Генетическое разнообразие и анализ количественных признаков грибов рода pleurotus

имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах рукописи

Сиволапова Анастасия Борисовна

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И АНАЛИЗ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ

ПРИЗНАКОВ ГРИБОВ РОДА PLEUROTUS

Специальность 03.02.12 – микология,

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва, 2013

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, а также в лаборатории микологии университета г. Вагенинген, Нидерланды доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Шнырева Алла Викторовна доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Наумова Елена Сергеевна доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична Ботанический институт

Ведущая организация:

им. В. Л. Комарова РАН

Защита диссертации состоится 17 мая 2013 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, тел./факс: 8(495)939-39-

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан апреля 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета М. А. Гусаковская кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Грибы съедобного культивируемого рода Pleurotus, относящиеся к отделу Basidiomycota, давно привлекли к себе интерес со стороны производителей, благодаря своим прекрасным вкусовым качествам, относительной простоте культивирования, а также благодаря богатому набору биологически активных веществ, перспективных для использования в фармакологии.

В настоящее время, в связи с развитием биотехнологических подходов к культивированию грибов, стало возможным создание современной индустриальной отрасли, занимающейся производством лекарственных препаратов на основе базидиомицетов (Краснопольская, 1998).

Кроме того, в последнее время все чаще предлагается использовать грибы рода Pleurotus в процессах биологической переработки отходов сельского хозяйства, а также бумажного и текстильного производств в силу того, что эти грибы обладают комплексом лигнинолитических ферментов. Самым распространенным культивируемым видом является вешенка устричная (обыкновенная) – P. ostreatus, однако в настоящее время производители все чаще стараются ввести в культуру более экзотичные виды вешенок, такие как P. djamor или P. sajor-caju. Эти виды привлекли внимание благодаря своей способности к плодоношению в условиях повышенных температур.

Несмотря на повышенный интерес к грибам рода Pleurotus, в России работа по маркированию, улучшению и введению новых штаммов в культуру практически не ведется. Для успешного промышленного культивирования грибов необходимо также иметь штаммы с хорошей и стабильной урожайностью, поэтому анализ количественных признаков ответственных за (QTL, quantitative trait loci), продуктивность и качество плодовых тел является важной как практической, так и теоретической задачей.

Цель работы - изучение генетического разнообразия различных видов и штаммов рода Pleurotus, оценка их урожайности и сравнительная характеристика скорости вегетативного мицелиального роста, а также поиск генетических маркеров хозяйственно полезных признаков для вида P. ostreatus.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. оценить урожайность культивируемых штаммов P. sajor-caju, P. djamor и P.

и подобрать наиболее перспективные субстраты и условия для ostreatus плодоношения этих видов;

2. провести генотипирование 17 штаммов, относящихся к 6 видам вешенки P. ostreatus, P. pulmonarius, P. djamor, P. sajor-caju, P. eryngii и P. calyptratus;

3. подтвердить таксономический статус P. sajor-caju;

4. построить подробную генетическую карту P. ostreatus на основе SNP маркеров для анализа локусов количественных признаков;

5. провести маркирование и анализ локусов количественных признаков P.

ostreatus, таких как урожайность, скорость мицелиального роста, цвет шляпки плодового тела;

6. определить типы спаривания штаммов экспериментальной гибридной ВКК популяции P. ostreatus и установить положение локусов типов спаривания P. ostreatus на генетической карте.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе настоящей работы была проведена оценка генетического разнообразия культивируемых видов и штаммов рода вешенка, а также разрешен вопрос о таксономическом статусе вида P.

sajor-caju (Fr.) Singer, прежде вызывавший множество споров среди микологов.

Впервые была получена подробная генетическая карта P. ostreatus с плотностью молекулярных маркеров, достаточной для эффективного поиска локусов количественных признаков данного гриба. Впервые были выявлены и проанализированы локусы количественных признаков, ответственных за скорость вегетативного роста дикариотического мицелия вешенки обыкновенной, а также найдены генетические области, контролирующие цвет шляпки плодовых тел P.

ostreatus, и области, оказывающие влияние на продуктивность штаммов.

Результаты данного исследования имеют практическую значимость, прежде всего, для селекционеров, которые занимаются выведением новых коммерческих сортов видов рода вешенка.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В.

Горленко, «Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества»

(Москва, 2008);

2-ом Съезде микологов России (Москва, 2008);

на Международном конгрессе «XVI Congress of European Mycologists» (Халкидики, Греция, 2011), на XII Международной молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 – статьи в журналах из списка рекомендованных ВАК, 6 – материалы конференций.

Структура и объем диссертации. Текст диссертации изложен на страницах, состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Список литературы включает 94 источника, из них 84 на английском языке. Приложение содержит 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлена информация о морфологии, распространению, систематике изучаемых в работе видов рода Pleurotus. Рассмотрены перспективы использования грибов рода вешенка в фармакологии и в переработке производственных отходов биологического происхождения. Представлен краткий обзор методов изучения генетического разнообразия видов, а также методов поиска маркеров количественных признаков.

