Распространенность и биологические особенности нозокомиальных штаммов pseudomonas aeruginosa
На правах рукописи
НИКОЛАЕВА Нина Владимировна
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
03.02.03 Микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пермь – 2011
3
Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Министерства здравоохранения и социального развития РФ, Пермь
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Октябрьский Олег Николаевич доктор медицинских наук Зубарева Надежда Анатольевна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, Оренбург
Защита состоится «»2011 г. в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342) 280 92 Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Автореферат разослан «_» _2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Pseudomonas аeruginosa (синегнойная палочка) распространена повсеместно, чему способствует высокая устойчивость этих бактерий к неблагоприятным условиям внешней среды, выраженная антагонистическая активность и резистентность к широкому спектру природных биологически активных веществ и антимикробных средств, применяемых в медицинской практике [Veesenmeyer, 2009;
Пруцаков, 2011]. Для человека синегнойная палочка считается условно патогенной, так как далеко не во всех случаях при ее попадании в организм развивается заболевание. Вероятность инфекции значительно повышается при большом количестве возбудителя, попавшего в организм, а также в случае иммунодепрессии или иммунодефицита у ослабленных, истощенных людей, на фоне влияния стрессовых факторов, сопровождающих травмы, ожоги, различные хирургические вмешательства и тяжелую соматическую патологию. С учетом этих двух составляющих, а также высокой резистентности P. аeruginosaе к противомикробным препаратам, заражение человека чаще всего может произойти во время пребывания именно в лечебном учреждении. Во всем мире прослеживается тенденция к увеличению удельного веса заболеваний, вызванных синегнойной палочкой, в общей структуре внутригоспитальных гнойно-септических инфекций [Mesaros, 2007;
Голубкова, 2011;
Свистунов, 2011]. Устойчивость P. аeruginosaе во внешней среде, непритязательность к условиям питания, наличие мощных факторов вирулентности, природная резистентность к соединениям с антибиотической активностью определяют широту ее распространения и формирования госпитальных штаммов, что зачастую превращает стационар в «эпидемический очаг» синегнойной инфекции [Aзолов, 1999;
Komolafe, 2003;
Шагинян, 2005;
Покровский, 2006;
Туркутюков, 2006;
Коршунова, 2007;
Nemec, 2010]. Инфекционные осложнения, возникающие у госпитализированных больных, отягощают течение основного заболевания, увеличивают длительность стационарного лечения и повышают число неблагоприятных исходов [Руднов, 2002;
Aзолов, 2004;
Сидоренко, 2005]. Широкое распространение (до 75%) атипичных форм возбудителя затрудняет постановку диагноза, препятствует своевременному проведению лечебных и противоэпидемических мероприятий [Мороз, 1988;
Зубков, 2003;
Пыж, 2011]. Все это обусловливает необходимость поиска информативных методов диагностики синегнойной инфекции с вычленением тестов, способствующих дифференциации госпитальных и внебольничных штаммов.
Нерешенность проблемы борьбы с госпитальной синегнойной инфекцией с помощью химиотерапевтических препаратов побуждает проводить поиск дополнительных методов и средств, повышающих ее эффективность. В последние годы разрабатываются и внедряются новые технологии, способные, с одной стороны, подавлять вирулентность госпитальной микрофлоры, с другой – нивелировать ее устойчивость к антибиотикам. В этом плане возрастает интерес к озонотерапии. Обладая высоким окислительным потенциалом, озон проявляет бактерицидные свойства. Однако сведения о влиянии небактерицидных концентраций озона в физиологическом растворе, применяемых для парентеральной озонотерапии инфекционных осложнений, на патогенные свойства P. аeruginosaе, в том числе на ее пленкообразующую активность и антибиотикочувствительность, весьма немногочисленны. Вместе с тем технология системного использования озона, концентрация которого в физиологическом растворе не превышает 10 мг/л, существенно расширяет спектр его лечебных возможностей, в частности, при инфекционных осложнениях, за счет оптимизации нарушенного кислородного гомеостаза организма больного [Rischbieter, 2000;
Белых, 2004;
Кувакина, 2006;
Фисталь, 2006;
Бокерия, 2007;
Верхулецкий, 2007;
Стручков, 2007;
Уметалиев, 2007;
Винник, 2008;
Водякова, 2009;
Дмитриева, 2009;
Burgassi, 2009].
Цель исследования – изучение фенотипических особенностей нозокомиальных штаммов, как основы для оптимизации микробиологической диагностики и способов воздействия на P. аeruginosa.
Основные задачи исследования:
1. На основании ретроспективного анализа (5 лет) установить частоту встречаемости P. аeruginosa в стационарах различного профиля.
2. Изучить основные биологические свойства P. аeruginosa, определяющие патогенный потенциал изолируемых штаммов.
3. Определить наиболее распространенные фенотипы антибиотикорезистентности в сочетании с экспресируемыми факторами патогенности изолятов P. аeruginosa.
