Механизмы действия фенозана калия в сверхмалых дозах на плазматические мембраны in vitro
На правах рукописи
Часовская Татьяна Евгеньевна
МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ФЕНОЗАНА КАЛИЯ В СВЕРХМАЛЫХ ДОЗАХ
НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ IN VITRO
03.01.02 – биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук Пальмина Надежда Павловна, доктор биологических Научный наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории руководитель:
физико-химических основ регуляции биологических систем федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики имени Н.М.
Эмануэля Российской академии наук Воейков Владимир Леонидович, доктор биологических Официальные наук профессор кафедры биоорганической химии оппоненты:
биологического факультета федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Куроптева Зоя Вениаминовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции биоэнергетических и иммунных процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение Ведущая науки Институт биофизики клетки Российской академии организация:
наук, г. Пущино
Защита состоится «27» ноября 2013 г. в 12-00 на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д.4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.
Автореферат разослан «_»2013 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук, _ Мазалецкая Л.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Одним из важных фундаментальных открытий последних десятилетий является обнаружение влияния растворов биологически активных веществ (БАВ) в низких (включая пикомолярные) и сверхнизких (фемтомолярные и ниже) концентрациях на биологические процессы. Эффекты сверхмалых доз (СМД) были зарегистрированы в экспериментах с веществами различной химической природы и биологического действия: гормонами, антиоксидантами, противоопухолевыми агентами, иммуномодуляторами и др. (Бурлакова, 1986;
Ашмарин, 1992;
Зайцев, 1993;
Bonavida, 1991;
Doutremepuich, 1991;
Benveniste, 1988;
Ямсков, 1999) на системах с различным уровнем биологической организации – от макромолекул и клеточных структур, до целых организмов и популяций. Однако, несмотря на большой объем накопленных за десятилетия экспериментальных данных, до сих пор не создано единой теории, способной объяснить подобные явления. Тем не менее, был выявлен ряд общих закономерностей, характерных для эффектов разнообразных БАВ с СМД (РХЖ, 1999). Наличие подобных закономерностей, возможно, связано с общностью критических мишеней действия БАВ. В качестве последних могут выступать плазматические мембраны клеток (ПМ), поскольку в них сосредоточены важнейшие регуляторные системы, отвечающие за функционирование клетки: системы вторичных посредников (циклических нуклеотидов и фосфоинозитидного цикла), обладающие свойствами каскадного усиления сигнала при проведении его в клетку (Nishizuka, 1984;
Yoshimasa, 1987;
Taylor, 1986) и система регуляции пероксидного окисления липидов (ПОЛ), определяющая состояние липидного бислоя (Владимиров, 1972;
Бурлакова, 1967). В силу своей общей локализации данные регуляторные системы влияют друг на друга (Yoshimasa, 1987;
Bouvier, 1990;
Mal'tseva, 1997), поэтому вещества, модифицирующие состояние одной из них, могут индуцировать изменения и в других.
Ранее было зафиксировано влияние СМД таких БАВ, как природный антиоксидант -токоферол, пептид тиролиберин и форболовые эфиры, на основные параметры системы ПОЛ, в частности структуру мембран, и сделаны предположения о механизмах действия этих агентов в СМД (Жерновков, 2007;
Белов 2011;
Пальмина, 1992). Все эти вещества природного происхождения, т.е. в норме входят в состав биологических систем в физиологических концентрациях. Для ответа на вопрос о том, насколько общими являются механизмы действия разнообразных БАВ в СМД, целесообразно проведение аналогичных исследований с синтетическими веществами, например с синтетическим антиоксидантом. В качестве такого БАВ нами был выбран фенозан калия (3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил пропионат калия), обладающий широким спектром биологического действия, в том числе и в СМД.
Целью данной работы являлось выяснение возможных механизмов действия фенозана калия (ФК) в интервале концентраций 10-5-10-20 М на плазматические мембраны клеток печени мышей in vitro посредством изучения закономерностей действия данного вещества на структуру различных липидных регионов и термодинамические характеристики мембраносвязанных белков, а также на структурно-динамическое состояние, размеры и форму липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ.
Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-5 - 1. Изучить влияние ФК в концентрациях 10 -10 М на микровязкость глубоколежащих областей (~20-22 ) и параметр упорядоченности поверхностных областей (~8 ) липидного бислоя ПМ и липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, при постоянной температуре 20оС методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), с использованием в качестве зондов стабильных свободных радикалов 16- и 5-доксилстеариновых кислот, обозначаемых соответственно С16 и С5, нитроксильные фрагменты которых локализуются в указанных липидных областях. Получить зависимости доза-эффект.
2. Исследовать влияние отдельных концентраций ФК, оказавших наибольший эффект на структурно-динамические параметры липидов при 20оС, на положение, ширину и эффективную энергию активации термоиндуцированных структурных переходов в различных областях липидного бислоя мембран и липосом в диапазоне температур 12-42оС методом ЭПР.
3. Определить изменения термодинамических характеристик суммарных белков, входящих в состав ПМ, индуцированные ФК в концентрациях, оказавших максимальное и нулевое влияние на липидную компоненту мембран методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).
4. Изучить действие ФК в концентрациях 10-5-10-20 М на размеры и форму липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ, методами динамического светорассеяния (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).
5. Провести корреляцию между изменениями структурных характеристик ПМ, индуцированных растворами ФК и физико-химическими свойствами этих растворов.
Научная новизна В данной работе впервые показано, что синтетический антиоксидант ФК в экспериментах in vitro в широком диапазоне концентраций, включающем сверхмалые (10-13-10-19 М), существенно модифицирует структурно-динамические параметры различных липидных регионов ПМ, выделенных из печени мышей, и липосом, приготовленных из липидных экстрактов ПМ. Зависимость эффекта от дозы ФК имеет бимодальный характер с максимумами в интервале «физиологических»
концентраций (10-5-10-7 М) и СМД, разделенными «мертвыми зонами», где эффект отсутствует. Принципиально дозовые зависимости для ФК не отличаются от таковых, полученных для веществ природного происхождения, в частности -ТФ (Белов, 2011), за исключением того, что максимумы эффектов ФК в СМД в поверхностных и глубоколежащих областях липидов ПМ наблюдаются при действии разных концентраций препарата: (10-13-10-15М) – в поверхностных;
(10-18-10-19 М) - в глубоколежащих.
Впервые обнаружено, что ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения в параметрах микровязкости и упорядоченности липидной компоненты, индуцирует появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода липидов в области физиологических температур (40-42оС).
Впервые показано, что эффект СМД ФК сохраняется при полном отсутствии белков в системе. Закономерности, наблюдаемые при действии СМД ФК на ПМ и липосомы, приготовленные из липидных экстрактов ПМ, полностью совпадают. Эти результаты позволяют полагать, что первичной мишенью действия ФК в СМД являются именно липиды и механизм данного феномена не обусловлен взаимодействием с рецепторными белками.
