Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. роль лигандов в стабилизации их структуры
На правах рукописи
СТЕПАНЕНКО
Ольга Викторовна
ФОЛДИНГ ЛИГАНД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ПЕРИПЛАЗМЫ
БАКТЕРИЙ. РОЛЬ ЛИГАНДОВ В СТАБИЛИЗАЦИИ ИХ СТРУКТУРЫ
03.00.03 – Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2008 3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Процессы разворачивания–сворачивания белков, их ус тойчивость к действию химических денатурантов и нагреванию, структура и механизмы об разования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интен сивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира. Актуальность этих исследований обусловлена как их значимостью для решения фундаментальной пробле мы фолдинга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в де натурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины [1-6] и биотехнологии [3, 7-8]. Специфическая ассоциация, приводящая к образо ванию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых “кон формационных болезней”), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркин сона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативных рекомбинантных белков.
К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга–рефолдинга не больших мономерных белков. Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени. В свя зи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежа щих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотакси са и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий. В настоящей работе объек тами исследования стали глутамин-связывающий белок и D-галактоза/D-глюкоза связывающий белок из Escherichia coli. Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и сахаров. Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурах;
[9]) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больных;
[10]). Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении процессов сворачива ния–разворачивания глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка. В задачи работы входило:
1. Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl);
2. Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатура ции глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний;
3. Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl обратимой;
4. Исследование роли лигандов – глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и D глюкозы и иона кальция, в случае D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка – в стабили зации структуры этих белков к денатурирующему действию GdnHCl и нагревания.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Связывание лиганда стабилизирует структуру лиганд-связывающих белков и делает про цесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания бел ка и число возникающих при этом промежуточных состояний.
2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу “все или ничего”, при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих состояний является со стоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией мо лекул глутамин-связывающего белка.
3. Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначи тельно.
Научная новизна исследований. Результаты исследования процессов разворачивания– сворачивания глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка, получены впервые. Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глу тамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание D-галактоза/D глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl. Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию GdnHCl и нагреванию, но и делает процесс денатурации более кооперативным. Впервые охарактеризо вана стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса.
Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и D-галактоза/D-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресцен ции при этом изменяются незначительно. Сделано заключение о том, что собственная флуо ресценция D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в ка честве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для неинвазивного опре деления содержания сахара в крови больных диабетом. Тем не менее, существенные измене ния пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток – донора и акцептора энергии возбуждения.
На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины вол ны возбуждающего света. Предложен метод учета этого эффекта.
Теоретическое и практическое значение работы. Новые данные о процессах свора чивания–разворачивания глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубо кого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их струк туры к действию различных химических денатурантов и нагреванию. Эти данные сущест венны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков.
Данные о характере процессов сворачивания–разворачивания глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое зна чение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара.
Существенной методической разработкой является установление того факта, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и конформационных изме нений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофа новых остатков, на составляющие.
Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 8-й междуна родной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), III Съезде биофи зиков России (Воронеж, 2004), итальянской конференции по биохимии (Италия, Витербо, 2004), XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломо носов-2007” (Москва, 2007), 12-й Европейской конференции по спектроскопии биологиче ских молекул (Бобиньи, Франция, 2007) и 4-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах” (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубеж ных рецензируемых журналах, 2 статьи в сборниках, а также тезисы 7 докладов на всерос сийских и международных конференциях и съездах.
Финансовая поддержка работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Рос сийского фонда фундаментальных исследований (проект 06-04-48231), INTAS (грант 01 2347), Программы РАН “Молекулярная и клеточная биология”, Программы “Ведущие науч ные школы РФ” (НШ-9396.2006.4;
НШ-1961.2008.4), администрации Санкт-Петербурга (грант 02/2.6/15-03/39) и Фонда содействия отечественной науке по программе “Лучшие ас пиранты РАН”. Работа проводилась с использованием оборудования ЦКП “Материаловеде ние и диагностика в передовых технологиях”.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выво дов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 179 наименований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Препараты глутамин-связывающего белка (GlnBP) из Escherichia coli и D галактоза/D-глюкоза-связывающего белка (GGBP) из Escherichia coli предоставлены проф.
Д'Ауриа (Институт биохимии белка, Неаполь, Италия). Белки GlnBP и GGBP из Escherichia coli были получены и очищены согласно известным методикам [9, 11]. Эксперименты вы полнены при концентрации растворов белков 0.1 – 0.3 мг/мл. Для образования комплекса бе лок – лиганд в раствор белка добавляли Glc и Gln в концентрации 10-3 – 10-2 М.
Препараты D-глюкозы и L-глутамина (Sigma, США), гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) и 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС) (Serva, США) использо вали без дополнительной очистки. При отщеплении иона кальция использовали раствор мМ ЭДТА фирмы Fluka (Швейцария). Во всех экспериментах с GGBP использовали 10 мМ TrisHCl буфер (pH 7.4), при работе с GlnBP – 10 мМ TrisHCl буфер (рН 8.5).
Анализ пространственной структуры белка. Свойства микроокружения и локализа цию триптофановых и тирозиновых остатков в GGBP и GlnBP и в их комплексах с лиганда ми анализировали с использованием данных о пространственной структуре белков, содер жащейся в PDB [12]: GGBP (файл 2FW0.ent;
[13]), GGBP/Glc (файл 2GBP.ent;
[14]), GlnBP (1GGG.ent;
[15]) и GlnBP/Gln (1WDN.ent;
[16]). Микроокружение триптофановых и тирози новых остатков определяли как совокупность атомов, расположенных на расстоянии менее r от геометрического центра индольного или фенольного кольца;
r0 принято равным 7 [7].
Выявляли атомы микроокружения, ближайшие к каждому атому индольного или фенольного кольца и расстояние между ними. Плотность упаковки атомов в микроокружении определя ли как число атомов, входящих в микроокружение, или как отношение объема, занимаемого атомами микроокружения, к общему объему сферы с радиусом 7. Объем, занимаемый атомами, определяли на основании известных Ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов, причем учитывали лишь ту часть объема, которая входит в сферу радиуса 7. Реальный объем, за нимаемый атомами, несколько меньше, так как атомы участвуют в образовании химических связей. Тем не менее, для целей данного анализа это не имеет существенного значения. Эф фективность безызлучательного переноса энергии рассчитывали согласно Ферстеру [17-21].
Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметриче ских установок собственного изготовления [22]. Спектры флуоресценции измеряли при воз буждении светом с длинами волн 280 и 297 нм. Для характеристики положения спектров флуоресценции использовался параметр А = I320/I365 (I320 и I365 – интенсивности флуоресцен ции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, соответственно;
см.: [23]). Спектры флуо ресценции и параметр А корректировали на спектральную чувствительность установки. Рав новесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белков от концентрации GdnHCl измеряли после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентра ции при 4 °С в течении 24 ч. Концентрацию GdnHCl определяли рефрактометрически [24] с помощью рефрактометра Аббе (ЛОМО, Россия). Все флуоресцентные измерения были вы полнены с использованием микрокювет (101.016-QS 5 5 мм;
Hellma, Германия). Термоди намические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [25].
Вклад тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка рассчитывали с по мощью выражения:
,Tyr = (I I 365 )280 (I I 365 ) Анизотропию флуоресценции [26-27] определяли, используя соотношение:
r = ( I V GI H ) /( I V + 2GI H ) V V V V V V где I V и I H – вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом, G – коэффициент, характеризующий различие чувствительности приемной системы установки к вертикально и горизонтально по ляризованному свету ( G = I VH / I H ).
H Интенсивность флуоресценции гидрофобного зонда АНС регистрировали при возб = 365 нм и рег = 480 нм.
Равновесные и кинетические зависимости интенсивности флуоресценции анализирова ли с помощью метода, основанного на параметрическом представлении двух независимых экстенсивных характеристик системы. В качестве параметра выступала концентрация дена турирующего агента или время, прошедшее после смешения раствора белка и GdnHCl. Этот подход был впервые предложен в работах [28-29] и использовался в нашей лаборатории для изучения процессов сворачивания–разворачивания и доказательства существования проме жуточных состояний для ряда белков [30-34], в том числе при изучении данных кинетиче ских экспериментов, когда в качестве параметра выступает время после перевода белка в раствор денатуранта соответствующей концентрации[35-37]. В последние годы этот метод широко используется исследователями других лабораторий [38-39].
Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции. Измерение кривых затуха ния флуоресценции проводили на импульсной спектрофлуориметрической установке Инсти тута цитологии РАН [22]. Кривые затухания флуоресценции анализировали в мультиэкспо ненциальном приближении. Расчет проводили по методу наименьших квадратов с использо ванием алгоритма минимизации Маркуардта [40]. В качестве эталона использовали растворы р-терфенила в этиловом спирте или водный раствор N-ацетилтриптофанамида [41].
Круговой дихроизм. Измерение спектров КД проводили на спектрополяриметре J- (Jasco, Япония). Концентрация белка составляла 0.3 мг/мл. Для измерения спектров КД в дальней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 мм, из мерение проводили в области 250 – 190 нм с шагом 0.1 нм. Для измерения спектров КД в ближней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, из мерения проводили в области 340 – 250 нм с шагом 0.1 нм. Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3 – 5 раз и полученные данные усредняли. Спек тры КД белков построены с учетом КД соответствующего буферного раствора.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глутамин-связывающий белок (GlnBP) и D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia.coli относятся к обширной группе лиганд-связывающих белков, со держащихся в периплазме бактерий. Основная функция этих белков заключается в связыва нии различных биологически-активных молекул (сахаров, аминокислот, пептидов и т.д.) и неорганических ионов для их транспорта в клетку. Хотя белки этой группы существенно различаются по размеру и аминокислотной последовательности, все они имеют сходную пространственную структуру: два глобулярных домена связаны шарнирной областью, обра зованной двумя или тремя пептидными сегментами, в щели между доменами расположен лиганд-связывающий центр. Связывание субстрата приводит к большим структурным изме нениям в молекуле белка (рис. 1).
Рис. 1. Пространственная структура GGBP (а) и комплекса GGBP/Glc (б), GlnBP (в) и комплекса GlnBP/Gln (г).
Показана локализация триптофановых (красные) и тирозиновых (синие) остатков. Молекула связанного лиганда, D-глюкозы в случае GGBP/Glc (б) и Gln в случае GlnBP/Gln (г), изображена в зеленом цвете. На панелях а и б в структуре GGBP и GGBP/Glc изображен атом Ca2+ (желтый) и аминокислотный остаток Phe 16 (фиолетовый), участвующий в связывании D-глюкозы. На панелях в и г в структуре GlnBP и GlnBP/Gln показан аминокислотный остаток Lys 166 (фиолетовый), входящий в состав микроокружения Trp 220 этого белка. Для построения изображений использовали графические программы VMD [42] и Raster 3D [43]. Рисунок создан на основании данных банка белковых структур [12], файлы 2FW0.ent [13], 2GBP.ent [14], 1GGG.ent [15], и 1WDN.ent [16].
Спектральные свойства GGBP и GlnBP и их комплексов с лигандами Спектр триптофановой флуоресценции GlnBP в нативном состоянии представляет ши рокую бесструктурную полосу с максимумом при длине волны 332 нм. При связывании Gln максимум флуоресценции сдвигается в коротковолновую область лишь на 1–2 нм. Сравни тельный анализ микроокружения триптофановых остатков GlnBP и его комплекса с Gln по зволил объяснить этот эффект тем, что хотя связывание L-глутамина вызывает закрытие ще ли и существенные структурные изменения с образованием так называемой “закрытой” фор мы, микроокружение Trp 32 и Trp 220 изменяется незначительно (Kuznetsova et al., 2005;
Степаненко и др., 2005). Хотя GlnBP содержит 10 тирозиновых остатков, их вклад в суммарную флуоресценцию нативного GlnBP незначителен. Анализ микроокружения тирозиновых остатков показал, что возможны две причины низкого квантового выхода тирозиновых остатков GlnBP. Во первых, существуют условия для эффективного переноса энергии от большинства тирозино вых остатков к двум триптофановым остаткам белка Trp 32 и/или Trp 220 непосредственно или через другие тирозиновые остатки. Во-вторых, большинство тирозиновых остатков мо жет быть затушено не только за счет переноса энергии возбуждения на триптофановые ос татки, но также близлежащими тушащими группами или переносом энергии на тирозиновые остатки, которые затушены. Для того чтобы проверить существование эффективного перено са энергии от тирозиновых остатков к триптофановым остаткам, была измерена зависимость интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм (триптофановая флуо ресценция) от концентрации GdnHCl при двух длинах волн возбуждения: 280 и 297 нм (рис.