Объекты и методы исследования При выполнении работы по изучению генетического разнообразия рода вешенка были исследованы 6 видов, включающие 17 штаммов рода Pleurotus из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ. Для исследования количественных признаков были использованы дополнительно 6 коммерческих монокариотических штаммов вешенки, полученных из коллекции Университета Вагенингена, а также монокариотических штамма P. ostreatus, полученные в ходе работы. Список штаммов приведен в таблице 1.

Культивирование грибов проводили на сусло-агаре и среде Эгер при температуре 25о С.

Таблица 1. Виды и штаммы рода Pleurotus, использованные в работе Вид Штамм Характертистика и происхождение Выделен из производственного штамма, Россия Z Н Выделен из производственного штамма, Россия P. djamor Коммерческий штамм, фирма Sylvan KOP Культивируемый сорт, Northwest Mycological P. sajor-caju CS- Consultans, USA Природный изолят, Моск. обл.

06- Монокариотический штамм P. pulmonarius A8m Производственный штамм 27. Природный изолят, Моск. обл.

BP Сорт Мичиган P Производственный штамм Don Природный изолят, Моск. обл.

38- Р9 Сорт Флорида Сорт Мичиган P Природный изолят, Моск. обл.

P. ostreatus 38d Монокариотический штамм 55m P001-15* Протоклон коллекционного штамма ATCC Протоклон коллекционного штамма ATCC EP-25* Коммерческий монокариотический штамм EP-57* Коммерческий монокариотический штамм G24* Коммерческий монокариотический штамм P24* Дикариотический штамм P P. eryngii Дикариотический штамм 3- С2 Природный изолят, Моск. обл.

P. calyptratus * - данные штаммы были получены из коллекции Университета Вагенингена (Нидерланды). Остальные штаммы были получены из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического факльтета МГУ им. М. В. Ломоносова.

В качестве субстратов для получения плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju использовали лузгу, отходы хлопкового производства, измельченную древесину фикуса (Ficus triangulis) и бамбука (Bambusa sp.). Для оценки урожайности при получении плодовых тел P. djamor и P. sajor-caju использовали полипропиленовые пакеты с лузгой весом 120 г. Для каждого штамма (P. djamor H, Z1, КОР и P. sajor caju CS-32) опыт проводили в четырех повторностях. Отмечали время появления примордиев, зрелых плодовых тел и их количество на 1 мешок.

Определение факторов половой совместимости и получение гаплоидных штаммов-тестеров проводили по стандартной методике (Eger, 1978).

Для оценки генетического разнообразия видов и штаммов рода Pleurotus использовали стандартные подходы, основанные на изучении спейсерного участка кластера рибосомальных генов ITS1-5,8S-ITS2. В работе были использованы следующие комбинации праймеров: ITS1-ITS4;

ITS1F-ITS4B;

LR20R-5sRNA, ITS4B NS5. Положение праймеров в кластере рибосомальных генов указано на рис.1.

Рис.1 Cхема расположения геноспецифичных праймеров Для 12 штаммов, относящихся к 5 видам рода Pleurotus (P. djamor, P. sajor caju, P. eryngii, P. ostreatus, P. pulmonarius), были секвенированы нуклеотидные последовательности рибосомальной ДНК (рДНК), содержащие участки ITS- и IGS областей. Для обработки полученных данных и построения дендрограмм были использованы программы BioEdit (Hall, 1999) и Mega 5.10 (Tamura et al., 2011).

Анализ количественных признаков и построение генетической карты Pleurotus ostreatus Схема анализа локусов количественных признаков P. ostreatus представлена на рис.2.

Определение цвета шляпки проводили для 123 дикариотических штаммов, полученных путем скрещивания гаплоидных изолятов BKK-популяции и гаплоидного штамма ЕР25. Цвет шляпок культивируемых грибов определяли с помощью хромометра Minolta Chromameter (CM500) по трем параметрам (индексам):

L – соотношение черного и белого цветов (варьирование от 0 – черный до 100 – белый), a – соотношение красного и зеленого цветов, b – соотношение синего и желтого цветов (рис.3).

Рис. 2. Общая схема опытов, проведенных для анализа количественных признаков P. ostreatus.

Рис. 3. Параметры (индексы), по которым оценивалися цвет шляпок плодовых тел P. ostreatus.

Оценку урожайности проводили для 150 штаммов, полученных путем скрещивания гаплоидных изолятов BKK-популяции и гаплоидного штамма ЕР25.

Полученные от первой волны плодоношения базидиомы взвешивали, а также регистрировали момент появления плодовых тел.

Измерение скорости роста дикарионов на субстрате проводили для произвольно выбранных штаммов ВКК-популяции, каждый из которых был скрещен поочередно с тремя коммерческими тестерными штаммами ЕР25, Р24 и G24. Таким образом, в эксперименте участвовали 210 дикариотических культур P. ostreatus.

В качестве субстрата в опыте по изучению скорости зарастания мицелием субстрата использовали измельченную ферментированную и стерилизованную солому пшеницы (влажность 70%);

стерилизацию проводили в два этапа по минут при 1 атм. Подготовленный субстрат помещали в стеклянные пробирки высотой 16 см и диаметром основания 16 мм. Зерновой инокулюм помещали поверх субстрата и закрывали пробирку бумажной пробкой. Каждый опыт был поставлен в трех повторностях. Кроме того, на каждую пробирку были нанесены по 4 измерительные линии, на которых каждые 2 дня отмечалась граница роста Рис. 4. Пробирки с заросшим мицелия. Для каждого из 210 полученных в мицелием субстратом.

