Системы контролируемого высвобождения биологически активных соединений на основе поли(3-гидроксибутирата)

На правах рукописи

Лившиц Владимир Александрович

СИСТЕМЫ КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫСВОБОЖДЕНИЯ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА

ОСНОВЕ ПОЛИ(3-ГИДРОКСИБУТИРАТА)

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Г.А. Бонарцева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц доктор химических наук, профессор Г.Е. Заиков

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 26 ноября 2009 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119 071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия проводятся интенсивные разработки и исследования полимерных систем для контролируемого высвобождения (ПСКВ) биологически активных соединений (БАС). Пролонгированная доставка БАС в организм в требуемых дозах позволяет устранить многие недостатки перорального, инъекционного, ингаляционного и других способов их введения при использовании традиционных лекарственных форм. Такими недостатками, чаще всего, являются повышенная токсичность и нестабильность БАС, неравномерная скорость их подачи, неэффективный расход действующего начала и др. Использование ПСКВ дает возможность планомерно и целенаправленно вводить в организм требуемую дозу препарата, что особенно важно при терапии хронических заболеваний. Более того, используя полимерную форму лекарственного препарата, можно варьировать время высвобождения от нескольких часов (наночастицы) до нескольких месяцев (матрицы и резервуары).

В настоящее время поли(3-гидроксибутират) (ПГБ) и его сополимеры, полученные биотехнологическим способом, привлекают большое внимание как биодеградируемые и биосовместимые полимеры для применения в различных областях и, в частности, в медицине. Являясь продуктом современной биотехнологии, ПГБ обладает широким спектром полезных эксплуатационных характеристик, среди которых, прежде всего, следует отметить биосовместимость и способность к биодеградации в организме с образованием нетоксичных конечных продуктов. В Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН разработана микробиологическая технология получения ПГБ разной молекулярной массы, в связи с этим в качестве полимерного носителя для исследования и разработки новых лекарственных форм был использован данный материал.

Цель и задачи работы. Целью работы явилось создание пленочных систем и микросфер на основе ПГБ для контролируемого высвобождения различных лекарственных веществ (ЛВ), а также изучение высвобождения инкапсулированных веществ из полученных систем. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

получить полимерные пленочные системы и микросферы на основе ПГБ для инкапсулирования в них ЛВ;

1. усовершенствовать методы введения различных ЛВ в полимерную матрицу ПГБ применительно к разрабатываемым ПСКВ;

2. c целью разработки научных принципов создания нового поколения лекарственных форм пролонгированного действия изучить кинетику высвобождения ЛВ различной химической природы из полимерных пленочных систем и микросфер из ПГБ in vitro;

3. выяснить влияние таких определяющих характеристик системы, как ММ ПГБ, массовая доля ЛВ, размер и форма ПСКВ, на кинетику высвобождения ЛВ из полимерных систем на основе ПГБ in vitro;

4. провести комбинированные исследования как in vitro, так и in vivo высвобождения ЛВ из ПСКВ на основе ПГБ для оценки возможности их применения в качестве пролонгированной лекарственной формы.

Научная новизна. Впервые проведено моделирование системы высвобождения различных БАС из ПСКВ на основе ПГБ, представлены уравнения для описания этой системы. Впервые показано, что механизм этого процесса является двухстадийным – первый этап связан с преобладанием диффузионных процессов, когда скорость выхода БАС нелинейная и весьма высокая;

второй этап – с доминированием деструкции полимерной матрицы, что соответствует кинетике высвобождения нулевого порядка.

Впервые проведены комплексные исследования влияния ряда значимых параметров на кинетику высвобождения БАС: молекулярной массы ПГБ, размера и формы ПСКВ, массовой доли БАС, а также химического строения инкапсулированного БАС.

Показана возможность использования ПГБ различной молекулярной массы для создания ПСКВ лекарственных препаратов широкого спектра действия.

Усовершенствованы способы введения различных ЛВ в полимерную матрицу ПГБ.

Разработан оптимальный способ получения микросфер заданного диаметра из ПГБ различной молекулярной массы с инкапсулированными лекарственными препаратами разного фармакологического действия.

Практическая ценность работы. Работы по созданию лекарственных форм на основе биоразлагаемых микросфер в России находятся на начальном этапе, и все имеющиеся на фармацевтическом рынке страны пролонгированные формы ЛВ экспортируют из других высокоразвитых стран. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых отечественных лекарственных форм пролонгированного действия для лечения широкого спектра заболеваний.

Большинство работ в мире по созданию ПСКВ ведутся с использованием синтетических биоразлагаемых полимеров, в основном, таких как полилактиды, полигликолиды и их сополимеры, имеющих ряд недостатков. Полученные в настоящей работе пленочные системы и микросферы из биосовместимого и биоразлагаемого бактериального ПГБ позволят разработать новые лекарственные формы, использование которых поможет избежать осложнений, связанных с воспалительной тканевой реакцией при применении ПСКВ на основе синтетических полимеров.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (279 источников). Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 9 таблиц.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»

(Москва, 2007), третьей Санкт-Петербургской конференции «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2007), 17-ом Европейском съезде по гипертонии (Милан, Италия, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Современные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Одесса, Украина, 2007), финале конкурса молодых ученых на 23-ей ежегодной научной конференции Американского Общества Гипертензии (Новый Орлеан, США, 2008), VI открытой украинской конференции молодых ученых по высокомолекулярным соединениям ВМС-2008 (Киев, Украина, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ (4 статей, 9 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение микробиологического ПГБ. В работе исследовали системы на основе поли(3-гидроксибутирата) в качестве матрицы-носителя лекарственных веществ разной фармакологии. В качестве продуцента ПГБ был использован штамм Azotobacter chroococcum 7Б. Клетки продуцента поли(3-гидроксибутирата) Azotobacter chroococcum 7Б выращивали при 28 °С в течение 48 часов на агаризованной среде Эшби. Затем для получения биомассы с высоким содержанием ПГБ штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б пересевали и выращивали на жидкой среде Берка.

Культивирование осуществляли в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 30 °С, рН 7.2 в течение 48 часов.

Выделение и очистка ПГБ из биомассы. Выделение из биомассы и очистка полимера включали следующие стадии: получение очищенной сухой биомассы (центрифугирование, промывка биомассы изопропанолом, сушка при 60 °С), получение раствора ПГБ (экстракция полимера из сухой биомассы хлороформом при умеренном нагревании (35-40 °С), фильтрация, упаривание раствора), получение очищенного ПГБ (осаждение ПГБ из раствора изопропанолом, фильтрация и промывка полученного геля изопропанолом, сушка при температуре 60 °С).

