Тесты на основе стабилизированных препаратов холинэстеразы в экологическом контроле биологически активных соединений
На правах рукописи
БЕЛЯКОВА СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА
ТЕСТЫ НА ОСНОВЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Специальность: 03.00.16 – Экология
АВТОРЕФЕРЕТ
диссертация на соискание ученой
степени кандидата химических наук
Казань - 2002
Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета
Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Евтюгин Г.А.
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Евгеньев М.И.
(Казанский государственный технологический университет) кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Зобов В.В.
(Институт органической и физической химии им.А.Е.Арбузова КНЦ РАН)
Ведущая организация: Институт экологии природных экосистем Ака демии наук Республики Татарстан
Защита диссертации состоится "_ "_ 2002 г. в 14 ч. в зале заседаний диссертационного совета Д 212.080.02 в Казанском государственном технологи ческом университете по адресу: 420015, г.Казань, ул.К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-330).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета
Автореферат разослан "_"_ 2002 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, А.С.Сироткин кандидат технических наук, доцент ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Современное развитие экологического мониторинга ха рактеризуются приоритетным развитием обобщенных методов оценки состояния окружающей среды. В условиях постоянного увеличения числа контролируемых параметров, ужесточения санитарно-гигиенических норм присутствия загрязни телей в объектах контроля тест-методы позволяют быстро оценить потенциаль ную опасность загрязнения для человека и биосферы в целом, произвести скри нинг биологической активности вновь синтезируемых соединений, установить источник и характер загрязнения. Предварительный контроль с использованием тест-методов не только позволяет выиграть время и тем самым предотвратить поступление токсикантов по трофическим цепям, но и существенно сократить себестоимость экологического контроля, исключив из последующего детального изучения заведомого нетоксичные пробы.
В средствах биохимической диагностики индикация загрязнения или при сутствия биологически активного вещества основана на его вовлечении в фер ментативную реакцию. Полученные результаты характеризуют тот потенциаль ный вред, который тестируемые соединения могут нанести живому организму.
Детальная количественная оценка токсического эффекта не только расширяет сферу действия экологического мониторинга, но и позволяет решать задачи эко токсикологии, фармакологии и т.д. (экологическое нормирование, поиск новых лекарственных препаратов, установление механизма метаболической трансфор мации и токсикации живого организма).
Внедрение средств биохимической диагностики в практику экологическо го мониторинга требует в первую очередь решить вопросы надежности детекти рования и интерпретации биохимического сигнала, расширения круга опреде ляемых соединений, в том числе с использованием модификаторов, обеспечи вающих селективность детектирования конкретных токсикантов. Необходимо также выработать алгоритмы скрининга биологической активности вновь синте зируемых соединений.
Цель настоящей работы - развитие теоретических и практических под ходов к диагностике загрязнения окружающей среды и скринингу токсичности органических соединений с помощью стабилизированных препаратов холинэ стеразы с фотометрическим и потенциометрическим детектированием сигнала.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
- изучены операционные характеристики тестов на основе холинэстеразы, вклю ченной в состав водорастворимого стабилизатора - N-фталилхитозана, в опреде -3 лении ингибиторов фермента в модельных растворах и объектах окружающей среды;
- установлено влияние макрокомпонентов объектов окружающей среды (почвы, зерно, виноградный сок, осадки сточных вод) на чувствительность и селектив ность определения фосфорорганических пестицидов с помощью разработанных тестов, предложить новые способы пробоподготовки, нивелирующие обнаружен ное влияние матрицы сложных объектов;
- предложены подходы к скринингу токсического действия новых синтезирован ных элементоорганических соединений, не являющихся специфическими ингиби торами холинэстеразы;
- разработаны способы биохимической регистрации образования комплексов типа "гость-хозяин" с участием 1,3-дизамещенных каликсаренов и их тиоаналогов, обосновать механизм влияния каликсаренов -комплексообразователей на актив ность нативной холинэстеразы, а также предложить методики фотометрического и потенциометрического определения органических соединений, участвующих в формировании комплексов.
