Экологические особенности ксилотрофных базидиомицетов родов laetiporus murrill и ganoderma p. karst.
На правах рукописи
Озерова Надежда Семеновна
Экологические особенности ксилотрофных
базидиомицетов родов Laetiporus Murrill и
Ganoderma P. Karst.
Специальность 03.00.24. – «Микология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2006
Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном учреждении высшего профессионального образования «Пензенская государственная сельскохозяйственная академия».
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Иванов Александр Иванович
Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук Гарибова Лидия Васильевна.
кандидат биологических наук Гордиенко Павлина Васильевна Ведущее предприятие – Пермский Государственный Педагогический университет.
Защита состоится 10 ноября 2006 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:
119992 Москва, ГСП-2, факс: (495) 939-39-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан « » октября 2006 года
Ученый секретарь диссертационного совета М.А. Гусаковская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность и практическая значимость работы.
Одним из приоритетных направлений социального развития Российской Федерации является федеральная целевая программа «Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера (2002-2006 годы)». Важным условием ее реализации является разработка и внедрение в медицинскую практику результатов научно-исследовательских работ, связанных с профилактикой заболеваний. Создание иммуномодулирующих лекарственных средств, обладающих профилактическим, антибактериальным и адаптогенным действием, позволит эффективнее обеспечивать претворение в жизнь мероприятий данной программы.
В качестве природного источника, указанных препаратов, в последнее время часто используют базидиальные макромицеты. Биологически активные вещества, обнаруженные в плодовых телах, а также культуральном мицелии данных грибов, повышают сопротивляемость организма к неблагоприятным факторам, стимулируют иммунную систему, способны регулировать кровяное давление, а также понижать содержание холестерина и сахара в крови. Кроме того, лекарственные средства на основе базидиомицетов преодолевают лекарственную устойчивость микроорганизмов, не обладают токсичностью и отрицательным побочным действием (Краснопольская, 1998). К видам, перспективным с точки зрения поиска перечисленных выше веществ, относятся некоторые представители афиллофороидных грибов, в частности трутовик серно-желтый - (Fr.) Bond. et Sing., трутовик Laetiporus sulphureus лакированный - Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) Karst. и трутовик плоский Ganoderma applanatum (Pers.) Pat., порядок Aphyllophorales s.l., Basidiomycota.
L. sulphureus характеризуется наличием в глубинном мицелии целого ряда комплекса биологически активных липофильных соединений: полиеновых жирных кислот, стероидных соединений, фосфолипидов и др. (Капитанов, 1996). Выше указанные соединения обладают антимутагенными, антиканцерогенными, иммуномодулирующими, радиопротекторными свойствами. Основными биологически активными веществами, входящими в состав биомассы грибов рода Ganoderma, являются полисахариды, обладающие противораковой активностью (Краснопольская, 1998). Из G. lucidum было изолировано более 30 биологически активных тритерпенов, которые способны стабилизировать уровень артериального давления, повышать сопротивляемость стрессу, препятствовать накоплению свободных радикалов (Бисько, Митропольская, 2001). Указанные виды грибов были использованы в качестве объектов исследования. Результаты изучения их эколого-биологических особенностей могут быть использованы в качестве теоретической основы для разработки способов их промышленного культивирования для получения биологически активных веществ. Это определяет актуальность выбранного направления исследований.
Цели и задачи исследований.
Цель настоящей работы состояла в изучении эколого-биологических особенностей L. sulphureus, G. lucidum и G. applanatum.
В ходе исследований были поставлены следующие задачи:
1. Изучить закономерности расселения рассматриваемых видов в природных условиях, их приуроченность к древесным субстратам, сроки развития базидиом и внутривидовой полиморфизм.
2. Дать оценку функциональной роли L. sulphureus, G. lucidum, G.
applanatum в лесных экосистемах Приволжской лесостепи.
3. Выявить оптимальные питательные среды для развития мицелиальных культур изучаемых видов.
4. Изучить отношение мицелиальных культур к таким экологическим факторам как температура, свет, реакция среды.
5. Определить диапазон изменчивости штаммов чистых культур по морфолого-культуральным признакам.
6. Изучить возможность поверхностного культивирования мицелиальных культур на жидкой питательной среде.
7. Выяснить возможность использования зерна пшеницы и различных отходов сельскохозяйственного производства для выращивания мицелия изучаемых видов.
Научная новизна.
