Про- и антиапоптотическое действие нейролипинов на нормальные и трансформированные клетки нервной системы

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Андрианова Екатерина Львовна

ПРО- И АНТИАПОПТОТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НЕЙРОЛИПИНОВ НА

НОРМАЛЬНЫЕ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ НЕРВНОЙ

СИСТЕМЫ

03.01.04.- биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Институте биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Безуглов Владимир Виленович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Сапожников Александр профессор Михайлович доктор химических наук Сергеева Марина Глебовна Учреждение Российской академии

Ведущая организация:

наук институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится « » февраля 2010 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биооpганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Автореферат разослан 23 декабря 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета В.А.Олейников доктор физ.-мат. наук I.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В основе таких патологических процессов центральной нервной системы, как травмы, ишемические нарушения, нейродегенеративные заболевания, злокачественные новообразования, лежат сложные механизмы межклеточной и внутриклеточной регуляции. Апоптоз является одним из ключевых этапов развития нейропатологии. Так, при нарушении мозгового кровообращения именно за счет запуска апоптотической гибели клеток происходит увеличение зоны повреждения. В случае злокачественных новообразований, нарушение регуляции процессов апоптоза позволяет клеткам неограниченно делиться и приводит в итоге к развитию опухоли. В настоящее время ведется активный поиск соединений, позволяющих предотвращать развитие апоптоза при ишемических и нейродегенеративных заболеваниях. Поэтому в последние годы актуальным стал вопрос о возможности модулирования апоптотических процессов для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся аномалиями в механизмах регуляции программированной гибели клеток.

Эндогенные соединения или схожие с ними агенты представляются наиболее подходящими кандидатами для создания препаратов против нейропатологических заболеваний, поскольку именно эндогенные соединения могут оказывать дифференцированный эффект в зависимости от типа клеток. В данной работе в качестве подобных соединений рассматривались нейролипины и их синтетические аналоги.

Нейролипины представляют собой семейство эндогенных амидных и эфирных производных жирных кислот, действующих на ключевые белки каннабиноидной и ванилоидной систем. Обе эти системы вовлечены в передачу внутриклеточных сигналов с цитоплазаматической мембраны в ядро, модулирующих физиологическое состояние клеток и влияющих на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. К нейролипинам, в частности, относят такие эндогенные производные арахидоновой кислоты, как N арахидоноилэтаноламин (анандамид, AA-EA), 2-арахидоноилглицерин (2-AG), N-арахидоноилглицина (AA-Gly), N-арахидоноилдофамина (AA-DA).

Нейропатологические процессы существенно затрагивают системы регуляции с участием нейролипинов. Ранее было показано, что некоторые нейролипины, относящиеся к семейству эндоканнабиноидов, способны защищать культуры нейрональных клеток от различных токсических факторов.

Агонисты каннабиноидного рецептора (CBR1) подавляют глутаматэргическую нейропередачу, ингибируя выброс глутамата и модулируя ингибиторную функцию ГАМК. К настоящему моменту доказана способность N арахидоноилэтаноламида (AA-EA) и 2-арахидоноилглицерина (2-AG) ингибировать пролиферацию и индуцировать апоптоз в трансформированных клетках различных линий. Однако полученные ранее данные относятся только к наиболее изученным представитялям семейства AA-EA и 2-AG или синтетическим экзоканнабиноидам – аналогам ТНК. При этом механизмы описанных нейропротективного и противоопухолевого эффектов неоднозначны. Исследования последних лет значительно расширили представления о липидных регуляторах в ЦНС, что позволило объединить две группы веществ: эндоканнабиноиды и эндованилоиды, а также их биологически активные метаболиты в семейство нейролипинов. Однако данные о механизмах их действия в норме и при патологии, а также о функциональной активности новых групп нейролипинов, в частности, ацил-дофаминов, крайне скудны. Изучение механизмов действия нейролипинов позволит расширить представление о функционировании соединений семейства в организме.

Цели и задачи исследования Целью данной работы было определение влияния нейролипинов на апоптоз в нормальных и трансформированных клетках нервной системы. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выявление из 4-х групп эфирных и амидных производных жирных кислот соединений, оказывающих токсическое действие на трансформированные клетки нервной ткани;

2. Определение механизмов проапоптотического действия активных соединений;

3. Выявление из группы исследуемых соединений веществ, оказывающих нейропротективное действие на клетки нормальной нервной ткани в различных токсических моделях;

4. Определение механизмов нейропротективного действия активных соединений.

Научная новизна и практическая значимость Проведенная работа позволила расширить представления о реализации сигнала нейролипинов в клетках нервной системы, как в норме, так и при патологии. В результате проведения скрининга на первичных и трансформированных клетках нервной системы крысы выявлены соединения, обладающие проапоптотическим действием в отношении трансформированных клеток и, напротив, проявляющие антиапоптотичекие свойства в отношении первичных культур. Установлены структурные особенности молекул, необходимые для реализации данных эффектов.

Впервые показано проапоптотическое действие нейролипинов и вновь синтезированных аналогов на культуры глиомы крысы и человека. Определены механизмы токсического действия активных веществ. На моделях нейронального апоптоза и эксайтотоксичности показаны нейропротективные свойства нейролипинов и вновь синтезировнных аналогов, а также механизмы их нейропротективного действия. Выявлено значение межклеточных взаимодействий для реализации нейропротективного стимула нейролипинов.

На основании полученных данных выдвинута гипотеза о пути передачи внутриклеточного сигнала под действием нейролипинов и их синтетических аналогов.

