Накопление меди и марганца в клетках цианобактерии spirulina platensis
На правах рукописи
ЧЕРНИКОВА Анна Александровна
НАКОПЛЕНИЕ МЕДИ И МАРГАНЦА
В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИИ
SPIRULINA PLATENSIS
03.00.12 – Физиология и биохимия растений
АВТОРЕФЕРАТ
ДИССЕРТАЦИИ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва -2009
Работа выполнена в Лаборатории управляемого фотобиосинтеза
Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им.
К.А. Тимирязева РАН, г. Москва НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук, профессор Пронина Наталия Александровна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор Тамбиев Александр Хапачевич кандидат биологических наук Серегин Илья Владимирович ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт фундаментальных проблем биологии РАН
Защита состоится 30 июня 2009 г. в 14 ч. 30 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им.
К.А. Тимирязева РАН по адресу:
127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977-80- e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.
Автореферат разослан «26» мая 2009 г.
Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат биологических наук М. И. Азаркович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) становится все более актуальной. Металлы представляют серьезную угрозу для биоты вследствие острой токсичности и постепенного накопления в окружающей среде до опасного значения.
В последние годы экологи наряду с оценкой уровня загрязнений и определения их источников всё больше обращают внимание на выявление «судьбы» попавших в природную среду веществ, их превращений и взаимодействий с живыми организмами. Удобным объектом для таких исследований служат цианобактерии, которые способны накапливать в высоких концентрациях многие элементы и переводить их в нетоксичную форму, что в настоящее время широко применяется в целях биоремедиации - для очистки водных стоков (Жубанова & Заядан, 2004;
do Nascimento & Xing, 2006;
Saeed & Iqbal, 2006).
Поскольку процесс поступления металлов в окружающую среду является неизбежным по мере интенсификации промышленности и сельского хозяйства, следует признать актуальным вопрос прогнозирования развития водных биоценозов в условиях загрязнения водной среды. В этой связи возникает необходимость исследований устойчивости широкого круга микроорганизмов к различным химическим элементам.
Металлы, как главные природные ресурсы, образуют группу опасных загрязнителей среды, и, в то же время, они являются необходимой частью ферментативных систем живых организмов (Babula et al., 2008). Физиологическая роль меди и марганца, а также их фитотоксичность (в высоких концентрациях) определяют важность изучения закономерностей их накопления и распределения у разных видов растений и цианобактерий.
Цианобактерия Spirulina platensis широко распространена в природе и является перспективным объектом биотехнологии благодаря богатству белкового состава, наличию витаминов и высших жирных кислот (Richmond, 1986;
Mosulishvini et al.
2002;
Тамбиев и др., 2006). Пластичность метаболизма S. platensis позволяет получать биомассу, обогащенную необходимыми элементами, путем направленного изменения условий культивирования, что используется при создании биологически активных добавок (Мазо и др., 2004;
Попова и др., 2006;
Кравченко и др., 2008). Для понимания физиологических механизмов адаптации цианобактерий к действию ТМ и оптимизации условий культивирования с целью получения биомассы, обогащенной эссенциальными микроэлементами, представляется важным выявить специфику накопления и токсического действия ионов Cu и Mn в клетках цианобактерии Spirulina platensis.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование возможности адаптации Spirulina platensis к действию ионов меди и марганца, а также способности клеток к накоплению металлов для получения биомассы, обогащенной этими элементами.
В связи с этим были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить влияние меди и марганца на рост S. platensis, определить оптимальные и летальные концентрации этих элементов.
2. Исследовать влияние меди и марганца на ультраструктурную организацию клеток S. platensis.
3. Изучить динамику накопления Cu и Mn в клетках S. platensis.
4. Исследовать влияние света на накопление Cu и Mn.
5. Исследовать включение Cu и Mn в состав клеточных компонентов.
6. Идентифицировать металлсвязывающие внутриклеточные компоненты.
Научная новизна. Показана высокая степень устойчивости S. platensis к ионам меди и марганца на различных стадиях роста культуры. Впервые показано, что цианобактерия способна восстанавливать Cu2+ до Cu+ и переводить ТМ в недоступную для клетки форму. Впервые показано, что Cu и Mn накапливаются в клетках в основном в составе низкомолекулярных белков, которые по ряду характеристик могут быть отнесены к фитохелатинам или металлотионеинам.