Экологические особенности видов L. sulphureus, G. lucidum, G. applanatum в условиях Приволжской лесостепи ранее не изучались.
Полученные в результате исследований данные, выявили закономерности распространения, динамику плодоношения и функциональную роль рассматриваемых видов в экосистемах. Впервые изучен внутривидовой полиморфизм L. sulphureus, а также морфолого-культуральные свойства трех видов ксилотрофных базидиомицетов.
Практическая значимость.
Проведенные исследования позволили выявить оптимальные условия для развития мицелиальных культур L. sulphureus, G. lucidum, G. applanatum, особенности состава питательных сред, освещения, температуры. Полученные данные можно использовать для разработки производственных регламентов поверхностного и глубинного культивирования мицелия изученных видов.
Апробация работы.
Результаты исследований и основные положения диссертационной работы докладывались на международной конференции «Физиология растений – основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003);
на VIII молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004.);
международной научно-практической конференции «Роль почв в сохранении устойчивости ландшафтов и ресурсосберегающее земледелие» (Пенза, 2005);
всероссийской научно-практической конференции «Проблемы охраны и экологического мониторинга природных ландшафтов и биоразнообразия» (Пенза, 2006).
Публикация результатов исследования.
По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных статей.
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 121 странице текста компьютерной верстки, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, трех глав, содержащих результаты собственных исследований и выводов. Работа содержит 17 таблиц, 3 приложения и 53 рисунка, включая фотографии, диаграммы и графики. Список литературы включает источников, из них 36 – зарубежные.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Данный раздел включает анализ номенклатурного статуса L. sulphureus, описание географического распространения G. lucidum, G. applanatum, названных видов, обзор публикаций, посвященных исследованиям морфолого культуральных особенностей изучаемых видов, а также аспектам использования афиллофороидных базидиомицетов в качестве продуцентов биологически активных веществ.
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ При выполнении работы объектами исследования служили следующие виды грибов: Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond. et Sing., Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) Karst., Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. Основным материалом исследований были результаты полевых и лабораторных исследований автора.
Изучение экологических особенностей указанных видов афиллофороидных базидиомицетов осуществлялось в течение 4-х лет (2002 2005 гг.) в природных экосистемах Приволжской лесостепи маршрутным и стационарным методом. На стационарных участках наблюдения согласно методическому руководству по изучению экологии грибов (Великанов, Сидорова и др., 1980), определяли распространенность, интенсивность плодоношения изучаемых видов афиллофороидных грибов, а также обилие и общественность плодовых тел. Сбор плодовых тел проводился по общепринятым методикам. При определении видов использовали определители следующих авторов: W. Julich (1984);
А.С. Бондарцев (1953);
М.А. Бондарцева (1998). При обработке собранного материала подробно описывались характерные диагностические признаки свежих базидиом: окраска, форма шляпки, консистенция, цвет ткани, вкус мякоти, а также их возрастные изменения.
Морфолого-культуральные свойства видов изучались на кафедре биологии и экологии Пензенской государственной сельскохозяйственной академии. При этом, согласно методике А.С. Бухало (1988), устанавливали значение ростового коэффициента, выявляли оптимальную агаризованную среду для культивирования штаммов чистых культур изучаемых видов, изучали отношение к температуре, освещению и реакции среды, описывали микроморфологию мицелия чистых культур. В данных исследованиях были использованы 5 штаммов чистых культур L. sulphureus, 4 штамма G. lucidum и штамма G. applanatum, выделенных с разных мест обитания и различных пород деревьев (табл. 1).
Таблица Штаммы чистых культур, используемые в работе Штамм Плодовое тело, его Древесный Место сбора характеристика субстрат плодового тела С-3 L. sulphureus Базидиомы светло-охристой (г-5)1 Ива белая. Пойма р.Суры, окраски;
L. sulphureus (Fr.) Bond. et окр. г. Пензы Sing. forma imbricatus (Fr.) B. et G.
Поверхность шляпки охряно - Дуб Широколиственный 6 L. sulphureus желтая (г-6);
гименофор обыкновен- лес на желтовато-белый (ж-6);
мякоть на ный водораздельном изломе белая участке Окраска поверхности плодового Тополь Лесопарковая зона 5 L. sulphureus тела кремовая, (г-7) белый г. Пензы.