Таким образом, полученные данные могут быть использованы при разработке тактики лечения ряда заболеваний ЦНС, в частности, ишемических повреждений мозга.

Апробации работы Основные материалы работы были доложены и обсуждены на 5-м Международном Симпозиуме аспирантов EMBL ( Гейдельберг, 2004);

на симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний» (Москва, 2005);

на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007);

на Конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные результаты и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 198 ссылок.

Диссертация содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В рамках данной работы были исследованы четыре группы аналогов нейролипинов:

аналоги анандамида (AA-EA) – в данную группу вошли наиболее активные каннабиноиды и их производные;

аналоги 2-арахидоноилглицерина (2-AG) – ранее были показаны нейропротективные свойства прототипа этой группы, а также увеличение его концентрации в очаге ишемического повреждения мозга человека;

аналоги N-арахидоноилглицина (AA-Gly) – соединения данной группы не только взаимодействуют CBR, но и обладают способностью ингибировать FAAH – основной фермент метаболизма нейролипинов;

аналоги N-арахидоноилдофамина (AA-DA) – в группу вошли ацилированные производные биогенных амидов;

соединения данной группы с высокой аффинностью взаимодействуют как с CBR, так и с TRPV.

На первом этапе работы был проведен скрининг нейролипинов на проапоптотическое и нейропротективное действие. Токсическое действие исследуемых соединений было изучено на клетках глиомы крысы С6. В клетках данной линии синтезируются CBR1, CBR2, TRPV1. Кроме того, действие наиболее активных соединений было изучено на клетках глиомы человека U251. Для изучения нейропротективных свойств исследуемых соединений были выбраны две модели этапов ишемического повреждения нервной системы: модель глутаматной эксайтотоксичности и модель нейронального апоптоза в гранулярных нейронах мозжечка крысы.

На следующем этапе было проведено изучение механизмов действия наиболее активных соединений в выбранных моделях.

1 Проапоптотическое действие нейролипинов 1.1. Проапоптотическое действие на клетки глиомы крысы С Аналоги анандамида (AA-EA) Исследовано действие 6 аналогов AA-EA на клетки глиомы крысы С6.

Наиболее эффективным в последней группе оказался AA-CPA, показавший значительный токсический эффект: 17,8% выживших клеток при концентрации 10 мкМ. В концентрации 100 мкМ токсическое действие проявляли N-арахидоноилпиперазин и N-арахидоноилнитроэтаноламин (1,8% и 10,8% от контроля, соответственно).

Принятые сокращения: CBR – каннабиноидный рецептор, TRPV – ванилоидный рецептор, AA – арахидоновая кислота, DHA - докозагексаеновая кислота, PI3K – фосфоинозитол-3 киназа, PKA - протеинкиназа А, PKC - протеинкиназа С, CaMKII – кальмодулинзависимая киназа II, ERK - киназа, регулируемая внеклеточными факторами (extracellular-regulated kinase), FAAH – амидогидролаза жирных кислот;

Аналоги 2-арахидоноилглицерина (2-AG) Была протестирована библиотека соединений, полученных путем модификации всех трех составных частей фармакофора эндоканнабиноида 2 арахидоноилглицерина, а именно, изменения жирнокислотного остатка, карбоксильной группы и альфа-углеродного атома жирной кислоты, а также полярной части молекулы (Таблица 1). Всего исследовано 12 соединений. В целом, можно охарактеризовать соединения данной группы как малотоксичные по отношению к клеткам глиомы крысы C6. Слабовыраженный эффект в достаточно высокой концентрации 100 мкМ не имеет практического значения.

Таблица 1 Токсическое действие аналогов 2-арахидоноилглицерина на клетки глиомы С Короткое количество живых клеток в % от Полное название название контроля 1 мкM 10 мкM 100 мкM 2-арахидоноилглицерин 2-AG 106,6±8,2 103,2±7,6 88,4±5, О-арахидоноилэтиленгликоль AA-EG 114,7±10, 106,8±9,1 105,2±9, О-эйкозапентаеноилэтиленгликоль н/о EPA-EG 106,1±4,2 121,3±11, О-докозагексаеноилэтиленгликоль DHA-EG 110,8±5,6 103,6±6,2 116,1±13,,-диметил-эйкозапентаеноил-О- DMEPA-EG 95,5±10,2 108,3±9,2 26,3±4,4* этиленгликоль AA-GABA- 109,3±0,8 92,0±1,6 85,9±4, N-арахидоноил--аминобутирил-О этиленгликоль EG О-арахидоноилнитроэтиленгликоль AA-NEG 106,6±2,8 103,2±9,3 88,4±6,,-диметил-арахидоноил-О- DMA-EG 102,1±2,4 103,9±8,5 44,4±4,7* нитроэтиленгликоль О-эйкозапентаеноилнитроэтиленгликоль EPA-NEG н/о 102,4±5,1 75,9±2, н/о 2-эйкозапентаеноилдинитроглицерин EPA-DNG 95,8±4,1 102,8±9, Эйкозатетаеноилдиметилгидроксипропи ETE- 118,2±8,9 101,6±3,3 8,5±0,8* лнат DMHPA Сукцинимидный эфир арахидоновой AA-o-Su н/о 80,6±5,2 87,1±4, кислоты н/o – не определяли;

* р0. Аналоги N-арахидоноилглицина AA-Gly До настоящего момента не проводилось исследований действия соединений данного класса на трансформированные клетки отмечалось только, что AA-Gly регулирует действие уровня AA-EA в клетке как ингибитор FAAH.

На основе этих данных было сделано предположение, что ацилированные аминокислоты могут оказывать антипролиферативное действие как ингибиторы FAAH.