2, г). За единицу принята интенсивность флуоресценции нативного белка при длине волны возбуждающего света, равной 297 нм. Величина интенсивности флуоресценции развернутого белка при длине волны возбуждения 280 нм была принята равной величине интенсивности флуоресценции развернутого белка длине волны возбуждения 297 нм. Следует отметить, что приравнивание этих величин оправдано, так как разворачивание белка приводит к потере ус ловий для переноса энергии от тирозиновых остатков к триптофановым остаткам и нивели рует все особенности микроокружения отдельных триптофановых и тирозиновых остатков.
Можно было ожидать, что для нативного белка получим (I280/I297)3651, если при возбу ждении светом с длиной волны 280 нм энергия возбужденных триптофановых остатков оп ределяется поглощением самих триптофановых остатков и переносом энергии от тирозино вых остатков (Tyr Trp). Это отношение может быть равным единице, если нет переноса энергии от тирозиновых к триптофановым остаткам. Однако экспериментально было обна Здесь и далее в круглых скобках приводятся ссылки на работы, представленные в списке публикаций по теме диссертации.
ружено, что (I280/I297)3651. Такое соотношение может иметь место только в случае изменения спектра поглощения при разворачивании белка, что может вызывать уменьшение величины (I280/I297)365, если для коэффициента молярной экстинкции справедливо соотношение (280/297)N(280/297)U. Изменение формы спектра поглощения при разворачивании белка должно быть значительным для того, чтобы превзойти эффект, обусловленный уменьшением эффективности переноса энергии Tyr Trp, который, напротив, приводит к превышению I280 над I297.
В работе Акселсена с сотрудниками [44] было показано, что спектр поглощения GlnBP в нативном состоянии имеет необыч- Длина волны (нм) 260 280 300 320 360 ную форму, а именно, характеризуется б в 1.6 наличием небольшого плеча при 293 1. A 1. I (отн.ед.) нм. Это плечо в длинноволновой об- 1. а D (отн.ед.) ласти спектра поглощения GlnBP было 0.8 0. надежно зарегистрировано и в наших 0.4 0. экспериментах (рис. 2, а). Согласно 0.0 0. г нашим данным, оно обусловлено 1.0 1 - возб= 297 нм I365 (отн.ед) большим вкладом в поглощение на 2 - возб= 280 нм 0. 3 - I() = I297() - I280() длинноволновом краю спектра погло- 0.8 щения GlnBP Trp 220 по сравнению с 0. Trp 32. Этот вывод сделан на основа- 0. нии характера зависимости параметра 0 1 2 GdnHCl (M) А от длины волны возбуждения (рис. 2, Рис. 2. Спектральные характеристики GlnBP. а: Спектр б) и анализа микроокружения трипто- поглощения GlnBP в нативном состоянии. б: Зависи мость величины параметра А GlnBP в нативном состоя фановых остатков белка. Как было по нии от длины волны возбуждения. в: Спектры флуорес казано выше, тирозиновые остатки да- ценции GlnBP при длине волны возбуждения 297 (кривая 1) и 280 нм (кривая 2). Кривая 3 – Iвозб() = I297() – ют незначительный вклад в спектр I280(). г: Изменение интенсивности триптофановой флуоресценции (рег = 365 нм) при возбуждении светом с флуоресценции нативного GlnBP. длинами волн 297 и 280 нм GlnBP в процессе разворачи вания белка под действием GdnHCl.
Вследствие этого зависимость пара метра А от длины волны возбуждения может определяться только изменением относительно го вклада Trp 32 и Trp 220 в суммарную флуоресценцию белка. Характер этой зависимости свидетельствует о том, что вклад триптофанового остатка с более длинноволновым спектром флуоресценции возрастает с увеличением длины волны возбуждающего света. На рис. 2, в представлены спектры флуоресценции нативного GlnBP при длинах волн возбуждения 297 и 280 нм (которые построены с учетом определенного нами соотношения (I280/I297)365 = 0.93, см. рис. 2, г), а также разностный спектр I297() – I280():
I exp ( ) = I 297 ( ) I 280 ( ) = I 297 ( Trp 220) I 280 (Tyr Trp 220) I 280 (Tyr Trp32) Величина Iexp() представляет ту часть флуоресценции Trp 220, которая определяется пре вышением поглощения этого остатка на длинноволновом краю спектра поглощения I297(Trp220). Величины I280(TyrTrp220) и I280(TyrTrp32) представляют собой части флуоресценции Trp 220 и Trp 32, которые определяются их переходом в возбужденное со стояние при переносе энергии от тирозиновых остатков при длине волны возбуждения нм.
Спектр флуоресценции триптофановых остатков более чувствителен к их микроокру жению, чем спектр поглощения. Различия спектров поглощения отдельных триптофановых остатков невелики и обычно не принимаются в расчет при анализе флуоресцентных данных.
GlnBP – необычный белок, в котором один из двух триптофановых остатков, несомненно, имеет более высокое значение коэффициента молярной экстинкции по сравнению с другим триптофановым остатком в длинноволновой области спектра. Анализ экспериментальных данных и характеристик микроокружения двух триптофановых остатков GlnBP позволил нам сделать вывод о том, что Trp 220 является тем остатком, который вносит больший вклад во флуоресценцию белка при возбуждении на длинноволновом краю спектра поглощения.
Пока неясно, как часто такое различие в спектрах поглощения отдельных триптофановых остатков встречается в белках. Таким образом, результаты этой работы свидетельствуют о том, что спектры триптофановой флуоресценции при возбуждении светом с длинами волн 280 нм и 297 нм могут различаться. Этот факт следует учитывать при оценке вклада тирози новых остатков в суммарную флуоресценцию белка при возбуждении светом с длиной вол ны 280 нм. Кроме того, этот эффект, очевидно, может являться причиной различий в длин новолновой области спектров флуоресценции некоторых белков (приведенных к интенсив ности флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм), измеренных при длинах волн возбуждения 280 нм и 297 нм. В этом случае для представления таких спектров в сопостави мых единицах необходимо учитывать величину соотношения (I280/I297)365. Для определения этого соотношения наряду со спектрами флуоресценции нативного белка необходимо изме рять спектры флуоресценции полностью развернутого белка при длинах волн возбуждения 280 нм и 297 нм (Kuznetsova et al., 2005;
Степаненко и др., 2005;
Степаненко и др., 2007).