Поверхность шляпки - ярко Валежная Пойма р.Суры, 1 L. sulphureus оранжевая (ж-1);
ива окр. г. Пензы 28 L. sulphureus Крупное черепицеобразное Ива белая Пойма р.Суры, плодовое тело. Поверхность темно- окр. г. Пензы оранжевая (п-6);
Шляпка 25 см в диаметре. Темно- Дуб Парк Летяжевского 1-П G. lucidum фиолетовая шляпка и обыкновен- санатория, эксцентрическая темно-коричневая ный Аркадонского р-на, ножка. Саратовской области Не известно Дуб обыкн. Кавказ 1 G. lucidum Не известно Не известно Корея 3 G. lucidum Не известно Дуб обыкн. Московская область 6 G. lucidum Пень дуба Широколиственный Шляпка светло-коричневой окраски.
Возраст, приблизительно 7 лет. обыкновен- лес на G. applanatum ного водораздельном уч-ке Шляпка темно коричневой Валежный Широколиственный окраски, Возраст, 3 года ствол лес на G. applanatum лещины водораздельном уч-ке обыкн.
Характеристика окраски дается по шкале цветов А.С. Бондарцева (1953).
При изучении влияния экологических факторов на скорость роста мицелиальных культур в культуре использовались линейные методы измерения. Замеры производились с интервалом в 2-3 дня до полного обрастания субстрата мицелием. Затем производился расчет средней скорости роста мицелия (мм/сут). Для установления влияния температурного фактора на жизнедеятельность грибов их культивировали на картофельно-глюкозном агаре (КГА) при температурах: +100С;
+230С;
+350С. Для изучения влияния света на рост и развитие мицелиальных культур, колонии, выращенные на КГА, помещали в следующие условия: полная темнота;
освещенность в течение двенадцати часов в сутки;
круглосуточное освещение. Для выяснения влияния разной концентрации ионов водорода в среде на рост и развитие мицелиальных культур использовали КГА с разными значениями рН (Давыдкина, 1980).
Культуры инкубировали в термостате при +240С. Все опыты проводили в 3-х кратной повторности.
При изучении накопления биомассы мицелия, культуры выращивали поверхностно в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде (среда Чапека) (Давыдкина, 1980). Инкубирование осуществлялось в термостате при +24 C в течение тридцати суток. Затем отделяли мицелиальную пленку от жидкости, высушивали ее на воздухе и определяли воздушно-сухую массу мицелия. Опыт проводили в 3-х кратной повторности.
Наличие целлюлаз определяли путем выращивания культур на фильтровальной бумаге с добавлением среды Чапека (Дудка, Вассер, 1982).
Повторность опыта 3-х кратная.
Для культивирования видов на органических субстратах использовали отваренное зерно пшеницы, подсолнечную лузгу, соломенную резку, дубовые опилки и их следующие сочетания: соломенная резка 70% + подсолнечная лузга 30%;
соломенная резка 60% + дубовые опилки 40%;
подсолнечная лузга 50%+ дубовые опилки 50%;
соломенная резка 60%+ подсолнечная лузга 20% + дубовые опилки 20%.
Математическую обработку данных проводили по общепринятым методикам (Рокицкий, 1967), Наименьшую существенную разницу (НСР) рассчитывали используя программу составленную по методике Б.А. Доспехова (1985).
III ЭКОЛОГИЯ ИЗУЧАЕМЫХ ВИДОВ АФИЛЛОФОРОИДНЫХ ГРИБОВ 3.1. Экологические особенности Laetiporus sulphureus.
L. sulphureus в районе исследований обитает на древесине следующих видов деревьев: дуб обыкновенный (Quercus robur), ива белая и ломкая (Salix alba, S. fragilis), реже тополь белый (Populus alba) и ясень обыкновенный (Fraximus excelsior). Продолжительность, образование и обилие плодовых тел данного вида зависят от погодных условий, а основными лимитирующими факторами данных процессов являются температура и влажность места обитания. Сезонную динамику развития базидиом L. sulphureus отражает рис. 1, на котором показано, что у изучаемого вида наблюдается два периода массового образования и активного развития базидиом.
2002 г.
2003 г.
Количество 2004 г.
плодовых тел (шт) 30 2005 г.
L. sulphureus в возрасте 1-2 сут.на 1 га.
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 май июнь июль август сентябрь октябрь ноябрь Месяцы (декады) Рис. 1. Сезонная динамика плодоношения L. sulphureus в условиях района исследований Первый период длится с мая по июнь, второй - с августа по октябрь.