Научная новизна работы заключаются в том, что:
- определены рабочие условия прямого обнаружения и полуколичественной оценки содержания пестицидов антихолинэстеразного действия в растительных и почвенных экстрактах, виноградном соке и осадках сточных вод без предвари тельного концентрирования пробы;
- впервые установлено влияние процессов ионного обмена и миграции подвиж ных форм металлов на ингибирующее действие осадков сточных вод и почв и на этой основе предложено использовать показатели степени ингибирования в раз личных режимах пробоподготовки для предварительной обобщенной характери стики загрязненности объектов контроля;
- впервые установлен факт ингибирования холинэстераз 1,3-замещенными калик саренами, предложен механизм ингибирования, включающий кооперативное взаимодействие комплекса типа "гость-хозяин" между субстратом и каликсареном и активного центра фермента без образования ковалентных связей или электро статического взаимодействия;
- впервые количественно охарактеризовано антихолинэстеразное действие фос форилированных производных оксиндола и изатина, семичленных ацеталей про изводных витамина В6 и дельдрина, предложены методологические подходы к оценке механизма ингибирования и количественной оценке ингибирующего эф фекта.
-4 Практическая значимость работы состоит в том, что:
- разработаны простые и удобные в использовании ферментные тесты на основе коммерческих препаратов холинэстераз, включенных в водорастворимые пленки на основе фталилхитазана, и фотометрических и потенциометрических способов детектирования, отличающиеся повышенной стабильностью при хранении и ис пользовании;
- предложены методики высокочувствительного детектирования остаточных ко личеств фосфорорганических соединений в объектах окружающей среды на уровне установленных норм, а также оценки общей загрязненности почв и осад ков сточных вод подвижными формами тяжелых металлов без трудоемких спосо бов пробоподготовки;
- разработаны алгоритмы оценки экотоксикологических характеристик и скри нинга биохимической активности новых синтезированных органических веществ, содержащих несколько потенциальных центров связывания с ферментом.
На защиту выносятся:
- результаты исследования влияния макрокомпонентов матрицы на результаты определения пестицидов с помощью ферментных тестов на основе стабилизиро ванных препаратов холинэстеразы и вывод о возможности прямого детектиро вания их количеств на уровне ПДК без концентрирования экстрактов или их очистки;
- обоснование возможности применения ферментных тестов для обобщенной оценки загрязнения почв и осадков сточных вод подвижными формами тяжелых металлов;
- сравнительное исследование процессов комплексообразования индофенил ацетата различными 1,3-замещенными каликсаренами физико-химическими и биохимическими методами и обоснование кооперативного механизма ингибиро вания в системе каликсарен - холинэстераза - субстрат без образования кова лентных связей с активным центром фермента;
- влияние присутствия органических кислот и их эфиров, способных связываться с каликсаренами, на их ингибирующую способность и способ определения мо лекул – "гостей" по их либеративному действию на ингибированную холинэсте разу.
- результаты скрининга антихолинэстеразной активности производных изатина и оксиндола, семичленных ацеталей производных пиридоксина и дельдрина и подходы к определению центров связывания и механизма ингибирования холи нэстераз полифункциональными неспецифическими ингибиторами.
-5 Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Итого вых научных конференциях Казанского государственного университета (2000, 2001 гг.), Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материа лов" (Москва, 2000 г.), Российско-германском симпозиуме "Биосенсоры для эко логического мониторинга" (Иркутск, 2000 г.), Международном симпозиуме "Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных структур" (Казань, 2000 г.), 11 Российско-японском симпозиуме по аналитической химии (Москва, 2000 г.), 1 Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000), 7 Симпозиуме по кинетическим методам анализа (Бухарест, 2001), Все российском симпозиуме по тест-методам анализа (Москва, 2001).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, включает 31 рисунок и 20 таблиц. Состоит из Введения, 4 глав, Выводов и Списка использованных библиографических ис точников, включающего 173 ссылки на отечественные и зарубежные работы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Использовали препараты бутирилхолинэстеразы (БуХЭ, К.Ф. 3.1.1.8) из сыворотки крови лошади ("Биомед", г.Пермь) с удельной активностью 4.2±0. Е/мг белка, включенные в водорастворимые пленки на основе N фталилхитазана. В качестве субстратов использовали индофенилацетат (ИФА) и эфиры холина. Мерой скорости ферментативной реакции (1,2) служило время перехода окраски раствора t, отвечающее 30% конверсии субстрата. Измерения проводили с помощью фотоколориметрического анализатора АКИ-Ц-01 ("Био машприбор", г.Йошкар-Ола).
