Получение препарата грибной -галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности

На правах рукописи

СУХИХ Ольга Анатольевна

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ГРИБНОЙ -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЛАКТАЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Специальность 03.00.23. – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2007

2

Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ Научно-технического центра «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Бравова Галина Борисовна

Официальные оппоненты

Ведущая организация:

Защита состоится «_»2007 г. В ч мин на заседании диссертационного совета ДМ.212.204.13 в Российском химико технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Моск ва, Миусская пл., д.9.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Научно информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева Просим Вас принять участие в заседании диссертационного совета или прислать отзыв в 2-х экземплярах, заверенных печатью научного учреждения, по указанному выше адресу.

Автореферат диссертации разослан «»_ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук Шакир И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ферменты широко используются в различных отраслях промышленности, сельского хозяйства, научных исследованиях, медицине. В по следние годы в мире значительно возрос объем производства ферментов для меди цинских целей, причем около 50% из них получают из микробного сырья. Наиболее емким является рынок пищеварительных ферментов. Это связано с тем, что с ухуд шением экологической обстановки и повышением психо-эмоциональных нагрузок, число людей, страдающих нарушениями пищеварения из-за ферментной недоста точности, растет из года в год. Одна из серьезных патологий – непереносимость мо лока, встречающаяся у 15-30% населения России [Жвавый и др.;

1991, Козлов, 1992], обусловлена дефицитом в организме человека фермента лактазы (-галактозидазы), который вырабатывается в тонком кишечнике и катализирует расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу, которые затем легко всасываются в кровь. Из-за недостатка лактазы (гиполактазии) больные вынуждены исключать из рациона молоко и молочные продукты [Валенкевич, 1989], что особенно опасно для детей грудничкового возраста.

Коррекция лактазной недостаточности может быть осуществлена двумя пу тями: использованием молочных продуктов с частично гидролизованной лакто зой, либо приемом лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу.

В нашей стране производство низколактозных молочных продуктов и лекар ственных средств для восполнения дефицита лактазы отсутствует. Импортные препараты, закупаемые в ограниченном количестве, не удовлетворяют спрос в нужном объеме. В связи с этим создание конкурентоспособного отечественного универсального препарата -галактозидазы, который может быть использован как для предварительного гидролиза лактозы в молочных продуктах, так и для приема внутрь, является весьма актуальным и практически важным.

В НТЦ «Лекбиотех» на основе микроскопического гриба Penicillium canes cens F-178, активного продуцента -галактозидазы, разработана технология полу чения ферментного препарата Лактоканесцин Г20Х, предназначенного для гидро лиза лактозы в молочной сыворотке и разрешенного к использованию в пищевой промышленности. Однако при гидролизе лактозы молока препаратом Лактоканес цин было обнаружено изменение органолептических показателей обрабатываемо го продукта, что указывало на недостаточную степень очистки -га-лактозидазы от сопутствующих ферментов и на невозможность использования препарата для по лучения низколактозного молока и коррекции дефицита лактазы. Результаты про веденной работы явились основой для исследований по получению из препарата Лактоканесцин препарата -галактозидазы медицинского назначения.

Цель настоящего исследования состояла в разработке эффективной технологии получения высокоочищенного ферментного препарата грибной -галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности, а также в изучении физико-химических и ка талитических свойств фермента.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• исследовать ферментный комплекс препарата Лактоканесцин Г20Х;

• разработать рациональную схему выделения и очистки из комплексного ферментного препарата субстанции -галактозидазы с активностью не менее 10000 ед/г для коррекции энзимодефицита;

• разработать способ и получить высокоочищенную форму фермента -галактозидазы с целью использования его в качестве стандартного образца при определении активности (подлинности) лекарственного средства;

• изучить основные физико-химические и каталитические свойства фермента -галактозидазы в субстанции и в фермент-стандарте;

• исследовать процесс гидролиза лактозы в молоке и молочных продук тах, катализируемый препаратом -галактозидазы, и разработать оптимальные режимы их ферментативной обработки;

• разработать готовую лекарственную форму препарата -галактозидазы и срав нить его эффективность с действием зарубежного препарата «Лактраза» (США) на лактозу молочных продуктов, в условиях, имитирующих среду организма.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• впервые по оригинальной технологии получена лекарственная субстан ция (препарат Галактозим) и готовое лекарственное средство (капсулы Галак тозим) для коррекции лактазной недостаточности на основе -галактозидазы из Penicillium canescens;

• на основе хроматографического разделения ферментного комплекса получена высокоочищенная -галактозидаза для использования в качестве стандарта при опре делении лактазной активности (подлинности) лекарственного средства;

• проведено комплексное изучение физико-химических и каталитических свойств выделенного фермента;

• исследовано специфическое действие препарата Галактозим на лактозу молочных продуктов и определены оптимальные условия их ферментативной обработки с целью достижения требуемой степени гидролиза молочного сахара.