Погодные условия в указанное время характеризуются высокой относительной влажностью воздуха (65%) и среднесуточной температурой +21-230С. При +250С повышении температуры выше (июнь-июль) плодоношение прекращается и возобновляется при ее снижении и обилии осадков. При оптимальных условиях продолжительность развития базидиом L. sulphureus составляла 20 – 26 суток, причем, с возрастом заметно увеличивалась их масса, менялась форма, окраска, консистенция и вкус. Окончание развития плодовых тел данного вида чаще всего было связано с разрушением и поеданием их массы насекомыми и слизнями. Таким образом, образуя значительную биомассу плодовых тел, рассматриваемый вид имеет важное экологическое значение, являясь звеном пищевой цепи.
Выявлено предпочтение данным видом перестойных насаждений, где деревья имеют диаметр стволов более 50 см. На таких деревьях базидиомы L. sulphureus были значительно крупнее и состояли из нескольких массивных шляпок, черепицеобразно соединенных у основания. На деревьях, диаметром 25-30 см, плодовые тела были одиночными и небольших размеров. На иве белой, в пойме р. Суры, была обнаружена разновидность L. sulphureus, которая Г. Бурдо и А. Гальзеным определялась как Polyporus imbricatus (Fr.) B. et G.
А.С. Бондарцев (1953) рассматривает данный таксон, как разновидность Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond. et Sing. forma imbricatus B. et G. В ходе изучения морфолого-культуральных свойств мицелиальной культуры Laetiporus sulphureus forma imbricatus было установлено, что данная разновидность имеет ряд особенностей, а именно светлую окраску колонии и медленный рост мицелия. Таким образом, можно предположить, что это четкий внутривидовой таксон. Однако эта проблема требует дальнейшего изучения, так как одна находка не дает оснований для подобных выводов.
Было установлено, что заражение L. sulphureus является одной из главных причин отмирания старых деревьев ивы и дуба, так как под действием ферментативного комплекса гриба развивается бурая гниль древесины, что делает ее очень хрупкой и обуславливает дальнейшее разламывание стволов деревьев под действием ветра.
3.2.Экологические особенности Ganoderma lucidum.
G. lucidum является редким видом для лесостепи правобережного Поволжья. Вид был обнаружен только на древесине дуба обыкновенного. Было выяснено, что период развития плодовых тел G. lucidum на изучаемой территории начинается в конце августа и продолжается до середины сентября (25-28 сут.). В Пензенской области G. lucidum был отмечен двумя находками.
Найденные плодовые тела отличались малыми размерами. Диаметр шляпки не превышал 10 см. Вероятно, это объясняется малым диаметром пня (30 - 35 см) на котором они были обнаружены. В Саратовской области наблюдения за плодоношением G. lucidum проводили в искусственно посаженной дубраве (Иванов, 2002). В указанном районе исследований, базидиомы были обнаружены у основания ствола усыхающего дерева дуба (диаметр = 52 см), возраст которого был более 100 лет. Обнаруженные плодовые тела характеризовались большими размерами шляпок, достигающих 15 - 25 см в диаметре. Ножки имели длину от 10 до 15 см, соответственно размеру шляпки.
Как видно из выше изложенного материала, масса и размер базидиом G. lucidum зависели от диаметра ствола пораженного дерева.
3.3. Экологические особенности G. applanatum.
G. applanatum в районе исследований является мало распространенным видом. Его плодовые тела наблюдались, в большинстве случаев, в поймах рек, смешанных лесах на сухостое, валеже и пнях таких деревьев, как дуб обыкновенный, ива белая, ива ломкая, реже - береза бородавчатая (Betula verrucosa), ясень обыкновенный (Fraximus excelsior) и лещина обыкновенная (Corylus avellana). Для изучения биологии размножения и распространения исследовалась общая продукция спор и динамика G. applanatum спорообразования данного вида. На изучаемой территории освобождение базидиоспор G. applanatum начиналось обычно в конце июля и продолжалось в течение месяца или более, в зависимости от погодных условий в исследуемый год. Выяснилось, что оптимальными для данного процесса являются высокая относительная влажность (65 %) и среднесуточная температура +18-200С.