Были синтезированы и протестированы на противоопухолевое действие аналогов арахидоноилглицина: ацилированные арахидоновой кислотой глицин, пролин, тирозин, триптофан, финилаланин и -аминомасляная кислота. Выбор аминокислот был обусловлен их значением для процессов молекулярной регуляции в ЦНС. Исследование токсичности проводилось на клетка глиомы крысы С6.

Среди соединений данной группы не было выявлено токсичных соединений при использовании концентраций до 100 мкМ. При концентрации исследуемых соединений 1, 10, 100 мкМ количество живых клеток в эксперименте достоверно не отличалось от контроля (р0,05). В Таблице приведен список аналогов, вошедших в данную группу, а также показатели их токсического действия на клетки глиомы крысы.

Таблица 2 Токсическое действие аналогов N-арахидоноилглицина на клетки глиомы крысы С Короткое количество живых клеток в % от Номенклатурное название название контроля 1 мкM 10 мкM 100 мкM N-арахидоноилглицин AA-Gly 90,2±1,9 96,9±4,3 98,3±11, н/о AA-Tyr N-арахидоноилтирозин 105,1±4,4 84,3±5, н/о N-арахидоноилтриптофан AA-Trp 99,6±2,4 92,7±4, н/о AA-Pro N-арахидоноилпролин 100,6±0,1 96,7±9, н/о AA-Phe N-арахидоноилфенилаланин 103,0±9,2 100,1±3, AA-GABA 93,3±6,1 99,6±3,2 107,0±5, N-арахидоноил--аминобутират н/o – не определяли Аналоги N-арахидоноилдофамина (AA-DA) В данной группе были проанализированы свойства 12 соединений ацилированнх производных биогенных аминов: дофамина, норадреналина, адреналина, серотонина (Таблица 3).

Ряд производных дофамина и серотонина содержали в липофильной части молекулы различные жирные кислоты. N-арахидоноилтриптамин и N арахидоноилметокситриптамин были включены в эту группу как возможные эндогенные предшественники AA-DA и AA-5HT, соответственно. N арахидоноилванилиламин вошел в группу в качестве вещества сравнения как агонист ванилоидного рецептора.

Практически все производные, содержащие дофамин, оказывали токсическое действие на клетки глиомы С6 в концентрациях до 10мкМ.

Дофаминовые производные докозапентаеновой (C22:5 3) и стеаридоновой (С18:4 3) кислот не обладали токсическим эффектом. Наиболее активными в группе оказались AA-DA и DHA-DA: 8.6% и 11,8% от контроля при концентрации 10 мкМ, соответственно. Диметильная трансформация AA-DA приводила к полной отмене проапоптотического действия.

AA-VAN и AA-5HT проявляли токсическое действие, но в более высокой концентрации (100 мкМ): 6,5% и 3,3% от контроля, соответственно. Наиболее активным в ряду серотониновых производных был N арахидоноилметокситриптамин (1,5% в концентрации 100 мкМ).

Таблица 3 Токсическое действие аналогов N-арахидоноилдофамина на клетки глиомы крысы С Короткое количество живых клеток в % от Полное название название контроля 1 мкM 10 мкM 100 мкM N-арахидоноилдофамин (С20:4, 6) AA-DA 74,3±8,0* 8,6±0,9* 3,5±0,7* N-эйкозапентаеноилдофамин (С20:5, 3) EPA-DA 79,6±11,3 14,4±3,2* 11,4±3,4* N-докозагексаеноилдофамин (С22:6, 3) DHA-DA 86,6±7,5 11,8±7,1* 5,8±0,03* н/о N-,-диметиларахидоноилдофамин DMA-DA 102,3±5,1 110,4±9, н/о N-докозапентаеноилдофамин C22:5-DA 112,9±8,2 108,0±4, (С22:5, 3 ) N-стеаридоноилдофамин (C18:4, 3) н/о 109,5±4,0 108,0±8, C18:4-DA N-олеоилдофамин (С18:1, 9) н/о OL-DA 98,0±8,8 38,7±3,2* 89,4±0, N-арахидоноил--аминобутирил-N- 33,75±1,2* 7,5±1,1* AA дофамин GABA-DA N-арахидоноилтирамин 83,8±11,3 73,9±4,1* 2,7±0,2* AA-TA н/о N-арахидоноилнорадреналин AA-NAD 98,3±8,6 56,8±7,4* н/о N-арахидоноиладреналин AA-AD 101,8±2,6 39,1±1,4* N-арахидоноилванилиламин AA-VAN 94,0±2,3 106,96±2,3 6,48±0,1* н/o – не определяли;

* р0. Таблица 4 Токсическое действие аналогов N-арахидоноилсеротонина на клетки глиомы крысы С короткое количество живых клеток в % от Полное название название контроля 1 мкM 10 мкM 100 мкM N-арахидоноилсеротонин AA-5HT 102,2±5,9 54,4±10,2* 3,3±0,1* N-эйкозапентаеноилсеротонин EPA-5HT 91,5±4,07 77,8±7,5 6,5±2,3* N-линоленоилсеротонин (C18:3, 3 ) C18:3- 91,8±3,7 63,2±1,6* 5,7±1,1* 5HT C9-5HT N-наноилсеротонин 82,6±7,4 67,3±3,4* 41,3±3,1* N-арахидоноилметокситриптамин AA-MOT 89,9±5,2 77,6±3,07 1,5±0,4* * р0. Для трех дофаминовых производных: AA-DA, DHA-DA были получены концентрационные зависимости (Рис.1).