Научная новизна подтверждена получением положительного решения о выдаче патента на изобретение «Средство для коррекции дефицита лактазы»

(Заявка № 2006110265 от 31.03.2006 г.).

Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения из комплексного ферментного препарата Лактоканесцин лекарственной субстанции, содержащей грибную -галактозидазу. Разработанная технология апробирована в опытных условиях и обеспечивает выход фермента по активности не менее 75%.

Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул. По эффективно сти действия полученный препарат не уступает зарубежному аналогу Лактразе (США). Проведены доклинические исследования и показана целесообразность ис пользования препарата -галактозидазы для коррекции лактазной недостаточности.

Препарат может использоваться как для получения низколактозных молочных про дуктов, так и в качестве лекарственного средства для восполнения энзимодефицита.

Разработана нормативно-техническая документация, включающая технологиче ские регламенты и фармакопейные статьи предприятия (ФСП) на субстанцию, гото вое лекарственное средство и фермент-стандарт. Наработаны экспериментальные и опытные образцы препаратов. Решением Фармкомитета Министерства здравоохране ния и социальной политики РФ препарат рекомендован для клинических испытаний.

Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 15.802.1.1.0002 от 15 марта 2002 г. «Организация производства ферментных субстанций и импорто замещающих лекарственных средств для заместительной терапии, лечения дерма томикозов и коррекции энзимодефицита» и является вкладом в реализацию при оритетного национального проекта «Здоровье».

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований докла дывались на научно-технических конференциях, семинарах и конгрессах, в том чис ле на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы раз вития» (Москва, 2003 г.), на 8-м Международном семинаре – презентации иннова ционных научно-технических проектов «Биотехнология – 2005» (Наукоград Пущи но, 2005 г.);

на заседаниях Ученого совета НТЦ «Лекбиотех.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 печатные работы, в которых отражены основные положения диссертации, и получено положительное решение ФГУ ФИПС на заявку о выдаче патента на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введе ния, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 247 источников, и приложения. Материал изложен на 177 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 18 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы В обзоре литературы представлены основные сведения об источниках получения -галактозидаз, способах выделения и очистки фермента, свойствах -галактозидаз различного происхождения и механизме их действия. Рассмотрены области примене ния -галактозидаз. Особое внимание уделено использованию фермента в медицине для коррекции дефицита лактазы.

2. Экспериментальная часть 2.1 Материалы и методы исследований Исходным продуктом для получения лекарственной субстанции служил фер ментный препарат Лактоканесцин Г20Х из Penicillium canescens F-178 со стандартной активностью -галактозидазы 1000 ед/г (по о-НФГ), произведенный на ОАО «Вос ток» по технологии, разработанной в НТЦ «Лекбиотех».

Очистку -галактозидазы осуществляли методами ультра- и микрофильтрации с использованием отечественных ультрафильтрационных и микрофильтрационных мембран с различными размерами пор, с последующим осаждением фермента этило вым спиртом и лиофильным высушиванием. Для дальнейшей очистки -галактозидазы применяли методы ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и ДЭАЭ целлюлозе («Serva»), гель-фильтрацию на сефадексах G-100 и G-200 («Pharmacia»).

Степень чистоты фермента определяли с помощью диск-электрофореза в полиакрила мидном геле по методу Дэвиса на установке фирмы «Реанал».

Определение -галактозидазной активности проводили по гидролизу лактозы в соответствии с ТУ 11249895-13-10-92 и по гидролизу орто-нитрофенил--D галактопиранозида (о-НФГ) («Fluka») по методу [Kuby, Lardy, 1953]. Определение других гликозидазных активностей (-галактозидазы, -фукозидазы, -глю козидазы) проводили по методу [Kuby, Lardy, 1953] с использованием в качестве субстратов соответствующих гликопиранозидов («ICN»). Активность протеиназы определяли по гидролизу казеината натрия («Fluka») по ГОСТ 20264.2-74, эндо полигалактуроназы – по уменьшению вязкости свекловичного пектина по ГОСТ 20264.3-81. Активность -ксиланазы и -глюканазы определяли по количеству восстанавливающих сахаров (с ДНС-реактивом), образующихся при гидролизе ксилана овса или глюкана ячменя, соответственно, в стандартных условиях: тем пература 50 0С, рН 4,7, время гидролиза 1 ч, [Bailey et al., 1992]. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Молекулярную массу -галактозидазы определяли методом гель-фильтрации на хроматографе FPLC («Pharmacia») на колонке Superose 12 HR 10/30. Изоэлектрическую точку фермента определяли методом хроматофокусирования на колонке Mono P HR 5/20 в системе буферов 25 мМ трис-НСl буфер рН 7,1 – полибуфер 74 рН 5,0. Константу Михаэлиса (Кm) и максимальную скорость (Vmax) определяли по начальным скоростям гидролиза лактозы и о-НФГ по методу Корниш-Боудена или Хейнса-Вулфа [Корниш Боуден, 1979]. Для определения характера ингибирования и расчета константы ингиби рования использовали методы Лайнуивера-Берка и Диксона [Диксон, Уэб, 1961].