4. Разработать и усовершенствовать дифференцирующие тесты, позволяющие с большей эффективностью определять природу штаммов P. аeruginosa, изолируемых в ЛПУ.
5. Оценить влияние абиотических и микробных факторов на уровень пленкообразующей активности штаммов P. аeruginosa в условиях эксперимента.
Научная новизна. Впервые охарактеризована динамика распространенности P. aeruginosa и инфицированности пациентов ЛПУ г. Перми в 2006–2010 гг. Определены типичные фенотипы P. аeruginosa с учетом спектров их антибиотикочувствительности. Предложен и экспериментально обоснован набор биологических характеристик, способствующих дифференцировке госпитальных и внебольничных эковаров P. аeruginosa. В условиях эксперимента впервые показана неоднозначность действия озонированного физиологического раствора с различным содержанием озона на планктонные и сесильные формы синегнойной палочки, его способность потенцировать бактерицидный эффект антибиотиков различных классов. Подтверждена высокая антагонистическая активность нозокомиальных культур P. аeruginosa и предложен способ оценки характера их взаимоотношений при формировании бипленок с наиболее часто встречающимися ассоциантами (приоритетная справка № 2010127885 от 06.07.2010).
Теоретическая и практическая значимость работы. Определение основных фенотипов в комплексе с антибиотикорезистентностью штаммов P.aeruginosa, циркулирующих в стационарах различного профиля, будет способствовать оптимизации в них эмпирической антибиотикотерапии и проведению противоэпидемических мероприятий, как в конкретном отделении, так и в ЛПУ в целом. Выявленные биологические особенности, в том числе способность к пленкообразованию изолируемых штаммов, предложенные оригинальные и модифицированные диагностические тесты (рацпредложение № 2549 от 07.06.2011 г.) позволят рационализировать методические подходы к оценке антибиотикочувствительности и принадлежности изолятов к госпитальным либо внебольничным эковарам.
Установленные эффекты озонированного физиологического раствора на планктонные и структурированные в биопленки формы P.aeruginosa (патент на изобретение №2425888 от 22.08.2011 г. «Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора»), а также его сочетаний с антибиотиками различных классов демонстрируют целесообразность использования озона в комплексной терапии внутрибольничной синегнойной инфекции с учетом индивидуальных особенностей изолируемых штаммов.
Положения, выносимые на защиту:
1. В многолетней динамике (2006–2010 гг.) наблюдается тенденция к росту инфицированности пациентов стационаров различного профиля представителями P.aeruginosa, среди которых доминируют штаммы, полирезистентные к регламентированному набору антисинегнойных препаратов.
2. Проявление биологических свойств штаммами P.aeruginosa, изолируемыми в различных стационарах, в значительной степени варьирует.
Преимуществом при колонизации любых экологических ниш с последующим закреплением и распространением в стационаре обладают изоляты, отличающиеся высокой пленкообразующей способностью, антибиотикорезистентностью, антагонистической активностью и широким набором факторов вирулентности.
3. Пленкообразующая способность P.aeruginosa в контексте нозокомиальной синегнойной инфекции может рассматриваться как возможная мишень и средство оценки эффективности мер воздействия различных факторов на нозокомиальные штаммы.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:
краевой конференции «Проблема синегнойной инфекции в реанимационных отделениях ЛПУ» (Пермь, 2009), VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), V Молодежной школе конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), научной сессии ПГМА (Пермь, 2010), XIII Международном конгрессе по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID (Москва, 2011), 4th Congress of European Microbiologists FEMS (Geneva, Switzerland, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Внедрение в практику. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами, врачами-интернами на кафедрах микробиологии и вирусологии, общей хирургии Пермской государственной медицинской академии, а также в клинической практике ГКБ №4.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с общим планом НИР ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, номер государственной регистрации 01.2.00709668.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 323 работы отечественных и зарубежных авторов.
Автор выражает искреннюю признательность главному бактериологу г. Перми Н.С. Авдеевой, врачу-бактериологу ГКБ № И.П. Новоселовой, зав. лаб. ГКБ №4 М.И. Еремеевой, врачу-бактериологу О.Е. Ямлихановой, а также заведующей лабораторией водной микробиологии д.м.н. Н.В.Немцевой (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург), к.м.н. С.М. Розановой и врачу-бактериологу В.П. Панюшову (Лаборатория микробиологии МУ «Клинико-диагностический центр», Екатеринбург), начальнику отдела учебно-методического и научного обеспечения ГБОУ ВПО ПГМА к.б.н.
Н.В. Чемурзиевой за оказанное содействие и участие в работе. Отдельная благодарность директору ИЭГМ УрО РАН чл.-корр. РАН, профессору, д.м.н.
В.А. Демакову, а также к.м.н. Л.М. Лемкиной и к.б.н. М.В. Кузнецовой за предоставленную возможность и содействие в выполнении работы.