Рис.1 Концентрационная зависимость токсического действия AA-DA и DHA-DA на клетки глиомы крысы С6. Клетки инкубировали с исследуемыми веществами в течение 24 часов.

Количество живых клеток анализировали с помощью МТТ-теста.

1.2. Проапототическое действие нейролипинов на клетки глиомы человека U На культуре клеток глиомы человека U521 было проведено исследование цитотоксической активности соединений, показавших проапоптотический эффект в отношении культуры глиомы крысы С6.

Изучение свойств нейролипинов на трансформированных клетках человека, безусловно, представляет практический интерес.

На настоящий момент не доказано, что клетки глиомы человека U экспрессируют гены каннабиноидных или ванилоидных рецепторов.

Дофаминовые производные оказывают токсическое действие на клетки этой культуры (Таблица 5).

Таблица 5 Токсическое действие нейролипинов на клетки глиомы человека U количество живых клеток в % от контроля 2,5 мкM 10 мкM 25 мкM 50 мкM 104,5±9,21 86,7±4, AA-DA 20,4±2,63* 17,7±1,11* EPA-DA 66,7±3,59* 63,3±1,19* 64,7±4,54* 56,4±0,67* DHA-DA 74,9±0,23* 49,3±1,55* 43,6±2,68* 33,2±4,54* 98,8±2, OLDA 70,9±6,37* 43,31±2,91* 34,9±2,93* 115,0±8, AA-GABA-DA 23,6±1, 40,7±0,65* 21,5±2,09* 117,7±8,30 106,0±6,96 108,2±8,36 99,8±4, AA-5HT 76,2±5,06 104,5±5,80 86,6±4,41 81,5±2, AA-NAD 94,7±3,89 94,07±2,15 81,3±7,03 85,7±6, C22:5-DA 95,4±6,23 87,8±8,37 90,0±9,29 88,65±6, C18:4-DA 95,8±7,2 92,6±6,02 82,0±4, AA-CPA 42,8±3,05* 89,5±6, AA-EA 62,1±8,8* 40,5±5,4* 44,3±6,1* * р0. AA-CPA оказался практически неактивным в данной модели. Поскольку доказано, что AA-CPA является высокоаффинным антагонистом CBR1, можно сделать предположение об отсутствии СBR1 на мембране клеток этой линии.

Интересно, что на клетках человеческой глиомы AA-EA оказался более активен, чем на клетках глиомы крысы, в то время как AA-5HT, напротив, не активен в данной модели.

1.3. Действие AA и DHA на клетки культуры глиомы крысы С6 и культуры глиомы человека U AA и DHA являются биологически активными соединениями, способными регулировать пролиферацию в различных клеточных линиях.

Известно, что накопление AA приводит к индукции апоптоза в клетках нервной системы. Можно сделать предположение, что именно жирные кислоты, входящие в состав соединений, после гидролиза последних оказывают токсическое действие на культуры глиом. Результаты проведенных экспериментов показали, что обе жирные кислоты не только не оказывают токсического действия на глиомы, но и значимо стимулируют пролиферацию.

По результатам МТТ-теста, АА на 40% увеличивала количество клеток относительно контроля, а DHA - на 60%. Таким образом, проапоптотический стимул нейролипинов и их синтетических аналогов не является результатом действия жирных кислот, высвобождаемых при гидролизе исследуемых соединений.

1.4. Механизм проапоптотического действия нейролипинов Влияние антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов на активность нейролипинов В первую очередь, был протестирован цитотоксический эффект наиболее активных соединений (AA-DA и DHA-DA) в присутствии антагонистов каннабиноидных (SR141716A, SR144528), ванилоидных (капсазепин) и дофаминовых (галлоперидол) рецепторов в клетках глиомы С6. Ни один из антагонистов не оказал влияния на цитотоксическое действие исследуемых нейролипинов в данной модели.

Кроме того, было проведено изучение связи цитотоксического действия AA-CPA с активацией CBR1, CBR2, TRPV1. Антагонист CBR1 SR 141716A (рис.2) полностью ингибировал цитотоксическое действие AA-CPA, в то время как антагонисты CBR2, TRPV1 не оказывали влияния на активность АА-СРА в данной модели.

Рис.2 Действие AA-CPA на клетки * глиомы крысы С6 на фоне антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов. Hal галоперидол sr1-SR141716A;

sr2 SR144528;

Cap-капсазепин. Клетки инкубировали с исследуемыми веществами в течение 24 часов.

Количество живых клеток анализировали с помощью МТТ-теста.

Все группы, кроме (*), достоверно не отличались друг от друга;

р 0.05.

Влияние ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала на проапоптотическую активность нейролипинов Было проанализировано действие ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала в клетках линии глиомы крысы С6. Ранее в литературе уже рассматривались, как возможные мишени действия каннабиноидов, участники сигнального каскада Raf/MEK/ERK. В данной работе были использованы ингибиторы киназ этого пути, а также сигнального пути PI3K/Akt. На цитотоксический эффект AA-DA и DHA-DA исследовалось влияние ингибиторов PKA (KT-5720), PI3K (вортманин), МЕК1(PD-98059);

MEK2 (sl-327), PKC (GF-109203X), CaMKII (KN-62). Ни один из ингибиторов ферментов передачи внутриклеточного сигнала не оказал достоверно значимого эффекта на проапоптотическое действие исследуемых соединений (р0,05).

АА-DA и DHA-DA вызывают апоптоз в клетках крысы глиомы С Для определения механизмов клеточной гибели была проведена оценка морфологических изменений в ядрах клеток глиомы, а также проведен анализ активности каспазы-9 и каспазы-3.