Существование различий в спектрах поглощения (возбуждения) и спектрах флуоресценции триптофановых остатков может быть полезным при разработке подхода для разложения многокомпонентного белкового спектра флуоресценции на составляющие.
Спектр флуоресценции GGBP в нативном состоянии представляет собой широкую бес структурную полосу и имеет максимум при длинах волн 344 – 346 нм. При связывании ли ганда максимум спектра флуоресценции GGBP сдвигается в коротковолновую область на 4 – 5 нм. В состав белка входят 5 Trp и 7 Tyr остатков. Особого внимания заслуживает Trp С-концевого домена, ориентированный внутрь щели, соединяющей два домена белка и слу жащей для связывания лиганда. Этот остаток и остаток N-концевого домена Phe 16 непо средственно участвуют в связывании сахара в щели между двумя доменами GGBP, форми руя ароматический карман из индольного и фенольного колец, между которыми помещается молекула сахара [14]. Именно этот остаток характеризуется наибольшими различиями в со ставе микроокружения в GGBP и в комплексе GGBP/Glc. Микроокружение Trp 183 GGBP характеризуется высокой полярностью, поскольку насчитывает много гетероатомов поляр ных остатков, 5 атомов кислорода связанной воды и всего 1 группу неполярного остатка (Ala 155). В состав микроокружения Trp 183 GGBP/Glc по сравнению с микроокружением этого остатка в GGBP дополнительно входят полярные группы OH Tyr 10 и OD1 Asp 14, принад лежащие N-концевому домену, и группа OE1 Glu 149. Но, в то же время, микроокружение этого остатка в комплексе GGBP/Glc по сравнению с GGBP содержит на 2 атома кислорода связанной воды меньше. В комплексе GGBP/Glc все атомы углерода и кислорода глюкозы входят в состав микроокружения Trp 183. Плотность микроокружения Trp 183 в комплексе GGBP/Glc выше, чем в GGBP (0.84 и 0.81, соответственно). По-видимому, небольшой корот коволновый сдвиг спектра флуоресценции GGBP/Glc связан с увеличением плотности мик роокружения Trp 183 (Степаненко и др., 2007).
Процессы сворачивания и разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl. Характер равновесных зависи мостей различных флуоресцентных характеристик – интенсивности флуоресценции, пара метра А, характеризующего положение спектра флуоресценции, и анизотропии флуоресцен ции (рис. 3 и 4) – свидетельствует об одностадийном разворачивании GGBP и комплекса GGBP/Glc. Линейный вид параметрических зависимостей для GGBP и комплекса GGBP/Glc, построенных на основании зависимостей интенсивности флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, также говорит о том, что процесс разворачивания GGBP и ком плекса GGBP/Glc происходит по принципу “все или ничего” (рис. 4). Спектры КД в дальней УФ-области, измеренные для GGBP и комплекса GGBP/Glc, совпадают. Это свидетельствует о том, что связывание молекулы D-глюкозы не влияет на вторичную структуру белка. Харак тер зависимости эллиптичности при 222 нм от концентрации GdnHCl для GGBP и комплекса GGBP/Glc свидетельствует о наличии только одного перехода в процессе денатурации в об ласти 0.3 – 1.5 М GdnHCl и 0.8 – 1.9 М GdnHCl, соответственно (рис. 3). Таким образом, ха рактер изменения спектров КД в дальней УФ-области спектра белка и комплекса с D глюкозой под действием денатуранта также свидетельствует об одностадийности процесса разворачивания GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl.
а N 1. Параметр A а 2. I320, отн.ед.
1. 0.8 2 2.0 1. 0.6 1 0. Анизотропия фл.
0. 0. I320, отн.ед.
1. б 0.15 2 0.12 [GdnHCl], M [GdnHCl], M 0.09 1. 1 2. 0. x103 б I365, отн.ед.
в 2. -2 [] 0.5 1. - 1. -8 U - 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2. GdnHCl (M) I365, отн.ед.
Рис. 3. Конформационные переходы GGBP в Рис. 4. Параметрические зависимости между интенсив отсутствие (кривые 1, кружочки) и в присутст- ностями флуоресценции при длинах волн регистрации вии D-Glc (кривые 2, треугольники) под дейст- 320 и 365 нм, характеризующие процесс разворачива вием GdnHCl. ния GGBP (открытые кружки) и GGBP/Glc (открытые Открытые символы – разворачивание, закрашен- треугольники) под действием GdnHCl.
ные – сворачивание. а – изменение параметра A Параметр – концентрация GdnHCl. Темные кружки от = I320/I365, возб =297 нм;
б – изменение анизотро- вечают процессу ренатурации GGBP. Вставка а и б – пии флуоресценции, возб = 297 нм, рег = 365 нм;
изменение I320 и I365 в зависимости от концентрации GdnHCl, соответственно. ex = 297 нм.
в – изменение эллиптичности при 222 нм (град см2 дмоль-1).
Рис. 5. Доля молекул GGBP (верхняя панель) и Рис. 6. Влияние EDTA на третичную структуру GGBP GGBP/Glc (нижняя панель) в нативном (откры- (панель а) и комплекса GGBP/Glc (панель б). Кривые 1, тые символы) и развернутом (закрашенные сим- 2, 3 и 4 были измерены для растворов, содержащих 0.0, волы) состояниях в зависимости от концентра- 0.005, 0.01 и 0.75 мМ EDTA, соответственно. Вставки:
ции GdnHCl. Данные рассчитаны из величины Спектры триптофановой флуоресценции GGBP (I) и триптофановой флуоресценции при регистрации GGBP/Glc (II) в нативном состоянии (кривые черного на 320 (кружки), 350 (квадраты), 365 (треуголь- цвета) и в присутствии EDTA разной концентрации:
ники) нм и эллиптичности при 222 нм (ромбы). 0.005 (зеленый цвет), 0.01 (синий цвет) и 0.75 мМ (красный цвет). возб = 297 нм.
а I 1.5 1. N U Инт. фл.
1.0 1. 0. 1. I350 отн.ед.
0.8 0. N / U 0.6 1.3 300 320 340 360 0.4, нм.
1. 0.2 1.1 0.0 1.0 N U 1.0 б II 1. Инт. фл.
1. 1. 0. N / U 0. I350 отн.ед.
0. 0.6 1. 0.4 300 320 340 360 1.1, нм.
0.2 1.0 0.0 0 2 4 6 0 1 2 3 Время, мин. ч.