Специфическое действие препарата -галактозидазы исследовали на молоч ных продуктах (молоке, кефире, твороге, йогурте) в соответствии с «Методически ми рекомендациями по экспериментальному изучению новых ферментных препа ратов, предлагаемых для клинических испытаний» [1981]. Определение образую щихся в ходе расщепления лактозы продуктов реакции (глюкозы и галактозы) и расчет степени гидролиза лактозы осуществляли по методу [Kurz, Beutler, 1974].

Микробиологическую чистоту препарата определяли в соответствии с ГФ XI, вып.2, стр.187;

Изм. №3 от 19.06.2003 г.

Статистическую обработку результатов проводили по ГФ XI, вып.1, с.199.

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Характеристика ферментного комплекса препарата Лактоканесцин Г20Х Изучение ферментного комплекса исходного препарата показало, что помимо основного фермента -галактозидазы (1000 ед/г), в нем в значительном количестве присутствуют -галактозидаза (75 ед/г), -фукозидаза (90 ед/г), -ксиланаза (730 ед/г), -глюканаза (280 ед/г), эндополигалактуроназа (600 ед/г) и протеиназы кислые – 13 ед/г (рН 2,5);

19 ед/г (рН 5,5) и нейтральная – 7 ед/г (рН 7,2).

2.2.2 Выделение и очистка -галактозидазы из комплексного препарата К чистоте ферментов медицинского назначения предъявляют особые требова ния: они должны быть освобождены от большинства сопутствующих белков и об ладать определенной микробиологической чистотой. Для очистки -галактозидазы использовали методы ультра- и микрофильтрации. Водный раствор исходного пре парата, используемый для ультрафильтрации, имел следующие характеристики: ак тивность -галактозидазы – 67-68 ед/см3;

содержание белка – 13,0-14,0 мг/см3;

со держание сухих веществ – 6,9-7,1%;

величина рН – 5,8-6,2. Сравнительный анализ результатов ультрафильтрации ферментного раствора с использованием различных мембран показал, что оптимальное соотношение производительности, выхода фер мента по активности и степени очистки в процессе ультраконцентрирования обес печивает полиамидная мембрана марки УПМ-67 (табл. 1).

Таблица Характеристика процесса ультрафильтрации -галактозидазы на мембранах УПМ Исследу- Объем Общее Общее Марка Сред- Удель- Сте- Вы см емый кол-во мембра- няя коли- ная ак- пень ход по раствор -гал.

ны произ- чество тив- очи- актив актив води- белка, ность, стки ности, ности, тель- мг ед/мг % ед.

ность, белка дм3/м2ч Исходный 500 6800 34000 5 раствор Концентрат УПМ-20 15,8 50 4860 33048 6,8 1,36 97, Фильтрат 450 1830 Концентрат УПМ-50 32,4 50 1469 32402 22,7 4,54 95, Фильтрат 450 5281 Концентрат УПМ-67 34,5 50 1226 31314 25,6 5,1 92, Фильтрат 450 5516 Концентрат УПМ-100 44,0 50 1205 25126 21,5 4,3 73, Фильтрат 450 5574 Изучение влияния рН и степени концентрирования ферментного раствора на процесс ультрафильтрации показало, что максимальная производительность (34,5 дм3/м2ч) наблюдается в зоне рН 5,5–6,5 (естественный рН раствора), а выход фермента в концентрате при изменении рН меняется незначительно. Ферментный раствор -галактозидазы может быть сконцентрирован в 10-15 раз на мембране УПМ-67 с выходом по активности 91–93 % и степенью очистки 5,1.