скрещиваниях дикарионов опыт был поставлен в 12 ти повторностях (рис. 4).

Генетическую карту для составляли на основе данных P. ostreatus полногеномного секвенирования штаммов ЕР57 и Р001-15, благодаря чему были найдены около 1500 SNP-маркеров (single nucleotide polymorphism) в пределах геномов этих двух штаммов (данные были получены при сотрудничестве с Объединенным Институтом Генома, Joint Genome Institute, США). Полученные монокариотических штамма экспериментальной ВКК-популяции были генотипированы по обнаруженным SNP-маркерам по технологии Golden Gate, Illumina (ServiceXS, Лейден, Нидерланды). Из 1500 SNP-маркеров были выбраны и проанализированы 347, на основании которых была построена генетическая карта для P. ostreatus (JoinMap4.0, Kyazma;

Van Ooijen, 2006).

При анализе количественных признаков применяли тестирование распределений каждого количественного признака (скорость мицелиального роста, урожайность, цвет шляпок плодовых тел) на основе критерия нормальности Колмогорова Смирнова, после чего оценивали степень влияния генотипа на проявление признаков с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

Расчеты производили при помощи пакета программ SPSS Statistics (SPSS Inc.

Released 2009. PASW Statistics for Windows, Version 18.0. Chicago: SPSS Inc.).

Для картирования количественных признаков использовали два типа анализа:

интервальное картирование и непараметрический тест Крускал-Уоллиса (MapQTL 6.0;

Van Ooijen, 2004).

Результаты и обсуждение Получение плодовых тел и оценка урожайности P. djamor, P eryngii и P. sajor-caju При подборе субстратов для эффективного плодоношения грибов все четыре апробированных субстрата - лузга, хлопковый очес, древесина фикуса и бамбука – показали хорошую перспективу для дальнейшего использования. На всех субстратах был отмечен хороший мицелиальный рост, а также на 15-18-е сутки после начала вентиляции получены примордии для исследуемых штаммов. На всех субстратах, кроме хлопкового, на 18-21-е сутки были получены плодовые тела для трех штаммов P. djamor - KOR, H и Z1, а также для штамма P. sajor-caju CS-32;

однако плодовые тела исследованных четырех штаммов отличались скоростью образования и степенью сформированности. В виду того, что наилучшие результаты по скорости мицелиального зарастания сусбтрата были получены на лузге, этот субстрат был использован для оценки урожайности исследуемых штаммов. В ходе эксперимента наблюдали 2 волны плодоношения для P. djamor и P. sajor-caju. Наименьшая урожайность была отмечена у P. sajor-caju (28 г грибов на 100 г субстрата), наибольшая - у P. djamor Z1 (34 г грибов на 100 г субстрата).

Генотипирование культивируемых штаммов и видов рода Pleurotus Результаты ПЦР с несколькими наборами специфичных праймеров показали наличие полиморфизма по длине транскрибируемых ITS- и IGS-спейсерных участков кластера генов рРНК у анализируемых штаммов. Полученные в реакции амплификации ПЦР-продукты варьировали по длине среди исследуемых видов, в то время как длины амплифицированных последовательностей среди штаммов в пределах одного вида почти не отличались. Так, длина ITS-участка рДНК составила 800 н.п. для P. djamor, 775 н.п. — для P. sajor-caju, 770 н.п. — для P. pulmonarius, н.п. для P. ostreatus и для P. eryngii, 785 н.п. — для P. calyptratus. Межвидовые различия длин ITS-участков колебались в пределах 15 н.п.

Длины IGS-участков также варьировали между видами и штаммами. Для P.

djamor длина данного участка составила 1200 н.п., для P. sajor-caju, P. pulmonarius и P. ostreatus — 1100 н.п., для P. eryngii — 1150 н.п. Межвидовые различия длин IGS участков колебались в пределах 100 н.п. Однако были отмечены отличия и между штаммами одного вида.

С целью установления степени гомологии ITS-локусов между штаммами были отсеквенированы ITS- последовательности рРНК следующих штаммов: P. sajor-caju CS-32;

P. ostreatus P10;

P. ostreatus 27.4;

P. ostreatus BP, P. ostreatus 38d, P. ostreatus В процессе секвенирования были прочтены Don, P. eryngii P13, P. eryngii 3-1.

последовательности длиной около 500 н.п., которые были сопоставлены с аналогичными последовательностями, имеющимися в базе данных Генбанка (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). При анализе ITS-последовательностей исследуемых видов и штаммов вешенки была показана высокая степень гомологии между видами с колебаниями в пределах от 0.836 (между P. calyptratus C2 и P. pulmonarius 27.4) до 1.0, (для P. sajor-caju CS-32 и P. pulmonarius 06-1).

Установление таксономического статуса P. sajor-caju Видовая принадлежность sensu stricto тех или иных культивируемых штаммов P. sajor-caju часто вызывает дискуссию, так как данный вид имеет сходство по макро и микроморфологическим признакам с близкородственным видом P. pulmonarius.