Определение молекулярной массы ПГБ. Молекулярную массу полимера определяли методом вискозиметрии. Измерения вязкости раствора ПГБ в хлороформе проводили при 30 °С. Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка Хаувинка - Куна, используя следующие коэффициенты [] = 7,7·10-5·М0,82, где вязкость, М – молекулярная масса ПГБ (Akita et al., 1975).

Лекарственные вещества, инкапсулируемые в полимерную матрицу ПГБ.

Использованные в работе химически чистые ЛВ фирмы "Aldrich-Sigma" (США) принадлежат трем фармакологическим группам: антибактериальные препараты – рифампицин, левофлоксацин и метронидазол, противовоспалительные препараты – индометацин и флурбипрофен, а также противоспаечный/ противотромботический препарат – дипиридамол.

Получение пленочных систем из ПГБ с инкапсулированными ЛВ.

В экспериментах по исследованию кинетических характеристик высвобождения ЛВ из матрицы ПГБ пленочных систем использовали 4 партии ПГБ с различной молекулярной массой (ММ): 320 кДа, 450 кДа, 1010 кДа, 1540 кДа. Использовали пленочные матрицы ПГБ толщиной 11, 22 и 39 мкм, которые содержали различные количества ЛВ (3.3, 10 и 30% мас.). Пленочные системы с заданным содержанием ЛВ получали путем растворения ПГБ и ЛВ в хлороформе с последующим испарением растворителя на стеклянной подложке при комнатной температуре.

Исследование контролируемого высвобождения ЛВ из пленочных систем in vitro. Исследование зависимости кинетических характеристик высвобождения ЛВ от молекулярной массы ПГБ полимерных пленочных систем проводили на пленках с дипиридамолом, от толщины полимерной матрицы – на пленках с дипиридамолом и индометацином. Исследование зависимости кинетических характеристик высвобождения ЛВ от природы самого ЛВ проводили на пленках толщиной 40 мкм, содержащих 10% мас. ЛВ. Скорость высвобождения лекарственных веществ регистрировали методом спектрофотометрии в области максимального поглощения водных растворов ЛВ. Высвобождение ЛВ проводили в 0.025М калий-фосфатном буферном растворе (рН = 7.4) при 37 °С в течение всего времени эксперимента (до суток). Каждые сутки инкубационную среду заменяли на новую. Суммарное высвобождение ЛВ из пленок ПГБ контролировали по разнице в концентрации ЛВ в пленках ПГБ до эксперимента и в конце его.

Исследование деградации пленочных систем из ПГБ in vitro. Степень потери массы пленочных систем в результате деструкции определяли гравиметрически после выдерживания пленок ПГБ толщиной 40 мкм с различной массовой долей дипиридамола (ДП) (1, 3.3, 10 и 30 % мас.) в калий-фосфатном буферном растворе (рН = 7.4) при 37 °С в течение 1, 3, 7, 15, 29 сут. с периодической сменой инкубационной среды. Одновременно регистрировали количество высвобождающегося ЛВ методом спектрофотометрии.

Получение микросфер из ПГБ с инкапсулированными ЛВ. Микросферы и наносферы с ЛВ получали с использованием метода одноэтапного эмульгирования.

Раствор ЛВ и ПГБ (ММ = 485 кДа) растворяли в хлороформе и постепенно добавляли к водному раствору поливинилового спирта (ПВС) различной концентрации (0.4-1.2 % мас.) при перемешивании с помощью механической верхнеприводной мешалки RZR 2021 (Heidolph, Германия) при 600-2000 об/мин или гомогенизатора SilentCruisher M (Heidolph, Германия) при 20 000 об/мин. После полного испарения органического растворителя однородные по размеру фракции микросфер получали фильтрованием через стеклянные фильтры с различным диаметром пор (16 и 40 мкм). Разделенные таким образом микросферы отделяли центрифугированием (6 мин при 4400 об/мин) с использованием центрифуги 5702 R (Eppendorf, Германия), а затем 3 раза промывали дистиллированной водой для полного удаления эмульгатора и ЛВ на поверхности сфер. Затем микросферы сушили в термостате при 60 °С. Процент включения ЛВ в микросферах определяли спектрофотометрически (по максимумам поглощения при и 415 нм) при сравнении с контрольным раствором ПГБ и ЛВ в хлороформе. Средний диаметр и стандартное отклонение у полученных партий микросфер определяли по микрофотографиям.

Исследование контролируемого высвобождения ЛВ из полимерных микросфер in vitro. Контролируемое выделение ЛВ из микросфер проводили при 37°С в 0.025М калий-фосфатном буфере (pH = 7.4) с небольшим добавлением эмульгатора (0.05% Triton X-10 по объему): 4 партии по 5 мг микросфер в 4 мл буфера перемешивали в бюксах при 50 об/мин на магнитной мешалке MS-01 (Elmi, Латвия).

При исследовании кинетики выделения ЛВ через заданные интервалы времени (1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18 часов, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 суток с начала эксперимента) микросферы отделяли от буфера центрифугированием при 14000 об/мин и добавляли 4 мл свежего буфера. Содержание ЛВ в опытном растворе определяли спектрофотометрически при сравнении с калий-фосфатным буфером. Остаточное содержание ЛВ в микросферах определяли, растворяя их в заданном количестве растворителя, с последующим определением концентрации ЛВ в растворе спектрофотометрически, сравнивая с контрольными растворами известной концентрации.

Исследование деградации микросфер из ПГБ in vitro. Деградацию микросфер с инкапсулированными ЛВ исследовали микроскопически на примере микросфер с дипиридамолом (10% мас.). Исследование деградации микросфер проводили в тех же экспериментальных условиях, что и исследование кинетики высвобождения ЛВ. В определенные промежутки времени (1-30 сут. с начала эксперимента) небольшую часть микросфер исследовали микроскопически и фотографировали.

Исследование контролируемого высвобождения ЛВ из полимерных микросфер in vivo. Для исследования контролируемого высвобождения ЛВ из полимерных микросфер in vivo использовали микросферы из ПГБ (молекулярная масса 475 кДа) с инкапсулированным дипиридамолом (10% мас.). В качестве объекта исследования использовали лабораторных крыс линии Wistar. Микросферы и буферный раствор (1 % водный раствор NaCl с добавлением эмульгатора – 2.5 % Polysorbat-20) предварительно стерилизовали автоклавированием. Получали однородную дисперсию 15 мг микросфер в 1 мл буферного раствора. Затем делали инъекцию полученной дисперсии в правую заднюю бедренную мышцу крысы. Для контрольного сравнения в бедренную мышцу крысы делали инъекцию раствора 1.5 мг нативного дипиридамола в 1 мл буфера с добавлением 2.5 % Polysorbat-20. Через определенные промежутки времени (1, 3, 7, 14 и 30 суток от начала эксперимента) крыс забивали, фрагмент мышцы крысы, в которую производилась инъекция, гомогенизировали, экспериментальную сыворотку отделяли центрифугированием.