С целью очистки концентрата от контаминирующей микрофлоры был применен способ микрофильтрации с использованием мембран МФЦ с различным размером пор (0,6;

0,4 и 0,22 мкм). Стерилизующая фильтрация через мембрану с размером пор мкм позволила получить готовый продукт, соответствующий по 0, микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

В результате проведенных операций активность -галактозидазы на этом этапе очистки (в лиофильно высушенном концентрате) повысилась более чем в 10 раз при значительном снижении количества сопутствующих ферментов:

глюканазы, ксиланазы и фукозидазы – на 65–75%, эндополигалактуроназы и протеиназы – на 60%, -галактозиадзы – на 35%.

Следует отметить, что наличие протеиназы в препаратах, предназначенных для об работки молока, нежелательно, т.к. она вызывает протеолиз молочных белков, изменяя органолептические показатели обрабатываемых продуктов. Для очистки препарата от протеиназы были использованы методы, основанные на различных принципах разделе ния белковых смесей: гельфильтрация на сефадексе G-100 и осаждение органическими растворителями (этиловым спиртом). Наилучшие результаты были достигнуты при ис пользовании способа осаждения -галактозидазы из концентрата этанолом при содер жании спирта в смеси 57,6 % (1,5 об/об), рН 6,5 и температуре 0-4 0С, что позволило до полнительно отделить 85% протеиназы и обеспечить выход -галактозидазы более 83%. Осадок после отделения спирта высушивали лиофильно. Молочные продукты, обработанные лиофилизированным препаратом, не имели горького привкуса или ка ких-либо других нежелательных органолептических показателей, что указывало на дос таточную степень очистки фермента от сопутствующих белков.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана техно логическая схема выделения и очистки -галактозидазы, позволяющая получить базо вый препарат с активностью 12850 ед/г (по о-НФГ), содержанием белка 48%, удельной активностью 26,7 ед/мг белка (степень очистки 5,34), выходом по активности 75% (табл.2) и лекарственную субстанцию (препарат Галактозим) со стандартной активно стью 10000±500 ед/г для коррекции лактазной недостаточности (рис.1).

Исследованы условия хранения препарата и показано, что Галактозим сохраняет активность и другие характеристики, заложенные в ФСП, более 4 лет при его хранении в защищенном от света месте при 4 0С и 20 0С.

2.2.3 Разработка способа получения высокоочищенной -галактозидазы (фер мент-стандарта) При разработке нового ферментного препарата медицинского назначения по мимо лекарственной субстанции требуется создание стандартного образца фермента та (фермент-стандарта), представляющего собой высокоочищенную, по возмож Рис. 1 Технологическая блок-схема получения целевых продуктов из препарата Лактоканесцин Приготовление 7% раствора Лактоканесцина и центрифугирование 10000 об./мин., 20-25 мин, Т=0-4 0С Фугат Ультрафильтрация УМП-67, n= 10-15 раз, Т = (19±1) 0С, р = 0,3-0,4 МПа Концентрат Микрофильтрация размер пор – 0,22 мкм, Т=(19±1) 0С, р = 0,1-0,2 МПа Микрофильтрат Осаждение этиловым спиртом 1,5 об/об., рН 6,5, Т= 0-4 0С;

время – 20 мин Осадок Лиофильное высушивание Базовый препарат Растворение и центрифугирова- Стандартизация мальтодекст ние 10000 об./мин., 20-25 мин, рином: активность 10000 ед/г Т= 0-4 0С фугат Лекарственная субстанция Диализ против 0,015 М цитратно (препарат Галактозим) фосфатного буфера, рН 5, Смешивание с крахмалом раство диализованный р-р римым и стеаратом кальция Хроматография на КМ-целлюлозе элюат Расфасовка в капсулы по 0,3 г Обессоливание и концентрирова ние (УПМ-20) ) Готовое лекарственное средство (капсулы Галактозим) Лиофильное высушивание Высокоочищенный препарат -галактозидазы (фермент стандарт) Таблица Характеристика стадий получения базового препарата Стадии Объем, Содержание Активность Удельная Выход, % процесса масса, белка -галактозидазы актив см3, г мг/г суммар- ность сум- ед/г на от 3 ед/мг мг/см марное, ед/см ная, ед. ста- исх.

белка мг дии Растворение 140 г 200,0 28000 1000 140000 5,0 100 препарата Лак- в 2000 мг/г ед/г см токанесцин Центрифугиро- 1950 10,7 20865 70,0 136500 6,5 97,5 97, вание раствора Лактоканесци на Ультрафильт рация 140 35,0 4904,0 898,1 125734 25,6 92,1 89, Микрофильт- 135,2 34,5 4669,6 898,0 121410 26,0 96,6 86, рация Осаждение 8,2 г 481,3 3946,7 12850 105370 26,7 86,7 75, спиртом и суш ка ности, гомогенную, форму для контроля активности фермента в лекарственном средстве. Высокоочищенная форма фермента нужна также для более полного изучения свойств белковой молекулы.