Исходя из описания Стейметса, вид P. sajor-caju отличается от P. pulmonarius наличием тонкого кольца на ножке плодового тела, однако коммерческие штаммы, культивируемые в лабораторных условиях, часто не имеют этого признака, что делает их практически неотличимыми от штаммов вида P. pulmonarius (Stamets,1983).

Полученные нами плодовые тела также не имели кольца на ножке. Исследуемый штамм P. sajor-caju CS-32 формировал мясистые плодовые тела на выраженной светлой эксцентрической ножке со шляпкой серого цвета;

средний вес плодового тела составил 35,9±2,02 г. Длина ножки составила в среднем 4,6±1,5 см, диаметр шляпки 6,4±2,1 см. Споровые отпечатки от полученных базидиом были светло лилового цвета. Данное описание плодовых тел совпадает с таковым и для вида P.

pulmonarius. Таким образом, по морфологии плодовых тел и культурально морфологическим признакам разделение видов и P. pulmonarius P. sajor-caju оказалось затруднительным. Поэтому полученные при секвенировании ITS- и IGS последовательности штамма P. sajor-caju CS-32 были сопоставлены с аналогичными последовательностями из базы данных ГенБанка. В ГенБанке происходило выравнивание штамма вешенки P. sajor-caju CS-32 в равной степени как с последовательностями P. sajor-caju, так и с последовательностями P. pulmonarius, а также с последовательностями, депонированнывми под видовыми названиями P.

sapidus и P. australis. Не исключено, что подобные результаты могут быть следствием ошибок при определении видов вешенок, чьи сиквенсы депонируются в электронную базу данных ГенБанка. Поэтому идентифицировать виды и, тем более, штаммы грибов, ориентируясь лишь на данные секвенирования ITS-локусов рДНК, не всегда возможно и однозначно. Для решения этой проблемы был проведен филогенетический анализ на основе ITS-последовательностей рибосомальных генов.

В анализ, помимо полученных нами в ходе секвенировагия ITS-последовательностей, были включены последовательности из ГенБанка. Результаты представлены в виде кладограммы на рис. 5. Как видно из кладограммы, штаммы видов P. sajor-caju и P.

сформировали общий кластер, не дифференцированный по видовой pulmonarius принадлежности.

Таким образом, в результате проведенного филогенетического анализа нам не удалось четко разграничить виды P. sajor-caju и P. pulmonarius, т.е. провести молекулярно-генетическую дифференциацию между видами. Поэтому на следующем этапе были проведены мон-мон скрещивания (монокарион х монокарион) между полученными нами гаплоидными монобазидиоспоровыми тестерными штаммами P.

sajor-caju с гаплоидными тестерами половой совместимости вида P. pulmonarius c целью анализа присутствия репродуктивных барьеров (репродуктивной изоляции, или нескрещиваемости) между штаммами данных видов (4х4, всего 16 скрещиваний).

Ни одна из 16-ти комбинаций в мон-мон скрещиваниях не оказалась Рис.5. Кладограмма сходства между штаммами видов рода Pleurotus, построенная на основе ITS-последовательностей кластера рибосомальных генов с применением метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood Estimation). Подчеркиванием выделены виды и штаммы, чьи ITS-последовательности были секвенированы во время выполнения данной работы, остальные последовательности были взяты из базы данных ГенБанка.

Цифрами на ветвях указаны значения бутстреп (bootstrap).

фертильной: не наблюдали формирование пряжек в месте контакта монокариотических партнеров. Образование пряжек при скрещивании монокарионов (гаплоидов) указывает на формирование фертильного дикариона и, следовательно, на половую совместимость между скрещиваемыми монокарионами. Отсутствие формирования фертильного дикариона свидетельствует о репродуктивной изоляции (половой несовместимости) между штаммами. Таким образом, несмотря на сходство морфологии, P. sajor-caju и P. pulmonarius являются разными видами. Результаты данного эксперимента являются еще одним подтверждением предположения о том, что в пределах рода репродуктивная изоляция, сопровождаемая Pleurotus установлением генетических барьеров, препятствующих скрещиваниям, происходит быстрее морфологической дифференциации, которую можно рассматривать как второй шаг, следующий за генетической изоляцией (Шнырева с соавт., 2004).

Анализ количественных признаков Pleurotus ostreatus Коммерческий монокариотический штамм P. ostreatus P001-15, который является протоклоном коллекционного штамма ATCC58937 (American Type Culture Collection), и производственный монокариотический штамм P. ostreatus EP57 были скрещены между собой на чашке Петри для получения дикариотического штамма BKK0 (рис.2). Полученный дикариотический мицелий был высеян на субстрат для получения плодовых тел – ферментированную и стерилизованную солому пшеницы, помещенную в мультиперфорированный полиэтиленовый мешок, рассчитанный на кг субстрата. На 22-е сутки после инокуляции субстрат был полностью колонизирован мицелием вешенки, и мешок с субстратом был перенесен в камеру для выгонки плодовых тел со стандартными условиями культивирования для вешенки обыкновенной. На 4-е сутки после перемещения мешка с колонизированным субстратом в камеру для выгонки плодовых тел на мицелии вешенки появились примордии, а еще через 2 суток они развились в зрелые плодовые тела. Из спорового отпечатка произвольно выбранной базидиомы дикариона BKK0 путем высевания суспензии спор на чашки Петри со средой Эгер была получена популяция, состоящая из 202 монобазидиоспоровых изолятов. Эти штаммы были использованы в последующих экспериментах с целью изучения наследования количественных признаков P. ostreatus. Все полученные штаммы были маркированы порядковыми номерами BKK1 – BKK202 соответственно (рис.2).