Окраска красителем, связывающимся с ДНК, - Hoechst 33342, показала, что уже через два часа под воздействием 10 мкМ AA-DA и DHA-DA наблюдается суперконденсация хроматина и фрагментация ядер клеток исследуемой культуры и, как следствие, образование апоптотических телец.

Данная картина характерна для гибели клеток путем апоптоза. Уже через три часа большая часть клеток погибает (рис.3).

Анализ активности каспаз с помощью флуоресцентных субстратов показал значительное увеличение активности каспазы-9 и каспазы-3 через часов после внесения исследуемых соединений (AA-DA и DHA-DA) в культуру клеток глиомы (Таблица 6).

Таблица 6 Активность каспазы-3 и каспазы-9 в клетках глиомы крысы С6.

AADA DHA-DA 15 часов 24 часа 15 часов 24 часа Каспаза - 3 2325% 158% 317% 743% Каспаза - 9 460% 194% 940%;

547% Данные приведены в % от контроля Проведенные исследования продемонстрировали, что AA-DA и DHA-DA вызывают апоптоз в клетках глиомы крысы, причем апоптотический каскад развивается по каспазозависимому пути.

Рис.3 Морфологические изменения в ядре клетки глиомы крысы С6 на фоне действия нейролипинов: А. AA-DA 10 мкМ;

В. DHADA 10 мкМ. Окраска Hoechst 33342. Белыми стрелками обозначены образующиеся апоптотические тельца.

1.5. Токсическое действие нейролипинов на первичные культуры глии крысы В экспериментах на глиоме наиболее выраженный токсический эффект продемонстрировали АА-GABA-DA AA-DA и DHA-DA. Именно эти соединения были протестированы на токсичность по отношению к первичной культуре глии крысы.

Эксперименты проводились по той же схеме, что и с трансформированными клетками, однако нейролипины не оказывали токсического эффекта в исследуемых концентрациях. Отсутствие токсичности у наиболее активных ингибиторов пролиферации глиом (AA-DA и DHA-DA) в отношении первичной культуры глии делает перспективным их изучение как фармакологических агентов для лечения глиом.

Антиапоптотическое (нейропротективное) действие нейролипинов 2.1. Антиапоптотическое действие нейролипинов в модели К+ - депривации Данная модель апоптоза в нервной ткани представляет собой культуру гранулярных нейронов мозжечка крысы;

клетки этого типа нуждаются в повышенной концентрации ионов K+ (25 мМ). Снижение концентрации ионов калия вызывает постоянную деполяризацию мембран клеток, что впоследствии приводит к индукции апоптоза.

Несмотря на то, что 2-AG является эндогенным нейропротектором при ишемическом повреждении головного мозга (Karanian D., 2005), соединения группы эфирных производных не проявили нейропротективное действие в данной модели.

В группе амидных наиболее выраженными защитными свойствами обладали дофаминовые производные. По убыванию нейропротективной активности дофаминовые производные можно расположить в следующий ряд:

AA-DA DHA-DA EPA-DA. Исключение составляет DMA-DA, не проявивший нейропротективного эффекта. Таким образом, и про- и антиапоптотическй эффект производных AA-DA исчезает при диметильной модификации ацильной части молекулы.

Для наиболее активных соединений были получены дозовые зависимости нейропротективного эффекта (Рис.4).

% нейропротективного действия 60 DHA-DA AA-DA 0 5 10 15 20 25 30 концентрация, мкМ Рис.4 Зависимость нейропротективного действия в модели К+- депривации от концентрации для AA-DA DHA-DA. Результаты приведены в % нейропротективного действия.

AA-VAN также оказывал нейропротективное действие, что полностью согласуется с литературными данными (Veldhuis W., 2003).

В незначительной степени нейропротективным действием обладали AA CPA и AA-EA. Этот эффект не превышал 20%.

В высоких концентрациях AA-DA и DHA-DA полностью теряют защитное действие и даже становятся токсичными. Так AA-DA теряет нейропротекторные свойства в концентрации 25 мкМ, а DHA-DA - в концентрации 35 мкМ.

2.2. Действие AA и DHA на клетки первичной культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы в модели K+ депривации.

Кроме вышеописанных групп нейролипинов и их синтетических в модели К+-депривации было проведено изучение аналогов, нейропротективного действия жирных кислот как возможных гидролитических производных исследуемых соединений. Арахидоновая кислота (AA) проявляет незначительное нейропротективное действие в данной модели.

Докозагексаеновая кислота (DHA) оказалась эффективным нейропротектором, проявляя защитные свойства практически на уровне DHA-DA.

Диметилмодифицированная докозагексаеновая кислота полностью теряла нейропротективное действие.

2.3.Механизмы нейропротективного действия нейролипинов в модели К+ депривации Нейропротективное действие нейролипинов на первичные культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы с пониженным содержанием глии При использовании стандартной методики выделения гранулярных нейронов мозжечка через неделю культивирования в полученной смешанной культуре количество клеток глии составляет до 30%. Для выяснения вовлеченности глиальных клеток в механизмы нейропротекции были проведены эксперименты на культурах клеток с минимальным содержанием глии. Пролиферацию глии подавляли внесением в инкубационную среду мкМ AraC.

Рис. 5 Нейропротективное действие AA DA и DHA-DA на смешанные культуры нейронов мозжечка крысы и культуры гранулярных нейронов с минимальным содержанием глии () в модели К+ депривации. Результаты приведены в % нейропротективного действия.

Количество глиальных клеток в культуре при этом не превышало 5%.