Концентрацию дипиридамола в сыворотке определяли спектрофлуориметрически, используя для сравнения раствор дипиридамола в буфере известной концентрации. В качестве дополнительного контроля использовали мышцу контрольной интактной крысы.

Спектрофотометрия. Спектры поглощения буферных растворов ЛВ, растворов систем из ПГБ для контролируемого высвобождения ЛВ в хлороформе записывали на спектрофотометре DU-650 (Beckman Coulter, США) в 1 см кювете. Запись спектров проводили при комнатной температуре.

Спектрофлуориметрия. Регистрацию спектров флуоресценции дипиридамола в эксперименте in vivo проводили при комнатной температуре на спектрофлуориметре RF-5301 PC (Shimadzu, Япония). Длина волны возбуждения составляла 415 нм, испускания – 500 нм.

ИК-спектроскопия. ИК-спектры образцов регистрировали на Фурье - спектрометре IFS-66 v/s (Bruker, Германия) в области 400-4000 см. Разрешающая способность составляла 1 см-1.

Микроскопия. Для определения диаметра микросфер, а также для оценки степени биодеградации микросфер из ПГБ с инкапсулированными ЛВ использовали микрофотографии, полученные при помощи световой микроскопии - микроскоп Биомед 1 Вар.2 (Биомед, Россия) с цифровым окуляром MYscope 300M (Webbers, Тайвань), а также сканирующей электронной микроскопии – микроскоп Quanta 200 3D (FEI Company, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование контролируемого высвобождения лекарственных веществ из пленочных систем.

1.1. Механизм высвобождения ЛВ из пленочных систем ПГБ.

Первичной информацией о кинетике высвобождения лекарственных веществ в окружающую водную среду из ПСКВ является зависимость количества ЛВ, высвободившегося к моменту времени t, от времени, называемая кинетическим профилем высвобождения.

Изучение механизма высвобождения соединений, включенных в полимерную матрицу, проводили на пленочных системах из ПГБ с различной толщиной и различным процентом включения дипиридамола и индометацина. Типичные кинетические кривые высвобождения дипиридамола и индометацина (ИМ) из пленочных систем на основе ПГБ представлены соответственно на рисунках 1 и 2, где показана зависимость выхода ЛВ (в %) от времени. Кривые построены на основе данных эксперимента по исследованию контролируемого высвобождения ЛВ из пленок ПГБ in vitro.

Из литературных данных (Baker, 1987) известно, что полимерным системам с включением биологически активных агентов присущ диффузионный механизм высвобождения включенных веществ, при котором ЛВ перемещается под действием диффузии к краю полимерного изделия и затем переходит во внешнюю среду.

Из данных, приведенных на рисунках, видно, что у всех полимерных систем Рисунок 1. Кинетические кривые высвобождения дипиридамола из пленочных отсутствуют постоянные предельные систем ПГБ c MM = 450 кДа различной толщины (L) и с различной исходной значения концентрации, которые обычно концентрацией лекарства. Система:

- ДП (3. наблюдаются в случае классической %), ПГБ (L = 20 мкм) (1);

- ДП (3.3 %), ПГБ (L = 40 мкм) (2);

- ДП (10 %), ПГБ (L = 10 мкм) диффузии. В нашем случае кинетические (3);

- ДП (10 %), ПГБ (L = 20 мкм) (4);

ДП (10 %), ПГБ (L = 40 мкм) (5).

кривые характеризуются начальным, нелинейным от времени участком и завершающим линейным участком, где скорость высвобождения практически постоянна.

Анализ представленных на рисунках и 2 зависимостей показывает, что механизм высвобождения определяется суперпозицией двух процессов: собственно, десорбцией ДП и ИМ по диффузионному механизму и Рисунок 2. Кинетические кривые гидролитической деструкцией ПГБ, высвобождения индометацина (10%) из пленок наиболее отчетливо проявляющейся после ПГБ c MM= 450 кДа при различной толщине этих пленок. – 10 мкм (1), - 20мкм (2), – завершения первого диффузионного этапа.

40 мкм (3), - 50 мкм (4).

В результате деструкции лекарственное вещество в течение последних 10 - 14 сут.

высвобождается линейно. Для доказательства деструкции пленочных систем из ПГБ с введенными в полимер ЛВ проводили эксперимент по измерению убыли массы образцов с течением времени. Измеряли потерю массы образца в результате деструкции матрицы ПГБ с включенным в полимер дипиридамолом in vitro. Результаты эксперимента представлены на рисунке 3. Общая потеря массы образца включает изменение массы за счет высвобождения ЛВ и за счет деструктивных процессов макромолекул ПГБ. Поэтому из общей массы, образца ПГБ (Mt), подвергнутого гидролитической деструкции вычитали массу ЛВ (Gt), высвободившегося из полимера в окружающую среду. Таким образом, с целью анализа кинетики высвобождения вычитали линейный вклад гидролитической деструкции из общих текущих значений количества высвобожденного вещества, представленных на рисунках 1 и 2.

Результаты, представленные на рисунке 3 показывают, что деструкция полимера, также протекает по линейному закону. Кроме того, скорость деструкции возрастает с увеличением концентрации ЛВ вещества в полимере. Пленка ПГБ без включения ЛВ вообще не подвергается деструкции в течение срока испытаний (до 40 дней).

Полученные данные значительно отличаются от результатов экспериментов по деградации полимерных систем из других биоразлагаемых полимеров – полилактидов и полигликолидов. Для полимерных матриц из этих полимеров даже без включения ЛВ наблюдалась потеря веса до 60% в течение 4 недель (Gogolewski et al., 1993;

Taddei et al., 2001;

Taddei et al., 2002;

Loo, Sudesh, 2007).

Результаты других работ по деградации Рисунок 3. Относительная потеря массы ПГБ в процессе высвобождения дипиридамола из пленок образцов из ПГБ хорошо согласуются с ПГБ с различной массовой долей ЛВ ( – 1%, – 10%, - 30%) в 0.025М калий-фосфатном буфере полученными нами данными и также при 37°С.

подтверждают значительно меньшую степень деградации ПГБ по сравнению с полактидом – потеря массы образцов из ПГБ в течение 6 месяцев составляла не более 2% (Correa et al., 2008).

Таким образом, ПГБ менее подвержен гидролитической деструкции по сравнению с полилактидами и полигликолидами, а высвобождение ЛВ из ПГБ в большей степени определяется диффузионными процессами. Тем не менее, возможность контролировать скорость биодеструкции лекарственных пленочных систем из ПГБ является важным условием для их использования, особенно для пленок с большой массовой долей ЛВ.