[GdnHCl], M Зависимости изменения доли молекул в нативном и развернутом состояниях от концен трации GdnHCl, построенные на основании изменения интенсивности флуоресценции при трех различных длинах волн регистрации и изменения КД при 222 нм, хорошо совпадают как для свободного GGBP, так и для его комплекса с D-глюкозой (рис. 5). Это свидетельст вует об одновременном разрушении третичной и вторичной структуры белка и его комплек са с лигандом. Как белок, так и комплекс разворачиваются кооперативно. Середина перехода от нативного к развернутому белку для GGBP и его комплекса с D-глюкозой составляет 0.5 и 1.2 М GdnHCl, соответственно. Таким образом, присоединение лиганда стабилизирует структуру белка. Об этом же свидетельствуют сопоставление величин свободных энергий Гиббса для белка и комплекса – эти величины различаются приблизительно в два раза (Сте паненко и др., 2007).
Ренатурация GGBP. Все равновесные зависимости различных флуоресцентных харак теристик, таких как интенсивность флуоресценции, параметр А и анизотропия флуоресцен ции, и КД в дальней УФ-области от концентрации GdnHCl (рис. 3 и 4), полученные при ре натурации GGBP из полностью развернутого состояния (в присутствии 3 М GdnHCl), совпа дают с соответствующими кривыми, характеризующими процесс разворачивания белка. Это говорит об обратимости процесса денатурации GGBP под действием GdnHCl (Степаненко и др., 2007).
Отщепление иона кальция. Молекула GGBP содержит один ион кальция, локализо ванный в петле C-концевого домена (остатки 134 – 142) и образующий координационную связь с атомами кислорода каждого второго остатка этой петли и остатка Glu 205 (рис. 1).
Структура кальций-связывающего сайта напоминает структуру мотива “EF-руки”, распро страненного во внутриклеточных кальций-связывающих белках [13-14].
Все проведенные эксперименты показали стабилизирующую роль иона кальция в структуре GGBP. Отщепление иона кальция приводит к изменению третичной структуры молекулы GGBP, о чем свидетельствует изменение флуоресцентных свойств GGBP с отщеп ленным кальцием по сравнению с GGBP. Кинетические зависимости интенсивности флуо ресценции, зарегистрированные при исследовании процесса отщепления иона Са2+ от GGBP с помощью ЭДТА, характеризуются увеличением интенсивности триптофановой флуорес ценции на 35 % (рис. 6, а). Равновесные значения интенсивности флуоресценции GGBP с удаленным ионом Са2+, устанавливающиеся за время от 2 до 7 мин после смешения раство ров белка и хелатирующего агента, оказались больше соответствующего значения для на тивного белка (рис. 6, а и вставка I). В то же время присутствие молекулы связанного сахара Glc делает белок более устойчивым к перестройкам структуры GGBP-Ca/Glc, вызванным удалением иона Са2+. Отщепление иона Са2+ в значительно меньшей степени влияет на тре тичную структуру комплекса GGBP/Glc, о чем свидетельствует меньшая амплитуда увели чения интенсивности триптофановой флуоресценции GGBP/Glc после добавления ЭДТА и достижение равновесных значений регистрируемой характеристики за время меньше 2 мин (рис. 6, б). При этом равновесные значения интенсивности флуоресценции GGBP/Glc с уда ленным ионом Са2+ (GGBP-Са/Glc) совпадают со значением, характерным для комплекса GGBP/Glc (рис. 6, б и вставка II). Эксперименты по кинетике денатурации GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc химическим денатурантом GdnHCl позволили показать, что GGBP-Ca менее устойчив к денатурирующему действию GdnHCl по сравнению с GGBP;
в то же время нали чие в структуре белка молекулы связанной D-глюкозы повышает устойчивость GGBP-Ca/Glc к денатурирующему действию GdnHCl (Stepanenko et al., 2008).
Процессы сворачивания и разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/Gln Разворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием GdnHCl. Равновесные зависимо сти интенсивности триптофановой флуоресценции, параметра А, характеризующего положе ние спектра флуоресценции, анизотропии флуоресценции, величины эллиптичности при длине волны 222 нм, интенсивности флуоресценции АНС и вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию для GlnBP и GlnBP/Gln от концентрации GdnHCl свидетельст вуют о сложном процессе разворачивания как GlnBP, так и комплекса белка с лигандом под действием GdnHCl (рис. 7).
Характер зависимостей интенсивности триптофановой флуоресценции при длине вол ны регистрации 320 нм, параметра А и КД в дальней УФ-области спектра GlnBP от концен трации GdnHCl (рис. 7, вставка I к панели а, б и г), свидетельствует о существовании, по крайней мере, двух переходов при разворачивании белка под действием GdnHCl. Первый пе реход лежит в области концентраций 0.2 – 0.7 М GdnHCl, а второй – в области 1.4 – 2.1 М GdnHCl. В противоположность GlnBP, зависимости соответствующих характеристик GlnBP/Gln под действием GdnHCl имеют простой сигмоидальный вид, что соответствует мо дели перехода “все или ничего”. Зависимость интенсивности триптофановой флуоресценции GlnBP от концентрации GdnHCl, измеренная при длине волны 365 нм, характеризуется вы раженным увеличением интенсивности флуоресценции в области концентраций GdnHCl 0. – 1.1 М, что говорит о более сложном процессе разворачивания GlnBP под действием GdnHCl. В то же время, зависимости анизотропии флуоресценции GlnBP и GlnBP/Gln от концентрации GdnHCl совпадают на всем промежутке концентраций денатуранта от 0.0 до 3.0 М, при этом величина анизотропии флуоресценции остается постоянной вплоть до 1.3 М GdnHCl (рис. 7, в). Постоянство величины анизотропии в области от 0.0 до 1.3 М GdnHCl свидетельствует о том, что белок в этой области концентраций денатуранта сохраняет глобу лярную структуру и достаточно жесткое микроокружение триптофановых остатков, которое а бг 1. I320, отн.ед.
I 1. 2 3. 0.0 N 0. Параметр A IАНС, отн.ед.
1.0 1. 0. 1 2. 1. 0. 2. 0.2 1. 0.8 2 1. 0. I320, отн.ед.
0 1 2 1. GdnHCl, M 0. 0.6 x 1.1 I Анизотропия фл.
вд 0.75 0. GdnHCl, M - I1 1. 0. 0 1 2 0.4 - [] 0. 1.0 I365, отн.ед.