Впервые показано влияние света на накопление Cu и Mn. Показано влияние меди и марганца на изменение ультраструктурной организации клетки.
Практическая значимость. Полученные в работе данные об особенностях накопления меди и марганца имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптационных процессов и механизмов устойчивости цианобактерий к действию ТМ. Полученные результаты позволяют рекомендовать использование цианобактерии S. platensis для биоремедиации промышленных стоков и городских водоемов от тяжелых металлов, а также могут быть использованы в биотехнологии для получения биомассы обогащенной Cu и Mn при производстве биологически активных добавок к пище человека и животных (патент РФ № 2277124).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме «Molecular genetics and biotechnology» (Москва, 2001);
на международной конференции «Biotechnology of Microalgae» (Германия, 2003);
на 5-ом съезде Всероссийского общества физиологов растений (Пенза, 2003);
на 6-м съезде Всероссийского общества физиологов растений (Сыктывкар, 2007);
на Всероссийской научной конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, включая патент РФ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, заключения и выводов. Работа изложена на … стр. машинописного текста, включая … таблиц, … рисунок, библиография содержит … источника.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В качестве объекта исследования использовали термофильную нитчатую цианобактерию Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (IPPAS).
Культивирование цианобактерии осуществляли на среде Заррука в стерильных условиях при круглосуточном освещении (30 Вт/м2) и непрерывном барботировании газо-воздушной смесью содержащей 1.7-2% СО2, при 35оС (Семененко, 1991). В опытных вариантах в стандартную среду Заррука добавляли сульфат меди или хлорид марганца в концентрациях: 0.04;
0.06;
0.08 мМ и 1.3;
2.5;
5.1 мМ соответственно. Соли вводили в питательные среды либо одновременно с внесением посевного инокулята, либо при выходе культуры на линейную фазу.
Биохимические анализы проводили на линейной стадии роста в клеточной массе предварительно отмытой от культуральной среды. Образцы хранили при -200С.
Содержание белка определяли по методу Lowry (Lowry et al., 1951).
Содержание хлорофилла измеряли спектрофотометрически в метанольных экстрактах (Porra et al., 1989).
Содержание липофильных соединений оценивали весовым методом в пробах, экстрагированных метанолом при 60°С (Клячко-Гурвич, 1966).
Разрушение клеток проводили в гомогенизаторе Retsch-ММ2 (Германия) в течение 10 мин при 90000 уд/мин с использованием стеклянных бус, при соотношении бусы/суспензия 1:1.
Фракционирование бесклеточного гомогената на фракции, обогащенные растворимыми белками и нерастворимыми клеточными компонентами осуществляли центрифугированием при 14000 об/мин, 30 мин при 4°С. Экстракцию липофильных соединений проводили при обработке фракции нерастворимых клеточных компонентов метанолом при 60°С.
Хроматографический анализ белков проводили с использованием колоночной хроматографии высокого давления на колонке 1,650 см. В качестве матрицы использовали Superosa-12 («Pharmacia», Швеция). Белок элюировали с колонки фосфатным буфером, содержащим 0,05М KH2PO4, 0,15M NaCl (рН 6,8), со скоростью мл/мин.
Электрофоретическое разделение белков проводили в 12% трицин-ПААГ (Schagger & Jagow, 1987).
Хелатирование меди и марганца осуществляли с использованием ЭДТА (Steiner & Winden, 1970).
Содержание меди и марганца в культуральной среде, а также в биомассе S.
platensis или выделенных из нее фракциях, озоленных путем мокрого сжигания в смеси азотной и хлорной кислот, определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Hitachi 270», Япония).
Определение Cu+ проводили аналитическим методом путем проведения качественной реакции с N-диметиламино-бензилиденроданином (Грива и др., 1967).
Для получения электронно-микроскопических снимков клетки обрабатывали по методике Владимировой с соавт. (1978).
Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных результатов эксперименты проводили в 2-3-х биологических и не менее чем в 3-х аналитических повторностях. В результатах работы представлены данные характерных опытов и относительные стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние меди и марганца на рост S. platensis. Добавление CuSO4 (0.04 и 0. мМ Cu) в начальный период культивирования одновременно с внесением инокулята приводило к удлинению лаг-фазы, которая составляла около суток в контроле и суток в опыте, с последующим более быстрым линейным ростом (рис. 1А).
