура шлемника байкальского является продуцентом аскорбиновой кислоты и флавоноидов, а также может быть основой для получения суспензионной культуры данного вида.
На экспериментальном участке Сибирского ботанического сада Томского госуниверситета создана плантация S. baicalensis, площадью 150 м2. Результаты исследований используются при чтении курсов: «Биотехнология лекарственных растений», «Фитохимия», «Избранные главы биохимии».
Личный вклад соискателя. Автором проведена экспериментальная работа и интерпретация результатов. Постановка задач, решение методических проблем осуществлялось совместно с профессором, доктором биологических наук Р.А. Карначук, старшим научным сотрудником СибБС ТГУ кандидатом биологических наук Т.Г. Хариной.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на молодежной конференции «Исследования молодых ботаников Сибири»
(Новосибирск, 2001);
Международном совещании «Проблемы охраны растительного мира Сибири» (Новосибирск, 2001);
XI Съезде русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России»
(Новосибирск, 2003);
VI Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004);
III Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004);
VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино-на-Оке, 2005), XII Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология»
(Алушта, Украина, 2005);
Международной конференции, посвященной 60 летию Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН «Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов» (Москва, 2005);
III Международной конференции, посвященной 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова Томского государственного университета (Томск, 2005) V Международной научно практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии»
(Барнаул, 2006), VII Открытой окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2006), Заочной электронной конференции Российской Академии Естествознания (Москва, 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, 1 статья в ведущем научном журнале из перечня ВАК.
Структура диссертации и её объем. Диссертационная работа изложена на 175 страницах, содержит 30 рисунков, 11 таблиц и 9 приложений. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 332 источников, из них 206 отечественных и 126 иностранных.
Список условных обозначений: 2,4-Д – 2,4-дихлорфенилуксусная кислота;
АК – аскорбиновая кислота;
БАВ – биологически активные вещества;
БАП – 6 бензиламинопурин;
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека;
ВС – восстанавливающие сахара;
ГСО – Государственный стандартный образец;
ГПС – гидролизуемые полисахариды;
ГК – гуминовые кислоты;
ДВ – дубильные вещества;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
ИУК – индолилуксусная кислота;
КК – корневой каллус;
КСП – коэффициент семенной продуктивности;
ЛРС – лекарственное растительное сырье;
ЛК – листовой каллус;
MS – среда Мурасиге и Скуга (1962 цит. по Бутенко, 1999);
ОП1ЛК, ОП1СК, ОП2ЛК, ОП2СК, ОП2КК – каллусные культуры, полученные от разных эксплантов;
ПС – полисахариды;
ПСП – потенциальная семенная продуктивность;
РСП – реальная семенная продуктивность;
СибБС ТГУ – Сибирский ботанический сад Томского государственного университета;
СК – стеблевой каллус;
СП – семенная продуктивность;
ФС – фенольные соединения.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям профессору, д-ру биол. наук, Р.А. Карначук и старшему научному сотруднику СибБС, канд. биол. наук Т.Г. Хариной за внимательное и чуткое отношение, помощь в интерпретации полученных результатов исследования.
Искренне признательна доценту, канд. биол. наук Р.И. Лещук за консультации при освоении методик фитохимического анализа и за моральную поддержку на протяжении всего периода исследований.
Благодарю доцента канд. биол. наук, С.В Пулькину за помощь в освоении методик по определению фертильности пыльцы;
канд. мед. наук Е.Н. Амосову за предоставленный метчик байкалеина, профессора д-ра хим. наук, В.И.
Литвиненко за предоставленный ГСО байкалина;
сотрудников и студентов кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ, лаборатории лекарственных растений СибБС ТГУ.
1.ШЛЕМНИК БАЙКАЛЬСКИЙ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Первая глава состоит из четырех разделов. В первом разделе представлены данные об ареале и экологии шлемника байкальского, доказана необходимость охраны популяций и рационального использования лекарственного сырья S. baicalensis. Во втором разделе описаны основные действующие вещества шлемника байкальского, характерные, главным образом, для корней. В третьем разделе описано историческое развитие фармакологических и клинических исследований препаратов S. baicalensis. Четвертый раздел посвящен интродукционным исследованиям и введению шлемника байкальского в культуру in vitro.
2.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объект исследования. Объектами исследования являются интродуцированные растения и каллусная культура шлемника байкальского.
Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) из семейства яснотковых (Lamiaceae Lindl.) – многолетнее поликарпическое растение. Является перспективным источником БАВ для фармацевтической промышленности.
Физико-географическая характеристика района исследований. В этом разделе описаны особенности климата юга Томской области и состава почв учебно-производственного участка Сибирского ботанического сада Томского государственного университета.
Методы исследований. Методы интродукционных исследований. В семилетнем эксперименте находились растения 1, 2, 3, 4, 5 лет, выращенные через рассаду и посевом в открытый грунт. В первой декаде июня высевали стратифицированные и нестратифицированные эремы для определения влияния стратификации на грунтовую всхожесть эремов S. baicalensis. Во второй декаде июня высаживали рассаду S. baicalensis в открытый грунт широкорядным способом – междурядья шириной 60 см, между растениями в ряду – 20 см. Ритм роста генеративного побега трехлетних растений шлемника байкальского определяли еженедельным измерением высоты генеративного побега в течение мая, июня и июля. Для исследования ритма развития использовали метод фенологических фаз И.Н. Бейдеман (1974). Накопление сырой массы определяли в фазах вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения.
Количество ранне-, средне-, и позднецветущих растений шлемника байкальского устанавливали в фазе массового цветения на разновозрастных особях. Длительность цветения соцветия и отдельного цветка S. baicalensis определяли по методике А.П. Пономарева (1960) в фазе массового цветения на 25 маркированных соцветиях от момента раскрытия первого цветка до момента завязывания плода и опадения венчика.
Морфометрический анализ шлемника байкальского проводили на 17- маркированных разновозрастных особях в фазе цветения (Методика исследований при интродукции лекарственных растений, 1984) по следующим параметрам: высота, число листовых узлов на генеративном побеге, длина и ширина листовой пластинки 10 яруса, число побегов второго, третьего порядка, число цветков, располагающихся на побегах первого, второго и третьего порядков у растений.