Задача состояла в разработке способов очистки -галактозидазы с минимальным количеством стадий и максимальным выходом фермента. На первой стадии исполь зовали метод ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе при оптимизирован ных условиях проведения процесса: сорбция в 0,015 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,2;

элюция -галактозидазы 0,4 М NaСl в 0,015 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,2. В этих условиях сорбция фермента достигала 95%, элюция 85-87%. Предло женный режим позволил отделить инертные белки и большую часть ксиланазы, глю каназы и эндополигалактуроназы, которые не сорбировались на КМ-целлюлозе и вы шли в пике несорбированных белков, что было подтверждено определением специфи ческих ферментативных активностей (рис.2, пик I). При элюции в градиенте NaCl (0– 1 М) был получен один белковый пик (пик II), вышедший при концентрации соли 0, М, в котором обнаруживались активности - и -галактозидаз.

NaCl, M -гал -гал 280 нм 1, 405 нм 420 нм 1, 0, Рис.2 Хроматография -галактозидазы 1, 1, на колонке с КМ-целлюлозой, 1 – бе 0, II 1,2 1, лок, D280;

2 – активность -галакто 4 0, зидазы, D420;

3 – активность -галакто 1,0 0, 0, зидазы, D405;

4 – градиент NaCl (0-1 М) 0,8 0, 0, 0,1 0,6 0, 0, 0, 0, I 0, 0, 0, 0, 0,2 0, 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 мл Для разделения - и -га лактозидаз использовали гель-фильтрацию на сефадексах G-100 и G-200, хрома тографию на ДЭАЭ-целлюлозе в различных вариациях и последовательностях, что однако не привело к значительному повышению удельной активности галактозидазы и не позволило разделить комплекс - и -галактозидаз. Это ука зывало, с одной стороны, на достаточно высокую степень очистки галактозидазы, с другой – на схожесть физико-химических свойств этих фермен тов. Кроме того, с каждой следующей стадией очистки увеличивались механиче ские потери -галактозидазы, так как обработке подвергались только наиболее активные фракции фермента. В связи с этим включение стадий гель-фильтрации на сефадексах и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в схему очистки было при знано нецелесообразным.

Элюат после хроматографии на КМ-целлюлозе был обессолен и сконцентри рован методом диа- и ультрафильтрации на мембране УПМ-20 и лиофильно высу шен. Высушенный препарат содержал 85% белка с активностью 44200 ед/г.

Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана схема получения высокоочищенной -галактозидазы (фермент-стандарта) (рис. 1), включающая ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе, обессоливание и концентрирование элюата методом ультрафильтрации на мембране УПМ-20 с по следующим лиофильным высушиванием, позволяющая получить фермент с удель ной актиностью 52 ед/мг и выходом 71% (табл. 4).

Таблица Характеристика стадий получения фермент-стандарта Стадии Объем, Содержание Активность Удельная Сте- Вы процесса масса, белка -галактозидазы актив- пень ход, см, г мг/см сум- ед/см, суммар- ность, очи- % 3 ед/мг стки мг/г марное, ед/г ная, ед.

белка мг Растворение ба- 1,5 г 481,3 722 12850 19275 26,7 1 зового препарата в 15 см Диализ против 0,015 М фосфат но-цитратного буфера 17 40,0 680,7 1077,1 18311 26,9 1 ИОХ на КМ целлюлозе 65 4,7 305,8 243,7 15839 51,8 1,9 Диа- и ультра фильтрация 6,0 47,7 286,5 2506,7 15035 52,5 1,97 Лиофильное вы- 0,309 850 263,5 44200 13685 52,0 1,95 сушивание Процесс очистки контролировали методом диск-электрофореза в полиакрила мидном геле (рис.3), показавшем эффективность используемых методов очистки.

Рис. 3 Электрофоретический спектр белков в препаратах:

1 – Лактоканесцин;

2 – субстанция Галактозим;

3 – фермент-стандарт 1 2 2.2.4 Изучение свойств -галактозидазы Изучение каталитических свойств -галактозидазы показало, что фермент, вне зависимости от степени очистки, максимально активен при температуре 50-55 0С и рН 3,8-4,5 (по о-НФГ и по лактозе). -Галактозидаза стабильна в интервале рН от 3,5 до 6,5: после инкубации в течение 4 ч и температуре 37 0С, близкой к темпера туре тела млекопитающих, она сохраняла 95% от исходной активности. При рН 2, и рН 7,0 фермент сохранял 57% и 90% от исходной активности, соответственно.