Список сокращений. ГСИ – гнойно-септические инфекции, ЛПУ – лечебно-профилактическое учреждение, МПК – минимальная подавляющая концентрация, НОФР – неозонированный физиологический раствор, ОП – оптическая плотность, ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии, ОФР – озонированный физиологический раствор.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Изучено 204 штамма Pseudomonas аeruginosa, выделенных в 2008 2010 гг. от больных хирургических, акушерских и детских стационаров г. Перми, г. Екатеринбурга и г. Оренбурга. В качестве контрольного использовали референс-штамм P. aeruginosa АТСС 27853. Повторную идентификацию предоставленных клиническими лабораториями микробных культур проводили с использованием НЕФЕРМ-тест 24 Лахема Микро-Ла Тест (MIKRO-LA-TEST, Чехия).
При проведении исследований P. aeruginosa культивировали в аэробных условиях при температуре 37оС в течение 18-24 часов на жидкой и агаризованной среде Лурия-Бертани, ацетамидном агаре. Продукцию пиоционина оценивали согласно E. Deziel (2001). Фосфолипазную активность изучали на желточном агаре [Лабинская, 2004]. Качественную оценку гемолитической активности проводили на кровяном агаре, количественную – по D. Dacheux (2001) с использованием эритроцитов барана и человека. Для изучения пленкообразующей активности за основу была взята методика O`Toole G.F. (2000). Гидрофобность клеток оценивали по их относительному распределению между водной фазой и фазой органического растворителя гексадекана [Rosenberg, 1980;
Коваленко, 1998].
Чувствительность к антибиотикам определяли на Мюллер-Хинтон агаре в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Для получения экзометаболитов тест-штаммов культуральную жидкость 18-часовых тест культур отделяли фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.
При оценке характера взаимного влияния изучаемых штаммов P. aeruginosa и других распространенных возбудителей ГСИ были использованы тест-культуры соименных видов из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича с типичными морфологическими и биохимическими свойствами (E. coli № 25922 АТСС, K. pneumoniae № 49619 АТСС, S. aureus № 25923 АТСС, S. haemolyticus CCM № 2737, C. albicans №24433 АТСС). Результаты оценивали по оригинальной методике, изучая формирование моно- и смешанных биопленок. Если наблюдали аддитивный эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОПmix) достоверно не отличался от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП1+ОП2), – регистрировали нейтральный характер, если показатель ОПmixОП1+ОП2 – синергический характер, если показатель ОП mixОП1+ОП2 – антагонистический характер в межмикробном взаимодействии.
Действие озонированного физиологического раствора на рост, пленкообразующую способность и антибиотикорезистентность изолятов, а также разрушение биопленок, сформированных P. aeruginosae, под влиянием озона изучали по оригинальной методике (Патент №2425888 от 22.08.2011 г).
Для получения озонированного физиологического раствора использовали медицинский озонатор с широким диапазоном регулирования концентрации озонокислородной смеси. Физиологический раствор озонировали путем барботажа до получения необходимой концентрации.
Статистическую обработку данных и графическое изображение результатов проводили с использованием программ Statistica 6,0 и Excel 2003, а также авторского пакета прикладных электронных таблиц «Stat2000» [Шелудько, 2001]. Различие показателей оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Для оценки связи двух признаков рассчитывали величину статистического критерия 2. Силу связи признаков измеряли коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона.
Выравнивание динамического ряда производили с использованием метода наименьших квадратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Динамическая характеристика частоты встречаемости P. aeruginosa среди микробных культур, изолируемых от пациентов различных ЛПУ г. Перми. Согласно сводным статистическим данным бактериологической службы г. Перми в 2006-2010 гг. был обследован пациент, из клинического материала обследованных изолировано бактериальных и грибковых культуры, в том числе 1,62 ± 0,038 % P. aeruginosae, при среднемноголетнем уровне инфицированности 15,16 ± 0,354 на 1000 обследованных. Выравнивание динамического ряда показателей, оценка соотношения фактических данных и прямолинейной тенденции показали, что направленность пятилетней динамики инфицированности P. aeruginosa характеризовалась общей тенденцией к увеличению с темпом прироста 6,2% (рис.1). За 5 лет темп прироста данного показателя составил 28,35%.
на 1000 обследованных Рис. 1. Прямолинейная тенденция инфицированности P. aeruginosa.
В динамике обсемененности разного клинического материала наблюдали существенные колебания. На фоне увеличения инфицированности такие биологические среды, как раневое отделяемое, моча и мокрота, сохраняли свою приоритетную значимость в контексте выделения возбудителей и распространения синегнойной инфекции, оставаясь наиболее актуальным клиническим материалом (рис. 2).