Оценка урожайности Для изучения локусов количественных признаков вешенки обыкновенной, ответственных за урожайность и цвет шляпок базидиом, было необходимо получить плодовые тела, поэтому 202 гаплоидных монокариотических штамма экспериментальной ВКК-популяции были поочередно скрещены на чашках Петри со штаммом P. ostreatus EP25. Из 202 дикариотических штаммов, полученных в результате скрещивания ВКК-штаммов со штаммом ЕР-25 и инокулированных на растительный субстрат для плодоношения, только 150 образовали базидиомы в течение 21 суток после начала вентиляции. Зрелые плодовые тела вешенок имели типичный для внешний вид: мясистая шляпка на плотной P. ostreatus эксцентрической или боковой ножке, диаметр шляпки до 10 см. Сразу после срезания плодовые тела взвешивали. Общий вес плодовых тел, собранный с 1 мешка в первую волну плодоношения, варьировал от 2,2 до 159 грамм, со средним значением для всей популяции дикарионов равным 58 г/мешок. Диаграмма распределения дикариотических штаммов в зависимости от их урожайности представлена на рис.6.

Все исследуемые штаммы были разделены на 8 групп в зависимости от общего веса образовавшихся на мешках базидиом.

Количество индивидуумов 1-20 21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141- Ве с плодовых те л, г Рис. 6. Распределение штаммов P. ostreatus в зависимости от их продуктивности Определение цвета шляпок плодовых тел P. ostreatus Для оценки генетического разнообразия штаммов вешенки по интенсивности цвета шляпок базидиом, были проанализированы 124 дикариона: по 10 плодовых тел от каждого штамма. Цвет шляпок характеризовали, используя три параметра (индекса) цветности: по шкале от зеленого до красного (a), от желтого до синего (b) и от черного до белого (L, рис. 2). Значения индекса L (яркость) варьировали от 54,4 для самых темных до 82,6 - для самых светлых грибов, со статистическим порогом значимости 3,64. Это позволило разделить все исследуемые штаммы на 6 классов в соответствии с интенсивностью цвета. Как показал статистический анализ, и, как видно на рис. 7, распределение штаммов вешенки по цвету шляпки плодовых тел близко к нормальному, что является наиболее благоприятным условием для локализации и анализа генных областей, ответственных за цвет шляпок базидиом P.

ostreatus.

Рис. 7. Распределение штаммов P. ostreatus в зависимости от цвета шляпки базидиом.

Определение скорости вегетативного роста Для изучения генных локусов, ответственных за скорость вегетативного роста вешенки обыкновенной, из 202 моноспоровых изолятов BKK-популяции были произвольно отобраны 70 штаммов. Выбранные штаммы были скрещены поочередно с гаплоидными тестерными штаммами EP25, P24 и G24 (I, II и III группы скрещивания соответственно). Два последних штамма являются широко используемыми коммерческими штаммами устричной вешенки и были включены в анализ для расширения генетической базы вариабельности признака.

Усредненные данные по скорости роста трех произвольно выбранных дикариотических культур, полученные в ходе эксперимента, представлены на рисунке 8. Как видно на этом рисунке, скорость обрастания дикариотическим мицелием субстрата в пробирке имеет линейный характер и может описываться функцией вида y=ax+b, что позволило нам использовать значения параметра «а» этих функций в качестве количественного признака при картировании областей, ответственных за скорость мицелиального роста вешенки.

Однофакторный дисперсионный анализ показал, что в нашем эксперименте генотип оказывал существенное и статистически достоверное влияние на скорость мицелиального роста дикариотических штаммов P. ostreatus.

140, 120, R2 = 0, 100, Граница роста мицелия, мм 80, R2 = 0, 60, 40, R2 = 0, 20, 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 -20, Дни BKK25 BKK175 BKK Рис. 8. Динамика мицелиального роста различных штаммов P. ostreatus. На оси абсцисс отмечены сутки роста мицелия, на оси ординат - расстояние, пройденное мицелием на субстрате (оценку проводили в пробирках).

Для двухфакторного дисперсионного анализа использовали данные о генотипах исследуемых штаммов BKK-популяции в качестве первой независимой переменной и данные о генотипах тестерных штаммов EP25, G24 или P24 в качестве второй независимой переменной. Анализ доказал влияние генотипа гаплоидных тестерных штаммов (EP25, G24 или P24) на скорость мицелиального роста дикарионов, а также показал, что штаммы во II группе скрещивания характеризовались более быстрым мицелилальным ростом по сравнению с двумя другими группами скрещивания I и III.