Исследования температурной стабильности -галактозидазы при рН 4,2 показа ли, что в течение 4 ч фермент полностью сохраняет свою активность в интервале температур от 4 0С до 25 0С. При 30 0С и 40 0С фермент сохранял 96% и 94% от ис ходной активности, соответственно, при 50 0С – 65%, а при 60 0С – 50% активности.

На активность фермента не влияли ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Ba2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, Pb2+, Co2+, Cd2+), а в присутствии ионов Fe3+ активность -галактозидазы снижалась на 60% за 1 ч инкубации при 20 0С, через 24 ч наблюдалась полная потеря активности. Было установлено, что причиной инактивации является не действие ионов железа, а резкое падение рН среды с 6,2 до 2,5 при добавлении к ферментному раствору соли металла. ЭДТА и n-ХМБ в исследуемых концентрациях (10-3 и 510-3 М) не оказывали ингиби рующего действия на -галактозидазу.

Таким образом, можно заключить, что -галактозидаза из Penicillium canes cens не относится к металлозависимым ферментам и не содержит функциональ но значимых SH-групп, что согласуется с литературными данными, приведен ными для других грибных -галактозидаз [Летунова и др., 1981;

Watanabe et al., 1983;

Gonzales et al., 1991].

Изоэлектрическая точка -галактозидазы, определенная методом хроматофоку сирования, равнялась 6,7. Молекулярная масса фермента была определена методом гель-фильтрации на хроматографе FPLC с использованием тестовых белков и соста вила около 130 кD. Константа Михаэлиса, определенная разными методами по гидро лизу лактозы и о-НФГ, не зависела от степени очистки фермента и равнялись 16 Мм (Vmax=40 мкмоль/мин мг) и 0,5 Мм (Vmax=48 мкмоль/мин мг), соответственно, что по казало более высокое сродство -галактозидазы к синтетическому субстрату. При изу чении процесса ингибирования -галактозидазы продуктами гидролиза лактозы уста новлено, что глюкоза не оказывает ингибирующего действия на фермент, в то время как галактоза ингибирует фермент по смешанному типу (рис. 4), приводя к изменению как КМ, так и Vmax, с константой ингибирования Кi = 20 мМ (рис. 5).

1|V 7 1/V 6 I -0,1 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0, - 0 Концентрация галактозы, М - -100 -50 0 -1/Km 1|S Рис. 4 Ингибирование -галактозидазы галак- Рис. 5 Константа ингибирования -галактозидазы тозой (метод Лайнуивера-Берка): 1- без инги- галактозой (метод Диксона): 1 – 0,14 М раствор битора;

2- в присутствии ингибитора (галакто- лактозы;

2 – 0,07 М раствор лактозы;

3 – 0,035 М зы) в концентрации 0,05 М раствор лактозы Таким образом, изучены основные физико-химические и каталитические свойства -галактозидазы, важные для ее практического применения (табл.5).

Таблица Свойства -галактозидазы из Penicillium canescens F- Показатель Характеристика рН-оптимум 3,8-4, Т-оптимум, С 50- рН-стабильность 3,5-6, Термостабильность, С не выше Молекулярная масса, kD ИЭТ 6, КМ, мМ 16 (по лактозе) 0,5 (по о-НФГ) Vmax, мкмоль/мин мг 40 (по лактозе) 48 (по о-НФГ) Константа ингибирования галактозой, мМ 2.2.5 Исследование процесса ферментолиза лактозы в молочных продуктах Исследовано специфическое действие -галактозидазы (препарата Галактозим) на лактозу молока и кисломолочных продуктов с целью выбора оптимальных режи мов их ферментолиза. В экспериментах учитывали тот факт, что у большинства лю дей, страдающих гиполактазией, при употреблении молочных продуктов со степе нью гидролиза лактозы не менее 50% симптомы непереносимости лактозы не возни кают [Brand, Holt, 1991].

Динамика гидролиза лактозы при температуре 20 0С в молоке и кисломолочных продуктах различными концентрациями фермента показала (рис.6), что более 50% лак тозы в молоке расщепляется при концентрации -галактозидазы 0,2% (2000 ед) за 6 ч или за 4,5 ч при концентрации фермента – 0,4%. В кисломолочных продуктах гидролиз происходит значительно быстрее, т.к. рН 4,3-4,5 соответствует оптимуму действия фермента. Степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигала 50-60% за 1,5-3 ч в зависимости от концентрации фермента (рис.7). Лактоза в твороге гидролизовалась бо лее чем на 90% за 1 ч даже минимальными концентрациями фермента (0,1%).