(CH3)3N+CH2CH2ХC(O)R + H2O (CH3)3N+CH2CH2ХH + RCOOH, X = O,S;
R = CH3, C3H7 (1) БуХЭ OH OCOCH3 + H2O O N O N (2) O Продукты окисления (коричневые) -6 Потенциометрические измерения с помощью иономера И-130 ("Измери тель", г.Гомель). Изученные соединения - неспецифические ингибиторы БуХЭ приведены в табл.1. Производные индола были переданы для исследований проф. Гуревичем П.А., семичленные кетали - ст.н.с.Штырлиным Ю.Г., каликса рены и их тиоаналоги - ст.преп.Стойковым И.И.
Таблица Структура и шифры исследованных соединений Производные оксиндола и изатина O 3 O N NH S H P H2N O N O N O N H CH H OH 4 P(C6H5) P(C6H5) O O N N H H SO2NH2 CHO 5 N OH N O P COCH O O O N H Семичленные кетали - производные дельдрина и витамина В CH2OH CH2OH 9 HO CH2OH HO CH2OH + N H3C I + N H3C Cl CH H -7 H H CH 11 CH3 O O O CH O CH CH3COO CH CH3COO CH N+ H3C H3C N I H Cl Cl 13 Cl (R = CH3, Cl Cl O R = H) Cl R O O Cl CH O H H 1,3-замещенные каликсарены и их тиопроизводные 15 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-9-CH2-флуоренил, R R 16 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-4-CH2-C6H4-NO2, 17 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-4-CH2-C6H4-CN, 18 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-t-CH2-СH=CH-Ph, 19 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-CH2-Ph, 20 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-4-CH2-C6H4-COOEt, OO OO 21 R1=-t-Bu, R2= H, R3=-2-CH2-нафтил, R3 22 R1=-NO2, R2= -CH2-Ph, R3 = H R3 R R 23 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2-COOEt, 27 R1=-CH2-N(C2H5)2, R2=R3=H 24 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2-C(O)NHCH2Ph 28 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2-CH2- CH2-CN 25 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2CH2NHC(O)Ph 29 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2-C(O)-CH 26 R1=-t-Bu, R2=R3=-CH2-CH2-NH R R R R R R O O S S S S O S SS O S R 33 R=-CH2C(O)NEt R OOOO 30 R =-t-Bu 34 R=-CH2C(O)CH H H H H 31 R = H 35 R =-CH2C(O)NH 32 R=-CH2NEt 36 R=-CH2C(O)Ph -8 R O S S S S S S S O S O OR OO OO RR R R R R 37 R=-CH2-C(O)-Ph 38 R=-CH2-C(O)Ph X S S S OH OH S OO OO R H R H 40 X=CH2 41 X=S 39 R=-CH2-C(O)-Ph ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫЕ ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ В КОНТРОЛЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Стабилизация БуХЭ в N-фтатилхитазане позволяет проводить быстрое и надежное определение ингибирующего действия токсикантов в течение по меньшей мере полугода при хранении тестов при 4оС в сухом виде. Некоторые характеристики теста приведены в табл.2.
Предварительно были установлены характеристики определения пестици дов в водных модельных растворах. Тионовые пестициды перед инкубировани ем электрохимически окисляли до кислородных аналогов. Все изученные фос форорганические пестициды оказывают строго необратимое ингибирующее дей ствие в диапазоне концентраций n(10-9-10-6) М. По достигнутым пределам об наружения изученные токсиканты располагаются в ряд, соответствующий изме нению значений их ПДК: базудин фозалон малатион кумафос хлорпири фос гутион паратион-метил трихлорфон.
-9 Таблица Операционные характеристики холинэстеразных тестов Удельная активность БуХЭ, мг / ячейку планшета 0. Е / ячейку планшета 0. Скорость растворения ферментсодержащей пленки, мин.
Свежеприготовленного планшета Через 3 месяца хранения Величина сигнала (время перехода окраски, отвечающего 30% конверсии субстрата), с Свежеприготовленного планшета 10- Через 3 месяца хранения 35- Относительная погрешность измерения отклика, % для измерений на одном планшете ( Р 0.90) Свежеприготовленного планшета Через 3 месяца хранения 4. Единственным исключением явился пиримифос-метил. Предел его обна ружения (1.310-5 М) почти в 100 раз выше ПДК, что, возможно, связано с его частичным разрушением в процессе пробоподготовки. В присутствии 10-15% ацетона и этанола время перехода окраски теста увеличивается по сравнению с контролем на 10-20 %, а при использовании ацетонитрила - снижается на 5-15%.