IV МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР ИЗУЧАЕМЫХ ВИДОВ АФИЛЛОФОРОИДНЫХ ГРИБОВ 4.1. Морфолого-культуральные особенности штаммов чистых культур L sulphureus. В результате изучения линейной скорости роста мицелиальных культур L sulphureus на разных агаризованных питательных средах самый активный рост культуры был выявлен на КГА, где средняя скорость роста штаммов варьировала от 4,77 до 8,82 мм/сут. Менее интенсивно осваивалась среда из отвара пшеницы. Добавление в агаризованные питательные среды дубовых опилок способствовало значительному повышению скорости роста лишь у одного штамма, другие оказались менее отзывчивыми. Сусло - агар (СА) оказался наименее благоприятной средой для роста мицелия данного вида, скорость роста мицелия при этом составляла от 2,05 до 6,49 мм/сут.
Учитывая ростовые коэффициенты штаммов L. sulphureus, из них можно было выделить 2 группы: быстрорастущие и медленнорастущие. Необходимо отметить, что наибольшими ростовыми характеристиками обладали штаммы, выделенные из яркоокрашенных плодовых тел, что указывает на возможную корреляцию между жизненной активностью грибного организма и количественным содержанием пигмента в нем. Медленнорастущий штамм был выделен из светлоокрашенного плодового тела, найденного на иве белой и относящегося к одной из разновидностей трутовика серно-желтого - Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond. et Sing. forma imbricatus B. et G.
Колонии всех штаммов L. sulphureus по классификации Дж. Сталперс (Stalpers, 1978) относились к порошковидному типу без ясно выраженной концентрической зональности, с неровными краями. Следует подчеркнуть, что штаммы, выделенные из более пигментированных плодовых тел, отличались и значительно большей пигментацией мицелия. Микроморфология штаммов также имела небольшие отличия, но в целом она характеризовалась наличием тонкостенных узких гиф и отсутствием пряжек. На КГА, у наиболее пигментированного и быстрорастущего штамма (штамм 28), на концах некоторых гиф наблюдались булавовидные утолщения с более плотными стенками, определенные нами как терминальные хламидоспоры.
В ходе изучения влияния экологических факторов на рост и развитие штаммов чистых культур L. sulphureus, было установлено следующее:
1) температурный оптимум составляет от +230 до +250С (рис. 2);
1, температура 30 С Штамм 6 4, 1, 2, температура 23 С Штамм С-3 4, 1, 2, температура 15 С Штамм 1 7, 3, 2, Штамм 28 8, 3, 1, Штамм 5 4, Скорость роста, мм/сут 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 2 Скорость роста штаммов L. sulphureus (мм/сут) при разной температуре культивирования 2) наиболее активный рост штаммов L. sulphureus имеет место при отсутствии освещения;
3) наиболее интенсивный рост большинства штаммов отмечается на средах с рН 4,5 (до 12,2 мм/сут), слабый рост мицелия штаммов наблюдается на среде с рН 7,4 (минимальное значение 3,5 мм/сут).
При поверхностном культивировании на жидкой питательной среде L. sulphureus в течение тридцати суток накопление массы мицелия было незначительным и составляло 0,2 г. При этом мицелий L. sulphureus был порошкообразным, рыхлым, низкой плотности, желтой окраски, с короткими гифами и после высушивания уменьшался в объеме и распадался на отдельные комочки.
В последние годы высшие базидиомицеты особенно интенсивно изучают с целью поиска среди них продуцентов ферментов, пригодных для использования в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и т.д. вызывает бурую гниль древесины и следовательно L. sulphureus характеризуется целлюлозолитической активностью (Бондарцев, 1953). Наши исследования в данном направлении показали, что штаммы чистых культур L. sulphureus слабо разрушают целлюлозный субстрат (фильтровальная бумага).
Масса фильтровальной бумаги уменьшилась в среднем на 4,96 %. Наиболее активными деструкторами целлюлозы были быстрорастущие и более пигментированные штаммы L. sulphureus.
4.2. Морфолого-культуральные особенности мицелия штаммов чистых культур G. lucidum. Исследования показали, что штаммы чистых культур G. lucidum наиболее активно росли на КГА. Необходимо отметить высокую скорость роста штамма, выделенного из плодового тела, найденного на территории Саратовской области (штамм 1-П). В результате такого отличия, его отнесли к быстрорастущим (ростовой коэффициент равен 184), а остальные, используемые в работе штаммы (штаммы 1, 3, 6) к медленнорастущим.