Отделяемое ран Мокрота Моча Отделяемое зева и носа БАЛЖ Отделяемое полостей Отделяемое уха Секционный материал Другой материал Рис. 2. Структура исследуемого материала, наиболее часто служившего источником P. aeruginosa (среднее за 2006-2010 гг.).
Одним из характерных биологических признаков, отличающих синегнойную палочку от других микроорганизмов, является способность синтезировать водорастворимый пигмент – пиоцианин, регистрация которого используется в рутинной практике при идентификации P. aeruginosa. Хотя при первичном высеве на плотные среды атипичные беспигментные колонии встретились в нашем исследовании лишь в 4,4 % случаев, количественная оценка пигментообразования разными штаммами выявила существенные различия его интенсивности. Следовательно, только факт наличия этого признака, подлежащий учету при традиционном бактериологическом анализе, не позволяет оценить его вклад в патогенный потенциал изолированной культуры.
В клинических лабораториях особое внимание уделяется гемолитической активности P. aeruginosa, которая определяется при посеве на кровяной агар, в лучшем случае, с определением величины зоны гемолиза (просветления среды) вокруг колонии, появление которой исследователи связывают, главным образом, с действием фосфолипазы С, устойчивой к инактивации белками плазмы крови. Между тем, хорошо известно, что многие секретируемые субстанции, в том числе и пигменты синегнойной палочки, обладают гемолитическими свойствами. Для получения более полного представления о гемолитической активности и гемолизинах изучаемого изолята рутинную методику нельзя назвать исчерпывающей. При изучении данного признака за основу была взята количественная методика Dacheux D. (2001), модифицированная нами с учетом повышения эффективности сравнительного анализа изучаемых культур. Поскольку гемолизины синегнойной палочки различаются по устойчивости к температуре, дополнительно оценивали результаты «стандартного» и «терморезистентного» гемолиза. В сравнительном плане оценивали также информативность и целесообразность использования эритроцитов барана либо человека в проводимых тестах. Статистический, в том числе, корреляционный, анализ полученных результатов (табл. 1) позволил заключить, что для изучения данного признака у нозокомиальных штаммов следует использовать эритроциты человека, так как они оказались более чувствительными к действию гемолизинов клинических изолятов P. aeruginosa. Продление времени экспозиции эритроцитов с супернатантами бактериальных культур до 3 часов обеспечивает большую информативность получаемых результатов. Сравнение результатов, полученных при высеве культур на кровяной агар и при 3-часовой экспозиции взвеси эритроцитов с их нативными метаболитами, выявило умеренную положительную корреляцию зарегистрированных при этом показателей (r = 0,52). После кипячения и инактивации термолабильных гемолизинов, прежде всего фосфолипазы С, связь уровня гемолитической активности супернатантов с результатами традиционного метода практически утрачивалась (r = -0,27). В то же время, было установлено, что как минимум у трети культур гемолиз обеспечивали терморезистентные фракции. Это лишний раз указывает на то, что используемый в лабораторной практике качественный метод оценки гемолитической активности не позволяет проводить корректный сравнительный анализ степени ее выраженности у разных штаммов, так как не выявляет действие значительной части компонентов.
Развитие прикрепленных сообществ – одна из основных стратегий выживания бактерий и в окружающей среде, и в организмах инфицируемых хозяев [Ильина, 2006]. Показано, что пленкообразующим было большинство штаммов P. aeruginosa, выделенных как в (ОРИТ) (75,5%), так и в других отделениях (76,8%) всех ЛПУ, но «реанимационная» группа чаще проявляла высокий уровень способности к пленкообразованию. Высокая пленкообразующая активность обеспечивает конкурентоспособность штаммов и, по-видимому, может служить одним из маркеров внутрибольничных изолятов. Установлено, что максимальное усиление пленкообразующей активности при 20°С отличало непленкообразующие штаммы. Ответные реакции отдельных изолятов со средней и высокой пленкообразующей активностью существенно различались по степени Таблица 1.