Впервые установлено, что эффект ФК в области СМД обусловлен физико химическими свойствами «наноассоциатов», образованных из молекул ФК и воды.
Основные положения, выносимые на защиту 1. ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидных регионов ПМ как в «физиологических» дозах (10-5-10- М), так и в СМД (10 -13-10-15 М, 10-18-10-19 М, соответственно). Концентрационная зависимость эффекта имеет бимодальный характер, свойственный веществам, проявляющим активность в СМД.
2. ФК в широком диапазоне концентраций, включающем СМД, способен оказывать влияние на температуры и энтальпии переходов в белках ПМ. Наибольшее воздействие наблюдается для доз 10-6 М и 10-18 М, что соответствует наибольшим изменениям в микровязкости глубоколежащих областей липидов ПМ (~20-22 ).
3. ФК способен модифицировать структурно-динамическое состояние гидрофильных и гидрофобных липидных регионов липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, подобно влиянию на мембраны. Эффекты СМД ФК (10-13-10-15 М, 10 -10-19 М) сохраняются в отсутствии белковой фракции, следовательно, первичной мишенью действия препарата являются липиды.
4. Изменения, индуцируемые в липосомах ФК в концентрациях 10-5-10-7 М и 10-13-10 М приводят к увеличению их гидродинамического диаметра и изменению формы от шарообразной к палочкообразной.
5. Корреляция между структурно-динамическими изменениями, индуцированными СМД ФК в ПМ и липосомах, и дозовыми зависимостями физико-химических свойств разбавленных водных растворов ФК позволяет сделать вывод о ключевой роли «наноассоциатов», состоящих из молекул ФК и воды, в механизме действия СМД.
Личный вклад автора Личный вклад автора состоял в подготовке образцов, проведении биофизических экспериментов, обработке и анализе полученных данных, формулировании положений и выводов, подготовке статей к опубликованию и участии в конференциях. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором лично или при ее непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов.
Научно-прикладное значение работы Данная работа является составной частью комплекса научных исследований проблемы действия БАВ в СМД. Полученные в работе выводы и используемые методологические подходы могут быть применены в её решении. В частности, изменение структурно-динамических характеристик биомембран и липосом может быть использовано в качестве чувствительной модели для скрининга БАВ, действующих в ультранизких концентрациях;
снижения терапевтических доз препаратов, активных в СМД, при сохранении их эффективности и уменьшении вероятности побочных эффектов. Результаты о влиянии ФК в СМД на структуру и форму липосом могут быть полезны для разработки методов стабилизации липидных оболочек лекарственных препаратов.
Работа выполнена в лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ФГБУН ИБХФ РАН) в соответствии с научным направлением «Изучение механизмов и эффектов действия химических и физических факторов (в т.ч. в сверхмалых дозах и при низких интенсивностях излучения) на биологические системы различной степени сложности с целью создания новых протекторных средств и лекарственных препаратов». Работа поддержана Программой ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».
Апробация диссертационной работы Материалы работы были представлены в России на: ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН – ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, ноябрь 2007 2010;
Ежегодной конференции МФТИ, Долгопрудный, 2007;
VII Международной конференции «Биооксидант», Москва, октябрь 2010;
I международной конференции МФТИ БФК «Северный», Москва, май 2011;
Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии», Москва, октябрь 2011;
Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики», Черноголовка, июнь 2011;
VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, июль 2012;
Международной конференции «Структура воды: физические и биологические аспекты», Санкт-Петербург, сентябрь 2013.
Результаты были представлены на зарубежных конференциях: 50-th International Conference on the Bioscience of Lipid, Regensburg, Germany, August 2009;
FEBS Advanced Course "Lipid Signaling and Disease", Ortona, Italy, September 2009;
Issfal Conference. Maastricht, The Netherlands, May 2010;
8-th Euro Fed Lipid Congress, Munich, October 2010;
9-th Euro Fed Lipid Congress, Rotterdam 2011;
52-nd International Conference on the Bioscience of Lipids, Warsaw, Poland, August 2011;
VI Conference on the Physics, Chemistry and Biology of Water, Vermont, USA, October 2011;
International Workshop «Lipids: from Lipidomics to Disease and Green Energy», Spetses, Greece, August 2012;
10-th Euro Fed Lipid Congress, Cracow, Poland, September 2012.
Публикации в рецензируемых журналах Основные положения диссертационной работы опубликованы в 16 печатных работах, из которых 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 12 публикаций в сборниках научных трудов и тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, основных выводов и списка литературы.
Работа изложена на 160 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 10 таблицами.
Библиография включает список из 257 работ.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Во введении охарактеризована тема работы, обоснована ее актуальность, определены цели и задачи исследований, положения, выносимые на защиту, научная новизна работы и ее научно-прикладное значение.
Глава 1 содержит обзор литературы по теме диссертации, в котором рассматриваются современные представления о роли клеточных мембран и регуляторных систем, сосредоточенных в мембранах, а также структурирования молекул воды в разбавленных растворах в механизме действия различных БАВ в СМД. Подробно рассмотрено строение и свойства фенозана калия, проявления его активности в СМД на различных моделях in vivo и in vitro.
Глава 2 посвящена материалам и методам исследования. Водные растворы ФК готовили методом последовательного разведения раствора исходной концентрации 10-3 М на порядок. В качестве исследуемых объектов использовали ПМ печени мышей линии F1 (C57 x DBA2), выделенные методом последовательного центрифугирования (Loten, 1986). Содержание белка в мембранах определяли по методу Лоури (Lowry, 1951). Экстракция липидов из ПМ производилась по методу Блайя и Дайера (Bligh, 1954). Липосомы готовили из суммарных экстрагированных липидов с помощью регидратации буфером СЭТ (pH 7,3), содержащим 0,25М сахарозы, 10мМ трис-HCl и 1мМ ЭДТА, использовавшимся для хранения мембран, и обработки полученной суспензии ультразвуком. Все проведенные эксперименты воспроизводились на мембранах, выделенных в разные времена года. Для опытов использовались мембраны, размороженные в день эксперимента и хранившиеся не более 4х дней при 4оС, или липосомы, хранившиеся не более 3х дней после приготовления при 4оС.
Структурное динамическое состояние ПМ и липосом изучали на ЭПР-спектро метрах “Bruker 200D” и “Bruker EMX” (Германия) методом спинового зонда (Кузнецов, 1976, Гриффит, 1979). В качестве зондов были взяты стабильные нитроксильные радикалы 5- и 16-доксилстеариновые кислоты (зонды С5 и С16), локализующиеся на различных глубинах в липидном бислое (~8 и ~20-22, соответственно;
рис. 1). Конечная концентрация зондов в мембранах и липосомах не превышала 6·10 -5 М. Спектры зонда С 5 характеризовали параметром упорядоченности S, а зонда С16 временем вращательной корреляции с (рис. 1).