Для определения степени фертильности свежесобранной пыльцы S. baicalensis использовали метод дифференциальной окраски по методике Р. Alexander (1969). Микрофотосъемку проводили с помощью микроскопа Olympus CX41 и фотоаппарата Olympus Т7070 при увеличении х 400.
Семенную продуктивность (СП) определяли по общепринятым методикам (Вайнагий, 1974;
Методические указания по семеноведению интродуцентов, 1980) с учетом того, что плод шлемника байкальского представлен четырехэремным ценобием. При изучении СП за элементарную единицу выбрали генеративный побег, вычисляли потенциальную семенную продуктивность (ПСП), реальную семенную продуктивность (РСП) и коэффициент семенной продуктивности (КСП). При изучении морфобиологических особенностей эремов S. baicalensis определяли массу эремов, их размеры (длину и ширину), всхожесть и энергию прорастания (Методика исследований при интродукции лекарственных растений, 1984). Для определения влияния стратификации на прорастание эремов S. baicalensis их закладывали на 10, 20, 30 суток стратификации при температуре 0-4 °C. После завершения срока стратификации определяли всхожесть и энергию прорастания стратифицированных и нестратифицированных (контроль) эремов (Методика исследований при интродукции лекарственных растений, 1984).
Культивирование каллусной культуры. Для введения S. baicalensis в культуру in vitro эремы стерилизовали 30 секунд в 80 % этаноле, затем в течение 10 минут в 0,1 % растворе сулемы и трижды промывали в стерильной дистиллированной воде. Затем простерилизованные эремы помещали на среду Кнопа. Экспланты листьев, сегменты стеблей и корней стерильных растений помещали на модифицированную питательную среду с минеральной частью по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (1962, цит: по Бутенко, 1999), с тиамином (1 мг/л), никотиновой кислотой (0,5 мг/л) и пиридоксином (0,5 мг/л), сахарозой (30 г/л) и агаром (9 г/л). Затем каллусную культуру пассировали на среде с различным содержанием индолилуксусной кислоты (ИУК), кинетина, гуминовых кислот (ГуК).
Совместно с С.В. Песяком была получена каллусная культура ОП1 из эксплантов листьев (ОП1ЛК) S. baicalensis. В июне 2004 г. была предпринята вторая попытка получить каллус от эксплантов интактных растений S. baicalensis. Апикальные почки побегов второго порядка пятилетнего растения шлемника байкальского стерилизовали и эксплантировали на питательную среду MS, содержащей 1 мг/л ИУК и 0,1 мг/л кинетина. Культура ОП2ЛК была отмечена как наиболее интенсивно растущая. На 6-ом субкультивировании на основе ОП2ЛК исследовали влияние фитогормонов на ростовые процессы и накопление биологически активных веществ:
аскорбиновой кислоты и флавоноидов.
При исследовании морфологических особенностей культуры ткани S. baicalensis, окрашивали метиленовым синим, а затем на давленых препаратах (Шамина и др., 1966) определяли длину и ширину 100 клеток, окрашенных метиленовым синим. Объем клеток вычисляли по формуле Ю.А. Целникер и А.Т. Мокроносова (1978: цит. по Головацкой и Карначук, 1999). Для определения ростового индекса каллусной культуры шлемника байкальского взвешивали каллус перед культивированием и после, отмечая отношение прироста сырой и воздушно-сухой биомассы к начальной массе каллуса. Для определения воздушно-сухой массы каллуса S. baicalensis взвешивали сырой каллус, а затем высушенный (10 повторностей) в термостате на чашках Петри первоначально при t = 110° С в течение 15 минут, а затем при t = 55 - 60° C в течение 12 часов.
Аналитические методы. Сбор лекарственного проводили в фазе вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения. Для определения БАВ в надземной массе срезали 10 генеративных побегов или по 5 корней, разделяли на морфологические группы сырья (листья, стебли и корни). В свежесобранном растительном материале определяли содержание свободной и связанной аскорбиновой кислоты (АК). Для получения средней пробы сырье сушили минут в термостате при t = 110-115 °С, а затем 10-12 часов при t = 55-60 °С.
Определение содержания свободной и связанной АК (витамина С), основанное на восстановлении 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, проводили титрометрическим способом (Методы биохимического исследования растений, 1987). Микрометод определения сахаров в растительном сырье основан на восстановлении феррицианида калия редуцирующими сахарами в щелочной среде до ферроцианида, последний в присутствии желатина образует с сернокислым окисным железом устойчивую синюю окраску (Швецов, Лукьяненко, 1968: цит по Методы биохимического исследования растений, 1987). Дубильные вещества определяли пермангонатометрическим методом с предварительным осаждением дубильных веществ (ДВ) раствором желатина (Андреева и Калинкина, 2000).
На современном этапе исследований, разработана методика определения суммарного содержания флавоноидов в корнях и корневищах шлемника байкальского – временная фармакопейная статья Rizomata et radices Scutellariae baicalensis (ВФС У 42-1-92);
для надземной массы методика не разработана. В связи с этим были использованы две различные методики спектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидов в экстрактах шлемника байкальского. Экстрагирование лекарственного сырья проводили трижды на водяной бане с 70 % этанолом. Первая методика спектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидов, основана на комплексообразовании флавоноидов с хлоридом алюминия (III), измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на длине волны = 415 нм. Содержание флавоноидов рассчитывали с учетом поглощения ГСО рутина в 96 % этаноле. В основе второй методики – временная фармакопейная статья для корней и корневищ шлемника байкальского. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряли на длине волны = 279 нм, расчет суммарного содержания флавоноидов проводили с учетом поглощения ГСО байкалина в 70 % этаноле. Содержание флавоноидов в каллусной культуре определяли только по второй методике.