Показатели лизиса эритроцитов человека и барана штаммами P. aeruginosa и их метаболитами в различных экспериментальных условиях ЭРИТРОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА % лизиса % снижения % лизиса % снижения показателя ГА показателя ГА Экспозиция Экспозиция После Экспозиция Экспозиция После ШТАММ после термо- после термо 1 с метабо- с метабо- термо- с метабо- с метабо- термо обработки обработки литами литами обработки литами литами обработки 1 час 3 часа 1 час 3 часа P.aeruginosa 801 1,40 48,54 48,84 41,72 14,6 0,62 36,93 47,49* 32,24 32, P.aeruginosa 27853 1,78 58,07 58,08 8,91 84,7 1,94 70,16 71,03 7,31 89, P.aeruginosa 117р 1,10 5,80 44,50* 6,99 84,3 1,30 5,03 27,54* 5,38 80, P.aeruginosa 5 1,47 56,56 57,63 2,15 96,3 1,70 40,84 55,14* 2,54 95, P.aeruginosa 3-7 2,48 20,99 95,44* 10,29 89,2 2,40 12,77 99,90* 8,18 91, P.aeruginosa 2459 1,51 5,97 9,13* 8,12 11,1 1,52 3,29 5,43* 4,83 11, P.aeruginosa 63 2,39 22,51 22,91 0,46 98,0 1,06 32,34 36,34 0,73 98, P.aeruginosa БАЛЖ 1,81 57,23 56,10 53,93 3,9 1,81 36,87 54,62* 51,93 4, P.aeruginosa мокр 3,04 15,18 79,09* 18,78 76,3 1,50 34,53 67,59* 10,97 83, P.aeruginosa 9-3 1,10 54,32 63,22 61,12 3,3 1,61 47,06 70,64* 56,27 20, 2,10 68,88 67,58 1,18 98,3 1,50 61,62 77,35 0,26 99, P.aeruginosa дренаж P.aeruginosa 29а 1,00 28,87 29,32 0,73 97,5 1,10 21,90 27,39* 0,76 97, P.aeruginosa ИТТ 1,82 67,30 69,16 8,92 87,1 2,18 49,81 80,06* 8,48 89, P.aeruginosa 8-4 1,40 10,97 19,78* 17,01 14,0 1,70 2,95 7,06* 7,33 -3, P.aeruginosa 565 1,22 7,19 21,42* 0,21 99,0 1,64 2,62 7,76* 6,07 21, 1 – Отношение диаметра зоны гемолиза к диаметру колонии;
* –различия достоверны при сравнении с 1-часовой экспозицией, p0,05.
выраженности, что позволяет рассматривать этот показатель в качестве прогностически значимого маркера при формировании госпитального штамма. К тому же, многие исследователи связывают формирование биопленок с образованием штаммами альгината (мукоида) – значимого фактора патогенности, продукция которого усиливается при комнатной температуре. По результатам нашего исследования, более 40 % культур было отнесено к мукоидным.
В значительном проценте случаев изолированные культуры оказались полирезистентными, их доля составила 79,4 %, при этом 22,8 % из них были устойчивы к действию всех антибиотиков взятого спектра, т.е.
характеризовались панрезистентностью. Особого внимания заслуживает прослеженный нами высокий процент устойчивости к меропенему (46,6 %) и имипенему (78,4 %) у штаммов P. аeruginosa, изолированных в разных стационарах г. Перми, хотя еще в 90-х годах в многоцентровом клиническом исследовании, проведенном в России, 92 % изолятов P. aeruginosa от больных с тяжелыми инфекциями в ОРИТ были чувствительны к карбопенемам, в частности, меропенему [Яковлев, 1998].
В стационарах селективное воздействие антибиотиков ускоряет процесс эволюции P. aeruginosa, где формируются полирезистентные бактериальные популяции [Сидоренко, 2005]. Именно поэтому чаще всего о госпитальной природе возбудителя ГСИ судят по его устойчивости к антибактериальным средствам. Однако, тот факт, что, как внутри-, так и внебольничные варианты синегнойной палочки оказывались полирезистентными, свидетельствует о том, что этот традиционный маркер госпитальности зачастую недостаточен для достоверной оценки природы выделенного штамма, так как для P. aeruginosa характерна природная устойчивость к различным соединениям с антибактериальной активностью.
Учитывая тот факт, что гены лекарственной устойчивости часто обнаруживаются в ассоциациях с детерминантами факторов патогенности, полирезистентные бактерии обычно более вирулентны и обладают значительной способностью к распространению [Васина, 2008]. В этой связи, основной раздел нашей работы был посвящен изучению биологических особенностей нозокомиальных штаммов и совершенствованию диагностических подходов к их дифференциации.
Пленкообразующая активность и полирезистентность к антибактериальным препаратам у P. aeruginosa не являются взаимообусловленными признаками, однако образование биопленок, как известно, значительно снижает эффективность антибиотикотерапии и результативность антисептических мероприятий. Тот факт, что способность к пленкообразованию в большинстве случаев сочетается с продукцией альгината и высокой антибиотикорезистентностью, вполне логичен и укладывается в существующие представления о персистентных свойствах бактерий. На основании изучения антибиотикограмм изолятов многопрофильных стационаров был выявлен наиболее распространенный антибиотикофенотип (А), характеризующийся устойчивостью к цефтазидиму, цефепиму, имипенему, гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину (табл. 2). С учетом панрезистентных вариантов, резистентность к этому набору антибиотиков была свойственна более чем 40 % изученных культур, большинство из которых обладали схожим набором факторов патогенности, отличаясь не более чем по одному признаку.
Таблица 2.