- II 0.9 0. 0.2 0.8 - U 0.07 1, 0.7 3.0 - 0.6 0. 0. 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 30 1 2 GdnHCl, M GdnHCl, M I365, отн.ед.
Рис. 7. Конформационные переходы GlnBP (кривые 1, синий цвет) и его комплекса с Gln (кривые 2, крас ный цвет) под действием GdnHCl. Закрашенные кружки отвечают процессу ренатурации GlnBP.
а – параметрические зависимости между I320 и I365, параметр – концентрация GdnHCl. Показаны флуорес центные характеристики, соответствующие нативному (N), промежуточным состояниям (I1 и I2) и полно стью развернутому (U) состояниям. Числа на кривых – концентрации GdnHCl. Вставки I и II – изменение интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 и 365 нм, соответственно, возб =297 нм;
б – изменение параметра A = I320/I365;
возб =297 нм;
в – изменение анизотропии флуоресценции, возб = 297 нм, рег = 365 нм;
г – изменение интенсивности флуоресценции АНС, возб = 365 нм, рег = 480 нм;
д – изменение эллиптичности при 222 нм.
ограничивает внутримолекулярную подвижность индольных колец.
Параметрическое представление результатов измерений равновесных зависимостей ин тенсивности флуоресценции I320 и I365 от концентрации GdnHCl и кинетических зависимо стей интенсивности флуоресценции I320 и I365 после перевода белка в раствор GdnHCl соот ветствующей концентрации свидетельствует о существовании двух промежуточных состоя ний (I1 и I2) на пути перехода GlnBP из нативного в развернутое состояние (рис. 7, а).
Переход N I1 происходит в области концентраций GdnHCl от 0.0 до 0.6 – 0.7 М для GlnBP. Этот переход сопровождается уменьшением интенсивности флуоресценции и вели чины параметра А, увеличением вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также увеличением интенсивности флуоресценции АНС (рис. 7, г). Неизменность величины анизотропии флуоресценции вплоть до 1.3 М GdnHCl предполагает, что в этой об ласти концентраций GdnHCl белок сохраняет глобулярную и довольно жесткую структуру, несмотря на существенное уменьшение сигнала КД в дальней УФ-области. Возможно, со хранение высокого значения анизотропии флуоресценции белка обусловлено ассоциацией денатурированных частично-свернутых молекул белка, возникающих в результате перехода N I1. Существенное увеличение флуоресценции АНС в области перехода N I1, можно связать с возникновением состояния типа “расплавленной глобулы”. Возникновение гидро фобных кластеров на поверхности макромолекулы GlnBP при переходе в состояние типа расплавленной глобулы может являться предпосылкой ассоциации макромолекул.
Переход I1 I2 хорошо проявляется в равновесной зависимости интенсивности флуо ресценции, измеренной при длине волны регистрации 365 нм (рис. 7, а, вставка II), и в пара метрических зависимостях (рис. 7, а). Более того, для GlnBP существование I2 видно из срав нения равновесных зависимостей анизотропии флуоресценции r и интенсивности флуорес ценции АНС. Увеличение интенсивности флуоресценции АНС соответствует переходу N I1. Интенсивность флуоресценции АНС начинает уменьшаться до начала разворачивания белка, которое проявляется в уменьшении анизотропии флуоресценции. Разумно предполо жить, что существует дополнительный переход (I1 I2), приводящий к уменьшению интен сивности флуоресценции АНС, который предшествует полному разворачиванию белка (I U). Переход I1 I2 происходит в области 0.75–1.1 М GdnHCl. В то же время, ни зависимость интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм, ни зависимость пара метра А от концентрации GdnHCl не дают никаких свидетельств существования перехода в этой области концентраций GdnHCl. Согласно данным КД в дальней УФ-области, вторичная структура белка также не изменяется в этой области концентраций GdnHCl (рис. 7, д).
Переход I2 U происходит в области 1.3–2.4 М GdnHCl. В результате этого перехода разрушается компактная глобулярная структура. Прежде всего, это видно по значительному длинноволновому сдвигу спектра флуоресценции, т.е. по уменьшению параметра А (рис. 7, б), что предполагает увеличение полярности микроокружения триптофановых остатков.
Уменьшение анизотропии флуоресценции в этой области концентраций GdnHCl (рис. 7, в) говорит об увеличении подвижности триптофановых остатков и их микроокружения. Об уве личении подвижности микроокружения триптофановых остатков при этих концентрациях GdnHCl свидетельствует также изменение спектра КД в ближней УФ-области спектра. Су щественное уменьшение эллиптичности при 222 нм (рис. 7, д) свидетельствует о разрушении вторичной структуры белка в результате данного перехода. Интересно, что уменьшение ин тенсивности флуоресценции АНС начинается при концентрациях GdnHCl, которые сущест венно меньше, чем те, при которых начинается переход I2 U. Это косвенно подтверждает существование состояния I2. Это также означает, что при переходе в состояние I2 белок теря ет способность связывать АНС.
Так как GlnBP – двухдоменный белок, то мы не можем не учитывать возможности по следовательного разворачивания доменов. В то же время переход N I1 нельзя объяснить разворачиванием малого домена (который не имеет триптофановых остатков), так как он со провождается существенными изменениями флуоресцентных характеристик. С помощью FTIR была показана более низкая термочувствительность -спиралей белка по сравнению с -листами [45]. Возможно, -спирали GlnBP также менее устойчивы к денатурирующему действию GdnHCl. В этом отношении существенно отметить, что тепловая денатурация (в противоположность разворачиванию под действием GdnHCl) никогда не приводит к полно му разворачиванию белка. Таким образом, мы можем предположить, что в нашем случае, пе реход N I1 сопровождается разворачиванием -спиралей, тогда как переход I1 I2 связан с разрушением -листов (Staiano et al., 2005;
Степаненко и др., 2005;
Туроверов и др., 2007).
Ренатурация GlnBP. Несмотря на сложный характер разворачивания GlnBP под дей ствием GdnHCl, его денатурация полностью обратима (рис. 7). Все флуоресцентные характе ристики GlnBP, такие как параметр А, интенсивность триптофановой флуоресценции и ани зотропия флуоресценции, измеренные для растворов белка, содержащих 1.38, 0.71, 0.50 и 0.43 М GdnHCl, не зависят от того, были ли эти растворы получены в процессе денатурации или ренатурации из 3.0 М GdnHCl. Об обратимости процесса разворачивания белка под дей ствием GdnHCl свидетельствует также вид параметрических зависимостей процесса ренату рации GlnBP из 3.02 М GdnHCl, при построении которых параметром выступала концентра ция денатуранта (рис. 7, а).