1.2. Зависимость кинетики высвобождения ЛВ от различных параметров пленочных систем ПГБ.

В работе исследовали скорость высвобождения ЛВ из пленочных систем ПГБ в зависимости от ряда параметров: от молекулярной массы ПГБ, толщины пленки из ПГБ, от массовой доли включенного в полимер ЛВ, а также от природы самого ЛВ.

Молекулярная масса. Исследование зависимости кинетики высвобождения от молекулярной массы ПГБ проводили на пленочных системах из ПГБ с молекулярной массой 320, 450, 1010 и 1540 кДа. На рисунке 4 представлена зависимость количества ДП, высвобожденного из пленок одинаковой толщины с одинаковым процентом включения ЛВ, от молекулярной массы ПГБ. Эти данные наглядно демонстрируют, что молекулярная масса полимера оказывает значительное влияние на кинетику высвобождения дипиридамола.

На основании представленных на рисунке 4 данных можно видеть, что для полимерных лекарственных систем на основе ПГБ при низкой Выведение дипиридамола, % или высокой молекулярной массе полимера высвобождение ЛВ проходит равномерно и длительно, тогда как при средних значениях ММ высвобождение ЛВ происходит интенсивно в ранний период времени и сравнительно быстро 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Время, сут.

ДП, 3.3%, 40 мкм, 320 кДа ДП, 3.3%, 40 мкм, 450 кДа заканчивается. Полученные ДП, 3.3%, 40 мкм, 1010 кДа ДП, 3.3%, 40 мкм, 1540 кДа результаты несколько расходятся с Рисунок 4. Кинетика высвобождения дипиридамола из пленок ПГБ различной молекулярной массы: 320, 450, аналогичными данными 1010 и 1540 кДа (график приведен к 100%).

высвобождения для полилактидов и их сополимеров с полигликолидами, для которых наблюдалось увеличение скорости высвобождения с уменьшением молекулярной массы полимера (Zidan et al., 2006).

Известно также, что ПГБ с низкой ММ подвергается и деградации in vitro в большей мере, чем полимер с высокой ММ (Kosea et al., 2005). По всей видимости, более четкая зависимость скорости высвобождения от ММ этих полимеров по сравнению с ПГБ обусловлена тем, что ПГБ более устойчив к гидролитической деструкции. Зависимость скорости высвобождения от ММ полимера демонстрирует влияние концевых групп ПГБ, как функциональных групп, которые, с одной стороны, взаимодействуют с мобильными молекулами ЛВ, и, следовательно, замедляют их диффузию, а, с другой стороны, разрыхляют структуру ПГБ, т.е. мешают образованию совершенной структуры биополимера (Iordanskii et al., 1994;

Liggins, Burt, 2001).

Таким образом, варьирование молекулярной массы биополимера при изготовлении пленочных систем на основе ПГБ с включением ЛВ является важнейшим инструментом регуляции характера и скорости их высвобождения.

Толщина пленок. Влияние толщины пленочной системы на кинетический профиль высвобождения ЛВ из полимерной матрицы изучали на пленках различной толщины, изготовленных из ПГБ одинаковой молекулярной массы с одинаковым содержанием дипиридамола (рисунок 5).

На представленном рисунке наблюдается следующая зависимость: скорость Выведение дипиридамола, % высвобождения на начальном этапе тем выше, чем меньше толщина пленки из ПГБ, и, наоборот, высвобождение становится более равномерным с увеличением толщины полимерной матрицы.

Такая же зависимость наблюдалась при высвобождении иприфлавона 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Время, сут.

ДП, 10%, 10 мкм, 300 кДа ДП, 10%, 20 мкм, 300 кДа из пленок на основе хитозана, ДП, 10%, 40 мкм, 300 кДа высвобождения покрытых ПГБ и полигликолидом Рисунок 5. Кинетические кривые дипиридамола из пленок ПГБ различной толщины: 10, 20 и (Perugini et al., мкм (график приведен к 100%).

2003;

Cao et al., 2005), а также при исследовании выведения паклитаксела из пленок на основе сополимеров лактидов и гликолидов (Jackson et al., 2004).

Массовая доля ЛВ. На следующем этапе исследовали влияние массовой доли вводимого в полимер ЛВ на характер его высвобождения (рисунок 6). Из данных, представленных на рисунке, видно, что при снижении массовой доли ЛВ в матрице ПГБ высвобождение ЛВ происходит быстрее и менее равномерно.

Результаты, полученные нами для матриц из ПГБ, согласуются с аналогичными результатами при Выведение дипиридамола, % исследовании высвобождения этакриновой кислоты и паклитаксела из пленочных систем на основе полилактида (Wang et al., 2004;

Jackson et al., 2004). Однако в случае ПГБ, влияние массовой доли ЛВ в полимерной матрице на кинетический профиль 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Время, сут.

ДП, 3.3%, 40 мкм, 300 кДа ДП, 10%, 40 мкм, 300 кДа высвобождения ЛВ менее ДП, 30%, 42 мкм, 300 кДа Рисунок 6. Кинетические кривые высвобождения очевидно. По всей видимости, это дипиридамола из пленок ПГБ с различным содержанием объясняется меньшей степенью ЛВ: 3.3%, 10% и 30%.

связывания молекул ЛВ с полимерной матрицей ПГБ.

Таким образом, варьирование толщины пленки и массовой доли ЛВ в матрице ПГБ дает возможность создания такой ПСКВ, которая позволит обеспечить оптимальную скорость высвобождения ЛВ для поддержания его необходимой концентрации в организме.

Химическая природа ЛВ. Известно, что скорость высвобождения ЛВ подвижностью полимерных сегментов, морфологией ПГБ и интенсивностью взаимодействия лекарственного вещества с функциональными (сложноэфирными) группами полимера. При прочих равных условиях, т.е. при одинаковой толщине образца и концентрации ЛВ скорость высвобождения будет зависеть от степени связывания молекул ЛВ с полимером, которая может определяться различными факторами, в том числе, ММ ЛВ. На рисунке 7 показаны кривые высвобождения различных ЛВ из пленок ПГБ. Видно, что чем выше молекулярная масса ЛВ, тем медленнее и равномернее высвобождается оно из полимерной матрицы. Отклонение от этой картины для некоторых ЛВ, вероятно, связано с наличием полярных и гидрофобных групп в их структуре.

Для объяснения природы связывания ЛВ с полимерной основой был проведен анализ ИК спектров пленок из ПГБ с включением этих препаратов.