Методы обработки данных. Статистические процедуры проводили с помощью электронных таблиц «MS Exell 2003» и пакета программ «STATISTICA 6.0.». Графические объекты обрабатывали при помощи пакета программ «Adobe Photoshop CS 8.0.». При статистическом анализе вычисляли среднее арифметическое анализируемых параметров, X, стандартную ошибку среднего, s x. При исследовании объема клеток каллусной культуры вычисляли среднее кубическое (Лакин, 1980). На гистограммах высота столбцов характеризует среднее арифметическое, а планки погрешности – доверительный интервал при уровне доверительной вероятности P = 0,05. Для определения уровня изменчивости признаков (Мамаев, 1969: цит по Магомедмирзаеву, 1990) при проведении морфометрического анализа вычисляли коэффициент вариации V %. При сравнивании выборок данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест) (P 0,05).
Оценку линейной связи между количественными переменными проводили с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмана – rs (P 0,05).
3. МОРФОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI ПРИ ИНТРОДУКЦИИ При изучении ритма роста генеративного побега S. baicalensis установили, что наиболее интенсивный рост побега приходился на последнюю декаду июня и суточный прирост составлял 2,24 см. Наибольший прирост биомассы был отмечен в фазе плодоношения. Для растений шлемника байкальского, выращенных через рассаду, было характерно значительное накопление надземной биомассы, которое у двулетних достигало 59,5 ± 3,8 г (Рис. 1а), а у трехлетних растений – 157,1 ± 8,7 г (Рис. 1б). Масса корня меньше: у двулетних растений она составляла 22,4 ± 1,4, а у трехлетних растений она составляло 60, ± 8,2 г. Следствием интродукции шлемника байкальского в более северном регионе, относительно его естественных местообитаний, стало снижение апикального доминирования, образование значительного количества паракладиев в течение всего генеративного периода.
Шлемник байкальский проходит полный цикл сезонного развития в условиях юга Томкой области, он вегетирует, цветет и плодоносит. Отмечено, что 50 % растений, высаженных через рассаду, зацветают уже в первый год жизни, и только 11 % посевных растений (Харина и др., 2003). При этом у однолетних особей шлемника байкальского отмечена тенденция к сокращению фазы вегетации и увеличению периода плодоношения, что отражает ритмологические особенности адаптации данного вида к условиям интродукции.
200 масса генеративного масса генеративного 80 подземной части, г масса надземной и надземной части, г масса подземной и а б 150 60 побега, г побега, г 100 40 50 20 0 0 0 1 2 3 4 1 2 3 Фенофазы Фенофазы 1 – вегетация;
масса корня, г 2– бутонизация;
масса надземной части растения, г 3– цветения;
4– плодоношение масса генеративного побега, г Рисунок 1 – Изменение надземной и подземной сырой массы S. baicalensis в процессе сезонного развития: а – у двулетних особей, б – у трехлетних особей Начало генеративного периода многолетних растений шлемника байкальского приурочено ко второй декаде июля, а плодоношение и созревание эремов – к августу и сентябрю, что согласуется с темпами сезонного развития в природных местообитаниях (Фруентов, 1987). По существующей классификации, за основу которой взят характер ритма развития зеленой ассимилирующей поверхности (Серебряков, 1964;
Голубев, 1965;
Борисова, 1965), S. baicalensis относится к длительновегетирующим летнезеленым растениям с зимним типом покоя. По типу цветения шлемник относится к средне-позднелетним растениям (Голубев, 1965). Стабильность последовательности смены фенофаз свидетельствует о приспособленности вида к конкретным условиям.
Исследования разновозрастных особей по срокам цветения показали наличие 5-17 % раннецветущих, 60-85 % среднецветущих и 5-16 % позднецветущих особей. Раннецветущие особи имеют большое значение при культивировании растений в зоне рискованного земледелия. Таким образом, особенности ритма развития шлемника байкальского в условиях интродукции проявились в длительности фаз, в гетерогенности особей по срокам зацветания и также в ускорении темпов развития.
При проведении морфологического анализа разновозрастных особей от 1 до 5 лет было выявлено, что двулетние и трехлетние особи S. baicalensis, культивируемые рассадным способом, являются наиболее продуктивными. На первом году жизни рассадных растений S. baicalensis формируется один генеративный побег высотой 24-33 см, нарастающий моноподиально, несущий 12-19 листовых узлов, побегов второго порядка – 2-7 шт., побегов третьего порядка 1-3 шт. (Рис. 2) (Окладникова и др., 2005). Для двулетних растений, независимо от способа выращивания характерно увеличение числа генеративных побегов, числа листовых узлов, побегов второго и третьего порядков. Отмечено, что двулетние растения, выращенные через рассаду, не уступают трехлетним растениям, выращенным в посевах, по количеству генеративных побегов, высоте. У трехлетних рассадных растений происходит значительное увеличение количества генеративных побегов, которое может достигать 9-14 шт. на особь. В результате проведенных исследований установлено, что растения, выращенные через рассаду (Рис. 2а), по сравнению с растениями, культивируемыми в посевах (Рис. 2б), характеризуются более высоким развитием побегов первого, второго и третьего порядков, что приводит к значительному увеличению надземной массы.
50 а б 10 о дн о летн и е, д вулетн и е, тр ехлетн и е, о д н о летн и е, двулетн и е, тр ехлетн и е, 2002 2003 2004 2003 2004 Коэффициент вариации, % 160% в 240% г Коэффициент вариации, % 200% 120% 160% 120% 80% 80% 40% 40% 0% 0% о д н о летн и е, двулетн и е, тр ехлетн и е, о д н о летн и е, д вулетн и е, тр ехлетн и е, 2002 2003 2004 2003 2004 Ч и сл о ген ер ати вн ы х п об егов, ш т.
Ч и сл о ген ер ати вн ы х п об егов, ш т.
В ы сота, см.
В ы сота, см.
Ч и сл о л и сто вы х узл о в, ш т.
Ч и сл о ли стовы х узло в, ш т.
Ч и сл о п об егов втор ого п ор яд к а, ш т.
Ч и сл о п об егов втор ого п о ряд к а, ш т.
Ч и сл о п об егов третьего п ор яд к а, ш т.
Ч и сл о п об егов третьего п ор яд к а, ш т.