Кинетические кривые процесса ренатурации GlnBP из полностью развернутого состоя ния (в присутствии 3.02 М GdnHCl), как и равновесные эксперименты, свидетельствуют о том, что, хотя процесс разворачивания GlnBP является сложным, денатурация GlnBP обра тима. Параметрическое представление кинетических зависимостей интенсивностей флуорес ценции, измеренных при ренатурации белка, показывает, что ренатурация белка, очевидно, проходит через образование тех же промежуточных состояний, что и при денатурации белка (Staiano et al., 2005;
Степаненко и др., 2005).
Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом. Все эксперимен тальные данные говорят о том, что структура комплекса GlnBP/Gln более устойчива к дена турирующему действию GdnHCl по сравнению с GlnBP. В самом деле, для GlnBP/Gln пере ход N I1 происходит при более высокой концентрации GdnHCl (рис. 7). Это означает, что процессы N I1, I1 I2 и I2 U происходят в более узкой области концен траций GdnHCl. В результате связывания Gln разворачивание белка становится более коопе ративным и белок выдерживает большие концентрации GdnHCl. Это создает видимость того, что процесс денатурации GlnBP/Gln происходит с образованием только одного промежуточ ного состояния. Тем не менее, характер параметрических зависимостей между I320 и I365 (рис.
7, а) однозначно показывает, что процесс разворачивания GlnBP/Gln, так же как и GlnBP, яв ляется трехстадийным.
Таким образом, разворачивание GlnBP под действием GdnHCl является трехстадийным и обратимым. Связывание лиганда (Gln) приводит к тому, что структура белка становится более устойчивой к денатурирующему действию GdnHCl. Это, в свою очередь, приводит к кооперативному разворачиванию структуры по достижении соответствующей концентрации денатуранта (Степаненко и др., 2005;
Staiano et al., 2005). Возрастание интенсивности флуо ресценции АНС при разворачивании GlnBP под действием GdnHCl (переход N I1), по видимому, связано с образованием ассоциатов макромолекулы белка после их перехода в со стояние типа расплавленной глобулы (Staiano et al., 2005;
Степаненко и др., 2005).
Сравнение характера процессов разворачивания–сворачивания GGBP с GlnBP. Оба б елка, GlnBP и GGBP, относятся к одному семейству лиганд-связывающих белков пери плазмы бактерий и имеют сходную третичную структуру, несмотря на различие аминокис лотной последовательности и молекулярной массы (25 кДа для GlnBP и 33 кДа для GGBP).
Величины свободной энергии для этих белков близки по значению. Комплексообразование GlnBP с глутамином и GGBP с D-глюкозой делает белки более термостабильными. Установ лено, что температурная денатурация как GlnBP и GGBP, так и их комплексов со своими ли гандами является необратимой. Характер разворачивания GGBP и GlnBP под действием GdnHCl существенно различается. Как было показано, GlnBP и GlnBP в комплексе с глута мином разворачивается по трехстадийному механизму. Совокупность данных, полученных методом собственной флуоресценции белков, флуоресценции АНС, данных КД в дальней УФ-области, а также использование параметрического представления флуоресцентных дан ных позволили предложить следующую схему для разворачивания как GlnBP, так и GlnBP/Gln под действием GdnHCl:
N I1 I2 U где N – нативное состояние, U – развернутое состояние, I1 и I2 – промежуточные состояния, возникающие на пути перехода из нативного в развернутое состояние. В присутствии глута мина структура GlnBP становится более термостабильной и более устойчивой к денатури рующему действию GdnHCl. Несмотря на сложный характер процесса разворачивания GlnBP, он полностью обратим.
В то же время разворачивание как GGBP, так и его комплекса GGBP/Glc является од ностадийным процессом. Более кооперативный характер денатурации GGBP по сравнению с GlnBP, возможно, вызван присутствием иона Ca2+ в структуре GGBP. Макромолекула GGBP сохраняет нативное состояние, пока ион Ca2+ не отщепляется под действием GdnHCl или на гревания. Таким образом, разворачивание GGBP начинается при более высокой концентра ции GdnHCl (температуре) по сравнению с GlnBP, и переход осуществляется более коопера тивно. Разрушение GGBP/Glc начинается при еще более высокой концентрации GdnHCl (температуре) после удаления второго лиганда – молекулы сахара (Степаненко и др., 2005;
Kuznetsova et al., 2005;
Staiano et al., 2005;
Степаненко и др., 2007).
ВЫВОДЫ 1. Связывание лиганда стабилизирует структуру глутамин-связывающего белка и D галактоза/D-глюкоза-связывающего белка и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.
2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков сущест венно различается:
• разворачивание глутамин-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является трехстадийным, т.е. проходит с образованием двух промежуточных состоя ний I1 и I2.
• процесс разворачивания D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является одностадийным.
3. Разворачивание глутамин-связывающего белка и D-галактоза/D-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является обратимым, а тепловая денатура ция необратима.
4. Существенное увеличение интенсивности флуоресценции гидрофобного красителя 1 анилинонафталин-8-сульфоната при переходе в первое промежуточное состояние I1, воз никающее при разворачивании глутамин-связывающего белка, связано с образованием состояния типа “расплавленной глобулы”. Возникновение гидрофобных кластеров на по верхности макромолекулы глутамин-связывающего белка при переходе в это состояние сопровождается ассоциацией макромолекул.
5. Несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин связывающем белке и D-галактоза/D-глюкоза-связывающем белке при связывании соот ветствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом из меняются незначительно.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Kuznetsova I.M., Stepanenko Olga V., Turoverov K.K., Staiano M., Scognamiglio V., Rossi M., D'Auria S. (2005). Fluorescence properties of glutamine-binding protein from Escherichia coli and its complex with glutamine. J. Proteome Res. 4 (2):417-23.
2. Staiano M., Scognamiglio V., Rossi M., D'Auria S., Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. (2005). Unfolding and refolding of the glutamine-binding protein from Es cherichia coli and its complex with glutamine induced by guanidine hydrochloride.
Biochemistry. 44 (15):5625-33.
3. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д’Ауриа С. (2005). Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Es cherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47 (11): 988-1006.