ИК спектроскопия подтвердила предположение, что связывание ЛВ с Высвобождение ЛВ (M t), % ПГБ, вероятнее всего, помимо гидрофобного взаимодействия неполярных групп ЛВ с цепочкой ПГБ происходит путем образования водородных связей между Время, сут.

функциональными группами 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 лекарственных соединений с дипиридамол (ММ = 505 г/моль) индометацин (ММ = 358 г/моль) левофлоксацин (ММ = 361 г/моль) метрониданол (ММ = 151 г/моль) карбонильными и гидроксильными флурбипрофен (ММ = 244 г/моль) рифампицин (ММ = 823 г/моль) группами ПГБ, что должно приводить к Рисунок 7. Кинетические кривые высвобождения ЛВ различной химической природы из пленок ПГБ (ММ смещению сигналов последних в более ПГБ – 450 кДа, толщина – 40 мкм, 10% ЛВ) (график приведен к 100%). слабую область спектра.

Так, например, сравнение спектра пленки ПГБ со спектром пленки с включением дипиридамола показало наличие водородных связей между полимером и ЛВ (рисунок 8). Полоса 1531 см-1 – указывает на присутствие ДП в образце ПГБ-ДП, а широкая полоса 3200-3400 см-1 свидетельствует Рисунок 8. Сравнение ИК спектров ПГБ (пунктирная о наличии сильной ассоциации между линия) и ПГБ-дипиридамол (сплошная линия) –ОН группами.

Для остальных лекарственных соединений ИК спектроскопия также показала смещение сигналов гидроксильных групп ПГБ в слабую область, что подтверждает наличие водородных связей. Образование водородных связей между ПГБ и включаемыми в матрицу полимера веществами отмечено и другими исследователями для индометацина, диклофенака и ибупрофена при их введении в сополимер гидроксибутирата и гидроксивалерата (Poletto et al., 2007;

Wang et al., 2007).

Если говорить о влиянии молекулярной массы полимера-носителя на связывание ЛВ, то очевидно, что при низких значениях ММ ПГБ количество концевых гидроксильных групп, участвующих в водородных связях, велико, что должно влиять на более сильное удерживание ЛВ в матрице полимера. Как показывает рисунок 4, при низких значениях ММ скорость высвобождения ЛВ, относительно невелика. По мере увеличения ММ ПГБ количество концевых гидроксильных групп уменьшается, и удерживание ЛВ за счет водородных связей ослабевает. Однако при высоких значениях ММ ПГБ снова наблюдается уменьшение скорости высвобождения ЛВ. Это, по всей видимости, объясняется тем, что для высокомолекулярного ПГБ при связывании ЛВ уже играют роль гидрофобные взаимодействия. Длина цепи ПГБ велика и концевые гидроксильные группы экранированы основными звеньями полимера, что выражается в преобладании гидрофобных связей над водородными.

Резюмируя, можно сказать, что путем варьирования таких параметров как молекулярная масса ПГБ, толщина пленки, массовая доля ЛВ, а также учитывая химическое строение ЛВ, можно получать оптимальные кинетические характеристики пленочных ПСКВ.

2. Исследование контролируемого высвобождения лекарственных веществ из микросферных систем.

2.1. Факторы, влияющие на размер микросфер из ПГБ с инкапсулированными ЛВ.

Для получения микросфер из ПГБ применяли метод прямого (одноэтапного) эмульгирования (Kassab et al., 1997), адаптированный под используемый полимер и инкапсулируемые соединения.

Метод заключается в создании стабильной эмульсии раствора ПГБ и ЛВ во внешней фазе с последующим удалением растворителя и выделением Рисунок 9. Микрофотографии микросфер из ПГБ образовавшихся твердых микросфер.

диаметром 92±13 мкм (а), 63±7 мкм (б), 19±3 мкм Эксперименты, как и в случае с (в), 4±2 мкм (г) в исходном состоянии, содержащие 5% дипиридамола, полученные методом пленочными системами, проводили с одноэтапного эмульгирования (световой микроскоп).

использованием антитромбогенного лекарственного препарата дипиридамола. ДП входит в класс соединений - ингибиторов пролиферации клеток. Эти вещества являются одним из перспективных классов препаратов при лечении сердечно сосудистых и онкологических заболеваний. Кроме того, ДП оказался очень удобным модельным соединением для исследования систем контролируемого высвобождения на основе микросфер. Изменяя условия эксперимента (таблица 1), удалось получить микросферы из ПГБ с ДП, в широком диапазоне диаметров – от 4 до 92 мкм. На световых микрофотографиях (рисунок 9), а также на микрофотографиях, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (рисунок 10) можно видеть что, микросферы имеют правильную сферическую форму, без видимых кристаллических включений инкапсулированного ДП. Поверхность микросфер не является гладкой, имеются некоторые неровности и углубления, связанные с включением в полимерную матрицу лекарственного препарата.

Рисунок 10. Микрофотографии микросфер из ПГБ с инкапсулированным дипиридамолом, полученные методом одноэтапного эмульгирования (сканирующий электронный микроскоп).

Таблица 1. Условия получения микросфер различного диаметра на основе поли(3 гидроксибутирата), загруженных определенным количеством дипиридамола.

Масса ДП Масса Объем Концент- Скорость Содержа № Диаметр в ПГБ в раство- рация переме- ние ДП в об- микросфер растворе, раство- рителя, ПВС, шивания, микросфе разца мкм ± СО мг ре, мг мл % мас. об/мин рах, % мас.

1 24 96 8 1.2 2000 3.6 ± 2.4 4.8 ± 0. 2 24 96 9 0.6 1000 18.7 ± 2.9 5.2 ± 0. 3 24 96 5 0.4 600 62.7 ± 6.6 4.9 ± 0. 4 47 100 4 0.6 500 91.7 ± 15.4 11.0 ± 0. 5 12.5 50 6 1.2 20000 0.55 ± 0.33 4.0 ± 0. Как видно из таблицы 1, наиболее значимым фактором, ответственным за размеры микросфер, является скорость перемешивания эмульсии. Чем выше скорость, тем меньше размер получаемых микросфер. С увеличением концентрации поливинилового спирта увеличивается стабильность эмульсии, что также вызывает уменьшение размера микросфер. Объем внешней водной фазы эмульсии тоже оказывает заметное влияние на размер микросфер. С увеличением объема внешней фазы капли внутренней фазы меньше дробятся, в результате, средний диаметр микросфер увеличивается. Концентрация раствора ПГБ является еще одним фактором, влияющим на размер полимерных микросфер. С увеличением концентрации полимера, возрастает вязкость и плотность внутренней фазы эмульсии и увеличивается размер образовавшихся микросфер.