Рисунок 2 – Морфологические признаки и коэффициенты вариации соответствующих признаков и у разновозрастных растений S. baicalensis: а – морфологические признаки растений в посевах, б – морфологические признаки растений, выращенных через рассаду;
в – коэффициенты вариации признаков растений в посевах;
г – коэффициенты вариации признаков растений, выращенных через рассаду Повышенный, высокий, очень высокий и аномально высокий уровень коэффициента вариации отмечен для побегов первого (V = 34,3 – 53,2 %), второго (V = 41,0 - 115,9 %) и третьего (более 100 %) порядка, а низкий и средний – для высоты генеративного побега (V = 9,2 - 24,0 %) и числа листовых узлов (V = 8,5 - 21,3 %) (Рис. 2 в, 2г) (Харина и др., 2005).
При проведении корреляционного анализа была установлена положительная связь между следующими морфологическими признаками:
высотой генеративных побегов и числом листовых узлов, высотой генеративных побегов и числом побегов второго порядка, шириной листовой пластинки и числом побегов третьего порядка. Кроме этого были отмечены значимые уровни rs для следующих пар признаков: число генеративных побегов и ширина листа, высота генеративного побега и длина листа, число листовых узлов и число побегов второго порядка, длина и ширина листа.
Таким образом, при проведении морфологического анализа разновозрастных особей впервые выявлены возрастные изменения, определен уровень изменчивости и взаимосвязи морфологических признаков S. baicalensis. Отмечено, что в условиях интродукции уже трехлетние растения шлемника байкальского способны образовывать больше 8 побегов, в естественных зарослях образование такого количества побегов происходит только к пятнадцати годам (Атлас ареалов…, 1976).
В естественных условиях у S. baicalensis было также отмечено только семенное возобновление (Атлас ареалов…, 1976;
Дулепова, 1986;
Банаева, 1994), в связи с этим представляло интерес изучить особенности семенного размножения данного вида. При исследовании продолжительности и ритмики цветения соцветия S. baicalensis выявлена акропетальная последовательность:
первыми зацветают бутоны в нижней части флоральной единицы, что обуславливает наложение фаз бутонизации и цветения, цветения и плодоношения, а одном соцветии могут быть бутоны, цветки и плоды.
Продолжительность распускания цветков в соцветии составляет 14-16 дней, отдельного цветка – 5-8 дней. Для генеративного побега шлемника байкальского свойственны ритмологические характеристики истинных синфлоресценций (Кузнецова, 1992) – акропетальное зацветание в пределах флоральной единицы и базипетальное для паракладиев в пределах синфлоресценции.
В формировании семян и наследственных свойств большую роль играет пыльца (Поддубная-Арнольди, 1982). Для пыльцевых зерен шлемника байкальского характерны апертуры в виде трех борозд, которые имеют четко выраженную полярность и проходят меридианно от полюсов. При изучении фертильности пыльцы, выявлено, что с возрастом происходит снижение этого показателя, так у трехлетних растений она составляет 98,7 % (Харина и др., 2001), в то время как у семи-, восьми- и девятилетних 88-92 %.
Семенная продуктивность (СП) – один из показателей адаптации вида к конкретным условиям обитания, определяющий возможность внедрения новых видов и сортов, ранее не произраставших в данном регионе (Некрасов, 1980). За элементарную единицу СП выбран генеративный побег и выделены следующие элементы: число генеративных побегов на особь, число цветков первого второго и третьего порядков на генеративный побег, число эремов собранных с соответствующих особей. При изучении СП S. baicalensis установлено, что с возрастом происходит увеличение показателей семенной продуктивности. Так, у однолетних растений количество цветков составляет 38,2 ± 6,7 шт. на генеративный побег, ПСП – 152,6 ± 26,9 шт., РСП – 56,6 ± 11,5 шт. и КСП – 37,1 %. У двулетних растений увеличивается число цветков на генеративном побеге – 249,3 ± 36,7 шт., возрастает ПСП – 997,2 ±146,7 шт., РСП – 634,0 ± 114,6 шт., значительно повышается КСП – 63,6 %. У трехлетних особей количество генеративных побегов у трехлетних равно 14 шт.;
число цветков на генеративном побеге – 327,7 ± 24,5 шт.;
ПСП – 1310,7 ± 98,0 шт.;
РСП – 836, ± 67,0 шт.
В ходе многолетних исследований установили, что растения, выращенные из семян собственной репродукции, обладают более высокими показателями КСП. Так, двулетние растения шлемника байкальского характеризовались увеличением этого показателя от 45 % до 64 %, а трехлетние растения – с 54 % до 64 %, что свидетельствует о процессе адаптации данного вида к условиям интродукции (Окладникова и Харина, 2005). Таким образом, на КСП, как относительную величину, изменение количества побегов не влияет.
Наличие семян – один из важных показателей соответствия условий произрастания биологическим потребностям вида. В условиях интродукции на юге Томской области отмечен высокий КСП у двух и трехлетних особей шлемника байкальского, который достигает 64 %, по сравнению с 28 % в естественных местообитаниях (Пшеничкина и Банаева, 1988). На основе данных морфологического анализа и исследования семенной продуктивности была определена интенсивность развития признаков у разновозрастных маркированных растений (2004) и отобраны особи с максимальной реализацией признаков для последующего размножения в условиях юга Томской области.
Показатели семенной продуктивности дают в большей степени количественную характеристику плодовитости особи. Качество полученного материала определяется проверкой на всхожесть. Лабораторная всхожесть эремов S. baicalensis Georgi, хранившихся полгода составляет 79,5 % (Харина и др., 2001). Всхожесть эремов S. baicalensis после 10 дней стратификации составляла 98,5 %, после 20 дней – 99 %, после 30 дней – 98,5 %.
Нестратифицированные эремы прорастали 14-15 суток, стратифицированные – 8-9 суток. При изучении температурного режима прорастания эремов шлемника байкальского, выявили наиболее высокую всхожесть при 10° С в темноте, максимальная энергия прорастания на 7 день составляла 54 %, всхожесть достигала 68 %.