Наиболее распространенные фенотипы антибиотикорезистентности изученных штаммов P. aeruginosa Число Фенотипы антибиотикорезистентности % штаммов Цефтазидим + цефепим + имипенем + гентамицин + 52 25, амикацин + ципрофлоксацин (фенотип А) Панрезистентные штаммы (фенотип В) 37 18, Цефепим + имипенем + гентамицин + ципрофлоксацин 19 9, (фенотип С) Цефтазидим (фенотип D) 12 5, Цефтазидим + имипенем + гентамицин + амикацин + 11 5, ципрофлоксацин (фенотип E) Данные штаммы, в основном, были выделены в ОРИТ, однако присутствовали и в материале из других отделений, что характеризует отделение реанимации, как возможное место возникновения и источник распространения госпитальных штаммов P. aeruginosa. Более того, штаммы, изолированные из ОРИТ всех ЛПУ, наряду с выраженной множественной лекарственной устойчивостью характеризуются наиболее широким набором экспрессируемых факторов патогенности. С одной стороны, в этом проявляется определенное противоречие, так как защитные реакции организма у пациентов этих отделений в большинстве случаев снижены, и микроорганизмам нет необходимости проявлять патогенный потенциал в полной мере. С другой стороны, условия и средства оказания помощи, контингенты больных именно в отделениях реанимации становятся мощным провоцирующим и селективным фактором, способствующим изменению свойств бактерий. Характерная выраженность факторов патогенности и устойчивости к антибактериальным препаратам наблюдается и в отделениях с близким ОРИТ «статусом». Сочетание устойчивости к антибиотикам широкого набора факторов вирулентности с высокой степенью пленкообразующей способности указывает на то, что в условиях стационара, и прежде всего ОРИТ, именно в пленках накапливается высокий патогенный потенциал, вследствие чего пленкообразующие штаммы нередко становятся возбудителями острых инфекций. В целом полученные результаты по изучению особенностей формирования биопленок внутрибольничными штаммами P. aeruginosa указывают на то, что данный признак может служить одним из маркеров госпитальности, а выявление изолятов с высокой степенью пленкообразования требует новых подходов к организации и проведению дезинфекционных мероприятий по элиминации возбудителя.
Пленкообразующая способность может играть решающую роль и при развитии ГСИ, обусловленных двух-, трех- и более компонентными ассоциациями условно патогенных микроорганизмов, которые, как правило, характеризуются длительным и малосимптомным течением. Мы предположили, что характер межмикробных взаимоотношений с участием P. aeruginosa целесообразно определять при сравнительном анализе сформированных ассоциантами моно- и бипленок. (заявка на изобретение № 2010127885 от 06.07.2010). Использование в качестве тест-культур штаммов микроорганизмов, наиболее часто выделяемых в ассоциации с синегнойной палочкой, позволило выявить нейтральный, синергический и антагонистический типы взаимодействия. При этом установлено, что при совместном культивировании P. aeruginosa с грамположительными бактериями, развиваются все три типа взаимодействия, а определяющее значение имеют клеточные компоненты тест-культур, в то время как с грамотрицательными бактериями и их метаболитами – в большинстве случаев наблюдается однонаправленный эффект, ингибирующий пленкообразование. Очевидно, что при формировании смешанных биопленок могут складываться разнообразные метаболические взаимоотношения между ассоциантами, усугубляющие инфекционный процесс либо препятствующие его развитию.
Нами предложена и апробирована модификация диско-диффузионного метода определения антибиотикочувствительности, основанная на отсроченном выкладывании дисков на бактериальный газон и имитирующая воздействие на сформированную биопленку. После предлагаемой 10-часовой отсрочки у штаммов с различной степенью чувствительности исчезновение зоны задержки роста зафиксировано у 88,4% исследованных штаммов. При этом обнаружена сильная зависимость (Кп=0,94) между исчезновением зоны и способностью штамма к пленкообразованию. Такой подход дополняет регламентированную методику и решает две задачи: во-первых, он может способствовать более корректному выбору антибактериального средства с учетом пленкообразующей способности штамма, во-вторых, позволяет сделать вывод о степени выраженности последней (рацпредложение № от 07.06.2011).
В клинической практике все чаще возникает проблема появления штаммов бактерий, резистентных к наиболее распространенным антибактериальным препаратам, что ограничивает возможности антибиотикотерапии. Поэтому одно из важнейших направлений развития современной медицины – создание альтернативных противомикробных средств и методов лечения, обладающих, наряду с высокой эффективностью, хорошей переносимостью и простотой в применении. Лечение воспалительных процессов с помощью озона – один из таких методов.
Исследователи связывают его эффективность с выраженными детоксикационными, иммуностимулирующими, регенерирующими свойствами. Приводимые в литературе данные по поводу прямого воздействия терапевтических концентраций озона на бактериальную флору довольно противоречивы. Нами установлено, что обработка культур ОФР с концентрацией озона 2,5 и 5 мг/л в течение 10-минутной экспозиции стимулировала накопление биомассы, при этом для каждого третьего штамма различия с контролем были достоверны (р0,05). Концентрация озона 7,5 мг/л значимо замедляла этот процесс.