Мицелиальные культуры исследуемых штаммов G. lucidum отличались друг от друга. Их подробное описание и фотодокументация представлены в работе. Микроморфологические признаки штаммов данного вида также были различны. При микроскопическом изучении штамма 1-П были выявлены интересные особенности: пряжки у данного штамма встречались редко;
анаморфы, присущие другим штаммам G. lucidum, не были обнаружены ни в период развития, ни во время хранения культуры;
в первые дни культивирования на агаризованной среде мицелий был многоядерный.
Указанные отличия в микроморфологии, вероятно, объясняют его быстрый рост в культуре. Как было показано в разделе 3.2., штамм 1-П характеризовался и некоторыми морфологическими особенностями плодового тела, из которого он был выделен. Плодовое тело достигало диаметра 25 см, а ножка была длиной 15 см. Возможно, штамм 1-П, в силу своих особенностей, представляет внутривидовой таксон. Однако эта проблема требует дальнейшего изучения.
При изучении влияния температуры на рост мицелия чистых культур G. lucidum, штаммы 1, 6 и 1-П показали максимальную скорость роста при температуре +250С, которая составила 5,9;
6,2 и 21,4 мм/сут соответственно.
Относительно отношения к температурному фактору штамм 3 отличался от всех, так как оптимальной для него оказалась температура +320С, скорость роста при этом составила 12,2 мм/сут. По-видимому, это связано с тем, что для роста этого штамма G. lucidum необходимы более теплые регионы, где он встречается наиболее часто.
Круглосуточное освещение оказывало ингибирующее воздействие на рост мицелия данного вида.
При выращивании G. lucidum на КГА с разными показателями рН, наиболее благоприятной для большинства штаммов оказались кислая (рН 4,5) среда (рис. 3).
рН 4, 22 20, 19, pH 6, скорость pH 7, 11, роста 10, 8, (мм/сут) 7,1 6, 6,2 5,9 5,4 5, 1-П 1 3 штаммы Рис. 3 Скорость роста штаммов G.lucidum на средах с различными значениями рН (НСР0,05 для штаммов: 1-П = 1,3, 1 = 0,26, 3 = 2,27;
6 = 0,03) Штамм 3, в отличие от всех, показал наибольшую скорость роста (11, мм/сут) на слабо кислой среде (рН 6,2). Необходимо отметить отличие данного штамма, выделенного из плодового тела собранного на Кавказе, от остальных, при изучении влияния экологических факторов на его морфолого культуральные свойства.
Штаммы чистых культур G. lucidum при выращивании на жидкой питательной среде показали активный рост в течение всего периода исследований. При этом, наиболее интенсивное накопление биомассы было характерно для штамма 1-П. Средняя масса мицелиальной пленки данного штамма при культивировании на жидкой питательной среде в течение тридцати суток составила в среднем 0,88 г. С целью изучения стимуляции роста и накопления биомассы на жидкой питательной среде мицелия G. lucidum в среду вводили различные микроэлементы в виде солей, взятых в концентрации 10- г/л. Действие микроэлементов на развитие мицелия изучаемого вида оказалось различным (табл. 2).
Таблица Воздушно-сухая масса мицелия штамма 1-П G. lucidum (г), выращенного на жидкой питательной среде с добавлением солей в концентрации 10-5 г/л Действие солей в концентрации 10-5 г/л.
Контроль НСР0, K2Ge5O11 Na2SeO4 KMnO4 CuSО4 ZnSO 0,88 1,67 0,82 0,92 0,33 0,69 0, Изменение по отношению +89,8 % -6,8 % +4,5 % -62,5% -21,6% к контрольному варианту Из всех изучаемых микроэлементов наибольшее стимулирующее действие оказал германий, при этом показатели биомассы были выше, чем в контрольном варианте на 89,8 %. Небольшое увеличение массы мицелия G. lucidum наблюдалось при добавлении в питательную среду марганца.
Действие других исследуемых микроэлементов было или нейтральным (селен), или отрицательным.
При изучении целлюлозолитической активности чистых культур G. lucidum выяснилось, что штаммы резко отличаются по данному признаку.
Указанный вид в естественных условиях вызывает белую гниль древесины, что предполагает наличие лигнолитических ферментов. Однако, штаммы 3 и 1-П активно росли на целлюлозном субстрате (фильтровальная бумага) и показали способность к его разрушению, таким образом подтверждается наличие целлюлозолитических ферментов у данного вида.