Таким же способом были получены микросферы диаметром ~ 60 мкм с инкапсулированными рифампицином, индометацином и левофлоксацином. Условия эксперимента соответствуют условиям получения микросфер аналогичного диаметра, загруженных дипиридамолом.

Принимая во внимание все эти факторы, помимо относительно крупных микроразмерных сферических частиц нам удалось получить более мелкие – наносферы со средним диаметром менее 550 нм. (рисунок 11) Рисунок 11. Микрофотографии наносфер из ПГБ с инкапсулированным дипиридамолом, (световой микроскоп – слева, сканирующий электронный микроскоп – справа).

Таким образом, изменяя скорость перемешивания эмульсии, концентрацию эмульгатора, объем внешней фазы эмульсии и концентрацию раствора ПГБ, можно получать сферические микрочастицы в широком размерном диапазоне.

2.2. Влияние размера микросфер на кинетику контролируемого высвобождения лекарственных веществ in vitro.

Предполагая, что зависимости кинетики высвобождения ЛВ от молекулярной массы полимера и массовой доли ЛВ, полученные для пленочных систем, применимы для всех типов ПСКВ, мы сосредоточились на исследовании влияния размера микросфер на скорость высвобождения, ввиду того, что площадь поверхности сферических объектов сильно отличается от площади поверхности пленок.

Кинетические профили высвобождения ДП в 0.025М калий-фосфатном буфере из полученных ранее партий микросфер различного размера – 4, 19, 63, 92 мкм представлены на рисунке 12. Из данных, представленных на рисунке, кинетические кривые 3 и 4, принадлежащие микросферам большего диаметра 63 и 92 мкм, соответственно, имеют два характерных участка: быстрое выделение ЛВ при относительно малых временах и хорошо выраженный и протяженный линейный участок, соответствующий кинетике высвобождения нулевого порядка. При завершении высвобождения из микросфер диаметром 63 мкм при больших временах (более 48 часов) наблюдается некоторое изменение угла наклона кинетического профиля. Для микросфер относительно меньшего диаметра - 19 мкм (кривая 2) также можно отметить небольшой линейный участок в интервале 6-21 часов, а для самых маленьких 4-х микронных объектов такой участок трудно выделить (кривая 1).

Рисунок 12. Кинетические кривые высвобождения дипиридамола (массовая доля 5%) из микросфер на основе ПГБ различного диаметра (1 – 4 мкм, – 19 мкм, 3 – 63 мкм и 4 – мкм), помещенных в 0.025М калий-фосфатном буфере при °С. A – общий вид кинетических кривых высвобождения;

В – начальный участок кривых 1 и 2.

Прямыми линиями отмечены линейные участки кинетических кривых 3 и 4.

Качественно аналогичная по виду картина высвобождения наблюдалась и хорошо была описана для микросфер на основе сополимера лактида и гликолида с 5 фторурацилом (Siepmann, Siepmann, 2006). Отличие состояло в том, что наряду с вышеописанными двумя стадиями высвобождения, линейной и нелинейной, в системе “полимер – 5-фторурацил” наблюдался третий временной участок, где на завершающей стадии кинетики высвобождения наблюдался резкий выброс ЛВ.

В предыдущих экспериментах, описывающих кинетические профили высвобождения ДП из пленок ПГБ, также наблюдаются две аналогичных стадии высвобождения ЛВ. Это и неудивительно, т.к. толщины пленок ПГБ (10, 20 и 40 мкм) близки к диаметру исследуемых в настоящем эксперименте микросфер.

Кроме микросфер диаметром 4-92 мкм, исследовали контролируемое высвобождение ДП из частиц размером менее 550 нм. Кинетический профиль высвобождения ДП из сфер, свойства которых приближаются к свойствам нанообъектов, представлен на рисунке 13. Из представленных данных видно, скорость высвобождения ЛВ из наносфер практически линейна. То есть для достаточно малых объектов наблюдается только первая стадия быстрого высвобождения, последующая же стадия с длительным выделением инкапсулированного вещества отсутствует.

Полное высвобождение ДП в этом случае осуществляется, менее чем за 9 часов. Если сравнивать результаты исследования кинетики высвобождения дипиридамола из самых маленьких по размеру частиц с литературными данными, то можно заметить, что в нашем случае высвобождение 100, осуществлялось с большей скоростью.

90, 80, Например, выведение паклитаксела из 70, В ы х о д, % 60, наносфер на основе полилактида 50, 40, происходило в течение 7 дней (Lanza et 30, 20, al., 2002). Такое различие можно 10, 0, объяснить отличиями в используемых 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10, полимерах и ЛВ (в случае использования В ремя, час Рисунок 13. Кинетика высвобождения дипиридамола дипиридамола поверхность частиц (4% масс.) из микросфер на основе ПГБ различного получалась не диаметра диаметром менее 550 нм in vitro.

ровной, что увеличивало поверхность, с которой происходило высвобождение ЛВ) а также тем, что паклитаксел гораздо более гидрофобное ЛВ, чем ДП.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что имеется определенный минимальный критический размер сферических частиц, меньше которого начальная стадия высвобождения ЛВ преобладает настолько, что инкапсулированное вещество полностью выводится уже на первом этапе.

2.3. Механизм высвобождения лекарственных веществ из полимерных микросфер.

В настоящее время общепринятым является установленный факт, что при контролируемом высвобождении ЛВ из микросфер доминируют диффузионные процессы (Brannon-Peppas, 1997;

Faisant et al., 2006). Они протекают, прежде всего, потому, что в многокомпонентной системе, а именно такой является микрочастица, содержащая ЛВ, воду, низкомолекулярные компоненты калий-фосфатного буфера (in vitro) или компоненты биологических сред (in vivo), возникают градиенты химических потенциалов вышеуказанных компонентов.

После некоторых преобразований диффузионно-кинетического уравнения, описывающего высвобождение ЛВ из сферических объектов, его можно представить двумя уравнениями, соответствующими двум этапам высвобождения.

При относительно малых временах на начальном участке кинетической кривой десорбции, т.е. при условии Мt/M 0.5 – 0.6, в качестве решения диффузионно кинетического уравнения справедлива аппроксимация Mt/M = 6[(D·t/2R2)0.5], (1) Для относительно больших времен экспозиции микросфер в 0.025М калий фосфатном буфере, а точнее при выполнении условия Мt/M 0.5, решение диффузионно-кинетического уравнения имеет другой вид Mt/M = 1 – (6/ 2)·exp[-D 2t/R2] (2) Здесь Mt, M – кумулятивная масса ЛВ, десорбированного из микросфер в момент времени t и при бесконечном времени (t);

R – средний радиус микросферы, D – коэффициент диффузии.