Степень гидролиза лактозы, % Степень гидролиза лактозы,% 80 1000 ед 4000 ед 4000 ед 50 2000 ед 60 1000 ед 2000 ед 40 1000 ед 10 0 2 4 0 2 4 Время,ч Время, ч Рис. 6 Динамика гидролиза лактозы в Рис. 7 Динамика гидролиза лактозы в ки молоке в зависимости от концент- сломолочных продуктах в зависимости от рации фермента (20 0С) концентрации фермента (20 0С):

в йогурте в кефире в твороге Время обработки молочных продуктов при 20 0С должно быть ограничено из-за возможного микробного заражения и закисления продукта. С учетом этого, оптималь ной концентрацией фермента, обеспечивающей степень гидролиза молочного сахара более 50%, была принята доза 2000 ед на 100 г кисломолочных продуктов и 4000 ед на 100 г цельного молока. В связи с однотипностью динамики гидролиза лактозы в ке фире и йогурте в дальнейших исследованиях использовали только кефир.

Изучен процесс гидролиза лактозы в молочных продуктах выбранными до зами фермента при различных температурах (рис. 8) и показано, что 50% лакто зы может быть прогидролизовано при температуре 4 0С за 10-12 ч, либо при 37 0С – за 1-3 ч, в зависимости от вида продукта.

1 Степень гидролиза лактозы, % 100 Б Степень гидролиза лактозы, % А 90 70 70 2 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 Вре мя, ч Вре мя, ч Рис.8 Динамика гидролиза лактозы молока (А, доза фермента 4000 ед) и кефира (Б, доза фермента 2000 ед) при различных температурах:1 – 4 0С, 2 –20 0С, 3 – 37 0С Таким образом, к числу факторов, влияющих на процесс гидролиза лактозы в молочных продуктах, относятся активная кислотность среды, температурный режим, концентрация -галактозидазы и длительность процесса. Рекомендованы следующие режимы обработки молочных продуктов препаратом Галактозим, обеспечивающие степень гидролиза лактозы не менее 50%:

Обрабатываемый продукт Доза фермента (на 100 г Температура, Время гидролиза, продукта) С ч не менее Молоко 4000 ед 20 4- 37 4 10- Кисломолочные продукты 2000 ед 20 2- 37 2.2.6 Разработка готовой лекарственной формы препарата Галактозим и изучение эффективности препарата По результатам проведенных исследований разработана готовая лекарственная форма препарата Галактозим в виде капсул, содержащих 0,2 г (2000 ед) -галактози дазы и 0,1 г вспомогательных веществ (крахмала растворимого 0,095 г и кальция стеа рата 0,05 г), выступающих в роли смазывающих и скользящих средств (рис.1). Изучены некоторые фармакологические свойства лекарственной формы. Установлено, что ис пользуемые твердые желатиновые капсулы при температуре 37 0С распадаются за 4- мин в исследуемых растворах: 0,1 М НСl (рН 2,0);

0,2 М ацетатном буфере (рН 4,2), дистиллированной воде (рН 5,5), из чего можно заключить, что препарат при приеме per os начнет действовать уже с первых минут. Изучена растворимость капсул Галактозима с использованием прибора «Вращающаяся корзина»: среда растворения – 0,2М ацетат ный буфер рН 4,2, объем раствора 500 мл, температура 37 0С, скорость вращения 100 об/мин. Установлено, что за 45 мин в среду растворения переходит 100% содержа щейся в капсуле -галактозидазы, что удовлетворяет требованиям [ГФ ХI, вып.2, стр.145], по которым при указанных условиях в среду растворения за 45 мин должно перейти не менее 75% активного вещества от содержания его в лекарственной форме.

Для изучения эффективности разработанного препарата Галактозим при приеме внутрь в экспериментах были имитированы условия внутренней среды организма:

температура 37 0С, присутствие 10 % (об.) желудочного сока. Время обработки огра ничили двумя часами, т.к., известно [Козловский, 2001], что первые клинические симптомы лактазной недостаточности возникают через 1,5-2 ч после употребления молочных продуктов. Эффективность действия Галактозима сравнивали с действием импортного препарата «Лактраза» (США), предназначенного для перорального при менения одновременно с приемом молочной пищи, в тех же дозах.

Было установлено, что в условиях, приближенных к условиям организма, в зависимости от дозы вносимых препаратов лактоза молока гидролизуется одина ково эффективно обоими препаратами: на 55% (2000 ед) или 65% (4000 ед) за 2 ч.