Рисунок 1. Структурные формулы, спектры в мембранах и липосомах, а также формулы расчета параметров S и с зондов С16 (а) и С5 (б) Образцы для исследования методом ЭПР инкубировали при 4 оС с зондом в течение 15-20 минут, затем измеряли контроль при постоянной температуре 20оС, после чего к измеренным образцам добавляли ФК в необходимой концентрации, и, после инкубации в течение 15 минут, измерения повторялись для исследования эффекта введения препарата. При изучении температурных зависимостей структурно динамических характеристик ПМ и липосом в диапазоне 12-42оС измерения контроля и опыта проводились на разных образцах, т.к. нагретые до 42оС в контроле пробы были непригодны для использования в опыте.
Положения термоиндуцированных струк турных переходов определялись по изломам между линеаризованными участками температурных зависимостей в Аррениусовых координатах, как показано на рис. 2 и описано в работе (Chapman, 1975). Точками излома считали те точки, добавление которых к спрямленному участку графика выводило коэффициент корреляции за пределы норм, Рисунок 2. Характерная температурная определяемых статистической надежностью зависимость параметра с зонда С16 в Аррениусовых координатах на примере 95%. На рис. 2 также представлен способ контрольной пробы ПМ расчета эффективной энергии активации эфф Eакт переходов в глубоколежащих слоях липидов ПМ и липосом.
Исследование влияния ФК на термолабильность белковой фракции ПМ проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ- (Пущино, Россия). Метод ДСК подробно описан в работах (Шестак, 1987, Hohne, 2003). Эксперименты выполнены совместно с к.х.н. Козловым С.С. и д.х.н.
Семёновой М.Г.
Суспензия ПМ объемом 1мл, содержащая 5мг/мл белка, помещалась в калори метрическую ячейку и исследовалась в интервале температур 40-90оС при скорости нагрева 1оС/мин и избыточном давлении 2. бар. Образцом сравнения служила среда выделения СЭТ (рН 7,3). Полученные ДСК термограммы суспензии ПМ после вычитания базовой линии обрабатывали методом Рисунок 3. Деконволюция ДСК термограммы ПМ в контроле.
деконволюции с помощью программы PeakFit Концентрация белка 5 мг/мл, скорость v4.12 (SeaSolve Software Inc.). Положения сканирования 1оС/мин скрытых пиков вычисляли на основе анализа второй производной калориметрической кривой. В качестве примера, на рис. представлена деконволюция ДСК-термограммы ПМ в контроле.
Определение гидродинамического диаметра липосом проводили методом динамического рассеяния света, ДРС, или фотонной корреляционной спектроскопии (Berne, 1990) при постоянной температуре +25 оС с помощью анализатора Malvern Zetasizer Nano S (Malvern Instruments Ltd., Великобритания). Эта часть работы выполнена совместно с к.х.н. Плащиной И.Г. Показания измеряли в контроле, затем в исследуемом образце последовательно увеличивая концентрацию ФК от 10-19 М до 10-4 М (после каждого добавления препарата образец инкубировали 15 минут). Как показали данные, полученные в ходе экспериментов, схема введения (интервал увеличения концентраций, стартовая концентрация в серии) не влияла на результат.
Для сравнительного анализа гидродинамического диаметра частиц использовали положение максимума наибольшего пика интенсивности сигнала (70-90%), которое усредняли по 6-9 независимым экспериментам для каждой концентрации ФК. Индекс полидисперсности составлял в среднем 0,4, средняя скорость счета 280 kcps.
Действие ФК на форму и размеры липосом было изучено методом атомно-силовой микроскопии, АСМ (Muller, 2008, Dufrene, 2008) совместно с к.б.н. Бинюковым В.И..
Изображения липосом были получены с помощью атомно-силового микроскопа SOLVER P47 (SMENA, NT-MDT, Россия), в полуконтактном режиме на частоте колебаний 150 кгц, с использованием кантилевера NSG. Измерения производили с использованием воздушно сухих пленок, образующихся при высыхании тонкого слоя суспензии липосом на кремниевой подложке при комнатной температуре.
Характеристики липосом по полученным изображениям вычислялись с помощью программы NT-MDT Image Analysis V. 2.2.
Статистическая обработка данных осуществлялась методами параметрической и непараметрической статистики с использованием пакетов компьютерных программ Microsoft® Office Excel и OriginLab® 8.5 при статистической надежности 95%.
Относительные эффекты рассчитывались по формуле X опыт X контроль, где X – исследуемый параметр Эффект 100% X контроль Результаты экспериментов Представлены в Главе 3 диссертации.
Влияние ФК на плазматические мембраны клеток печени мышей in vitro 1. Действие ФК в концентрациях 10-5-10-20 М на вязкостные характеристики различных по глубине липидных регионов плазматических мембран при постоянной температуре 20 оС, изученное методом ЭПР Вязкостные характеристики липидного бислоя при заданной температуре являются важными структурно-динамическими параметрами, влияющими на функциональную активность компонентов мембраны. Мы изучили влияние ФК на с глубоколежащих (~20-22 ) и S поверхностных областей (~8 ) липидов ПМ при постоянной температуре 20 оС. Полученные данные представлены на рис. 4 и выражены в процентах по отношению к контролю.
Каждая точка на рис. 4 является усреднением результатов 3- независимых экспериментов (каждый эксперимент включает 10 измерений контроля и 12 – опыта). Средние значения изучаемых параметров в контроле составили с = 1,71±0,03 нс, S = 0,643±0,002. Дозовая зависимость для с (кривая 1), описывается Рисунок 4. Дозовые зависимости влияния ФК на наличием двух максимумов 10-5 микровязкость глубоколежащих областей (кривая 1, черная) и жескость поверхностных регионов 10-7 М (~11%) и 10-17-10-19 М плазматических мембран (кривая 2, серая) при (~7%), разделенных интервалом температуре 20 оС концентраций 10-8-10-16 М, для которого не обнаружено статистически достоверных эффектов. Для параметра упорядоченности S, (кривая 2) – двумя максимумами 10-6-10-7 М (~1,8%) и 10-13-10- М (~1,5%), также разделенными областью концентраций 10 -8-10-12 М, где эффект отсутствует. Сравнивая положение максимумов на данных кривых, можно отметить, что в области традиционных «физиологических» концентраций (10-5-10-9 M) наблюдаются однотипные увеличения параметров с и S, в то время как вторые максимумы на кривых 1 и 2 на рис. 4 в области СМД относятся к разным концентрационным интервалам (10 -13-10-15 М для S и 10-18-10-19 М для с).
Полученные дозовые зависимости эффекта ФК на структурно-динамические характеристики ПМ имеют полимодальный характер, типичный для веществ, проявляющих эффект в СМД.