Внесение 0.04 мМ меди на 2-е сутки культивирования (в начале линейной фазы) приводило к активации роста культуры (рис.1Б), но снижению ее продуктивности.
При увеличении концентрации меди до 0.06 мМ скорость роста и продуктивность культуры снижались и к 4-м суткам культура погибала, чего не происходило при внесении меди одновременно с инокулятом. В присутствии 0.08 мМ меди клетки погибали независимо от времени внесения соли.
Сравнение ростовых кривых рис. 1А и Б показывает, что при внесении металла на логарифмической стадии роста порог чувствительности культуры к меди снижается.
Вероятно это связано с тем, что в течение индукционного периода, в который не происходит сколько-нибудь значительного увеличения биомассы, клетки лучше адаптируются к новым условиям, что позволяет цианобактерии увеличить устойчивость к более высоким концентрациям меди.
Введение хелатирующего агента повышало устойчивость S. platensis к токсическому действию меди. В присутствии комплексов Cu с ЭДТА культура сохраняла способность к росту даже при летальной концентрации меди (0.08 мМ).
9 Оптическая плотность, 750 нм Оптическая плотность, 750 нм Б А 7 2 5 4 3 1 0 2 4 0 2 4 6 8 Время, сутки Время, сутки Рис. 1. Влияние CuSO4 на рост S. platensis.
Соль вносили вместе с инокулятом (А) и на 2-е сутки после начала культивирования (Б). Количество добавленной в среду Заррука меди составляло (мМ): 0 (1, контроль), 0.04 (2);
0.06 (3);
0.08 (4).
При внесении марганца в концентрациях до 2.5 мМ одновременно с инокулятом не отмечено расхождений с контролем в ходе ростовых кривых в течение лаг-фазы и на линейном участке (рис. 2А).
Оптическая плотность, 750 нм Оптическая плотность, 750 нм А Б 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 0 2 4 Время, cутки Время, сутки Рис. 2. Влияние MnCl2 на рост S. platensis.
Соль вносили вместе с инокулятом (А) и на 2-е сутки после начала культивирования (Б). Количество добавленного в среду марганца составляло (мМ):
0 (1, контроль), 1.3 (2);
2.5 (3), 5.1 (4).
Внесение таких же концентраций Mn на 2-е сутки культивирования приводило к активации роста культуры (рис. 2Б) по сравнению с контролем. При этом максимальная плотность биомассы была выше, чем в контроле и при действии эквивалентой концентрации Mn, добавленной одновременно с инокулятом.
Однако независимо от времени внесения MnCl2 в присутствии 1.3 и 2.5 мМ марганца наблюдалось существенное сокращение стационарной фазы с последующим быстрым лизисом клеток. Возможно, на фоне отсутствия активного деления клетки и замедления метаболизма токсичность Mn проявляется острее в силу снижения способности S. platensis включать поглощенный клетками марганец в метаболические процессы. При увеличении концентрации марганца до 5.1 мМ скорость роста снижалась независимо от стадии внесения металла.
Накопление меди и марганца клетками S. platensis. Анализ накопления меди в процессе культивирования S. platensis при внесении в культуральную среду соли с содержанием меди 0.06 мМ показал, что содержание Cu в клетках резко (на порядка) возрастало уже через 1 ч и в дальнейшем в течение 6 сут постепенно снижалось с 13.4 до 7.7 мкмоль/г сухой массы (рис. 3).
Содержание Cu, мкмоль/г сух. массы Рис. 3. Динамика накопления меди клетками S.
platensis при культивировании в присутствии сульфата меди.
Соль с содержанием 0.06 мМ меди вносили 8 вместе с инокулятом.
-100 20 50 80 110 Время, час Как видно из рис. 4А, с повышением концентрации меди в среде наблюдалось увеличение ее содержания в биомассе, которое зависело от времени инкубации цианобактерии с металлом. Через час при всех концентрациях металла в среде до 0.06 мМ его содержание в клетках было значительно выше (кривая 1), чем через сутки (кривая 2), 3 суток (кривая 3) и 6 суток (кривая 4). Однако, при культивировании клеток в присутствии 0.08 мМ Cu2+ эта закономерность нарушалась, что говорит о подавлении механизмов, ограничивающих поступление и накопление меди. Содержание металла одинаково высокое (17,3 мкмоль/г сухой массы) через 1 ч и через 1 сут, что приводило в дальнейшем к гибели клеток как это видно из ростовой кривой на рис. 1А, кривая 4.