Добавки указанных растворителей не меняют наклона градуировочных зависи мостей пестицидов, но повышают пределы их обнаружения. Кроме того, присут ствие ацетонитрила несколько сокращает время, необходимое для окисление ти онового пестицида. Активирующее влияние ацетонитрила и ингибирующее влияние пестицида аддитивно складываются и описываются единым градуиро вочным уравнением.
Растительная продукция. Разработана методика прямого определения присутствия пестицидов в органических экстрактах после их предварительного разбавления до конечного содержания растворителя 15 об.%. Экстракция в тече ние 10 мин ацетонитрилом позволяет извлечь до 60% пестицидов, ацетоном и этанолом - до 40 %. В качестве примера на рис.1 представлены результаты опре деления хлорпирифоса в зерне. С учетом разбавления экстракта методика позво ляет детектировать присутствие до 0.1 мг/кг изученных пестицидов. Степень из влечения (по данным ГЖХ) и чувствительность ферментативного определения пестицидов снижаются с уменьшением содержания масла в культуре. Природ ные ингибиторы фермента (катехоламины) при 10 минутной экстракции на сиг нал не влияют.
- 10 ln(ti/to) Рис Пшеница Сорго Рис Пшеница Сорго 1, 1, ln(ti/to) 0, 0, CI 10, M 0,0 0,2 CI10, M 0 5 10 0 10 20 -0, Ацетонитрил Ацетон -0, Рисунок 1. Определение хлорпирифоса в зерне риса, пшеницы и сорго при экс тракции ацетонитрилом и ацетоном Аналогичным образом проводилось определение остаточных количеств пестицидов в виноградном соке. Для повышения чувствительности определения окисление пестицидов проводили непосредственно в неразбавленном соке, при этом из-за высокого содержания фенольных соединений продолжительность электрохимического окисления была увеличена до 8 мин. ). Минимально опре деляемые содержания пестицидов в белом виноградном соке составили 110-6 М для кумафоса и 810-8 М для хлорпирифос-метила.
Почвы и осадки сточных вод. При использовании фосфатного буферно го раствора металлы, содержащиеся в почвах, не оказывают значимого влияния на скорость ферментативной реакции. Экстракция пестицидов позволяет извлечь до 40% их количеств. При содержании пестицидов свыше 0.6 мг/кг ингибирова ние БуХЭ перестает меняться, что связано, возможно, с влиянием соэкстраги руемых органических компонентов на эффективность электрохимического окис ления тионовых пестицидов.
Проведение ферментативной реакции в трис-буферном растворе позволя ет выявить вклад подвижных форм металлов. Для образцов почв, отобранных в г.Казани, с увеличением расстояния от автомобильных магистралей ингиби рующее действие водного и кислотного экстрактов из почв закономерно снижа ется. Установлена корреляция между величиной степени ингибирования БуХЭ - 11 I,%, и суммарным содержанием CMe подвижных форм кадмия, цинка и свинца в почвенном покрове, мг/кг, определенным методом ААС, для почв юго-востока Татарстана.
I,% = 0.9CMe - 1.2, r = 0.9755 (1) При внесении солей металлов в водные экстракты из осадков сточных вод их ингибирующее действие снижается при сохранении конкурентного механиз ма ингибирования. Если же соли металлов добавлять непосредственно в осадки в количестве до 10 мг/кг, получаемые экстракты практически не ингибируют фермент. В некоторых случаях наблюдается увеличение скорости реакции. Это связано с обменными процессами, протекающими между органическим вещест вом осадка и ионами металлов, и связано с высвобождением ионов кальция и магния - активаторов БуХЭ. В подтверждение данного механизма влияние экс трактов на БуХЭ зависит от минерализации осадков (времени хранения) и усло вий обработки: электролиз, разрушая органические комплексы, снижает влияние экстрактов, а увеличение продолжительности инкубирования экстракта и БуХЭ увеличивает (рис.2).
I,% 10 10 Электролиз, мин.
0 10 Инкубирование, мин.
Рисунок 2. Влияние условий пробоподготовки на ингибирующее действие ацетонового экстракта из осадков сточных вод очистных сооружений г.Казани Полученные результаты позволяют использовать разработанные фермент ные тесты для оценки подвижности тяжелых металлов в почвах и осадках сточ ных вод. Установлена также корреляция показателей антихолинэстеразной ак - 12 тивности ацетоновых экстрактов из осадков сточных вод и острой токсичности экстрактов для Paramecium caudatum (экспозиции 1 час).