4. Туроверов К.К., Поварова О.И., Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М. (2007). Термо динамически стабильные, компактные состояния белков: образование нативной структу ры в процессе фолдинга, аморфных агрегатов, амилоидных и амилоидо-подобных фиб риллярных структур при его нарушении. В сб. “Бреслеровские чтения. Молекулярная ге нетика, биофизика и медицина сегодня”. Ред. В.А. Ланцов. СПб.: ПИЯФ РАН, 78-87.
5. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д’Ауриа С. (2007). Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдомен ных лиганд-связывающих белков. Вестник молодых ученых. Выпуск IV. М.: СП “Мысль”.
42-52.
6. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Стаяно М., Д’Ариа С. (2004). Анализ микроок ружений триптофановых и тирозиновых остатков и спектральные свойства GlnBP. 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 34.
7. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д’Ариа С. (2004). Сравнительное изучение структуры и стабильности глутамин связывающего белка и его комплекса с глутамином. III Съезд биофизиков России, Воро неж, 105.
8. Parracino A., Scognamiglio V., Staiano M., Varriale A., Rossi M., D’Auria S., Kuznetsova I.M., Stepanenko Olga V., Turoverov K.K. (2004). Glutamine-binding protein from E.coli: lo cation of tryptophan and tyrosine residues, characteristics of their microenvironments, and their contribution to the bulk fluorescence of the protein. The Italian Journal of Biochemistry. V. 53, suppl. 1, 104.
9. Степаненко Ольга В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д’Ауриа С. (2007). Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдомен ных лиганд-связывающих белков. XIV Международная конференция студентов, аспи рантов и молодых ученых “Ломоносов-2007”, Москва, т. I, 76.
10. Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Scognamiglio V., Staiano M., Rossi M., D’Auria S.. (2007). Peculiarities of folding processes of ligand binding protein: D galactose/D-glucose-binding protein and glutamine-binding protein. XIIth European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Bobigny, France, 190.
11. Степаненко Ольга В. (2007). Фолдинг и стабильность двухдоменных лиганд связывающих белков – чувствительных элементов социально значимых биосенсоров.
Двенадцатая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 42.
12. Stepanenko Olga V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Scognamiglio V., Staiano M., D'Auria S. (2008). The role of calcium ion in the structure of D-galactose/D-glucose-binding protein. 4th Saint-Petersburg young scientists conference.
Abstract
book, Saint-Petersburg, 73.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Harper J.D., Lansbury P.T.Jr. 1997. Ann. Rev. Biochem. 66: 385 – 407. 2. Carrell R.W., Gooptu B. 1998. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799 – 809. 3. Fink A. L. 1998. Fold. Des. 3: 9 – 23. 4. Uversky V.N. et al., 1999a. Medical Science Monitor. 5: 1001 – 1012. 5. Uversky V.N. et al., 1999b. Medi cal Science Monitor 5: 1238 – 1254. 6. Selkoe D.J. 2003. Nature. 426: 900 – 904. 7. Wetzel R.
1994. Trends Biotechnol. 12: 193 – 198. 8. Speed M.A. et al., 1996. Nat. Biotechnol. 14: 1283 – 1287. 9. Dattelbaum J.D., Lakowicz J. R. 2001. Anal. Biochem. 291: 89 – 95. 10. Staiano M. et al., 2004. Biotechnology Progress. 20(5): 1572 – 1577. 11. Tolosa L. et al., 1999. Anal.Biochem. 267:
114 – 120. 12. Berman H.M., et al., 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235 – 242. 13. Borrok M.J. et al., 2007. Prot.Sci. 16(6): 1032–1041. 14. Vyas N.K. et al., 1988. Science. 242: 1290–1295.
15. Hsiao C.-D. et al., 1996. J. Mol. Biol. 262: 225–242. 16. Sun Y. et al., 1998. J Mol. Biol. 278:
219–229. 17. Turoverov K.K. et al., 1985. Biophys. Chem. 23: 79–89. 18. Forster Th. 1960. Rad.
Res. Suppl. 2: 326–339. 19. Dale R.E., Eisinger J. 1974. Biopolymers 13: 1573–1605. 20. Eisinger J. et al., 1969. Biochemistry. 8: 3908–3915. 21. Steinberg I.Z. 1971. Ann. Rev. Biochem. 40: 83– 114. 22. Туроверов К.К. и др., 1998. Цитология. 40 (8/9): 806–817. 23. Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2003. J. Fluorescence 13: 41 – 57. 24. Pace C.N. 1986. Methods Enzymol. 131:
266 – 280. 25. Nolting B. 1999. Protein Folding Kinetics. Biophysical Methods. Berlin-Haidelberg:
Springer-Verlag, 191 p. 26. Jablonski A. 1957. Acta Phys. Polon. 16: 471 – 479. 27. Лакович Дж.
1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136 – 139. 28. Бурштейн Э. А.
1976. Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва. 29. Ка планас Р.И. и др., 1975. Мол. Биол. 9: 795 – 804. 30. Bushmarina N. A. et al., 2001.
Chem.Bio.Chem. 2: 813 – 821. 31. Kuznetsova I. M., Stepanenko Olga V. et al., 2002a. Biochem.
Biophys. Acta. 1596: 138 – 155. 32. Kuznetsova I.M. et al., 2004. J. Proteome Res. 3: 485 – 494.
33. Stepanenko Olga V. et al., 2004. Biochemistry. 43: 5296 – 5303. 34. Кузнецова И.М., Степа ненко Ольга В. и др., 2005. Цитология. 47 (11): 1007 – 1016. 35. Kuznetsova I.M., Stepanenko Olga V. et al., 2002b. Biochemistry. 41: 13127 – 13132. 36. Turoverov K.K., Kuznetsova I.M.
2003. J. Fluorescence 13: 41 – 57. 37. Поварова О.И. и др., 2005. Цитология. 47: 935 – 977. 38.
Altschuler G.M. et al., 2005. J.Mol.Biol. 353(2): 385 – 396. 39. Das P. et al. 2005. 102(41): – 14574. 40. Marquardt D.W. 1963. J. Soc. Indust. Apl. Math. 11: 431–441. 41. Zuker M. et al., 1985. Rev. Sci. Instrum. 56: 14–22. 42. Humphrey W. et al., 1996. J. Molec. Graphics 14: 33 – 38.
43. Merritt E.A., Bacon D.J. 1977. Methods enzymol. 277: 505 – 524. 44. Axelsen P.H. et al., 1991.
Biophys. J. 60: 650–659. 45. D’Auria S. et al., 2005. Proteins. 58: 80 – 87.