Наибольшее снижение пленкообразующей способности наблюдали также при концентрации 7,5 мг/л: ОП580 элюата уменьшалась в среднем с 1,009±0,079 до 0,770±0,090. Массивность пленки при концентрации 2,5 мг/л либо значимо не изменялась, либо достоверно увеличивалась. Повышение содержания озона до 5 мг/л усиливало пленкообразование у половины исследуемых штаммов P. aeruginosae в среднем с 1,837±0,098 до 1,998±0, ЕД ОП580, в остальных случаях оно либо значимо не изменялось, либо достоверно снижалось (рис. 3).
Обработка сформированных биопленок ОФР разных концентраций приводила к их частичному (при содержании озона 2,5-5 мг/л) или практически полному разрушению (при 7,5 мг/л). Пленки подвергались деструктивному воздействию озона независимо от того, как «откликались»
на него планктонные формы образующих их штаммов (рис.4). Очевидно, что ОП 2, НОФР ОФР 2,5 мг/л 1,5 ОФР 5 мг/л ОФР 7,5 мг/л 0, 8 8 8 8 8 8 8 8 8 sa sa sa sa sa sa sa sa sa no no no no no no no no no gi gi gi gi gi gi gi gi gi ru ru ru ru ru ru ru ru ru ae ae ae ae ae ae ae ae ae P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
Рис. 3. Изменение пленкообразующей активности бактериальных культур под влиянием ОФР разных концентраций (показатели оптической плотности элюата).
ОП 2, НОФР ОФР 2,5 мг/л 1,5 ОФР 5 мг/л ОФР 7,5 мг/л 0, 8 8 8 8 8 8 8 8 8 sa sa sa sa sa sa sa sa sa no no no no no no no no no gi gi gi gi gi gi gi gi gi ru ru ru ru ru ru ru ru ru ae ae ae ae ae ae ae ae ae P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
P.
Рис. 4. Разрушение биопленок, сформированных бактериальными культурами, под влиянием ОФР разных концентраций.
при окислительном стрессе слабой интенсивности может наблюдаться стимуляция роста и пленкообразующей активности госпитальных штаммов P. aeruginosa, что необходимо учитывать при назначении озонотерапии.
Наиболее существенным эффектом, прослеженным при воздействии озона in vitro, явилось снижение МПК антибактериальных препаратов после обработки штаммов ОФР. При этом чем выше была концентрация озона, тем восприимчивее становился микроорганизм. В то же время концентрации препаратов, отмеченные ранее как минимальные подавляющие, помимо роста бактерий ингибировали их пленкообразование до уровня контроля.
Тот факт, что озон вызывает деструкцию сформированных биопленок и под влиянием ОФР повышается чувствительность к антибиотикам как планктонных, так и сесильных форм, указывает на целесообразность его использования в клинической практике. Однако для выработки конкретных рекомендаций необходимо проведение углубленных исследований, раскрывающих механизмы такого влияния.
ВЫВОДЫ 1. Среднемноголетний показатель инфицированности P. aeruginosa за период 2006-2010 гг. составил 15,16 ± 0,354 на 1000 обследованных.
Расчет границ достоверности прямолинейной тенденции указывает на значимый рост инфицированности в период наблюдений с темпом прироста 28,35%.
2. Установлено, что подавляющее большинство изолятов (79,4 %,) отличала множественная лекарственная устойчивость, при этом 43,6 % штаммов были резистентны к следующему набору антибиотиков:
цефтазидим, цефепим, имипенем, гентамицин, амикацин, ципрофлоксацин.
3. Более половины изолятов (53,1 %) с широким спектром антибиотикоустойчивости образовывали пигмент, гидролизовали эскулин, проявляли гемолитическую, фосфолипазную, пленкообразующую активность. При этом подавляющее большинство эскулинпозитивных изолятов (85,4 %) оказались полирезистентными, а 41,5 % – панрезистентными.
4. При определении госпитальной природы штаммов P. aeruginosa необходим комплексный подход, включающий определение фенотипа антибиотикорезистентности, способности к гидролизу эскулина, а также «терморезистентного» гемолиза, пигментообразования и пленкообразующей способности с обязательной количественной оценкой степени их выраженности.
5. Модифицированный диско-диффузионный метод дополняет регламентированную методику определения антибиотикочувствительности, отражая ее изменение в зависимости от пленкообразующей способности штамма. Предложенная методика оценки взаимного влияния P. aeruginosa и микрооргазизмов-ассоциантов позволяет установить характер взаимодействия между ними (нейтрализм, антагонизм, синергизм) и прогнозировать развитие микст-инфекции.