Грунтовая всхожесть эремов шлемника байкальского была невысокая и составляла 16,5 %, предварительная стратификации увеличивала её до 22,0 %.
Подзимний посев сухими эремами был неэффективен.
4. КУЛЬТУРА ТКАНИ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО Каллусная культура S. baicalensis была получена на эксплантах листьев, стеблей и корней на модифицированной среде MS с различными концентрациями стимуляторов роста (Таблица 10). Каллус образовывался на местах поранения листьев или среза у сегментов стеблей и корней. Ткани эпигенетически различных эксплантов отличались скоростью каллусогенеза.
Листовой каллус образовывался в течение 40-50 суток, корневой – 60-80 суток, стеблевой – 20-30 суток. Стеблевые экспланты были более чувствительны к высоким концентрациям ауксинов (1-2 мг/л), которые способствовали образованию вначале побегов, а затем через 10-15 суток и корней. Препарат гуминовых кислот (ГК) совместно с ИУК и кинетином стимулировал каллусообразование у листового и корневого каллуса S. baicalensis.
Применение более низких концентраций 2,4-Д (0,2 мг/л) приводило к дедифференцировке листового каллуса. В 2004 г. были получены каллусные культуры ОП1ЛК (из листьев) и ОП1СК (из стеблевых сегментов). В 2005 году были получены новая интенсивно растущая культура ОП2ЛК.
При определении объема клеток ОП1ЛК и ОП1СК S. baicalensis отмечали, что размеры клеток каллуса шлемника байкальского составляли 20-35 мкм, объем – 7000-33000 мкм3. На первых этапах культивирования клетки стеблевого каллуса на средах с относительно высоким содержанием ИУК (1 мг/л) и добавкой ГуК (0,1 мг/л), растягивались, так что, соотношение длины клетки к её ширине составляло 1,8-2,2.
При исследовании динамики ростовых процессов каллусной культуры ОП1ЛК S. baicalensis в течение 10-ого пассажа на среде MS, содержащей 0,2 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина (Рис. 3а) отмечено, что в первые 15 суток культивирования объемы клеток увеличивались. К 20 суткам происходило резкое снижение (до 10447 мкм3), а затем снова подъем до максимального значения на 25 сутки (20740 мкм3).
3, 4, а б в 2, 3, Воздушно-сухая масса, Объем клеток, мкм?
20000 3, Индекс роста 2, 2, мг/л среды 15000 1, 2, 10000 1,5 1, 1,0 0, 0, 0, 0, 0 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30 Сутки Сутки Сутки Рисунок 3 – Динамика ростовых процессов каллусной культуры ОП1ЛК S. baicalensis в течение 10-го субкультивирования на среде MS, содержащей 0,2 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина: а – изменение объема клеток;
б –динамика индекса роста, в – накопление воздушно-сухой массы.
Удвоение воздушно-сухой массы происходило к 20-ым суткам культивирования, а после 25-ых суток кривая роста выходит на плато, дальнейшие изменения массы незначительны. На 15 сутки отмечали снижение воздушно-сухой массы, что могло быть связано с катаболическими процессами.
В течение 30 суток с 1 литра среды можно получить 1,27-1,41 г воздушно сухой массы каллусной культуры.
Н.А. Трофимова (1982) предложила использовать высокие концентрации ауксинов – 2 мг/л. Однако при таких высоких концентрациях ауксинов мы наблюдали потемнение каллусной ткани. В связи с этим необходимо было оценить влияние различных концентраций фитогормонов (ИУК и кинетина) на размеры и объем клеток, индекс роста и накопление воздушно-сухой биомассы каллусной культурой S. baicalensis ОП2ЛК (Рис. 4).
Было установлено, что наибольшие размеры и объем клеток характерны для клеток каллусной ткани, выращенной на среде, содержащей 0,2 мг/л ИУК и 0, мг/л кинетина (Рис. 4 а). Максимальный индекс роста составлял 10,1 и был отмечен на среде с 0,5 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина (Рис. 4б). Наибольшее количество воздушно-сухой массы также выявили на среде, содержащей 0, мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина (6,65 г воздушно-сухой массы/л среды).
Вероятно, большой объем клеток на среде, с 0,2 мг/л ИУК и 0,5 мг/л кинетина обусловлен их оводненностью.
Объем клеток, мкм?
14,0 8, Воздушно-сухая масса, г/л среды а б в 120000 12,0 7, Индекс роста 6, 10, 80000 5, 8, 60000 4, 6, 40000 3, 4, 20000 2, 2, 0 1, 0, 0,2 0,5 1 мг/л 0, 0,2 м г/л 0,5 мг/л 1 мг/л мг/л мг/л 0,2 мг/л 0,5 мг/л 1мг/л ИУК ИУК ИУК Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 1 мг/л Кинетин 1 мг/л Кинетин 1 мг/л Рисунок 4 – Влияние различных концентраций ИУК и кинетина на размеры клеток каллусной культуры ОП2ЛК шлемника байкальского на 30 сутки субкультивирования на модифицированной среде MS: а – объем клеток, б – индекс роста, в – накопление воздушно-сухой массы.
5. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI ПРИ ИНТРОДУКЦИИ И В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Содержание аскорбиновой кислоты (АК) определяли в двулетних (2004, 2005) и трехлетних (2002, 2005 гг.) растениях S. baicalensis (Рис. 5).
Установлено, что наибольшее количество свободного и связанного витамина С в растениях, выращенных через рассаду, накапливалось в листьях в фазы вегетации или бутонизации и могло достигать 182 мг/100 г сырой массы (Рис. 5 г). В условиях интродукции АК наиболее интенсивно синтезировалась на первых этапах развития генеративных побегов (Окладникова и др., 2006). В стеблях шлемника байкальского накапливалось значительно меньше АК, а максимум был приурочен к фазе бутонизации, и составлял 43,9 мг/100 г сырой массы. В корнях отмечали два максимума: в фазе бутонизации и фазе плодоношения. У двулетних растений в фазе бутонизации содержание АК было равно 21 мг/100 г сырой массы (2004 г.) и 26 мг/100 г сырой массы (2005 г.), в фазе плодоношения – 24,07 мг/100 г сырой массы и 27,9 мг/100 г сырой массы.