2. Влияние отдельных концентраций ФК на термоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине липидных регионах, а также на эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липидов ПМ в диапазоне температур 12-42 оС, наблюдаемое методом ЭПР Помимо изменений вязкостных параметров липидного бислоя при постоянной температуре (с и S), важными характеристиками, описывающими динамическое состояние мембраны, являются количество и качество термоиндуцированных структурных переходов. Они представляют собой кооперативные структурные перегруппировки липидов при повышении температуры, которые сопровождаются скачкообразным изменением вязкостных характеристик. Для выявления переходов были определены зависимости с и S от температуры в контроле и при добавлении тех концентраций ФК, которым соответствовали максимумы или отсутствие эффектов на дозовых зависимостях (рис.4). Полученные результаты в Аррениусовых координатах представлены на (рис. 5).
Рисунок 5. Температурные зависимости параметра с, характеризующего микровязкость глубоколежащих областей липидного бислоя (20-22 ), и параметра S, характеризующего степень упорядоченности областей липидного бислоя (8 ) в контроле (а, г) и при действии ФК в концентрациях 10-6(д), 10-7(б), 10-14 (в) и 10-18 М (е). Стрелками отмечены положения термоиндуцированных структурных переходов Полученные сведения о положениях и эффективной энергии активации переходов (в глубоколежащих областях) суммированы в табл. 1.
Таблица 1. Положения термоиндуцированных переходов в ПМ в контроле и под действием различных концентраций ФК, а также эффективная энергия активации переходов в глубоколежащих эфф областях Eакт, кДж/М T, oC 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 контроль 6,5±0,2 8,1±0, 10-6 М ФК 6,9±0,3 8,8±0, С 10-13 М ФК 6,5±0,3 8,1±0, 10-18 М ФК 7,8±0,4 9,1±0,9 6,7±0, контроль 10-6 М ФК 10-7 М ФК С 10-12 М ФК 10-14 М ФК 10-15 М ФК По сравнению с контролем, для которого характерно два перехода, СМД ФК, которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 20 оС (рис. 4), вызывают появление дополнительного третьего перехода при температурах 24-26оС в поверхностных областях (при действии ФК в концентрациях 10-14-10-15 М), и 40-42оС в глубоколежащих областях липидов (при действии ФК в концентрации 10-18 М). Для концентраций, соответствующих «мертвым зонам» на дозовых зависимостях на рис. 4, общее количество переходов не меняется, однако в поверхностных областях по сравнению с контролем они сдвигаются в область более высоких температур, в том числе и «физиологических». Эффективная энергия активации в глубоколежащих областях ПМ при воздействии различных концентраций ФК меняется незначительно. Учитывая важную роль фазовых переходов липидов биологических мембран в жизнедеятельности клетки (в изменении проницаемости мембраны, образовании пор, слиянии мембран, терморегуляции и т.д. (Антонов, 1992, Харакоз, 2001)), эти эффекты ФК могут иметь регуляторное значение для живых систем.
3. Действие отдельных концентраций ФК на температуру и энтальпию структурных переходов в белках ПМ, исследованное методом ДСК Фазовое состояние липидов мембран напрямую сказывается на активности мембраносвязанных белков, т.к. влияет на их конформацию, подвижность, степень гидратации и т.д. Структурное состояние белков, в свою очередь, связано с их термодинамическими характеристиками плавления и денатурации. Чтобы выяснить, каким образом действие ФК отражается на белковой фракции ПМ, были проведены исследования методом ДСК по изучению изменений температуры и энтальпии переходов в ПМ под действием ФК. В контроле и для каждой исследованной концентрации ФК (10-5 М, 10-6 М, 10-14 М, 10-18 М) было сделано по 3 независимых эксперимента, при этом результаты воспроизводились во всех опытах.
Рисунок 6. ДСК-термограммы плазматических мембран в контроле и при добавлении ФК в концентрациях: 10-18 М (1), 10-5 М (2), 10-6 М (3), 10-8 М (4), 10-10 М (5), 10-14 М (6). Концентрация белка 5 мг/мл, скорость сканирования – 1 оС/мин Полученные в результате экспериментов термограммы представлены на рис. 6. Для всех исследованных образцов ПМ наблюдались несимметричные, с широким температурным интервалом эндотермического перехода, ДСК-термограммы, при этом все исследованные концентрации ФК меняют форму кривых по сравнению с контролем. Наибольшее изменение наблюдается при действии концентраций ФК 10- М, 10-6 М и 10-18 М (кривые 1,2 и 3 на рис. 6). На представленных термограммах после деконволюции отчетливо выделяются 4-5 пиков, относящихся к суммарным классам белков нескольких групп. Характеристики выявленных таким способом переходов (температура, изменение энтальпии) приведены в табл. 2 и 3.
Таблица 2. Температуры переходов (Tm) для отдельных эндотермических пиков, полученных в деконволюции ДСК-термограмм образцов плазматических мембран Tm, oC Пик A Пик B Пик C Пик D Пик E Пик F Контроль 37.1±0.2 - 52.8±0.3 61.1±0.2 71.1±0.3 79.6±0. 10-5 М ФК 36.4±0.2 - 54.4±0.1 - 70.6±0.3 77.8±0. - 10 М ФК - 48.8±0.2 57.0±0.3 - 72.5±0.1 79.6±0. - 10 М ФК - - 54.4±0.1 62.6±0.4 70.2±0.3 77.8±0. - 10 М ФК - - 53.8±0.3 61.7±0.6 69.6±0.3 77.1±0. - 10 М ФК - - 53.3±0.1 62.6±0.6 70.9±0.2 78.8±0. - 10 М ФК - - 52.3±0.3 60.2±0.2 70.2±0.2 77.8±0. Из табл. 2 видно, что ФК, использованный как в «физиологических»
концентрациях, так и в СМД, существенно изменяет термолабильность белковой фракции ПМ: в высоких дозах уменьшает её, а в СМД – увеличивает. Сравнивая эти результаты с данными, имеющимися в литературе о влиянии различных БАВ на термоиндуцированные структурные переходы в мембранных белках (Epand, 1999, Bennett, 2008), можно сказать, что ФК даже в СМД вызывает существенные изменения в этом показателе.
Таблица 3. Общая энтальпия образцов плазматических мембран и энтальпии отдельных переходов, полученных в результате деконволюции ДСК-термограмм образцов плазматических мембран H, Дж/г (по результатам деконволюции) H (общая), Дж/г Пик A Пик B Пик C Пик D Пик E Пик F Контроль 0.1±0.1 - 0.6±0.1 0.2±0. 10.6±0.4 6.5±0.3 3.2±0. 10-5 М ФК 5.9±0.3 0.04±0,1 - 4.4±0.3 - 0.9±0.1 0.6±0. - 10 М ФК - 1.3±0,2 - 0.25±0. 4.5±0.4 1.8±0.2 1.0±0. - 10 М ФК 8.4±0.4 - - 4.9±0.4 1.0±0.1 2.1±0.2 0.5±0. - 10 М ФК 9.2±0.4 - - 4.4±0.3 1.6±0.2 2.3±0.2 1.1±0. - 10 М ФК 10.6±0.3 - - 7.0±0.4 0.8±0.1 2.1±0.2 0.7±0. - 10 М ФК - - 1.0±0.1 0.4±0. 5.3±0.4 2.7±0.2 1.1±0. -6 - Из табл. 3 видно, что ФК в концентрациях 10 М и 10 М в два раза уменьшает как суммарную энтальпию, так и энтальпию отдельных переходов в ПМ. Под действием концентраций 10-8 М, 10-10 М и 10-14 М энтальпия меняется незначительно.