СКРИНИНГ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Ингибирование БуХЭ может рассматриваться в системе биотестирования объек тов окружающей среды как миграционный показатель токсичности при переносе загрязнителей к высшим животным. Разнообразие факторов, влияющих на ак тивность фермента, позволяет использовать разработанные тесты не только для оценки воздействия на передачу нервного импульса, но и обобщенной оценки биологической активности новых синтезированных соединений, предлагаемых для внедрения в промышленность.
Производные индола играют важную роль в жизнедеятельности живых организмов, многие их производные используются как красители, лекарствен ные препараты, стимуляторы роста растений. Нами обнаружено ингибирующее действие производных 3-8 в различных условиях измерения сигнала (табл.3).
Таблица Ингибирующее действие производных изатина и оксиндола ti/to = a + b(CI, мM) Диапазон Cmin, № pI50, М определяемых r a b мМ концентраций, мМ 0.87±0.09 3.53±0.25 0.9873 0.3 3.0 0.4-1. 1.08±0.04 0.86±0.15 0.9534 0.2 3.0 0.4 -6. 5 +) -0.06±0.2 2.35±0.15 0.9900 0.03 - 0.07-0. 6*) 0.96±0.04 2.19±0.11 0.9969 0.5 3.3 0.8-8. 1.06±0.02 3.45±0.53 0.9657 0.2 2.9 0.3-3. 7*) 1.04±0.03 3.44±0.44 0.9766 0.15 3.0 0.17-0. 1.11±0.03 0.50±0.10 0.9259 0.2 2.7 0.6- (+) Инкубирование в отсутствие субстрата, ln(ti/to) = a + b(CI, мМ) (*) После предварительного электрохимического окисления Ингибирующее действие соединений 3,4 и 7 обусловлено с процессами карбамоилирования БуХЭ и конкурентного действия сульфамидной и фосфо - 13 ниевой группировок и не связано с реакциями фосфорилирования. В подтвер ждение этого циклические фосфаты и фосфонаты, не содержащие активных за местителей, активность БуХЭ не меняют. Электрохимическая активация увели чивает антихолинэстеразное действие изученных соединений, по-видимому, за счет изменения механизма ингибирование: окисление инициирует фосфонат фосфатную перегруппировку и облегчает фосфорилирование активного центра фермента. Соединения 5,7 по своему токсическому действию сопоставимы с та кими инсектицидами, как октаметил или хлорофос. Важно также, что данные со единения повышают свое антихолинэстеразное действие в результате окисления.
Данная процедура моделирует метаболическую активацию токсикантов, кото рую сложно оценить в лабораторных тестах.
Семичленные ацетали - производные пиридоксина 11,12 и дельдрина 13,14 - демонстрируют неконкурентное ингибирование в диапазоне концентра ций 0.06-4.0 мМ (табл.4).
Таблица Ингибирующее действие семичленных ацеталей Диапазон ln(ti/to) = a + b(CI, мМ) Cmin, № определяемых мМ r2 концентраций, мМ а b 0.043±0.041 0.10±0.02 0.9494 0.1 0.2-4. 0.017±0.028 0.60±0.06 0.9789 0.05 0.06-0. 1.03±0.04 1.0±0.14 0.9755 0.07 0.1-0. 1.01±0.03 1.3±0.13 0.9851 0.05 0.07-0. При переходе от исходных производных пиридоксина 9,10 к циклическим производным 11,12 ингибирующее действие резко возрастает, что связано со стерическим ограничением доступа молекулы ингибитора в складку белковой глобулы вблизи активного центра БуХЭ. Для производных дельдрина 13,14 ин гибирование связано с неспецифическими гидрофобными взаимодействиями с остатками аминокислот, выстилающими вход к активному центру фермента.
Стерическое ограничение доступа субстрата без образования ковалентных свя зей с активным центром объясняет неконкурентный характер ингибирования:
включение ИФА в состав фермент-субстратного комплекса сохраняет возмож ность ориентации ацеталей по гидрофобным остаткам вблизи активного центра, т.е. возможность проявления ингибирующего действия. В силу неспецифическо го характера связывания не удается также разделить диастереомеры производ - 14 ных дельдрина: несмотря на низкие действующие концентрации, они оказывают в целом сходный ингибирующий эффект на БуХЭ.