Снижение содержания меди у S. platensis в ходе адаптации цианобактерии к избытку металла (рис. 3) свидетельствует об индукции механизмов, способствующих выносу Cu из клетки.
Содержание Mn, мкмоль/г сух. массы Б Содержание Сu, мкмоль/г сух.массы А 12 8 0 0 0,04 0,08 0 2 4 Концентрация Mn в среде, мМ Концентрация Cu в среде, мМ Рис. 4. Зависимость количества связанных меди (А) и марганца (Б) в клетках S.
platensis от количества элементарных Cu2+ и Mn2+, введенных в среду культивирования.
Пробы отбирали через 1 ч (1), 1 сут (2), 3 сут (3) и 6 сут (4) после внесения разных концентраций CuSO4 и MnCl2 в среду культивирования.
Накопление марганца клетками S. platensis происходило пропорционально времени культивирования и увеличению концентрации металла в среде с выходом на насыщение около 2.5 мМ (рис. 4Б). Пороговой внутриклеточной концентрацией этого металла, по-видимому, следует считать около 30 мкмоль/г сухой. Выход кривых накопления марганца на плато показывает, что клетки способны каким-то способом ограничивать поступление и накопление Mn, защищая их от токсического действия этого металла.
Влияние света на накопление меди и марганца клетками S. platensis. Анализ кинетики содержания меди в биомассе при инкубировании S. platensis в присутствии 0.06 мМ Cu2+ на свету и в темноте показал, что клетки не способны накапливать медь в темноте (табл. 1). Таким образом, накопление меди является светозависимым процессом, что также установлено и для других организмов (Verma & Singh, 1990).
Таблица 1. Накопление Cu и Mn при внесении металла в суспензию S. platensis на свету и в темноте Содержание металла в клетке (мкмоль/г сух. массы) Металл Время свет темнота 1 час 13.5±0.8 следы следы 1 сут 12.0±0. 0.06 мМ Cu следы 3 сут 9.5±0. следы 6 сут 7.7±0. 1 час 9.5±0.7 7.2±0. 2.5 мМ Mn 1 сут 11.6±1.0 56.0±2. 3 сут 16.9±0.9 20.1±2. В отличие от меди марганец накапливался в клетках S. рlatensis как в темноте, так и на свету (табл. 1). При внесении соли в темноте содержание марганца в клетках в 1 сутки, в расчете на единицу сухой массы, было почти в 5 раза выше, чем на свету.
Далее содержание металла в клетках снижалось, приближаясь через 3 суток к значению установленному на свету. Возможно, что различие в динамике содержания марганца в темноте и на свету связано с особенностями сорбции металла клеточными стенками S. рlatensis.
Биотрансформация и вынос меди из клетки. Для изучения природы механизмов ограничивающих аккумуляцию меди (рис. 3, 4А), мы исследовали изменение содержания металла в среде культивирования и в клетках. Для сопоставления выноса меди из среды и включения ее в клеточные структуры суспензию S. platensis, выращенную в присутствии 0.04 мМ Cu2+, центрифугировали для полного отделения клеток от среды. На поверхности осадка содержащего клетки, обнаруживался слой красноватого цвета, который был нами отобран и проанализирован на присутствие меди. Содержание меди определяли также в супернатанте (среда) и в осадке (клетки), трижды промытом буфером для полного отделения клеток от элементов среды.
Анализ хода кривых 1 и 2 рис. 5 показал, что количество меди, вынесенной из среды, значительно превышает количество меди, включенной в биомассу в течение всего цикла культивирования. Это различие показано на рис. 5 пунктирной линией 3. Мы предположили, что баланс распределения меди в среде и биомассе не сошелся из-за возможного образования нерастворимых комплексов меди, которые осаждались вместе с клетками и были утрачены при многократной отмывке клеток от среды. С этой целью мы провели анализ красноватого осадка, полученного при отделении клеток от среды, который показал наличие в нем восстановленной меди (Cu+). Поскольку в среду добавляли сульфат меди можно полагать, что S. platensis способна восстанавливать Cu2+ и переводить ее в недоступную для клетки форму.