Наблюдается отрицательная корреляция между микровязкостью глубоколежащих областей липидного бислоя ПМ под действием ФК в концентрациях 10 -6 М и 10-18 М, определенной методом ЭПР (рис. 4), и энтальпией переходов в белках ПМ (как суммарной, так и отдельных пиков).
Исходя из того, что ФК вызывает изменения в температурных характеристиках большей части белковой фракции ПМ, а не только отдельных белков, можно заключить, что это влияние опосредовано, и связано главным образом с модификацией структурно-динамических свойств липидного бислоя ПМ, а не с рецепторным взаимодействием ФК с белками.
Влияние ФК на липосомы, приготовленные из суммарных липидов ПМ 1. Действие ФК в концентрациях 10-5-10-20 М на вязкостные характеристики различных по глубине липидных регионов липосом при постоянной температуре 20 оС, изученное методом ЭПР Эксперименты по изучению влияния ФК в диапазоне концентраций 10-5-10-20 М на структурно-динамические характеристики липосом, приготовленных из суммарных липидов ПМ, проводились абсолютно аналогично экспери ментам на ПМ с использо ванием метода ЭПР и парамагнитных зондов С5 и С16.
Дозовые зависимости иссле дованных параметров в липосомах представлены на рис. 7.
Рисунок 7. Дозовые зависимости влияния ФК на Добавление ФК в суспензию микровязкость глубоколежащих областей (кривая 1, черная) липосом в концентрациях 10-7 и жескость поверхностных регионов липосом (кривая 2, 10-8 10-18-10- М и М серая) при температуре 20 оС статистически достоверно увеличивает микровязкость липидного окружения зонда С16, что отражается в увеличении значения времени вращательной корреляции с на 5-6 % по сравнению с контролем. В промежуточном интервале концентраций 10 -9-10-17 М достоверных эффектов не наблюдается. Влияние ФК на параметр S также носит нелинейных характер: наблюдается два максимума при действии концентраций 10 -4-10-6 М (2,5 3,5%) и 10-13-10-15 М (2-2,5%), причём положения максимумов эффекта ФК в мембранах и липосомах полностью совпадают.
Эти данные позволяют сделать принципиально важное заключение о том, что именно липиды являются мишенью действия ФК в СМД, и для реализации этого воздействия не требуются суперафинные рецепторы и какие-либо другие белковые системы.
2. Влияние отдельных концентраций ФК на термоиндуцированные структурные переходы в различных по глубине липидных регионах, а также на эффективную энергию активации переходов в глубоколежащих областях липосом в диапазоне температур 12-42 оС, наблюдаемое методом ЭПР Для сравнения влияния ФК на положение термоиндуцированных структурных переходов в различных липидных регионах ПМ и липосом мы изучили зависимости изменения параметров S и с в липосомах от температуры. В результате были получены данные, аналогичные зафиксированным ранее для ПМ (рис.5).
Температурные зависимости исследуемых параметров в липосомах в Аррениусовых координатах представляли собой линеаризованные участки с изломами, положения которых совпадали во всех сериях измерений. Сводные данные по термоиндуцированным структурным переходам в липосомах представлены в табл. 4.
Таблица 4. Положения термоиндуцированных переходов в липосомах в контроле и под действием различных концентраций ФК, а также эффективная энергия активации переходов в глубоколежащих эфф областях Eакт, кДж/М T, oC 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 9,9±0,4 15,9±0, контроль 10-6 М ФК 10,7±0,3 6,7±0, С 10-13 М ФК 10,1±0,4 15,4±0, 10-18 М ФК 10,9±0,7 14,8±0,6 16,6±0, контроль 10-6 М ФК С 10-12 М ФК 10-14 М ФК Из табл. 4 следует, что в контроле и при действии исследованных концентраций ФК липосомы имеют такое же количество термоиндуцированных структурных переходов в поверхностных областях и глубоколежащих областях, как и ПМ.
Переходы в поверхностных областях липосом в контроле происходят при более низких температурах, чем в ПМ. В глубоколежащих областях ПМ и липосом температуры переходов мало отличаются, тогда как эффективные энергии активации в 1,5-2 раза выше в липосомах, чем в ПМ. Воздействие СМД ФК 10-14 М и 10-18 М, которым соответствовали максимумы эффекта на дозовой зависимости на рис. 7, также как и в ПМ, в липосомах индуцируют появление дополнительного перехода в области физиологических температур (34-42оС).
Наблюдаемое сходство влияния ФК на переходы в липосомах и ПМ, как и совпадение максимумов на дозовых зависимостях в области СМД (рис. 4 и 7) при постоянной температуре, говорит о едином механизме действия СМД ФК на мембраны и липосомы.
3. Действие ФК в концентрациях 10 -4-10-19 М на гидродинамический диаметр липосом, исследованное методом ДРС Чтобы выяснить, каким образом структурно-динамические изменения в поверхностных и глубоколежащих областях липосом, обнаруженные методом ЭПР, отражаются на их внешних свойствах, было изучено влияние различных концентраций ФК на их гидродинамический диаметр методом динамического рассеяния света (ДРС).
Полученная зависимость эффекта от дозы препарата (в % по отношению к контролю) представлена на рис. 8. ФК в концентрациях 10-4-10-7 М и 10-13-10-15 М способен существенным образом (13-17%) увеличивать гидродинамический диаметр липосом по сравнению с контролем. Промежуточные концентрации 10 -9-10-12 М, а также более низкие концентрации 10-16-10-19 М не оказывали статистически достоверного эффекта.
Если сравнить эти данные с полученными нами ранее методом ЭПР результатами по влиянию ФК на структурно-динамическое состояние липидов в липосомах, можно отметить существенную корреляцию с изменением жесткости поверхностных областей липосом во всем исследованном диапазоне концентраций (r=0,98, p=0,0001).
Наличие высокой количест венной корреляции говорит о том, что изменения структуры, индуцируемые ФК в поверх ностных областях липидного бислоя (~ 8 ) как в «физио логических» концентрациях, так и в СМД, напрямую связаны с динамическим вязкостным Рисунок 8. Концентрационная зависимость эффекта ФК взаимодействием между липо на гидродинамический диаметр липосом D, оцененный сомами и окружающей их методом ДРС, при температуре 25оС. Концентрация липидов в суспензии 1,5 мг/мл. Приведены средние жидкостью.
результаты из 9 независимых экспериментов. Диаметр в Физический смысл увеличения контроле составлял 175,5±10,8 нм гидродинамического диаметра состоит в замедлении хаотического броуновского движения частиц в суспензии. Это, свою очередь, может быть связано не только с увеличением средних размеров частиц, но и с изменением их формы. Для более детального изучения влияния ФК на внешние характеристики липосом был использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ).