Сравнительные эксперименты показали, что нейропротективное действие исследуемых соединений напрямую зависит от количества глиальных клеток в культуре (рис.5). Можно сделать предположение, что действие, оказываемое нейролипинами, направлено именно на клетки глии, которые, в свою очередь, защищают нейроны от апоптоза.

Влияние антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов на нейропротективный эффект нейролипинов Антагонисты CBR2 (SR144528) и ванилоидного рецептора (капсазепин) полностью нейтрализовали нейропротективное действие AA-DA и DHA-DA в модели К+-депривации (рис.6). Антагонист CBR1 (SR141716A ) и антагонист дофаминовых рецепторов (галоперидол) не оказывали влияния на нейропротективное действие AA-DA и DHA-DA. Поскольку CBR экспрессируется на глиальных клетках, полученные данные подтверждают предположение о ключевой роли межклеточных взаимодействий между нейронами и клетками глии в реализации нейрозащитных свойств нейролипинов.

Рис.6 Действие AA-DA DHA-DA в модели К+-депривации на фоне действия антагонистов каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов. Hal-галоперидол;

sr1 SR141716A;

sr2-SR144528;

Cap-капсазепин. Анализ количества живых клеток проводили с помощью МТТ-теста. Все группы, кроме (*), достоверно не отличались друг от друга;

р 0. Влияние ингибиторов передачи внутриклеточного сигнала на нейропротективную активность нейролипинов Литературные данные из различных источников указывают на связь антиапоптотического действия каннабиноидов c активностью протеинкиназ, вовлеченных в передачу внутриклеточного сигнала. В свою очередь, активация рецепторов каннабиноидно-ванилоидной системы приводит к ингибированию фосфорилирования киназ проапоптотического пути. Нами было исследовано влияние ингибиторов основных киназных каскадов MAPK/ERK(MEK) и PI3K/Akt, вовлеченных в процессы гибели-выживания клетки. В частности, из (рис.7) видно, что ингибирование активности PI3K приводит к практически полной блокаде нейропротективного действия DHA-DA и значительно снижает защитный эффект AA-DA (p0,05). В экспериментах были использованы селективные ингибиторы PI3K вортманин и LY294002, а также ингибитор широкого действия стауроспорин.

Ингибирование активности ферментов группы МЕК (MEK1 и MEK2) (рис.9) не оказывало значимого эффекта на действие обоих исследуемых соединений Для анализа вовлеченности в механизм (p0,05).

нейропротективного действия AA-DA и DHA-DA данного пути передачи внутриклеточного сигнала были использованы ингибиторы ферментов семейства МЕК PD98059 и SL327.

Таким образом, можно сделать вывод об участии в механизме нейропротективного действия пути передачи сигнала через PI3K, без вовлечения МЕК.

Кроме того, было изучено влияние ингибиторов РКА, РКС и СаМKII на нейропротективное действие AA-DA и DHA-DA. Ингибитор РКА KT-5720 не оказывал достоверно значимого влияния на нейропротективные свойства DHA DA (p0,05), однако значимо снижал эффект AA-DA - до 15% нейропротективного действия (p0,05) (рис.8), т. о. молекулярный механизм действия производных дофамина зависит от структуры незаряженной части молекулы. Селективный ингибитор СаМKII KN-62, напротив, практически полностью ингибирует действие DHA-DA, не оказывая эффекта на защитные свойства AA-DA (рис.9). В то же время, активация РКС является ключевым этапом в механизме нейропротективного действия обоих исследуемых соединений в модели нейронального апоптоза: селективный ингибитор РКС GF109203X практически полностью блокировал нейропротективное действие как AA-DA, так и DHA-DA (рис.8).

Подводя итог, можно сделать вывод о вовлечении в реализацию нейропротективного эффекта производных дофамина следующих регуляторных белков: PI3K, РКС, РКА и СаМK II. PI3K и РКС являются ключевыми белками для обоих исследуемых веществ;

РКА вовлечена в механизм защитного действия AA-DA, а СаМKII является ключевым ферментом для проведения антиапоптотического сигнала DHA-DA.

Ингибирование активности каспаз нейролипинами и их аналогами Модель нейронального апоптоза, использованная в данной работе, на настоящий момент описана в литературе достаточно хорошо. В частности, неоднократно отмечалось, что в данном случае индукция апоптоза осуществляется через активацию каспазного пути, включающего в себя каспазу-9 и каспазу-3.

Было протестировано влияние AA-DA и DHA-DA на активность каспаз в модели К+ - депривации. Показано, что оба соединения ингибируют активность каспазы-9 и каспазы-3. Полученные результаты подтверждают предположение о вовлечении в механизм действия данных соединений пути передачи внутриклеточного сигнала через ферментативную систему PI3K/Akt. В нейрональной клетке активация PI3K приводит к активации Akt, которая, в свою очередь, ингибирует активность каспазы-9.

Рис.7 Нейропротективная активность AA-DA (10 мкМ) и DHA-DA (15 мкМ) в модели К+ депривации на фоне ингибиторов PI3K и PKA. Ly - LY294002, селективный ингибитор PI3K (5 мкМ);

wor – вортманин, селективный ингибитор PI3K (5 мкМ);

kt57 - KT-5720, селективный ингибитор PKA (1 мкМ). (*) – Группы, достоверно отличающиеся от контроля (р0.05).

Рис.8 Нейропротективное действие AA-DA (10 мкМ) и DHA-DA (15 мкМ) в модели К+ депривациии на фоне ингибиторов PKC и CaMKII. Gf - GF109203X, селективный ингибитор PKC (1мкМ);

kn62 - селективный ингибитор CaMKII (1мкМ). (*) – Группы, достоверно отличающиеся от контроля (р0.05).