Процессы поглощения (кривая 1) и восстановления (кривая 3) меди являются достаточно быстрой ответной реакцией цианобактериальной клетки и сопоставимы по масштабам. Уже через 1 ч после внесения сульфата меди отмечается высокое содержание Cu+, а в дальнейшем накопление в среде восстановленной меди замедляется.
Содержание Cu, мкмоль/л суспензии Рис. 5. Изменение содержания меди в клетках S.
platensis (1) и в среде культивирования (2).
Культуру выращивали в присутствии CuSO (0.04 мМ Cu2+). Пунктиром (3) отмечена расчетная кривая концентрации + восстановленной меди (Cu ), рассчитанная по формуле:
Свос = Свн – (Скл + Сср), где Свос – конц. восстановленной меди, Свн – конц. меди, внесенной в среду культивирования, Скл – конц. меди в клетке, Сср – конц. меди в среде культивирования.
-20 0 20 40 60 Время, час Осаждение металла из среды культивирования снижает токсическое действие меди и ограничивает накопление меди в клетке, позволяя пройти полный цикл развития. При концентрации меди свыше 0.08 мМ клетки утрачивали способность к выносу металла в среду (рис. 4А), что вызывало лизис клеток уже на ранних этапах культивирования (рис 1). Очевидно также, что секреция ТМ из клетки (рис. 3) по крайней мере, отчасти может быть связана с образованием восстановленной меди Cu+.
Адсорбция меди и марганца сухой биомассой S. platensis. Для исследования вклада биосорбции в накопление меди и марганца лиофилизированную биомассу S.
platensis ресуспендировали в среде, содержащей 0.06 мМ меди и 2.5 мМ марганца. В «мертвых клетках» уже через 1 час наблюдалось резкое увеличение количества металлов, которое далее не изменялось (рис. 6).
Таким образом, показана принципиальная возможность клеточных стенок S.
platensis сорбировать ТМ. Однако отсутствие какого-либо накопления меди в темноте (табл. 1.) может указывать, что вклад биосорбции в накопление металлов живыми и «мертвыми» клетками может различаться.
Содержание Mn, мкмоль/г сух.массы Содержание Cu, мкмоль/г сух.массы Б А 6 -20 0 20 40 60 -20 0 20 40 60 Время, час Время, час Рис. 6. Динамика накопления меди (А) и марганца (Б) при внесении 0.06 мМ Cu2+ и 2.5 мМ Mn2+ в суспензию S. platensis (1) и сухую биомассу (2).
Содержание Cu и Mn в живых клетках S. platensis значительно выше, чем у «мертвых» (рис. 6), что свидетельствует о включении металлов в состав внутриклеточных структур.
Идентификация металлсвязывающих клеточных компонентов. Для оценки способности клеток S. platensis сорбировать металлы, а также включать медь и марганец в состав клеточных компонентов, на первом этапе было проведено разделение биомассы на отдельные фракции – растворимых белков, нерастворимых клеточных компонентов и липофильных соединений.
Как видно из рис. 7, большая часть ТМ содержалась в составе фракции обогащенной растворимыми белками - меди около 55%, марганца более 80%. Около 20% меди обнаруживалось в липофильных соединениях, содержащих в основном пигменты и липиды тилакоидных мембран. Во фракции нерастворимых клеточных компонентов, которая включала белки тилакоидных мембран, элементы клеточных стенок и углеводы, содержалось около 17 % меди и марганца. Таким образом, можно полагать, что доля сорбированных живыми клетками металлов не превышает 20 – 30 %.
А Б Л Нк Л Р Нк Р Рис. 7. Распределение Cu (А) и Mn (Б) в биомассе S. platensis.
Л – липофильные соединения, Нк – фракция нерастворимых клеточных компонентов, Р – фракция растворимых белков.
Для поиска металлсвязывающих белков было проведено разделение растворимых белков, выделенных из клеток S. platensis, с использованием колоночной хроматографии высокого давления. На рис. 8А, Б представлены профили белков из клеток, выращенных на стандартной среде (контроль) и при внесении 0.06 мМ меди или 2.5 мМ марганца (опыт).
А Б 0,1 П оглощ ение 280 н.м.
0, П оглощ ение 280 н.м.
1 0 50 0 5 10 15 20 0 В Г 5 С одержание C u, отн. ед.
С одерж ание M n, отн. ед.