4. Влияние отдельных концентраций ФК на форму и размеры липосом, изученное методом АСМ.
Метод АСМ позволил оценить влияние ФК на различные визуальные характеристики липосом, такие как площадь поперечного сечения, высота, отношение длины к ширине и т.д. В табл. 5 приведен полный список и средние значения данных параметров в контроле из 17 независимых экспериментов.
Таблица 5. Характеристики АСМ-имиджей липосом в контроле среднее максимальное минимальное Кол-во липосом N, шт. 31 76 Средняя высота Z, нм 6,2 9,65 2, Площадь S, мкм2 0,007 0,019 0, Объем V, мкм3 0,055 0,18 0, Диаметр D, мкм 0,09 0,11 0, Длина L, мкм 0,14 0,17 0, Ширина W, мкм 0,06 0,08 0, Длина/ширина L/W 2,66 2,87 2, Для оценки изменений формы липосом под воздействием ФК в концентрациях 10- М, 10-8 М, 10-14 М и 10-18 М использовался параметр L/W, отношение длины к ширине.
Перечисленные концентрации ФК были выбраны, поскольку им соответствовали максимумы влияния на структурные характеристики различных регионов липосом, полученные методом ЭПР (рис. 7) Типичные АСМ-имиджи липосом, полученные в результате экспериментов, представлены на рис. 9.
а б в Рисунок 9. АСМ-имиджи липосом в контроле (а), и при действии концентраций ФК 10-14 М (б), 10- М (с). Изображения, полученные для концентраций ФК 10-18 М, 10-8 М не отличались от контроля а б Рисунок 10. Трехмерные модели липосом в контроле (а) и при действии ФК в концентрации 10 М (б), построенные по АСМ-имиджам Приближенные участки трехмерных изображений, смоделированные с помощью программы NT-MDT Image Analysis по интенсивности АСМ-имиджей, представлены на рис. 10.
На рис. 9 и 10 видно, что липосомы в контроле имеют округлую форму, что полностью соответствует данным, имеющимся в литературе (Ruozi, 2007, Spyratou, 2009). При действии ФК в концентрациях 10-8 М и 10-18 М их форма не изменяется.
Под действием ФК в концентрациях 10-6 М и 10-14 М они визуально «вытягиваются», что отражается количественно в изменении отношения длины к ширине липосом (L/W), которое представлено на рис. 11 в виде гистограммы (эффект по отношению к контролю).
Длина/ширина 20 Эффект L/W, % Эффект S, % Степень упорядоченности 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 - Lg [ФК] -5 - Рисунок 11. Влияние ФК в широком диапазоне концентраций на отношение длины к ширине липосом (столбцы гистограммы, серый цвет) и на параметр упорядоченности S поверхностных областей липосом (черная кривая) ФК вызывает статистически достоверное увеличение L/W на 12-14% по сравнению с контролем при действии в концентрациях 10-6 М и 10-14 М. При этом добавление ФК в концентрациях 10-8 М и 10-18 М в суспензию не оказывает достоверного влияния на данный параметр. Наблюдается хорошее соответствие изменения отношения L/W и параметра упорядоченности S (рис. 11, черная кривая), а отсутствие эффекта по показателю S коррелирует округлой формой липосом. Таким образом, можно сделать вывод о том, что изменения структурно-динамических свойств приповерхностных слоёв липидов, индуцированные ФК, непосредственно связаны с изменениями формы липосом.
Совпадение эффектов для методов АСМ и ДРС говорит о том, что наблюдаемые изменения внешних характеристик липосом не связаны со способом измерений и обусловлены именно действием ФК на липиды как в «физиологических»
концентрациях, так и в СМД.
Заключение Приведено в четвертой главе диссертации, где кратко суммированы основные результаты предлагаемого исследования, а также сделаны определенные выводы о механизме действия ФК в широком диапазоне концентраций (10-5-10-20 М) на на ПМ клеток печени мышей in vitro.
В данной работе в первую очередь были изучены особенности действия ФК структурно-динамическое состояние различных по глубине областей ПМ методом ЭПР. Было установлено, что зависимости параметров S и с, характеризующих состояние различных областей липидного бислоя, от концентрации вводимого ФК при температуре 20оС имеют немонотонный, бимодальный характер, связанный с наличием эффектов в трёх областях доз: области «физиологических» концентраций ФК (10-4–10-9 М), в которых он обычно используется при введении в организм;
его СМД (10-13–10-15 М) и даже «мнимых» концентраций (10 -18–10-19 М). Максимумы на кривых разделены так называемыми «молчащими» зонами, где эффект ФК на исследуемые структурно-динамические характеристики мембран не наблюдается.
Сопоставляя полученные данные с литературными, следует подчеркнуть, что, несмотря на разнообразия биологических моделей, в большинстве экспериментов зафиксированы наибольшие эффекты ФК в концентрациях 10-4-10-5 М и 10-14-10-15 М (Молочкина, 1999;
Трещенкова, 2003;
Пальмина, 2003;
Наглер, 2008;
Жигачева 2010).
Наибольшее соответствие в эффекте ФК на различных моделях коррелирует с изменением параметра упорядоченности S в ПМ, установленным нами, и, вероятно, именно изменения в структурно-динамическом состоянии поверхностных областей липидов мембран приводят затем к модификации в функционировании и регуляторных систем, локализованных в них, и, соответственно, биологическому эффекту.
Бимодальный характер дозовых зависимостей эффектов ФК на структурные характеристики липидного бислоя ПМ может быть связан с преобладанием в определенных интервалах доз роли различных механизмов действия ФК. Ранее при рассмотрении вопроса о возможных механизмах действия БАВ в СМД на примере токоферола (-ТФ) и тиролиберина (ТРГ) были высказаны предположения о причинах возникновения максимумов на дозовых зависимостях в разных концентрационных интервалах, которые были частично подтверждены и экспериментально: в области традиционных «физиологических» концентраций (10-4– 10-9 М) – встраиванием молекулы БАВ в мембрану;
в интервале СМД (10 -9–10-18 М) – специфическим связыванием БАВ с лигандами на мембране;
в интервале «мнимых»
концентраций (10-18–10-25 М) – изменением структурно-динамических характеристик воды, выступающей в роли полярного растворителя -ТФ и ТРГ и среды окружающей мембраны (Жерновков, 2007;
Белов, 2011). Сопоставляя полученные нами результаты с высказанными ранее предположениями о механизмах действия БАВ, можно заключить, что максимум в интервале высоких концентраций ФК также обусловлен неспецифическим характером его взаимодействия с липидной компонентой ПМ. В пользу этого предположения говорит и ряд результатов, полученных в нашей лаборатории, об изменении текучести различных биологических мембран под действием ФК в концентрации 10-4-10-6М, измеренных при использовании других зондов в экспериментах in vivo (Трещенкова, 2003). Второй максимум на дозовых зависимостях для -ТФ (он также общий для S и с) Белов В.В.