Рис.9 Нейропротективная активность AA-DA (10 мкМ) DHA-DA (15 мкМ) в модели К+-депривации на фоне ингибиторов MEK. pd – PD98059, ингибитор MEKK (10мкМ);

sl327 – селективный ингибитор MEK1 и MEK2 (1мкМ). Все группы достоверно не отличались друг от друга (р0.05).

2.4. Антиапоптотическое действие нейролипинов в модели глутаматной токсичности Глутаматная токсичность является моделью ключевого этапа ишемического повреждения в нервной системе.

В модели глутаматной токсичности проводили исследование нейропротективного действия AA-DA, DHA-DA, AA-CPA, AA-EA. В данной модели AA-DA и DHA-DA проявляли защитный эффект на уровне 50%. AA CPA показал незначительный нейропротективный эффект, в то время как AA EA не проявлял нейропротективного действия.

Механизмы нейропротективного действия нейролипинов и их 2.5.

аналогов в модели глутаматной токсичности Антагонист дофаминовых рецепторов (галоперидол) не оказывал действия на нейропротективный эффект AA-DA и DHA-DA.

В модели глутаматной токсичности профиль действия антагонистов рецепторов каннабиноидно-ванилоидной системы отличался для AA-DA и DHA-DA. SR141716A не оказывал действия на нейропротективный эффект AA DA, при этом практически полностью нейтрализуя защитный эффект DHA-DA.

SR144528 на 50% снижал эффективность действия для DHA-DA и на 85% для AA-DA. Капсазепин был неактивен в данной модели. Основываясь на полученных результатах, можно сказать, что CBRs в разной степени вовлечены в нейропротективное действие AA-DA и DHA-DA в модели глутаматной токсичности, причем CBR2 вовлечен в механизм действия обоих соединений.

Нейропротективное действие нейролипинов на срезы гиппокампа 2.6.

крысы в модели глутаматной токсичности Эксперименты, проведенные на органотипических гиппокампальных культурах, также продемонстрировали защитный эффект AA-DA и DHA-DA в модели глутаматной токсичности (Рис. 10).

До воздействия После воздействия контроль Глутамат 200мкМ 15 мин Глутамат 200мкМ 15 мин AA-DA 10 мкМ 22 часа Рис.10 Нейропротективное действие AA-DA (10 мкМ) на органотипические культуры гиппокампа в модели глутаматной эксайтотоксичности. Срезы помещали на 10 мин в буфер, содержащий 200 мкМ глутамата. После двухкратной отмывки Lock-буфером срезы помещали в кондиционированную среду, содержащую исследуемые вещества. Окраска пропидиумом иодидом.

Заключение В рамках данной работы был проведен анализ цитотоксичности и нейропротективной активности 36 аналогов нейролипинов. Анализ проводился с использованием как трансформированных, так и первичных культур. После скрининга на модели глиомы крысы С6 и модели нейронального апоптоза в первичной культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы были выявлены два наиболее активных соединения: AA-DA и DHA-DA. Данные соединения оказывали токсический эффект на клетки глиомы C6 и глиомы человека U251, а также защищали гранулярные нейроны от апоптоза, вызванного пониженным содержанием К+, и от глутаматной токсичности. Все эффекты данных соединений были дозозависимы.

Изучение механизмов действия AA-DA и DHA-DA продемонстрировало, что в клетках глиомы и первичных культурах мишенями служат различные белки. Так, нейропротективное действие нейролипинов связано с СBR2 и TRPV1, в то время как мишени цитотоксического действия AA-DA и DHA-DA в глиоме обнаружить не удалось. Поскольку в исследовании использовались антагонисты каннабноидных и ванилоидных рецепторов, а также ингибиторы регуляторных киназ, возможно, проапоптотический эффект исследуемых соединений реализуется за счет не активации, а, напротив, ингибирования данных регуляторных белков;

не исключено также, что в клетках нервной системы существуют другие мишени нейролипинов.

Влияние ингибиторов ферментов, не связанных цепью последовательной активации, на реализацию эффекта нейролипинов, а также вовлеченность в регуляцию их нейропротективного действия как каннабиноидного, так и ванилоидного рецептора, дают возможность говорить о мультифункциональном воздействии нейролипинов на пути передачи внутриклеточного сигнала в клетках нервной системы. Отдельно стоит остановиться на взаимодействии каннабиноидных и ванилоидных рецепторов.

Так, известно, что каннабиноидные рецепторы ингибируют активность аденилатциклазы (Howlett A.C;

1995), предотвращая активацию PKA, в то время как РКА фосфорилирует TRPVI, приводя его в активное состояние (De Petrocellis L., Harrison S., 2001;

Mohapatra D.P, 2003). Таким образом, несмотря на то, что в рамках данной работы не удалось обнаружить мишени AA-DA и DHA-DA в клетках глиомы крысы, можно сказать, что вектор действия данных нейролипинов определяется балансом воздействия на различные пути передачи внутриклеточного сигнала, в вершине каскада, которого стоят каннабиноидные и ванилоидные рецепторы. Это, в свою очередь, дает возможность объединить каннабиноидные и ванилоидные рецепторы в единую систему передачи внутриклеточного сигнала.