6. Установлено, что ОФР низкой концентрации (2,5 мг/л и 5 мг/л) может оказывать стимулирующее воздействие на бактериальные клетки и дозозависимо влиять на повышение чувствительности к антибактериальным препаратам как планктонных, так и структурированных в биопленку форм.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ 1. Карпунина Т.И., Николаева Н.В., Кузнецова М.В., Демаков В.А. Сравнительный анализ фенотипов Pseudomonas aeruginosa, изолированных в многопрофильном хирургическом стационаре // Вестник РУДН. Серия Медицина. – 2009. – № 4. – С. 489-492.
2. Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Касатов А.В., Карпунина Т.И. Фенотипические характеристики штаммов Pseudomonas aeruginosa, изолированных в стационарах хирургического профиля // Уральский медицинский журнал. – 2009. – № 9 (63). – С. 103-107.
3. Карпунина Т.И., Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Демаков В.А. Эпидемиологические аспекты нозокомиальной синегнойной инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре // Сибирский медицинский журнал. – 2009. – Т. 24. – № 4 (1). – С. 70-73.
4. Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Розанова С.М., Карпунина Т.И. Формирование биопленок нозокомиальными штаммами Pseudomonas aeruginosa // Журн. микробиол. – 2011. – № 4. – С. 8-14.
Публикации в других журналах и сборниках 5. Николаева Н.В., Кузнецова М.В. Сравнение профилей антибиотикорезистентности Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, циркулирующих в многопрофильном стационаре // Матер. V молодежной школы-конф. с междунар. участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва. – 2009. – С.44-45.
6. Николаева Н.В., Белякова Т.Б. Влияние озона на биопленки бактерий, изолированных от больных с панкреонекрозом // Матер. IV Междунар. научной конференции молодых ученых-медиков, Курск. – 2010. – Т. 2. – С. 349-351.
7. Николаева, Н.В. Формирование и разрушение биопленок под влиянием озонированного физиологического раствора // Матер. XV Всерос.
научно-практической конф. с междунар. участием «Молодые ученые в медицине», Казань. – 2010. – С. 96.
8. Демаков В.А., Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Николаева Н.В.
Гидрофобные свойства и пленкообразующая способность штаммов рода Pseudomonas, изолированных из разных экологических ниш // Вестник Пермского университета. Серия Биология. – 2010. – Вып. 1. – С. 55-58.
9. Николаева Н.В., Дробкова В.А., Кузнецова М.В., Карпунина Т.И. Изучение межмикробных взаимодействий нозокомиальных штаммов в биопленках in vitro // Современные проблемы инфекционной патологии человека: сб. науч. трудов. – Минск, 2010. – Вып. 3. – С. 213-218.
10. Карпунина Т.И., Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Демаков В.А. Распространенность карбапенемоустойчивых штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах г. Перми // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2010. – № 2 (12). – С. 32.
11. Самарцев В.А., Карпунина Т.И., Николаева Н.В., Осокин А.С., Соснин Д.Ю. Особенности озонотерапии пленкообразующей бактериальной флоры при панкреонекрозе // Тезисы докладов XVII междунар. конгресса хирургов-гепатологов России и стран СНГ «Актуальные проблемы хирургической гепатологии». – Уфа, 2010. – С. 102-103.
12. Карпунина Т.И., Николаева Н.В, Осокин А.С., Сампрцев В.А. Изменение чувствительности к антибиотикам Pseudomonas aeruginosae под влиянием озонированного физиологического раствора // Журн. инфектологии. – 2010. – Т. 2. – № 4. – С. 72.
13. Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Николаева Н.В., Розанова С.М., Панюшов В.П., Демаков В.А. Устойчивость к карбапенемам штаммов Pseudomonas aeruginosa, циркулирующих в хирургических стационарах Перми и Екатеринбурга // Материалы XIII Международного конгресса по антимикробной терапии МАКМАХ/ESCMID, КМАХ. – Москва, 2011. – Т.13. – №2, приложение 1. – С. 22-23.
14. Karpunina T.I., Kuznetsova M.V., Maslennikova I.L., Nikolaeva N.V., Nesterova L.Ju. Evaluation of antagonistic activity of Pseudomonas aeruginosa nosocomial strains by bioluminescent technique // Abstracts of 4th FEMS Congress of European Microbiologists. – Switzerland, Geneva, 2011.
15. Nikolaeva N.V., Karpunina T.I., Kuznetsova M.V. Oxidative stress and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa nosocomial strains // Abstracts of Internatinal Union of Microbiological Societies Congress. – Japan, Sapporo, 2011. – P-BA19-8.
Патенты и рацпредложения:
1. Карпунина Т.И., Кузнецова М.В., Николаева Н.В., Сампрцев В.А., Еремеева М.И., Осокин А.С., Кирилова Т.А. Способ оценки антибактериального действия озонированного физиологического раствора // Патент RU 2425888 C 1 от 10.08.2011.
2. Карпунина Т.И., Николаева Н.В., Коколева А.С. Способ определения степени антибиотикочувствительности микробных культур // Рацпредложение № 2549 от 07.06.2011.