Графическое решение уравнений (1) и (2) в координатах (Mt/M) – t0.5 и полулогарифмических координатах ln(1-Mt/M) – t соответственно, позволяет количественно определить значения коэффициента диффузии в полимерной фазе.

Так, коэффицианты диффузии будут определяться соотношениями:

D = 2R2·(tg)2/36, (3) D = tg·R2/ 2, (4) где tg и tg – тангенс угла наклона прямолинейного участка кинетической кривой в координатах (Mt/M) – (t)0.5 и ln(1-Mt/M) – t соответственно.

Таблица 2. Коэффициенты диффузии дипиридамола в микросферах на основе ПГБ, определяющие диффузионную стадию высвобождения, рассчитанные по уравнениям 3 и 4.

Диаметр микросферы Коэффициент диффузии Коэффициент диффузии х 103, см х1011, см2/сек (уравн.3) х1011, см2/сек (уравн.4) 0.40 0.10 0. 1.9 1.5 2. 6.3 2.8 2. 9.2 21.1 Таблица 2 показывает близость значений коэффициентов диффузии, рассчитанных для разных участков диффузионных кривых, и тем самым свидетельствует о классическом диффузионном механизме, определяющим кинетику первой стадии профиля высвобождения. Как и в работе (Witt, Kissel, 2001) для исследуемой системы ПГБ-ДП наблюдается четкая зависимость коэффициентов диффузии от радиуса микрочастиц.

Одновременно с диффузией наблюдается линейная кинетика выхода дипиридамола (Рисунок 12). Тангенсы наклона линейных участков, относящихся к различным диаметрам частиц, близки и соответствуют константе гидролитической деструкции ПГБ. Скорость гидролитического процесса деструкции ПГБ по уравнению нулевого порядка не зависит от размера образца, что и наблюдается на приведенном рисунке.

Таким образом, полученное математическое описание механизма высвобождения ЛВ из микросфер на основе ПГБ позволяет моделировать частицы с характеристиками, подходящими для поддержания необходимой концентрации ЛВ при контролируемом высвобождении в организме.

2.4. Исследование деградации микросфер из ПГБ с инкапсулированным ЛВ in vitro.

Одновременно с изучением кинетики высвобождения ЛВ из полимерной матрицы in vitro, мы изучали изменение морфологии микросфер с инкапсулированными ЛВ при гидролитической деструкции.

Представленные на рисунке 14, микрофотографии убедительно демонстрируют постепенную гидролитическую деструкцию микросфер из ПГБ с инкапсулированным ДП in vitro в течение 25 сут. Если же сравнивать полученные результаты с деструкцией Рисунок 14. Гидролитическая деградация микросфер из ПГБ диаметром 60 мкм с инкапсулированным микрочастиц на основе других дипиридамолом на 1 (а), 5 (б), 12 (в), 17 (г), 20 (д), (е) сутки инкубации в 0.025М калий-фосфатном биополимеров (полилактиды, буфере (рН = 7.4) при 37 °С.

полигликолиды), то деградация микросфер из ПГБ происходит в значительно меньшей степени. У более гидролитически лабильных полимеров появляется стадия быстрой деградации полимера, потерявшего свою механическую стабильность (Wada et al., 1995;

Husmann et al., 2002;

Faisant et al., 2006).

2.5. Влияние природы инкапсулируемых веществ на кинетику контролируемого высвобождения лекарственных веществ in vitro.

На следующем этапе работы были получены микросферы, содержащие до 5% различных по химической природе и фармакологическому действию лекарственных препаратов, со средним диаметром около 60 мкм. Как и в экспериментах с пленками из ПГБ, для сравнения кинетики высвобождения соединений разной природы были получены микросферы с антитромбогенным препаратом дипиридамолом, противотуберкулезным препаратом рифампицином, противовоспалительным препаратом индометацином, антибиотиком левофлоксацином. Результаты исследования кинетики контролируемого высвобождения in vitro, показали аналогичную для всех ЛВ картину (рисунок 15).

Схожесть кинетической картины для разных по природе ЛВ еще раз подтверждает, что на раннем этапе доминирует диффузионный процесс высвобождения, когда скорость выхода ЛВ нелинейная и весьма высокая;

последний участок кинетического профиля связан с деструкцией макромолекул полимерного носителя, что отражает линейный характер этого участка. Основным различием в картинах высвобождения ЛВ из микросферных систем по сравнению с пленками, является способность 100, микрочастиц полностью 90, высвобождать ЛВ. Таким 80, Ку му л ятив ны й в ы х од Б А В, % 70, образом, это свойство 60, микросфер является их 50, несомненным 40, 30, преимуществом для 20, использования в качестве 10, В р емя, с у т лекарственной формы, 0, 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25, так как позволяет более Дипиридамол Р иф ампицин Лев оф л окс ацин Индамет ацин точно рассчитывать дозу Рисунок 15. Кинетические кривые высвобождения ЛВ различной химической природы из микросфер ПГБ (средний диаметр – 60 мкм, ЛВ и планировать 4.5% дипиридамола, 5.1% рифампицина, 4.9% левофлоксацина, 5.2% методику лечения.

индометацина).

2.6. Исследование контролируемого высвобождения лекарственных веществ из полимерных микросфер in vivo.

Заключительный этап работы состоял в исследовании контролируемого высвобождения ЛВ in vivo. Целью эксперимента являлось доказательство возможности поддержания постоянной локальной концентрации ЛВ в организме в течение продолжительного времени при использовании в качестве носителя препарата микросфер из ПГБ. Для этого делали инъекцию микросфер, содержащих 10 % дипиридамола, в бедренную мышцу лабораторной крысы и измеряли содержание ЛВ в мышце через 3, 7, 14, 21 суток. Результаты эксперимента представлены на рисунке 16.

При использовании контрольного раствора дипиридамола локальная концентрация ЛВ в начале эксперимента была максимальной – 150 мкг/г мышцы, через сутки уже становилась равной примерно 1.5 мкг/г мышцы. На 3 сутки эксперимента содержания дипиридамола в мышце не наблюдалось.

Совершенно иная картина наблюдалась при использовании микросфер с инкапсулированным дипиридамолом. Постепенно возрастая, концентрация ЛВ в мышце на 1 сутки эксперимента достигала примерно 1 мкг/мг мышцы и оставалась почти постоянной на всем протяжении Рисунок 16. Локальная концентрация дипиридамола в мышце измерений (в течение крысы при использовании микросфер из ПГБ (средний диаметр – 10%) и контрольного раствора месяца).

50 мкм, содержание ЛВ дипиридамола.

Таким образом, на основании полученных нами результатов in vivo можно сделать вывод о возможности использования микросфер из ПГБ, с инкапсулированными ЛВ, для поддержания их определенной постоянной концентрации в организме.