0,5 0,5 4 0 2*10 2*10 14,1 1,82 0, 126 126 25 14,130 1,82 40 0, 5 0 5 10 20 35 45 Молекулярная масса, кДа Молекулярная масса, кДа Рис. 8. Спектры хроматографического разделения белков (HPLC) S. platensis и идентификация металлсвязывающих белков.
А, Б - профиль эллюции белка, выделенного из клеток, выращенных на стандартной среде Заррука (1) и при добавлении 0.06 мМ меди (2) или 2. мМ марганца (3).
В, Г - содержание металлов в расчете на единицу белка в контроле (4) и при добавлении меди (5) или марганца (6).
Сравнение профилей эллюции белков показало, что количественное содержание низкомолекулярных белков возросло более чем в пять раз, по сравнению с контролем при культивировании S. platensis в присутствии металлов. При этом анализ полученных в ходе хроматографического разделения фракций на содержание металлов показал, что именно эти белки с молекулярными массами 2 – 15 кДа содержат медь и марганец (рис. 8В, Г). Можно полагать, что данные белки относятся к классу металлсвязывающих белков S. platensis.
При электрофоретическом разделении медь- и марганец-содержащих белковых фракций было обнаружено несколько полос, соответствующих белкам с молекулярными массами 13 кДа и 8-9 кДа (рис. 9).
Таким образом, S. platensis обладает способностью синтезировать специфические индуцируемые белки, связывающие тяжелые металлы, что способствует повышению устойчивости клетки к стрессовому воздействию ТМ.
Контроль Cu М Mn 26. 17. 14.0 ~ ~ 8- 6. (кДа) Рис. 9. Электрофоретическое разделение Cu- и Mn-содержащих белков S. platensis.
М – маркеры молекулярной массы.
Влияние меди и марганца на ульраструктуру клетки. Анализ влияния повышенных концентраций меди на ультраструктуру S. platensis показал, что в присутствии Cu ламеллы утрачивают параллельную ориентацию и закручиваются.
Под действием Cu увеличивалось количество запасающих продуктов: появляются цианофициновые и полифосфатные гранулы, повышается количество карбоксисом (рис. 10Б).
При выращивании клеток S. platensis в присутствии марганца ультраструктура клеток также менялась (рис. 10В). Отмечалось существенное увеличение расстояния между ламеллами. В промежутках между тилакоидами накапливалось значительное количество углеводов. В то же время, при инкубировании клеток S. platensis в темноте в присутствии эквивалентной концентрации марганца ультраструктура клеток не подвергалась существенным изменениям по сравнению со световыми условиями (рис. 10Г). В клетках обнаруживалось увеличение количества цианофициновых и -гликановых гранул, что может быть обусловлено действием темноты.
Б А Г В Рис. 10. Влияние меди и марганца на изменение ультраструктуры клеток S. platensis.
Цианобактерию выращивали на стандартной среде Зарркука (А), при добавлении 0.06 мМ меди (Б), 2.5 мМ марганца (В). Г – клетки инкубировали в присутствии 2.5 мМ марганца в темноте.
ВП – внутритилакоидное пространство, Ка – карбоксисома, КС – клеточная стенка, Пф – полифосфатные гранулы, ТМ – тилакоидные мембраны, У – углеводы, ЦГ – цианофициновые гранулы, – гликоген.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, Spirulina platensis, в отличие от большинства фотосинтезирующих микроорганизмов, проявляет высокую толерантность к меди и марганцу. Согласно предложенной Baker (1981) классификации растений и микроорганизмов по степени накопления ТМ S. platensis можно отнести к гипераккумуляторам меди. Клетки способны накапливать около 1 мг/г сухой массы Cu, что является пороговой величиной накопления меди клетками гипераккумуляторами. По способности S. platensis накапливать марганец (1,6 мг/г сух. массы) культуру можно отнести к аккумуляторам. Пороговое значение концентрации марганца в клетках водорослей-гипераккумуляторов значительно выше и составляет около 10 мг/г сух. массы (Baldisserotto et al, 2007).
Механизмы детоксикации токсического действия меди и марганца в клетках S.
platensis связаны с сорбцией ТМ на клеточной поверхности, ограничением их поступления в клетку, индукцией синтеза металлсвязывающих белков и, возможно, компартментацией ТМ в полифосфатные гранулы и липиды тилакоидных мембран.