Вероятно, это могло свидетельствовать о накоплении этого витамина.
Сравнительный анализ двух- и трехлетних растений S. baicalensis (2005 г.) показал, что в двулетних растениях содержится не меньше витамина С, чем в трехлетних.
200 мг/ 100 г сырой массы а б в мг/100 г сырой массы мг/100 г сырой массы Содержание АК, Содержание АК, Содержание АК, 30 20 10 0 2004 2004 2005 2004 мг/ 100 г сырой массы мг/100 г сырой массы мг/100 г сырой массы 200 г д е Вегетация Содержание АК, Содержание АК, Содержание АК, 160 45 Бутонизация 30 Цветение 15 Плодоношение 0 0 2002 2005 2002 2005 Рисунок 5 – Динамика накопления АК в двулетних (2004 и 2005 гг.) и трехлетних (2002, 2005 гг.) растениях S. baicalensis: а – в листьях двулетних растений;
б – в стеблях двулетних растений;
в – в корнях двулетних растений;
г – в листьях трехлетних растений;
д – в стеблях трехлетних растений;
е – в корнях трехлетних растений Изучение динамики накопления сахаров в надземной части трехлетних растений S. baicalensis показало, что максимальное количество восстанавливающих сахаров (ВС) было приурочено к фазе цветения (Рис. 6) – 72 мг/г (2002 г.) и 68 мг/г воздушно сухой массы (2005 г.) (Рис. 6а). В стеблях ВС меньше – 30 мг/г и 24 мг/г воздушно-сухой массы в фазе бутонизации (Рис. 6 б). Максимальное содержание ВС в корнях отмечено в фазе вегетации и составляет 26 мг/г воздушно-сухой массы (Рис. 6в), а затем происходит снижение к фазе плодоношения до 12 мг/г воздушно-сухой массы.
Гидролизуемые полисахариды (ГПС) запасаются и откладываются во всех частях растений S. baicalensis в фазе плодоношения, так в листьях их содержание достигает 50 мг/г (2002 г.) или 40 мг/г воздушно-сухой массы (2005 г.) (Рис. 6 г). В стеблях ПС меньше – 33 мг/г (2002 г.) и 29 мг/г воздушно сухой массы (2005 г.) (Рис. 6д). В корнях максимальное количество ГПС составляет 34 мг/г воздушно-сухой массы (2005 г.) (Рис. 6е).
воздушно-сухой массы воздушно-сухой массы а б в воздушно-сухой массы Содержание ВС, мг/г Содержание ВС мг/г Содержание ВС, мг/г 30 0 0 2002 2005 2002 2005 г д е воздушно сухой массы Содержание ГПС, мг/г воздушно-сухой массы воздушно-сухой массы Содержание ГПС, мг/г Содержание ГПС мг/г Вегетация 45 Бутонизация 30 20 Цветение 15 10 Плодоношение 0 2002 2005 2002 Рисунок 6 – Динамика накопления восстанавливающих сахаров (ВС) и гидролизуемых полисахаридов (ГПС) в трехлетних растениях S. baicalensis: а – ВС в листьях;
б – ВС в стеблях;
в – в корнях;
г – ГПС в листьях;
д – ГПС в стеблях;
е – ГПС в корнях Качественный анализ дубильных веществ (ДВ) показал, что в лекарственном сырье S. baicalensis присутствовали преимущественно конденсированные ДВ, что согласовывалось с данными Л.М. Дьяконовой (1953). При количественном определении ДВ в пересчете на танин установили, что максимальное содержание дубильных веществ было обнаружено в корнях S. baicalensis в фазе бутонизации у двулетних (10,0 %) и трехлетних (13,0 %) растений (Рис. 7в). Содержание ДВ в фазе плодоношения согласовалось с данными Н.П. Максютиной с соавторами (1985) и составляло у двулетних растений – 2,4 %, у трехлетних растений – 4,9 %. В надземной части наибольшее содержание ДВ было отмечено в листьях у двулетних растений в фазы бутонизации (4,6 %) и цветения (5,2 %) и у трехлетних растений – в фазе бутонизации (4,6 %) (Рис. 7а). В стеблях шлемника байкальского происходит увеличение содержания ДВ к фазе бутонизации до 1,9 % (Рис. 7б).
При определении флавоноидов в S. baicalensis были использованы две методики. Обе методики показали увеличение флавоноидов в фазе цветения в листьях двулетних растений шлемника байкальского и варьировало от 8,1 % до 13,6 % и от 9,2 % до 11,7 % от воздушно сухой массы (Рис. 8 а, 8г;
9 а, 9г). У трехлетних растений максимальное количество флавоноидов в листьях отмечали в фазе бутонизации – 14,0 % и в фазе цветения – 11,5 % от воздушно сухой массы.
а б в воздушно-сухой массы воздушно-сухой массы 6% 2,5% 15% Содержание ДВ, % от Содержание ДВ, % от воздушно-сухой массы Содержание ДВ, % от 5% 2,0% 12% 4% 9% 1,5% 3% 6% 1,0% 2% 3% 0,5% 1% 0% 0,0% 0% 2 года 3 года 2 года 3 года 2 года 3 года Вегетация Бутонизация Цветение Плодоношение Рисунок 7 – Динамика ДВ в двухлетних и трехлетних растений (2005 г.) S. baicalensis: а – в листьях;
б – в стеблях;
в – в корнях 6,0 25, Суммарное содержание Суммарное содержание воздушно-сухой массы а б в 12 5, флавоноидов, % от 20, флавоноидов, % от Суммарное содержание воздушно-сухой массы 10 4, флавоноидов, % от 15, 3, 6 10, 2, 5, 1, 0 0, 0, 2001 2004 2005 2001 2004 2001 2004 Суммарное содержание воздушно-сухой массы 8,0 30, г д е Суммарное содержание воздушно-сухой массы флавоноидов, % от Суммарное содержание флавоноидов, флавоноидов, % от 25, 15 6, % от воздушно сухой массы 20, 10 4,0 15, 10, 2, 5, 0, 0 0, 2002 2004 2002 2004 2005 2002 2004 Вегетация Бутонизация Цветение Плодоношение Рисунок 8 – Динамика накопления флавоноидов S. baicalensis (методика 1, основанная на комплексообразовании флавоноидов с хлоридом алюминия (III) и стандартизации по ГСО рутина): а – в листьях двулетних особей;
б – в стеблях двулетних особей;
в – в корнях двулетних особей, г – в листьях трехлетних особей;
д – в стеблях трехлетних особей;
е – в корнях трехлетних особей Таким образом, разными методиками установили, что максимальное накопление флавоноидов в листьях шлемника байкальского было приурочено к фазам цветения и бутонизации. Содержание флавоноидов в стеблях S. baicalensis было невелико и составляло 2-5 % от воздушно сухой массы.