ВЫВОДЫ 1. Впервые разработаны и исследованы пленочные системы контролируемого высвобождения на основе ПГБ разной молекулярной массы с включением различных лекарственных веществ (противотуберкулезного препарата рифампицина, антитромбогенного препарата дипиридамола, антибиотиков левофлоксацина и метронидазола, противовоспалительных веществ индометацина и флурбипрофена).

2. Разработан эффективный способ получения микросфер различного размера (от нм до 100 и более микрометров) из ПГБ разной молекулярной массы, в том числе с включением тех же лекарственных соединений, что и в пленочные системы.

3. На основании анализа кинетики высвобождения ЛВ из полученных пленочных систем и микросфер in vitro, установлено, что скорость этого процесса возрастает при уменьшении диаметра микрочастиц и толщины пленок, увеличении массовой доли лекарственного вещества в микросферах или пленках, уменьшении степени химического связывания инкапсулированных соединений с полимерной матрицей, а также максимальна при средних значениях молекулярной массы ПГБ.

4. Показано, что высвобождение лекарственных соединений из биополимерных систем на основе ПГБ осуществляется по диффузионному и деструкционному механизмам – при этом, на начальной стадии преобладают диффузионные процессы, а на конечном этапе – деструкция полимерной матрицы.

5. Анализ кинетики высвобождения инкапсулированных веществ in vivo показал возможность использования систем контролируемого высвобождения на основе ПГБ для поддержания постоянной локальной концентрации ЛВ в течение длительного времени (месяц и более) в сравнении с традиционной лекарственной формой (до 3-х суток), что открывает перспективы использования таких систем в качестве пролонгированной лекарственной формы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Бонарцева Г.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Лучинина Е.С., Лившиц В.А., Босхомджиев А.П., Маркин В.С., Иорданский А.Л. Новые полимерные системы для контролируемого высвобождения дипиридамола и индометацина// Прикл.

биохимия и микробиология, 2006, т. 42, № 6, с. 710-715;

2. Bonartsev A.P., Myshkina V.L., Nikolaeva D.A., Furina E.K., Makhina T.A., Livshits V.A., Boskhomdzhiev A.P., Ivanov E.A., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Biosynthesis, biodegradation, and application of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers - natural polyesters produced by diazotrophic bacteria// Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, Ed: A. Mndez-Vilas, Formatex, Spain, 2007, v. 1, p. 295-307;

3. Bonartsev A.P., Livshits V.A., Makhina T.A., Myshkina V.L., Bonartseva G.A., Iordanskii A.L. Controlled release profiles of dipyridamole from biodegradable microspheres on the base of poly(3-hydroxybutyrate)// eXPRESS Polymer Letters, 2007, v. 1, № 12, p. 797-803.

4. Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л., Иванов Е.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Бонарцева Г.А. Микросферы из поли-3-гидроксибутирата для пролонгированного высвобождения лекарственных веществ// Высокомолек. соед.

(Серия Б), 2009, т. 51, № 7, с. 1243-1251.

Тезисы докладов:

1. Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Мышкина В.Л., Махина Т.К., Бонарцева Г.А.

Системы контролируемого высвобождения дипиридамола на основе микросфер из поли (-гидроксибутирата)// Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, с. 60;

2. Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Босхомджиев А.П., Лившиц В.А., Иванов Е.А., Постников А.Б., Николаева Д.А., Воинова В.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А., Медведева Н.А. Создание модельных и лекарственных полимерных систем на основе поли-3-оксибутирата// Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апр. 2007, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, т.1, с.19-20;

3. Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Мышкина В.Л., Махина Т.К., Бонарцева Г.А..

Биоразлагаемые микросферы из поли(-гидроксибутирата) – системы контролируемого высвобождения дипиридамола// Третья Санкт-Петербургская конференция молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах».

Тезисы докладов, 17-19 апреля 2007, Санкт-Петербург, с. 331;

4. Bonartsev A., Postnikov A., Mahina T., Myshkina V., Boskhomdzhiev A., Livshits V., Ivanov E., Voinova V., Nikolaeva D., Medvedeva N., Bonartseva G., Iorganskii A. A new model of prolonged local nitric oxide action on different blood vessels in vivo on basis of poly(3-hydroxybutyrate)// Book of abstracts of 17th European Meeting of Hypertension, June 15-19, 2007, Milan, Italy, p. 138;

5. Bonartsev A.P., Postnikov A.B., Mahina T.K., Myshkina V.L., Voinova V.V., Boskhomdzhiev A.P., Livshits V.A., Bonartseva G.A., Iorganskii A.L. A new in vivo model of prolonged local nitric oxide action on arteries on basis of biocompatible polymer// J. Clinical Hypertension, 2007, Suppl. A., v. 9, № 5, p. A152;

6. Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Мышкина В.Л., Махина Т.К., Бонарцева Г.А.

Исследование контролируемого высвобождения дипиридамола из биоразлагаемых микросфер на основе поли(-гидроксибутирата)// XII Всероссийская научно практическая конференция «Молодые ученые в медицине». Тезисы докладов, 25- апреля 2007, Казань: Отечество, с. 7. Livshits V., Bonartseva G., Bonartsev A., Makhina T., Myshkina V. Poly(3 hydroxybutyrate)-based biodegradable microspheres for controlled release of incapsulated dipyridamole// The young scientists’ and student’ international scientific conference «Modern problems of microbiology and biotechnology». Book of abstracts, 28-31, May 2007, Odessa, Ukraine, p.136;

8. Livshits V.A., Bonartsev A.P., Makhina T.K., Myshkina V.L., Bonartseva G.A.

Biodegradable micro- and nanospheres on the base of poly(3-hydroxybutyrate) for controlled release of incapsulated medicinal productd// Abstracts of VI Open Ukrainian Conference of Young Scientists on Polymer Science, September 30 - October 3, 2008, Kyiv, Ukraine, p. 123.

9. Livshits V.A., Ivanov E.A., Bonartsev A.P., Boskhomdzhiev A.P., Mahina T.K., Myshkina V.L., Voinova V.V., Iordanskii A.L., Bonartseva G.A. Microspheres, nanospheres and membranes on the base of biocompatible and biodegradable polymer, poly(3-hydroxybutyrate), loaded with antiproliferative and antihypertensive drugs// J. Clinical Hypertension, 2008, Suppl. A, v. 10, № 5, p. A2.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БАС – биологически активное соединение ДП – дипиридамол ИМ - индометацин ЛВ – лекарственное вещество ММ – молекулярная масса ПВС – поливиниловый спирт ПГБ – поли(3-гидроксибутират) ПСКВ – полимерная система контролируемого высвобождения