4.3. Морфолого-культуральные особенности мицелия штаммов чистых культур G. applanatum. Штаммы G. applanatum показали сходные ростовые характеристики на КГА и СА. Резкое отличие в росте между ними наблюдалось только на пшеничном агаре с добавлением опилок (8,2 и 5, мм/сут). Средний ростовой коэффициент штаммов данного вида на КГА при температуре +250С был равен 40,5, что характеризует вид G. applanatum в культуре как медленнорастущий. Штаммы чистых культур данного вида характеризовались колониями войлочного типа с неровными краями и разной степенью концентрической зональности. Мицелий был очень плотным, что затрудняло его разделение при пересевах.
В отличие от других изучаемых штаммов афиллофороидных грибов, мицелий G. applanatum, при выращивании на агаризованных питательных средах на поверхности колонии образовывал маленькие узелки, предполагаемые примордии. Со временем эти образования приобретали коричневую окраску и останавливались в своем развитии. Микроморфология штаммов чистых культур G. applanatum характеризовалась толстостенными, слабоветвящимися гифами с крутоизогнутыми, часто встречающимися, пряжками.
Влияние экологических факторов на морфолого-культуральные свойства штаммов чистых культур G. applanatum было следующее:
1) оптимальная температура культивирования +250С;
2) наличие ингибирующего действия круглосуточного освещения;
3) наиболее активный рост на слабокислой (рН 6,2) среде (8,2-10,5 мм/сут).
Необходимо отметить, что на кислых и слабокислых средах примордии в виде маленьких узелков на поверхности колонии преобразовывались через четырнадцать суток после посева в короткие (0,1-0,3 см) шиповидные образования.
При поверхностном культивировании штаммов G. applanatum на жидкой питательной среде в течение тридцати суток накопление массы мицелия характеризовалось средними показателями и составляло в среднем 0,61 г.
Мицелиальная пленка толщиной 2 мм после извлечения была очень плотной, а после высушивания незначительно уменьшалась в объеме и становилась хрупкой.
При выявлении целлюлозолитической активности у штаммов G. applanatum не наблюдалось роста и развития мицелия на целлюлозном субстрате, что, вероятно, объясняется экологическими особенностями вида.
G. applanatum в естественных условиях вызывает белую гниль древесины, т. е.
использует в качестве источников питания лигнин.
V КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗУЧЕННЫХ ВИДОВ ГРИБОВ НА РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ В ходе лабораторных исследований выяснилось, что использование отваренного зерна пшеницы в качестве субстрата для получения посевного мицелия изучаемых видов подходит только для L. sulphureus и G. lucidum.
Скорость роста последнего превышала показатели других видов на данной среде в среднем в полтора раза. Мицелий G. applanatum в процессе роста на отваренном зерне пшеницы сильно уплотнялся, что затрудняло дальнейший пересев мицелиальной культуры и не допускало использование данного субстрата для выращивания посевного мицелия G. applanatum.
Для изучения особенностей культивирования видов афиллофороидных грибов на органических субстратах были взяты: измельченная солома пшеницы, подсолнечная лузга, дубовые опилки и их сочетания. Выяснилось, что исследуемые виды по-разному осваивали указанные субстраты (рис. 4).
L. sulphureus 18 G. lucidum 15, G. lipsiense 16 14, 13,5 13,4 13, скорость роста мм/сут 11,8 11, 12 10, 10, 10, 9,1 9, 9,8 9, 8, 8,4 8, 7, 6 2, 3, 1, солома лузга опилки солома, солома, солома, лузга, лузга опилки лузга, опилки опилки Рис. 4 Скорость роста (мм/сут) изучаемых видов афиллофоровых грибов на различных органических субстратах Лучшим субстратом из отходов растениеводства для L. sulphureus можно считать подсолнечную лузгу, а для G. lucidum и G. applanatum - солому пшеницы, что, вероятно, связано со специфическим для каждого вида набором ферментов. Самый медленный рост у всех изучаемых видов наблюдался на субстрате из дубовых опилок. При их выращивании на средах комбинированных из разных органических субстратов увеличение скорости роста не наблюдалось, что показало нецелесообразность их использования.
Образование примордиев наблюдалось только у G. applanatum, причем это происходило на всех исследуемых органических субстратах, за исключением дубовых опилок.