1,3-дизамещенные каликс[4]арены и их тиоаналоги. Нами было впер вые установлено ингибирующее действие ряда каликс[4]аренов на БуХЭ при ис пользовании в качестве субстрата ИФА (табл.5).
Таблица Ингибирующее действие 1,3-замещенных каликс[4]аренов на БуХЭ, фотометрическая регистрация сигнала, ti/to = a + b(CI, мкМ) Диапазон № a b r определяемых концентраций, мкМ 0.90±0.09 0.0160±0.0013 0.9820 12- 1.06±0.14 0.0093±0.0008 0.9846 20- 1.05±0.34 0.0083±0.0019 0.9310 80- 0.93±0.03 0.0084±0.0002 0.9990 60- 1.02±0.04 0.014±0.003 0.9809 13- 0.82±0.10 0.021±0.002 0.9656 10- 1.07±0.02 0.0148±0.0007 0.9922 10- 0.79±0.03 0.0193±0.0067 0.9207 15- 1.04±0.06 0.022±0.002 0.9832 15- 1.10±0.03 0.012±0.001 0.9942 2- 0.98±0.01 0.0013±0.0001 0.9328 0.96±0.02 0.9950 14- 26 0.0029±0. 0.95±0.04 0.042±0.004 0.9912 2.4- 0.40±0.37 0.009±0.001 0.9434 70- 0.93±0.04 0.003±0.0015 0.9532 70- 0.81±0.05 0.031±0.002 0.9901 13- 1.1±0.02 0.016±0.002 0.9765 2- 0.85±0.05 0.041±0.005 0.9824 2- 1.06±0.018 0.020±0.002 0.9755 1.7- 1.09±0.03 0.0030±0.0005 0.9734 2-8. 1.02±0.004 0.0029±0.0001 0.9923 1.7-8. 1.0±0.01 0.028±0.002 0.9951 2- - 15 Анализ данных ИК- и ЯМР 1Н спектров показал, что субстрат образует с изученными каликсаренами комплекс "гость-хозяин", в котором ИФА распола гается вне полости в молекулярной щели, образуемой заместителями нижнего обода (рис.3). Координация молекулы "гостя" обеспечивает образование водо родных связей с участием гидроксильных групп калисарена и -стекинг взаимодействи ем ароматических систем заместителей R2 и ИФА (R). Сходное строение имеют также комплексы изученных каликсаренов с бен O O O зойной кислотой и глицином. Анализ зависи OH мости степени ингибирования БуХЭ от кон H центрации субстрата и каликсарена показал OR' O конкурентный характер ингибирования, что R2 предполагает взаимодействие реагентов с од R ним и тем же центром связывания фермента.
R2 Это позволило предложить механизм ингиби рования, включающий кооперативное взаи Рисунок 3. Строение комплекса модействие всех трех компонентов реакции.
Комплекс, образуемый в растворе, вовлекает "гость-хояин" ся в складку на поверхности белка, каликса реновая платформа плотно закрывает вход к активному центру за счет гидро фобных взаимодействий с остатками триптофана, выстилающими стенки склад ки, и объемных трет-бутильных радикалов, ограничивающих продвижение ком плекса вглубь белковой глобулы. Предлагаемый механизм хорошо объясняет за висимость ингибирующего действия каликс[4]аренов от строения радикалов R2:
увеличение длины алифатических линкеров, включение полярных заместителей в состав бензильного фрагмента снижает степень ингибирования БуХЭ. При ис пользовании в качестве субстрата эфиров холина, не способных координиро ваться по нижнему ободу, ингибирующего действия каликс[4]аренов не наблю далось. Механизм ингибирования подтверждает также влияние органических кислот, вытесняющих ИФА из состава комплекса. Глицин и бензойная кислота снижают чувствительность определения каликс[4]аренов и увеличивают преде лы их обнаружения. Ингибирующее действие амино- и амидопроизводных 24- снижается также в присутствии ионов переходных металлов. Минимальные кон центрации ионов металлов, снижающие действие каликс[4]аренов, составляют - 16 0.04-10 мкМ, что сопоставимо с чувствительностью их электрохимического оп ределения.
Поведение тиокаликс[4]аренов осложняется их конфирмационной ла бильностью. Замена метиленовых групп на атомы серы увеличивает размер по лости и способствует более плотному контакту тиокаликсарена с БуХЭ. В ре зультате тиоаналоги сильнее снижают активность фермента по сравнению с тра диционными каликсаренами. 1,3-Альтернаты дают возможность координации ИФА между заместителями, поэтому их ингибирующее действие сохраняется.