в воздушно сухой массы Суммарное содержание воздушно-сухую массу Сумарное содержание Суммарное содержание воздушно-сухой массы а б флавоноидов, % от флавоноидов, % от флавоноидов, % от 10 3 5 2004 2004 2004 Суммарное содержание воздушно-сухой массы 14 г д е воздушно сухой массы Суммарное содержани флавоноидов, % от 3, флавоноидов, % от Суммарное содержание воздушно-сухой массы флавоноидов, % от 2, 2, 1, 1, 2 0, 0 0, 2004 2004 2005 2004 Вегетация Бутонизация Цветение Плодоношение Рисунок 9 – Динамика накопления флавоноидов в двулетних растениях S. baicalensis (методика 2, основанная на стандартизации по ГСО байкалина): а – в листьях двулетних растений;
б – в стеблях двулетних растений;
в – в корнях двулетних растений, г – в листьях трехлетних растений;
д – в стеблях трехлетних растений;
е – в корнях трехлетних растений Определение содержания флавоноидов разными методиками сопоставимо, наблюдаются общие тенденции. Так, использование методики 1, основанной на стандартизации по ГСО рутина и комплексообразовании флавоноидов с AlCl3, показало, что в наибольшее количество флавоноидов у двулетних растений отмечалось в фазе цветения – от 19 % до 21 % от воздушно сухой массы;
у трехлетних – от 24 % до 28 % от воздушно сухой массы (Рис. 8).
Применение методики 2, основанной на стандартизации по ГСО байкалина, выявило увеличение количества флавоноидов также в фазе цветения, но у двулетних растений – 25-29 % и у трехлетних растений – 21 %. (Рис. 9). У двулетних растений, выращенных чрез рассаду, наблюдалось незначительное снижение суммарного содержания флавоноидов в фазу плодоношения по сравнению с трехлетними особями. Для трехлетних растений из посевов (2004 г.) было отмечено более низкое содержание флавоноидов в корнях, чем у рассадных растений, но характерно увеличение к фазе плодоношения до 22 %.
При изучении содержания АК в каллусной культуре S. baicalensis ОП1ЛК впервые было выявлено, что максимальное количество этого витамина отмечалось на 25 сутки субкультивирования и составляло 17,2 мг/100 г сырой массы (Рис. 10). В первые 20 суток количество этого витамина не превышало 8 мг/100 г сырой массы.
1,4% флавоноидов, % воздушно флавоноидов, мг/л среды Суммарное содержание Суммарное содержание Содержание АК мг/ а б в 1,2% 1,0% сырой массы сухой массы 0,8% 0,6% 0,4% 4 0,2% 0 0,0% 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 Сутки Сутки Сутки Рисунок 10 – Динамика накопления биологически активных веществ каллусной культуры S. baicalensis ОП1ЛК 10 субкультивирование: а – аскорбиновой кислоты, б – содержание флавоноидов, в – выход флавоноидов с 1 л питательной среды На уровень АК значительно влияли фитогормоны. Так, с увеличением уровня ИУК происходило увеличение АК в каллусной культуре шлемника байкальского ОП2ЛК с 12,0 мг/100 г сырой массы на среде с 0,2 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина до 20,5 мг/100 г сырой массы на среде с 1 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина. При повышении концентрации кинетина в среде наблюдалось снижение содержания витамина С в каллусе (Рис. 11а).
Содержание АК мг/100 г 24 2,0% а б в Суммарное содержание флавоноидов, % флавоноидов мг/л среды Суммарное содержание 1,5% сырой массы 12 1,0% воздушно-сухую массу 0,5% 4 0,0% 0 0,2 0,5 1мг/л 0,2 0,5 1 мг/л 0,2 0,5 1мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л мг/л ИУК ИУК ИУК Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,2 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 0,5 мг/л Кинетин 1 мг/л Кинетин 1 мг/л Кинетин 1 мг/л Рисунок 11 – Влияние различных концентраций ИУК и кинетина в питательной среде на накопление биологически активных веществ в каллусной культуре S. baicalensis ОП2ЛК: а – аскорбиновой кислоты, б – флавоноидов, в – выход флавоноидов с 1 литра питательной среды При изучении динамики накопления флавоноидов в каллусной культуре (ОП1ЛК) S. baicalensis, установили, что в процессе культивирования содержание флавоноидов постепенно возрастало к 30-ым суткам до 1,21 % от воздушно сухой массы (Рис. 10б, 10в). Это количество было сопоставимо с содержанием флавоноидов в стеблях интактного растения. Предполагаем, что снижение в накоплении флавоноидов и аскорбиновой кислоты на 20 сутки, возможно связано с наиболее интенсивными ростовыми процессами в этот период и уменьшением размеров клеток (Рис. 3). Исследование влияния фитогормонов на накопление флавоноидов в каллусной культуре ОП2ЛК S. baicalensis показало, что наибольшее количество флавоноидов синтезировалось в каллусе, выращенном на модифицированной питательной среде MS, содержавшей 1 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина (Рис. 11б, 11в). Таким образом, была изучена динамика накопления флавоноидов и АК, было выявлено, что накоплению этих веществ предшествовала фаза интенсивного роста. Было подобрано оптимальное сочетание фитогормонов для максимального выхода БАВ.