За это же время степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигает соответ ственно 87 и 91%, а в твороге уже в течение 1 ч лактоза гидролизуется полностью.

Сравнительный анализ действия препаратов Галактозим и Лактраза показал, что Галактозим по своим гидролитическим свойствам в условиях, имитирующих сре ду организма, не уступает импортному препарату.

Таким образом, препарат Галактозим обладает высокой эффективностью действия на лактозу молока и кисломолочных продуктов и может быть использован для коррекции дефицита лактазы как для обработки молочных продуктов перед употреблением, так и для приема внутрь одновременно с приемом молочной пищи.

Токсикологические исследования Галактозима, проведенные совместно с ООО «ТОКСОФАРМ», показали, что препарат относится к веществам с малой токсичностью, не обладает аллергизирующими, анафилактогенными и иммуно токсическими свойствами, не оказывает тератогенного и эмбриотоксического действия и может быть использован в медицинских целях.

ВЫВОДЫ 1. Исследован ферментативный комплекс исходного препарата Лактока несцин и разработана технология выделения и очистки из него -галактозидазы с использованием методов ультрафильтрации, микрофильтрации и спиртоосаждения, позволившая повысить удельную активность фермента более чем в 5 раз. Выход фермента составляет 75%.

2. Впервые по разработанной технологии получена лекарственная субстанция на основе -галактозидазы из Penicillium canescens (препарат Галактозим) со стан дартной активностью 10000 ед/г для коррекции лактазной недостаточности.

3. Для определения активности (подлинности) лекарственного средства получен высокоочищенный препарат -галактозидазы (фермент-стандарт) с содержанием белка 85% и активностью 442000 ед/г по схеме, включающей ионообменную хрома тографию на КМ-целлюлозе, диа- и ультрафильтрацию и лиофильное высушивание.

4. Изучены физико-химические и каталитические свойства высокоочищенной -галактозидазы: молекулярная масса фермента около 130 кD;

изоэлектрическая точка – 6,7;

оптимумы действия – температура 50-55 0С, рН 3,8-4,5;

зона стабильно сти в пределах рН 3,5-6,5;

константа Михаэлиса и максимальная скорость гидролиза природного и синтетического субстратов – 16,0 мМ и 40 мкмоль/мин мг;

0,5 мМ и 48 мкмоль/мин мг, соответственно. Установлен смешанный характер ингибирова ния фермента галактозой с Кi = 20 мМ. Показано, что -галактозидаза не относится к металлозависимым ферментам и не содержит функционально значимых SH-групп.

5. Изучена динамика гидролиза лактозы в молоке и кисломолочных продуктах препаратом Галактозим. Разработаны оптимальные режимы предварительной обра ботки молочных продуктов для получения необходимой степени гидролиза лактозы.

6. Разработана готовая лекарственная форма препарата в виде капсул (капсу лы Галактозим) и установлено, что препарат по эффективности действия не усту пает импортному препарату Лактраза и может быть использован в качестве кор ректора энзимодефицита как для приема внутрь одновременно с приемом молоч ных продуктов, так и для их предварительной обработки перед употреблением.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Мотина Л.И., Сухих О.А., Югова Л.В., Шишкова Э.А. Галактозим – но 1.

вый эффективный препарат для коррекции лактазной недостаточности// Мате риалы II Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». – Ч. 2. – Москва, 2003. – С. 236.

Югова Л.В., Мотина Л.И., Сухих О.А., Шишкова Э.А. Грибная -галак 2.

тозидаза для переработки молочной сыворотки: получение и применение// В кн.

«Микробные катализаторы и перспективы развития ферментных технологий в пе рерабатывающих отраслях АПК» – М. Пищепромиздат, 2004. – С. 67-70.

Мотина Л.И., Сухих О.А., Нестеренко Е.А., Полетаева О.А., Шишкова 3.

Э.А., Югова Л.В. Гастропек и Галактозим – новые лекарственные ферментные препараты для профилактики и лечения энзимодефицита// Материалы научно практической конференции. 8-й Международный семинар – презентация инно вационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2005» – Наукоград Пущино, 2005. – С.37-39.

Заявка № 2006110265 от 31.03.2006 о выдаче патента на изобретение 4.

«Средство для коррекции дефицита лактазы» (Положительное решение от 03.04.2007)/ Мотина Л.И., Сухих О.А, Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Югова Л.В.

Сухих О.А., Мотина Л.И., Югова Л.В., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б. По 5.

лучение препарата Галактозим для коррекции дефицита лактазы // Биотехноло гия. – 2007, № 3. – С.46-51.