Построение генетической карты P. ostreatus и локализация QTL-локусов Для дальнейшего анализа хозяйственно полезных признаков вешенки обыкновенной требовалось построение подробной генетической карты. Такая карта была построена на основе 384 найденных SNP-маркеров и данных генотипирования 186 ВКК-штаммов P. ostreatus. Все маркеры были распределены между 11 группами сцепления, которые, как мы полагаем, соответствуют 11 хромосомам вешенки обыкновенной (Larraya, 2009). Кроме того, геномы штаммов P. ostreatus P001-15 и EP-57 были полностью секвенированы и частично аннотированы сотрудниками Объединенного Института Генома (Joint Genome Institute, www.jgi.doe.gov/). Длина генома составила 1044 сМ, около 34 Mbp, с плотностью около 319 генов на 1 Mbp.

Средняя длина гена составила 1,7 kb, экзона – 218 kb, интрона – 77 kb.

Помимо SNP-маркеров, на карту были также нанесены локусы спаривания P.

ostreatus – matA и matB, ответственные за половую совместимость. Для выполнения этой задачи было необходимо установить типы спаривания (аллели локусов половой совместимости) для исследуемых штаммов BKK-популяции. Эта цель была достигнута серией экспериментов по скрещиванию монокариотических ВКК штаммов P. ostreatus между собой. Установив типы спаривания родительских штаммов (P001-15 и EP57) путем их скрещивания с гаплоидными тестерами из коллекции Университета Вагенингена и проведя ряд скрещиваний во всех возможных комбинациях между 16 произвольно выбранными ВКК-штаммами, были получены гаплоидных тестерных ВКК-штамма с четырьмя возможными сочетаниями аллелей локусов спаривания: А1B2, A5B2, A1B5, A5B5. Эти ВКК-тестеры были использованы для определения типов спаривания у необходимого количества ВКК-штаммов. Таким образом, серией из 376 скрещиваний были установлены типы спаривания штаммов экспериментальной ВКК-популяции.

Полученная генетическая карта P. ostreatus с нанесенными на нее маркерами (matA, matB и SNP-маркеры) представлена на рис. 9. Как видно на рисунке, локус matA попал в III группу сцепления, локус matB – в IX группу сцепления.

Полученные в ходе экспериментов данные о цвете шляпок плодовых тел P.

ostreatus позволили нам локализовать несколько областей генома вешенки, которые оказывают влияние на пигментацию плодовых тел (таблица 2).

Локусы количественных признаков, ответственные за скорость мицелиального роста Локусы количественных признаков, ответственные за цвет шляпок базидиом роста Рис. 9. Генетическая карта P. ostreatus и QTL-локусы, ответственные за коммерчески важные признаки вешенки: скорость мицелиального роста и цвет шляпок базидиом.

Наиболее статистически достоверным оказался маркер на I хромосоме, в позиции 920617 н.п. Проверка распределений каждого из двух аллелей этого локуса показала, что смещение в распределении штаммов по окраске плодовых тел вносит аллель b этого локуса, происходящий от родительского штамма PC001-15, тогда как аллель а, полученный от штамма EP57, напротив, характеризуется более темными плодовыми телами (рис. 10).

Количество штаммов a b общее распределение 57--60 60--63 63--66 66--69 69--72 72--75 75--78 78-- Значения яркости L Рис.10. Распределение штаммов с разными аллелями а (аллель родительского штамма ЕР 57) и в (аллель родительского штамма Р001-15) по цвету шляпок базидиом. На оси абсцисс отмечены значения параметра L, на оси ординат - количество штаммов.

Кроме того, при помощи методов интервального картирования и непараметрического теста Крускал-Уоллиса было также обнаружено 9 локусов (QTL), контролирующих скорость вегетативного мицелиального роста P. ostreatus. Один из них оказался сцеплен с одним из локусов спаривания вешенки - matA, вследствие чего было принято решение разделить исследуемую популяцию на две группы по типам спаривания - А1 и А5 - с целью обнаружения других QTL-локусов, возможно, «замаскированных» влиянием matA-локуса. Благодаря выбранной стратегии было обнаружено еще два QTL-локуса, оказывающих влияние на скорость мицелиального роста вешенки. Все найденные QTL-локусы представлены в таблице 2, а также на рисунке 9.

Дополнительно, был проведен сравнительный анализ распределений штаммов, несущих разные аллели генов на участке 226114-230263 нп хромосомы I. Анализ показал присутствие в данном участке генома аллеля с (от штамма EP57), который Таблица 1. Локусы количественных признаков, ответственные за скорость мицелиального роста и цвет шляпки базидиом P. ostreatus Вероятность Тестер Группа сцепления Локус случайной ошибки Признак - скорость мицелиального роста (Крускал-Уоллис) *124226-325965 EP25 I 0, III *2644222-2738759 (matA) 0, *1351225-1647713 0, P VIII *753270-950087 0, *1051105-1451125 0, *1351225-1647713 0, 950087-1051105 0, P24/A1 VIII *1751146 0, 1951041-2249929 0, V **2548223-3500674 0, P24/A5 III 2644222-2738759 (matA) 0, IX **550250-749592 0, II *550124-976908 0, *150853-349913 0, IV *450487-551695 0, G24 VI 48907-552424 0, *1647713-2249929 0, VIII 250390-648298 0, XI 1365970 0, Признак- цвет шляпок базидиом I *920617 0, VII 951269-1648882 0, VIII 1051105-950087 0, EP IX 1649953-1750001 0, X 1552308 0, XI 1454375 0, Примечание: цифры указывают позицию в н.п. (нуклеотидных парах) группы сцепления на генетической карте;

matA-локус находится в III группе сцепления;