ВЫВОДЫ 1. В условиях юга Томской области шлемник байкальский проходит все стадии развития. Обнаружено явление снятия апикального доминирования генеративного побега. Выявлена ритмологическая, временная поливариантность агропопуции шлемника байкальского.
2. Для разновозрастных особей шлемника байкальского выявлены признаки, обладающие разными уровнями изменчивости. Низкий уровень изменчивости характерен для высоты растений и числа листовых узлов;
высокий уровень изменчивости – для числа побегов второго и третьего порядка. Установлена корреляционная зависимость между высотой генеративных побегов и числом листовых узлов;
высотой генеративных побегов и числом побегов второго порядка;
числом побегов третьего порядка и шириной листа среднего яруса;
3. Для интродуцированных растений Scutellaria baicalensis Georgi установлена акропетальная последовательность распускания цветков в пределах флоральной единицы и базипетальная для паракладиев синфлоресценции. Показан высокий процент фертильности пыльцы, который снижается с возрастом растений. С возрастом увеличиваются все показатели семенной продуктивности, что связано с увеличением числа генеративных побегов на особь и числа цветков на генеративном побеге. Эремы шлемника байкальского обладают высокой лабораторной и низкой полевой всхожестью.
Стратификация увеличивает всхожесть на 20 % относительно контроля.
4. Интенсивный синтез и накопление биологически активных веществ (аскорбиновой кислоты, сахаров, дубильных веществ, флавоноидов) в надземной массе Scutellaria baicalensis Georgi приурочен к фазе бутонизации, а в подземной – к фазе цветения. Выявлено, что содержание биологически активных веществ существенно изменяется в ходе сезонного развития.
5. Использование двулетних растений шлемника байкальского, культивируемых через рассаду, как наиболее перспективных, обусловлено их ритмологическими и морфобиологическими особенностями, высоким содержанием биологически активных веществ.
6. Получена каллусная культура шлемника байкальского из листовых эксплантов на модифицированных питательных средах. Наибольший прирост биомассы отмечен на 20 сутки субкультивирования.
7. Максимальное накопление биологически активных веществ в каллусной культуре шлемника байкальского отмечено на 25-30 сутки субкультивирования.
Этому предшествует фаза интенсивного роста. Максимальное содержание аскорбиновой кислоты, флавоноидов и высокие темпы роста каллусной культуры Scutellaria baicalensis Georgi обнаружены на среде MS, содержащей 1 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина.
По теме диссертации опубликовано 11 работ:
1. Харина Т.Г., Окладникова Н.Н., Гусева А.В. Некоторые особенности выращивания Scutellaria baicalensis Georgi в лесной зоне Западной Сибири // Тезисы молодежной Конференции «Исследования молодых ботаников Сибири», Новосибирск, февраль 2001. – Новосибирск, 2001. – С. 85-86.
2. Окладникова Н.Н., Харина Т.Г., Лещук Р.И. Накопление флавоноидов в надземной части шлемника байкальского с Сибирском ботаническом саду // Проблемы охраны растительного мира Сибири: Тезисы докладов Международного совещания. – Новосибирск, 2001. – С. 73-74.
3. Харина Т.Г., Родионова Н.Н., Лещук Р.И. Значение онтогенетических исследований для целей интродукции на примере Scutellaria baicalensis Georgi // Ботанические исследования в Азиатской России. XI Съезд Русского ботанического общества: Материалы докладов, Т.3., – Новосибирск, 2003. – С. 274-275.
4. Родионова Н.Н., Лещук Р.И., Харина Т.Г. Особенности накопления флавоноидов в шлемнике байкальском // VI Симпозиум по фенольным соединениям: Тезисы докладов:, Москва, апрель 2004. – М., 2004. – С. 77.
5. Харина Т.Г., Окладникова Н.Н., Лещук Р.И., Интродукция шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) в лесную зону Западной Сибири // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования:
Материалы VI международного симпозиума, Москва - Пущино, июнь 2005. – М.: Изд-во Российского ун-та Дружбы Народов, 2005. – С. 386-388.
6. Харина Т.Г., Окладникова Н.Н., Лещук Р.И. Морфобиологические и биохимические особенности шлемника байкальского при интродукции // Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов: Материалы международной конференции, посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В.
Цицина РАН (5-7 июля 2005 г. Москва). – М., 2005. – С. 517-519.
7. Харина Т.Г., Окладникова Н.Н. Новые нетрадиционные растения на юге Томской области // Нетрадиционное растениеводство. Энилогия. Экология. 2-й съезд селекционеров: Материалы XIV международного симпозиума, Алушта, 3-11 сентября 2005 года. – Семфирополь, 2005. – С. 300-303.
8. Окладникова Н.Н., Харина Т.Г., Лещук Р.И. Морфобиологические особенности Scutellaria baicalensis Georgi при выращивании в лесной зоне Западной Сибири // Проблемы изучения растительного покрова Сибири:
Материалы III Международной конференции, посвященной 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова Томского государственного университета Томск, 16-18 ноября 2005 года. – Томск: Изд-во Том. гос. ун-та., 2005. – С. 143-144.
9. Окладникова Н.Н., Харина Т.Г. Особенности семенной продуктивности Sсutellaria baicalensis Georgi при интродукции на юге Томской области // Флора и растительность Алтая. – 2005. – Т.10 – С. 138-139.
10. Окладникова Н.Н., Лещук Р.И., Харина Т.Г. Динамика накопления аскорбиновой кислоты, сахаров и дубильных веществ в шлемнике байкальском Scutellaria baicalensis Georgi) // Вестник Поморского университета. Серия естественных и точных наук – 2006. – № 4. – С. 27-32.
11. Окладникова Н.Н. Влияние света различного спектрального состава на накопление флавоноидов шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) // Природно-ресурсный потенциал Сибири. Интернет-конференция Российской Академии Естествознания, ноябрь, 2006. – Электронный ресурс: на сайте www.rae.ru http://academtour.net/zk/openzip.php?url=arj%2F2006%F11% Okladnikova.zip&file;=2006.11.-Okladnikova.pdf (режим доступа: свободный)