Анализируя структуру молекулы, являющейся активатором данной системы, на основании проведенного скрининга можно сказать, что для реализации внутриклеточного сигнала значимым являются как неполярная, так и амидная части молекулы. Среди исследованных нейролипинов, именно дофаминовые производные обладали наиболее высокой активностью. Говоря о липофильной части молекулы, нужно отметить, что наиболее эффективными оказались соединения, имеющие в липофильной части молекулы 20-22 атома улерода, а также четное количество двойных связей (4 или 6). Введение двух метильных групп в альфа-положение жирной кислоты делает молекулу более устойчивой к гидролизу, но полностью лишает возможности реализации как про-,так и антиапоптотического эффекта.

При анализе эффективности метаболитов нейролипинов было показано, что DHA проявляла нейропротективные свойства и не обладала цитотоксическим эффектом. При этом АА оказалась неактивной в обоих тестах.

Не приходиться также говорить об активности дофамина, так как антагонист дофаминовых рецепторов галоперидол не оказывал влияния на действие нейролипинов во всех использованных моделях. Таким образом, можно сделать вывод, что значимыми для реализации про- и антиапоптотического действия нейролипинов являются не их метаболиты, а структурные характеристики молекулы.

Полученные в настоящей работе данные позволяют рассматривать AA DA и DHA-DA как перспективные протекторные соединения и дают новые подтверждения вовлеченности каннабиноидно-ванилоидной системы в процессы жизнедеятельности нейрональной клетки.

III. ВЫВОДЫ 1. На синтетической библиотеке аналогов нейролипинов изучены их про- и антиапоптотические свойства в отношении клеток нервной системы и выявлены наиболее активные соединения – AA-DA и DHA-DA.

2. Выявлены наиболее активные аналоги арахидонолдофамина, оказывающие на клетки глиомы крысы С6 проапоптотическое действие, которое не снимается антагонистами каннабиноидных, ванилоидных и дофаминовых рецепторов.

3. AADA и DHADA вызывают апоптоз в клетках глиомы крысы С6 через активацию каспазного каскада.

4. AADA и DHADA не оказывают цитотоксического действия на нейроны и глиальные клетки крысы.

5. AADA и DHADA оказывают нейропротективное действие в моделях нейронального апоптоза и глутаматной токсичности только в присутствии глиальных клеток. Этот эффект снимается антагонистами каннабиноидного рецептора 2-го типа и ванилоидного рецептора, а также ингибиторами фосфоинозит-3-киназы и протеинкиназы C.

СПИСОК ПУБЛИКАКЦИЙ С ОСНОВНЫМИ РЕЗУЛЬТАТАМИ РАБОТЫ Статьи 1. Бобров М.Ю., Лыжин А.А., Андрианова Е.Л., Грецкая Н.М., Зинченко Г.Н., Фрумкина Л.Е., Хаспеков Л.Г., Безуглов В.В. Антиоксидантные и нейропротекторные свойства N-докозагексаеноилдофамина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — Т. 142 — №10 — С.

406–408.

2. Фрумкина Л.Е., Бобров М.Ю., Лыжин А.А., Андрианова Е.Л., Королев С.К., Боброва Н.А., Хаспеков Л.Г. Влияние фармакологической блокады каннабиноидных рецепторов 1-го типа на ультраструктуру синапсов в органотипической культуре ткани гиппокампа.// Неврологический вестник — 2007. — Т.4 — №4 — С. 60–63.

3. Frumkina L.E., Bobrov M.Yu., Lyzhin A.A., Andrianova E.L., Koroleva S.K, Bobrova N.A., Khaspekov L.G. Plastic reorganization of hippocampal synapses resulted from pharmacological blockade of type 1 cannabinoid receptors // Annals of clinical and experimental neurology. — 2007. — V.2 —P. 17–21.

4. Bobrov M.Yu., Lyzhin A.A., Andrianova E.L., Gretskaya N.M., Frumkina L.E., Khaspekov L.G., Bezuglov V.V. Antioxidant and neuroprotective properties of N arachidonoyldopamine // Neuroscience Letters. — 2008. —V. 431. — P. 6-11.

5. Андрианова Е.Л., Бобров М.Ю., Грецкая Н. М., Зинченко Г. Н., Серков И. В., Фомина-Агеева Е. В., Безуглов В. В. Действие нейролипинов и их синтетических аналогов на нормальные и трансформированные глиальные клетки // Нейрохимия. — 2010. — Т.27 — №1 — С. 1–10.

Тезисы 1. Andrianova E.L., Bobrov M.Yu., Gretskaya N.M., Fedenyuk A.V., Bezuglov V.V.

Antiproliferative and cytotoxic effects of endocannabinoid analogs on rat C6 glioma cells // 5th International EMBL PhD Students Symposium «Design of life», Hedelberg, 2-6 December 2004 — Symposium handbook — P.33.

2. Безуглов В.В., Бобров М.Ю., Андрианова Е.Л., Блаженова А.В., Грецкая Н.М.

Функциональная роль нейролипинов в процессах нейродегенерации // Симпозиум «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний» — Москва, 17–18 ноября 2005 — Тезисы докладов — С. 54.

3. Андрианова Е.Л., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Лыжин А.А., Хаспеков Л.Г., Мясоедов Н.Ф. Действие пептолипинов и их структурных компонентов на трансформированные и нормальные клетки нервной системы // III Российский симпозиум «Белки и пептиды» — 12-17 cентября 2007 — Тезисы стендовых сообщений — С. 87.

4. Андрианова Е.Л., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Грецкая Н.М., Лыжин А.А., Хаспеков Л.Г. Действие нейролипинов на нормальные и трансформированные клетки нервной системы. // Конференция «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга»;

Санкт Петербург-Колтуши;

10-12 сентября 2008 — С. 24.