* - данные QTL были подтверждены с помощью метода интервального картирования;

** - данные QTL были обнаружены только после разделения ВКК-популяции по типам спаривания.

статистически достоверно оказывает положительное влияние на скорость мицелиального роста гриба. В соответствии с аннотированным сиквенсом исследуемых нами штаммов, который был составлен при сотрудничестве с Объединенным Институтом Генома (Joint Genome Institute, США), данный участок, находящийся на I хромосоме, кодирует белки, относящиеся к суперсемейству гликозидаз (six-hairpin glycosidases) (DOE Joint Genome Institute, www.jgi.doe.gov, Для этих белков показана http://supfam.org/SUPERFAMILY/index.html).

ферментативная активность по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозе, что доказывает их участие в процессе зарастания (колонизации) мицелием вешенки растительных субстратов, используемых при культивировании, а, следовательно, и возможность использования данного вида P. ostreatus в процессах переработки (биодеградации) отходов сельскохозяйственного производства. Кроме того, нами был полностью проанализирован участок 124226-325965 н.п. хромосомы I (таблица 2).

Этот достаточно протяженный участок кодирует около 30 известных белков, среди которых встречаются белки электронно-транспортной цепи (цитохромы), факторы транскрипции грибов, белки цинковых пальцев, белки цитоскелета и внутриклеточного транспорта (миозин, клатрины и др.), а также белки, участвующие в биосинтезе грибного хитина. Все эти гены, несомненно, оказывают влияние на скорость мицелилального роста, однако на данный момент еще не накоплено достаточного количества данных для более точного маркирования этих признаков и объяснения механизмов их наследования и проявления.

Как уже было отмечено выше, один из QTL-локусов оказался сцепленным с одним из двух локусов спаривания (половой совместимости) базидиомицетов – matA-локусом. Для некоторых видов базидиомицетов прежде уже было показано, что более быстрый вегетативный мицелиальный рост штаммов ассоциирован с конкретным типом спаривания (Larraya, 2000). Однако только теперь это было подтверждено для дикариотических культур вешенки с использованием молекулярно генетических методов картирования. Таким образом, тип спаривания может служить простым и удобным маркером для проведения селекционных программ, направленных на выведение быстрорастущих штаммов P. ostreatus.

Заключение Виды рода Pleurotus уже давно плотно вошли в культуру и производятся во всем мире в огромных количествах – больше 2000 тонн в год, – уступая в показателях только шампиньону. Несмотря на это, часть вопросов, касающихся культивирования вешенок, до сих пор остается нерешенной, и поэтому постоянно идет поиск новых, более оптимальных субстратов и условий для плодоношения, в культуру вводятся новые виды и штаммы с улучшенными показателями урожайности и качества плодовых тел. Так, результаты данной работы показали, что оптимальным субстратом для относительно новых для российского грибоводства видов - P. djamor и P. sajor caju - является подготовленная стандартным способом лузга, на которой наблюдали выход плодовых тел, сопоставимый или превышающий таковой у широко культивируемого вида P. ostreatus (до 34% для P. djamor Z1 в условиях лабораторного культивирования).

На сегодняшний день одним из самых прогрессивных путей селекции и получения новых, коммерчески более выгодных штаммов грибов является маркер направленная селекция метод, основанный на генотипировании и отборе организмов-носителей генетических маркеров хозяйственно полезных признаков. Эта техника, используемая во многих странах мира в течение последних двадцати лет, уже доказала свою эффективность в растениеводстве, и в последнее время все больше применяется и в животноводстве, однако в селекции съедобных грибов эта методика пока практически не используется. Найденные в процессе выполнения данной работы 12 QTL-локусов, ответственных за скорость мицелиального роста P. ostreatus, а также 6 QTL-локусов, оказывающих влияние на интенсивность цвета шляпок плодовых тел P. ostreatus могут стать объектами дальнейшего исследования и поиска генов кандидатов, оказывающих решающее влияние на описанные выше признаки. Так, среди локусов, ответственных за скорость вегетативного роста вешенки была обнаружена область, кодирующая белки из суперсемейства гликозидаз, для которых показана каталитическая активность по отношению к целлюлозе и гемицеллюлозе;

данную генетическую область мы считаем наиболее перспективной для дальнейшего более подробного изучения как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Также интересен QTL-локус, сцепленный с локусом половой совместимости вешенки matA (III, 2644222-2738759), который может быть использован в качестве маркера для отбора более перспективных и быстрорастущих штаммов.

Несмотря на доказанную эффективность методов молекулярно-генетического анализа при отборе интересующих исследователя штаммов, эти методы не всегда могут дать четкий ответ о видовой принадлежности гриба. В данной работе для разрешения дискуссионного вопроса о видовой принадлежности P. sajor-caju нам потребовалось сочетание методов молекулярно-генетического анализа и серии мон мон скрещиваний гаплоидных тестерных штаммов P. sajor-caju и P. pulmonarius.

Таким образом было доказано, что несмотря на близость микро- и макроморфологии, P. sajor-caju является самостоятельным, репродуктивно изолированным видом.