Дизамещенные тиокаликс[4]арены в конформации "частичный конус", как и тетразамещенные тиокаликс[4]арены, БуХЭ практически не ингибируют.
Реализация предложенного механизма взаимодействия в системе БуХЭ ИФА - каликс[4]арен предполагает выполнение определенных условий: соответ ствие размеров каликсареновой платформы и складки в области активного цен тра БуХЭ, определенное расстояние между ИФА и полостью каликсарена в ком плексе, обеспечивающее плотный контакт со стенками складки белковой глобу лы. Обнаруженное действие каликс[4]аренов позволяет расширить спектр со единений, определяемых с помощью холинэстеразной индикаторной реакции.
Были предприняты также попытки потенциометрической регистрации сигнала БуХЭ в присутствии каликс[4]аренов с помощью графитового электро да, модифицированного полианилином. Сенсор позволяет регистрировать изме нение редокс-потенциала раствора в ходе ферментативной реакции. В качестве субстрата БуХЭ использовали эфиры тиохолина. Изученные каликс[4]арены при содержании в n(10-7-10-5) М и тиокаликсарены в наномолярных концентрациях оказывают активирующее действие на БуХЭ. Регистрируемое изменение потен циала электрода после добавления субстрата было в 1.5-2.5 раза выше отклика в отсутствие комплексообразователей. Все указанные явления вызваны, по видимому, сорбцией реагентов на поверхности сенсора и их влиянием на редокс процессы с участием тиохолина, образующегося в ферментативной реакции.
Вещества, связывающиеся с каликс[4]аренами в комплексы типа"гость хозяин", меняют координацию каликс[4]арена на поверхности сенсора и подав ляют активирующий эффект. Так, добавление 510-5 М глицина или бензойной кислоты в 2-5 раз снижает активирующий эффект каликс[4]аренов 15,16 и 26.
Также происходит подавление острых максимумов сигнала, наблюдающихся у тиокаликс[4]аренов в области наномолярных концентраций. Сходным образом действуют ионы металлов. В концентрациях n10-8 М ионы серебра и ртути (II) - 17 полностью нивелируют влияние каликс[4]аренов на активность БуХЭ во всем диапазоне концентраций субстрата и каликсарена.
Полученные результаты могут составить основу для создания ферментных сенсоров для экспресс-определения как самих каликсаренов, применяемых в мембранных технологиях очистки сточных вод от тяжелых металлов, так и со единений -"гостей", участвующих в комплексообразовании. Подобные сенсоры с широким спектром действия имеют перспективы использования в программах биохимического и экологического мониторинга.
ВЫВОДЫ 1. Стабилизация бутирилхолинэстеразы в водорастворимых пленках на основе N-фталилхитазана в сочетании с фотометрической регистрацией скорости фер ментативного гидролиза субстрата - индофенилацетата - позволяет надежно об наруживать и полуколичественно определять остаточные количества пестицидов антихолинэстеразного действия в почвах, зерне и виноградном соке на уровне установленных максимально допустимых уровней. Найденные оптимальные ус ловия измерения в сочетании с электрохимического предобработкой пробы по зволяют полностью исключить влияние компонентов матрицы и необходимость в удалении органического экстрагента и иных способов концентрирования.
2. Внесение известных количеств солей металлов в почвы и осадки сточных вод с последующей экстракцией показало, что ингибирующее действие экстрактов на холинэстеразу обусловлено содержанием подвижных форм металлов и зави сит от соотношения процессов гидролиза и включения ионов металлов в состав комплексов с экстрагируемыми органическими компонентами. Установлена корреляция между степенью ингибирования холинэстеразы и суммарным со держанием подвижных форм наиболее токсичных металлов в водных экстрактах почв юго-востока Татарстана. Это позволяет предложить разработанные фер ментные тесты для обобщенной характеристики сильного загрязнения почв и осадков сточных вод, а также выявления потенциальной опасности миграции токсикантов антихолинэстеразного действия в сопредельные среды.
3. На основании комплекса физико-химических и биохимических исследований установлен механизм впервые обнаруженного ингибирующего действия 1,3 дизамещенных каликсаренов на холинэстеразу. Как показано, кооперативное взаимодействие комплекса "гость-хозяин" с участием каликсарена и индофенил - 18 ацетата с ферментом приводит к стерическому блокированию доступа субстрата к активному центру без образования с ним ковалентных или иных связей.