При адаптации к высоким концентрациям меди клетки S. platensis могут восстанавливать Cu (II) до Cu (I) с последующим экспортом в среду культивирования в недоступных для клетки соединениях восстановленной меди.
Способность S. platensis к выносу меди является условием выживания клеток в присутствии этого ТМ.
Проведенные комплексные исследования позволяют определить оптимальные концентрации меди и марганца для внесения в среду культивирования, которые не вызывают ингибирования роста культуры, изменений биохимического состава биомассы и ультраструктуры клеток для оптимизации внутриклеточного накопления этих элементов и получения биомассы, обогащенной медью и марганцем.
ВЫВОДЫ 1. S. platensis устойчива к действию высоких концентраций меди и марганца.
Культура сохраняет способность к росту при концентрациях меди до 0.06 мМ, марганца до 5 мМ.
2. Содержание внутриклеточной меди находится в прямой зависимости от концентрации металла в среде, что, очевидно, говорит о неспособности клеток S. platensis лимитировать накопление Cu вплоть до летальных величин.
3. В присутствии неингибирующих рост концентраций меди (до 0.06 мМ) максимальное накопление Cu клетками S. platensis наблюдается уже в первый час, с последующим выносом металла из клетки. Способность S. platensis к выносу меди является условием выживания клеток в присутствии этого ТМ.
S. platensis восстанавливает Cu2+ до Cu+, с последующим экспортом в среду в 4.
недоступной для клеток форме, что ограничивает поступление металла в клетку и снижает его токсическое действие.
5. Накопление марганца происходит пропорционально времени культивирования и увеличению его концентрации в среде с выходом на насыщение при 2.5 мМ. Пороговой внутриклеточной концентрацией Mn следует считать 30 ± 3 мкмоль/г сухой массы.
6. Накопление Mn и Cu зависит от освещения. В отличие от марганца, медь не накапливается клетками S. platensis в темноте.
7. Показано, что медь и марганец преимущественно включаются в белковую фракцию. Хроматографический анализ белков с последующим электрофоретическим разделением показал, что металлы обнаруживаются в полипептидах с молекулярной массой около 13 и 8-9 кДа.
8. Способность S. platensis сорбировать металлы на клеточной поверхности, восстанавливать металлы и переводить их в нетоксичную форму, хелатировать с помощью металлсвязывающих белков обеспечивает устойчивость цианобактерии к тяжелым металлам.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
:
1. Nalimova A.A. (Chernikova A.A.), Popova V.V., Pronina N.A. Enrichment of Spirulina platensis cells whith Cu and Zn.// Molecular genetics and biotechnology:
Abstr. Intern. Symp. Moscow. 2001.
2. Попова В.В., Налимова А.А. (Черникова А.А), Пронина. Н.А. Накопление эссенциальных микроэлементов клетками Spirulina platensis.// Тез. Докл. 5-го съезда ВОФР. Пенза. 2003. С.321.
3. Nalimova A.A. (Chernikova A.A.), Pronina N.A. The effect of light on the accumulation of Cu and Mn in Spirulina cells.// Biotechnology of Microalgae: Abstr.
5th European Workshop. Germany. 2003.
4. Налимова А.А. (Черникова А.А.), Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А.
Влияние меди и цинка на рост и аккумуляция клетками Spirulina platensis тяжелых металлов.// Физиология растений. 2005. Т.52. №2. С.259-265.
5. Попова В.В., Черникова А.А., Бедбенов В.С., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А.
Способ получения биомассы спирулины (Spirulina platensis). Патент РФ № 2277124. 2006.
6. Черникова А.А., Цоглин Л.Н., Маркелова А.Г., Зорин С.Н., Мазо В.К., Пронина Н.А.. Способность Spirulina platensis к накоплению марганца и его распределение в клетке.// Физиология растений. 2006. Т.53. №6. С.903-909.
7. Черникова А.А., Пронина Н.А. Способность S. platensis к накоплению марганца и его распределение в клетке.// Тезисы 6-го съезда ВОФР.
Сыктывкар. 2007. часть 2. С. 419.
8. Черникова А.А., Пронина Н.А., Маркелова А.Г. Влияние меди и марганца на ультраструктурную организацию клетки S. platensis. // Тезисы Всероссийская науч. конф. «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах». Москва. 2009.