ВЫВОДЫ Показано, что из четырех исследованных штаммов P. sajor-caju и P.

1.

djamor наилучшим плодоношением характеризуется штамм P. djamor Z1 (34 г грибов на 100 г субстрата), тогда как выход плодовых тел у штаммов P. sajor-caju CS-32 и P. djamor H составил 28 и 32 г грибов на 100 г субстрата соответственно.

Оптимальным субстратом для культивирования обоих видов является подготовленная стандартным способом лузга.

Анализ вариабельности ITS-последовательностей рДНК у 17 штаммов, 2.

относящихся к 6 видам рода Pleurotus, показал наличие полиморфизма по длине транскрибируемых спейсерных участков генов рРНК;

степень гомологии анализируемых фрагментов варьировала в пределах от 0.836 (между видами P.

calyptratus C2 и P. pulmonarius 27.4) до 1.0 (между видами P. sajor-caju CS-32 и P.

pulmonarius 06-1).

Проведенный молекулярно-генетический анализ вариабельной ITS 3.

последовательности локуса генов рРНК и мон-мон скрещивания показали, что вид P. sajor-caju является самостоятельным видом, репродуктивно изолированным от сходного по морфологии близкородственного вида P. pulmonarius.

На основе 384 SNP-маркеров и данных генотипирования 186 штаммов 4.

экспериментальной ВКК-популяции построена подробная генетическая карта для P. ostreatus;

все маркеры были распределены по 11 группам сцепления, соответствующим 11 хромосомам.

Хозяйственно важные количественные признаки P.ostreatus цвет 5.

шляпки плодового тела и скорость вегетативного мицелиального роста находятся под генетическим контролем сложной полигенной системы. В ходе анализа количественных признаков обнаружено 6 QTL-локусов, контролирующих цвет шляпки плодовых тел, и 12 QTL-локусов, контролирующих скорость колонизации субстрата мицелием гриба.

Были проанализированы аллели локусов половой совместимости (matA и 6.

matB) у гибридного потомства ВКК-популяции, что позволило определить положение matA и matB локусов на полученной генетической карте P.ostreatus.

Благодарности. Я выражаю огромную благодарность своему научному руководителю, д. б. н., профессору Шныревой Алле Викторовне за терпение, неоценимую помощь и всестороннюю поддержку на всех этапах выполнения и написания работы. Искренне благодарю всех сотрудников лаборатории микологии Университета Вагенингена, в особенности Йохана Барса, Антона Сонненберга, Патрика Хендрикса и Брайана Лаврайссена за помощь в планировании и проведении большой части работы по анализу количественных признаков вешенки, а также за их гостеприимство и чувство юмора. Хочу поблагодарить д. б. н., профессора Гарибову Лидию Васильевну и Завьялову Людмилу Анатольевну за помощь в работе, ценные советы и рекомендации. Отдельное спасибо всем сотрудникам кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, а также моим друзьям и близким.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК 1. Сиволапова А.Б., Сонненберг А., Барс И., Шнырева А.В. ДНК-маркирование некоторых локусов количественных признаков вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus // Генетика. – 2012. Т 48. – N4. – С. 465-472.

2. Шнырева А.А., Сиволапова А. Б., Шнырева А. В. Съедобные культивируемые грибы вешенки Pleurotus sajor-caju и P. pulmonarius сходны по морфологии, но являются самостоятельными репродуктивно изолированными видами // Генетика. –2012. – Т 48. – N11. С. 1260-1270.

3. Сиволапова А. Б. Грибы рода вешенка как перспективные агенты биодеградации отходов вредных производств и сельского хозяйства // Ветеринарная медицина. – 2012 – N2. – С. 3-4.

Материалы и тезисы конференций 4. Шнырева А. В., Сиволапова А. Б. Молекулярное генотипирование культивируемых штаммов и видов вешенки Pleurotus spp. // Современная микология в России. Том 2.

Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008. – С. 45.

5. Сиволапова А. Б., Завьялова Л. А. Морфолого-культуральные и некоторые физиолого-биохимические признаки Pleurotus djamor и Pleurotus sajor-caju. // Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества. Материалы юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М. В. Горленко. – М.: Изд-во «Восток-Запад», 2008. – С. 196-197.

6. Сиволапова А. Б., Шнырева А. В., Сонненберг А., Барс И. ДНК-маркирование локусов некоторых количественных признаков съедобного культивируемого гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. // Материалы XII международной молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». – 2012. – С. 59-60.

7. Sivolapova A., Shnyreva A., Sonnenberg A., Baars J. Quantitative trait loci controlling vegetative growth rate of edible mushroom Pleurotus ostreatus // Book of Abstracts of XVI Congress of European Mycologists. – 2011. – p. 189.

8. Snhyreva A.V., Sivolapova A. Reproductive isolation between closely related Pleurotus species is not reflected by morphological and physiological individuality // Book of Abstracts of XVI Congress of European Mycologists. – 2011. – p. 44.

9. Шнырева А.А., Сиволапова А.Б. Съедобные культивируемые грибы вешенки и сходные по морфологии, являются Pleurotus sajor-caju P. pulmonarius, репродуктивно изолированными видами по данным генетического анализа // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2012». М.:

МАКС Пресс, 2012. — С. 156.