4. Предложен новый подход к тестированию биологически активных соедине ний, основанный на сочетании принципов молекулярного распознавания с уча стием функционализированных каликсаренов и биохимической регистрации об разования комплексов "гость-хозяин". На примере органических кислот (глицин, бензойная кислота) и ионов металлов показано возможность обнаружения био логически активных веществ, не являющихся специфическими ингибиторами холинэстераз.
5. Проведен скрининг антихолинэстеразной активности фосфорилированных производных индола и семичленных ацеталей производных витамина В6 и дельдрина, позволивший выявить механизм взаимодействия полифункциональ ных соединений с ферментом и количественно охарактеризовать ингибирующее действие изученных соединений.
6. Разработан комплекс простых методик пробоподготовки и кинетического ана лиза ингибирования, позволяющий модифицировать разработанные ферментные тесты для решения задач биохимического мониторинга различных объектов ок ружающей среды и направленно регулировать чувствительность ферментных тестов в отношении приоритетных токсикантов в зависимости от требований чувствительности их обнаружения и влияния компонентов матрицы объектов контроля.
Основные результаты работы изложены в публикациях:
1. Evtugyn G.A., Stoikova E.E., Budnikov H.C., Beljakova S.V., Latipova V.Z.
Development of enzyme biosensing devices for the direct monitoring of soil and sewage sludge pollution in field. / "New Trends in Biosensor Development" Program and
Abstract
of NATO Advanced Research Workshop. Kiev (Vorzel), Ukraine, July 6 9, 1998. P.65.
2. Budnikov H.C., Evtugyn G.A., Stoikova E.E., Beljakova S.V. Сholinesterase biosensing devices for the detection of environmental pollutants in field. / INCO Copernicus Meeting "Biosensors for direct determination of environmental pollutants in field". 1999. Otrokovice, Chechia. P.19.
3. Стойкова Е.Е., Белякова С.В., Будников Г.К., Евтюгин Г.А. Ферментные тест-системы для определения остаточных количеств фосфорорганических пес - 19 тицидов в растительном материале. / Всерос.конф.”Химический анализ веществ и материалов.” Москва, 16-21 апреля 2000. С.128.
4. Стойкова Е.Е., Евтюгин Г.А., Белякова С.В., Хрусталев А.А., Антипин И.С., Будников Г.К., Коновалов А.И. Специфическое связывание 1,3-замещенных п трет-бутилкаликс[4] аренов с бутирилхолинэстеразой. / 1 Научн. конф. мол. уче ных, асп. и студ. научно-образовательного центра КГУ "Материалы и техноло гии XXI века" Тез.докл. Казань, 20-21 октября 2000 г. С.93.
5. Evtugyn G.A., Ivanov A.N., Beljakova S.V., Budnikov H.C., Vinter V.G.
Disposable cholinesterase sensors for the general estimation of environmental pollutants. / Russian-German International Scientific Workshop "Biosensors for Environmental Monitoring". Irkutsk, 21-26 July 2000, P.36-37.
6. Евтюгин Г.А., Стойкова Е.Е., Белякова С.В., Стойков И.И., Будников Г.К., Ан типин И.С. Каликсарены и ферментные тесты – новые перспективы. / Всерос сийский симпозиум "Тест-методы химического анализа". Москва 28-30 ноября 2001 г. Л7.
7. Evtugyn G.A., Stoikova E.E., Stoikov I.I., Beljakova S.V., Budnikov H.C., Antipin I.S. A novel approach to the determination of organic compounds based on biochemical detection of host-guest complexation. / 7th Intern.Symp.on Kinetics in Analytical Chemistry, 26-29 Sept. 2001, Bucharest, Romania, Book of Abstracts, O13.
8. Beljakova S.V., Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Latypova V.Z. Enzymatic test kit for the rapid and sensitive detection of insecticides in the corn. // Environ. Radioecol.
Appl. Ecol. 2001. V.7. №2 P. 35-42.
9. Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Beljakova S.V., Khrustalev A.A., Stoikov I.I., Antipin I.S., Budnikov H.C., Konovalov A.I. 1,3-Disubstituted p-tert-butylcalix[4]arenes as cholinesterase inhibitors.// J. Inclusion Phenomena. 2001. Vol.39. № 3-4. P.339-346.
Соискатель Белякова С.В.
- 20