ВЫВОДЫ 1. В районе исследований изучаемые виды грибов связаны с древесиной следующих видов деревьев: L. sulphureus - с древесиной дуба обыкновенного, ивы белой и ломкой, реже тополя белого и ясеня обыкновенного;
G. lucidum - с древесиной дуба обыкновенного;
G. applanatum - с древесиной дуба обыкновенного, ивы белой и ломкой, реже ясеня обыкновенного, лещины обыкновенной и березы бородавчатой.
2. Формирование плодовых тел L. sulphureus приходится на период с конца мая по середину июня и с середины августа по ноябрь. Ритм плодоношения в разные годы неодинаков, что обусловлено гидротермическими условиями. Оптимальным среднесуточным температурным диапазоном для формирования базидиом этого вида является +21-230 С.
3. Установлена прямая корреляция между размерами плодовых тел L. sulphureus и G. lucidum и диаметрами стволов пораженных деревьев.
4. Изученные виды играют определенную роль в лесных экосистемах Приволжской лесостепи: является широко L. sulphureus распространенным видом, способствует естественному отмиранию старых деревьев дуба и ивы;
G. applanatum относится к числу мало распространенных видов, является активным деструктором сухостоя и валежа.
5. Штаммы чистых культур L. sulphureus, а также G. lucidum при выращивании на агаризованных средах разделились на группы быстрорастущих и медленнорастущих. Быстрорастущие штаммы L. sulphureus были выделены из ярко окрашенных, а медленнорастущие из светлоокрашенных плодовых тел.
6. Для большинства штаммов изученных видов оптимальной температурой роста мицелия в чистой культуре является +250С, а оптимальным интервалом значений рН среды являются 4,5 - 6,2.
Освещение в течение двенадцати и двадцати четырех часов в сутки оказывает ингибирующее действие на рост мицелиальных культур всех изученных видов.
7. При добавлении некоторых микроэлементов в жидкую питательную среду, где поверхностно культивировался заметное G. Lucidum, стимулирующее действие оказал германий.
8. Лучшим субстратом для выращивания посевного мицелия L. sulphureus и является зерно пшеницы. Для искусственного G. lucidum культивирования рекомендуется использовать L. sulphureus подсолнечную лузгу, а для G. lucidum и G. applanatum – солому пшеницы. Данные субстраты могут быть рекомендованы для биотехнологических целей.
Автор выражает сердечную благодарность д.б.н. А.И. Иванову за внимательное руководство, а также Г.В. Ильиной, С.А. Сашенковой, Д.Ю.
Ильину за поддержку и помощь в проведении работы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Козырева Н.С., Сашенкова С.А., Блинохватов А.Ф., Иванов А.И. Влияние соединений селена на мицелиальные культуры трутовых грибов // Физиология растений – основа фитобиотехнологии. Материалы международной конференции. Пенза, 2003. – С. 179-180.
2. Сашенкова С.А., Ильина Г.В., Козырева Н.С., Иванов А.И. Рост и морфологические особенности мицелия чистых культур трутовика серно-желтого (Laetiporus sulphureus (Bull.:Fr.) Murrill ) в зависимости от условий культивирования // Материалы международной научно практической конференции. Минск, 2004. - С.56-58.
3. Озерова Н.С. Рост и морфологические особенности мицелия трутовика серно-желтого Laetiporus sulphureus в зависимости от культивирования // Материалы VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге.
– СПб, СПГУТД, 2004. – С. 70 - 71.
4. Сашенкова С.А., Ильина Г.В., Озерова Н.С., Иванов А.И. Эколого биологические особенности трутовика серно-желтого (Laetiporus sulphureus (Bull.:Fr.) Murrill) на основе изучения его мицелиальных культур // Микология и фитопатология, 2005. - Т. 37. - Вып. 3. – С.14-19.
5. Озерова Н.С. Экологические особенности трутовика серно-желтого Laetiporus sulphureus (Bull.:Fr.) Murrill в условиях Пензенской области // Материалы международной научно-практической конференции. Пенза, 2005. - С. 311-313.
Озерова Н.С., Иванов Д.В., Иванов А.И. Трутовик серно-желтый 6.
(Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond. et Sing.) в лесных экосистемах лесостепи правобережного Поволжья // Проблемы охраны и экологического мониторинга природных ландшафтов и биоразнообразия: сборник статей Всероссийской научно-практической конференции. – Пенза: РИО ПГСХА, 2006. – С.74-76.