с соавт. объясняют возможным взаимодействием препарата со специфическими местами его связывания на мембране (протеинкиназой С или включающими этот фермент рафтами). Так как ранее в работе Мальцевой Е.Л. (1997) было установлено, что ФК является суперактиватором данного фермента, в том числе и в СМД, мы провели сравнение полученной нами дозовой зависимости изменения под воздействием ФК параметра с в ПМ (рис.4) и активности мембраносвязанной ПК-С (рис.12).
Как видно из рис. 12, существует определённая качественная корреляция между этими величинами, что позволяет связать максимум эффекта с в интервале концентраций 10-18-10-19 М с образованием комплекса ФК с ПК-С или модификацией под Рисунок 12. Сравнение дозовых зависимостей влияния ФК влиянием ФК липидных на микровязкость глубоклежащих областей ПМ и активность мембранных кластеров, или мембраносвязанной протеинкиназы-С рафтов, содержащих ПК-С. В пользу такой взаимосвязи говорят и полученные нами данные о закономерностях изменения энтальпии переходов в белках плазматических мембран под влиянием различных концентраций ФК (табл. 3). Минимальные значения изменений общей энтальпии и переходов в отдельных фракциях белков отмечены методом ДСК при воздействии ФК в концентрациях 10-6 М и 10-18 М, которые соответствуют максимальной способности ФК активировать ПК-С и повышать микровязкость глубоколежащих областей ПМ (рис. 12).
Оставался открытым вопрос о том, какой процесс является первичным:
взаимодействие ФК с ПК-С как с рецептором и последующее воздействие на липиды или встраивание ФК в липидную компоненту мембраны и изменение активности фермента, липид-зависимость которого доказана в независимых экспериментах (Leonard, 2011). Ответ на него был получен нами после проведения исследований на липосомах, приготовленных из липидных экстрактов ПМ. При действии ФК в широком интервале концентраций (10-5-10-20 М) на липосомы мы получили дозовые зависимости изменения микровязкости липидов и жёсткости поверхностных областей липосом, аналогичные наблюдавшимся нами ранее в экспериментах с ПМ (рис. 4 и 7).
Это доказывает, что ФК непосредственно действует на липидную компоненту ПМ.
Тот факт, что в области СМД обнаружено совпадение максимумов на кривых изменения с липосом и активности ПК-С, свидетельствует о том, что ФК, индуцируя увеличение микровязкости глубоколежащих областей липидов, затем приводит к изменениям состояния белковой компоненты мембран и активации фермента, то есть именно липиды являются мишенью действия ФК в СМД. Дополнительные подтверждения этого заключения были получены нами при определении влияния ФК на положения термоиндуцированных структурных переходов в глубоколежащих липидных областях ПМ и липосом (табл. 1 и 4). Из таблиц видно, что ФК в концентрации 10-18 М вызывает появления дополнительного термоиндуцированного структурного перехода при 40-42оС. Есть литературные данные о том, что мембраносвязанная ПК-С обладает максимальной активностью именно в интервале температур 37-40оС (Micol, 1999;
Константинова, 1991).
Результаты экспериментов по влиянию на физико-химические свойства липидов в липосомах, полученные методом ЭПР, были существенно расширены и дополнены при исследовании влияния ФК на размеры и форму липосом методами ДРС и АСМ.
Было установлено, что ФК влияет на размеры липосом, причём дозовые зависимости изменения гидродинамического диаметра липосом, определяемого методом ДРС, и параметра упорядоченности S в поверхностных слоях липидов идентичны в исследованном диапазоне концентраций, между ними обнаружена линейная корреляция. Методом АСМ было показано также, что форма липосом принципиально изменяется, переходя от шарообразной к палочкообразной, в соответствии с изменением того же параметра S (рис. 11): при использовании ФК в концентрациях 10-6М и 10-14 М зафиксирован переход к палочкообразной форме, а при действии ФК в концентрациях 10-10 и 10-18 М форма липосом не изменена по сравнению с контролем. Что же может быть причиной таких существенных изменений, как в свойствах ПМ, так и липосом под действием ФК в СМД, когда концентрация активного веществе в системе ничтожно мала?
В качестве одного из механизмов эффекта БАВ в СМД ряд авторов рассматривают передачу информации через водную систему. Было установлено, что влияние на биологические мембраны некоторых БАВ в области СМД коррелировало со свойствами их водных растворов в инфракрасной области спектра (Жерновков, 2007);
при использовании растворов -ТФ в вазелиновым масле эффект препарата в СМД исчезал (Белов, 2011). В некоторых работах (Pollack, 2001;
Zheng, 2009) развиваются представления о наличии у гидрофильных поверхностей и частиц, в качестве которых могут рассматриваться и мембраны, толстых “приповерхностных” слоев воды (~ мкм), отличающихся от “объемной” воды по вязкости, плотности, диэлектрической проницаемости, электропроводности. В свою очередь, академиком Коноваловым А.И.
с соавторами обнаружено, что многие БАВ в СМД образуют в водных растворах наноассоциаты размером около 200 нм, которые также могут выступать в роли гидрофильных поверхностех (Рыжкина, 2010-2013). Концентрационные зависимости размеров наноассоциатов и удельной электропроводности растворов имеют полимодальный характер и взаимосвязаны. В нашей совместной работе с Коноваловым А.И. и его сотрудниками было установлено (Пальмина, 2009), что, действительно, изменение удельной электропроводности растворов ФК в зависимости от степени их разбавления представляет собой кривую с двумя максимумами: в области 10–9 М и 10–13–10–16 М, которые разделены областью снижения измеряемого параметра в интервале трех порядков концентраций. Для дозовых зависимостей изменения жесткости в ПМ и липосомах и удельной электропроводности растворов ФК в области сверхмалых доз 10 –12–10–18 М, получены достоверные корреляции между этими показателями в ПМ (r = 0.738, p = 0.05) и липосомах (r=0,705, p= 0,076).
В области СМД 10-15-10-20 М наблюдается высокая корреляция между средним диаметром ассоциатов ФК в водных растворах и их влиянием на микровязкость глубоколежащих областей ПМ (r = 0,932, p = 0,047) и липосом (r = 0,831, p = 0,092).
Этот факт также позволяет предполагать взаимосвязь между свойствами образующихся в разбавленных водных растворах ФК структур и их влиянием на состояние мембран.
Таким образом, в результате проделанной работы были получены экспериментальные данные, позволяющие на примере ФК сделать важные выводы о возможных механизмах действия БАВ в СМД. Сведения об изменении физико химических свойств биологических мембран и водной среды ставят новые вопросы и дают новый импульс для дальнейшего изучения этих сложных и во многом загадочных систем.
ВЫВОДЫ 1. Изучено действие синтетического антиоксиданта ФК в широком диапазоне концентраций (10-5-10-20 М) на структурные характеристики плазматических мембран клеток печени мышей in vitro и липосом, приготовленных из их липидных экстрактов. Установлено, что и для ПМ, и для липосом, характерны полимодальные дозовые зависимости эффектов ФК на жесткость поверхностных (~8 ) и микровязкость глубоколежащих (~20-22 ) областей липидного бислоя, имеющие во многом аналогичный характер и типичные для БАВ, проявляющих активность в широком диапазоне концентраций, включающем СМД.
2. Показано, что полимодальность полученных дозовых зависимостей как в ПМ, так и в липосомах связана с наличием статистически достоверных эффектов ФК в трех областях концентраций, каждый из которых обусловлен преобладающим вкладом одного из возможных механизмов действия ФК. А именно:
а) в области традиционных «физиологических» концентраций ФК (10-5–10-9 М) – непосредственным и неспецифическим взаимодействием препарата с компонентами мембраны;
б) в области СМД ФК (10-13-10-19 М) изменения в структуре ПМ и липосом, по видимому, обусловлены образованием в разбавленных растворах ФК «наноассоциатных» комплексов препарата и воды, причём максимум на кривой изменения «жёсткости» поверхностных слоёв липидов в интервале концентраций (10-13-10-15 М) коррелирует с удельной электропроводностью этих растворов;
а максимум на кривой изменения микровязкости липидов в интервале (10-18-10-19 М) – с изменением диаметра «наноассоциатов».
3. Определены температурные зависимости вязкостных характеристик различных по глубине областей липидов ПМ и липосом. Обнаружено, что концентрации СМД ФК (10-14 М;
10-18 М), которым соответствовали максимумы на дозовых зависимостях при температуре 20оС, вызывают появление дополнительного термоиндуцированного структурного перехода в области физиологических температур (32-42С).
4. Установлено наличие аналогичных количественных (максимумы на дозовых кривых) и качественных (появление дополнительного термоиндуцированного перехода) изменений в структуре липидов при действии СМД ФК на ПМ и липосомы, свидетельствующее о том, что именно липиды являются мишенью действия ФК в этих концентрациях.
5. Обнаружена прямолинейная взаимосвязь между изменением под действием ФК параметра упорядоченности липидов в поверхностных областях липосом и их формой и размерами. Методами ДРC и АСМ показано увеличение гидродинамического диаметра липосом на 12-15% и переход от шарообразной к палочкообразной форме липосом под влиянием ФК в концентрациях, вызывающих максимальные изменения параметра упорядоченности S (10-6 М и 10-14 М).
6. Методом ДСК показано влияние ФК в СМД 10-14 М и 10-18 М на термолабильность белковой фракции ПМ, коррелирующее с изменениями в структурно динамическом состоянии липидов мембран, индуцированными ФК: увеличение термостойкости белковых фракций на 1-4оС, а также (при действии 10-18 М) снижение суммарной энтальпии и энтальпии отдельных переходов в 2 раза по сравнению с контролем.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Часовская Т.Е., Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П. Действие фенозана калия на структуру плазматических мембран клеток печени мышей in vitro // Биофизика. – 2013. – Т.58. – №1. – С.97 – 105.
2. Часовская Т.Е., Плащина И.Г., Пальмина Н.П. Физико-химические изменения в липосомах, индуцированные низкими концентрациями синтетического антиоксиданта – фенозана калия // Доклады Академии Наук. – 2013. – Т. 449. – №6.
– С. 673-677.
3. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Белов В.В., Мальцева Е.Л. Дозовые зависимости изменения микровязкости липидов биологических мембран, индуцированные синтетическим антиоксидантом фенозаном калия // Доклады Академии Наук. – 2012. – Т.443. – №4. – С. 511-515.
4. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Коновалов А.И.
Водные растворы фенозана калия: влияние на структуру биологических мембран и электропроводность // Доклады Академии Наук. – 2009. – Т.429. – №1. – С. 128 131.
5. Пальмина Н.П., Белов В.В., Часовская Т.Е., Жерновков В.Е., Мальцева Е.Л. Роль воды в эффекте биологически активных веществ в сверхнизких концентрациях // Тезисы Международной конференции «Структура воды: физические и биологические аспекты», Санкт-Петербург, – 2013. – С. 40-42.
6. Пальмина Н.П., Часовская Т.Е., Бинюков В.И., Плащина И.Г. Механизм действия синтетического антиоксиданта фенозана калия в сверхнизких концентрациях на поверхностные области липидов плазматических мембран // Труды VI международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». – 2012. – С. 84-97.
7. Palmina N., Chasovskaya T. Modification of lipid domains in liver plasmatic membranes by phenosan potassium salt in a wide concentration range in vitro // Chemistry and Physics of Lipids. – 2009. – V.160. – S1. – P. 19.
8. Palmina N., Chasovskaya T., Binyukov V. Changes in structure of microdomains of liposomes under the effect of synthetic antioxidant in a wide concentration range // European Journal of Lipid Science and Technology. – 2011. – V.133. – S1. – P. 56.
9. Chasovskaya T., Binyukov V., Palmina N. Changes in structure of microdomains of liposomes under the effect of synthetic antioxidant in a wide concentration range // Chemistry and Physics of Lipids. – 2011. – V.164. – N.7. – P. 48.
10. Palmina N.P., Chasovskaya T.E., Binukov V.I., Plaschina I.G. Modification of rigidity of surface areas, size and shape of liposomes by potassium phenosan // Book of Abstracts of 10th Euro Fed Lipid Congress. Cracow. Poland. – 2012. – P.275.
11. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Модификация стуктуры плазматических мембран синтетическим антиоксидантом // Сборник тезисов докладов всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». – 2011.
– С. 224.
12. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Влияние фенозана калия на структуру плазматических мембран in vitro // Сборник тезисов докладов всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики». – 2011. – С. 215-216.
13. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Механизмы действия фенозана калия в сверхмалых дозах // Труды X Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН- ВУЗЫ «Биохимическая физика». – 2010. – С. 254-258.
14. Часовская Т.Е., Пальмина Н.П. Влияние фенозана калия в широком диапазоне концентраций на структуру плазматических мембран клеток печени in vitro // Труды IX Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН ВУЗЫ «Биохимическая физика». – 2009. – C. 263-264.
15. Балясина Т.Е. (Часовская), Баранников С.П., Белов В.В., Пальмина Н.П.
Исследование влияния фенозана калия на микровязкость липидной компоненты плазматических и микросомальных мембран клеток печени in vitro // Труды VII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ «Биохимическая физика». – 2007. – C. 18-20.
16. Балясина Т.Е. (Часовская), Баранников С.П., Белов В.В., Пальмина Н.П. О влиянии фенозана калия в широком интервале концентраций на микровязкость липидной компоненты плазматических и микросомальных мембран клеток печени in vitro // Труды 50-й Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием Московского физико-технического института «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Секция биохимической физики. – 2007. – С. 27-29.