Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих рнк в клетки-мишени
На правах рукописи
ЦИБУЛЬКИНА
Елена Арнольдовна
ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ
НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА
МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК
В КЛЕТКИ-МИШЕНИ
03.00.23 – биотехнология
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва – 2008
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государствен ной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова и в лабора тории иммунохимии отдела биологической психиатрии ФГУ «Государственно го научного центра социальной и судебной психиатрии им. В. П. Сербского».
академик РАМН, доктор химических наук Научные руководители:
ШВЕЦ Виталий Иванович академик РАМН, доктор медицинских наук ЧЕХОНИН Владимир Павлович чл.-корр. РАМН, доктор химических наук
Официальные оппоненты:
СЕВЕРИН Сергей Евгеньевич чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук ТЕРЕНТЬЕВ Александр Александрович ГУ НИИ биомедицинской химии
Ведущая организация:
им. В.Н. Ореховича РАМН
Защита состоится «08» декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссер тационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Моск ва, пр-т Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ло моносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.
Автореферат разослан «07» ноября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук А. И. Лютик СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Анти-ОБМ-антитела моноклональные антитела к основному белку миелина Анти-NSE-антитела моноклональные антитела к нейроспецифической енолазе МАТ моноклональные антитела мРНК матричная РНК миРНК малая интерферирующая РНК ОБМ основной белок миелина ОП оптическая плотность ПЭГ 2000 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 2000 Да ПЭГилированный конъюгированный с полиэтиленгликолем РНКи РНК-интерференция ЦНС центральная нервная система DDAB диметилдиоктадециламмоний бромид 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси (полиэти DSPE-PEG ленгликоль)-2000] 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимидо (полиэти DSPE-PEG-М ленгликоль)-2000] Dil 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат IgG иммуноглобулины класса G комплекс белков, индуцирующий подавление экспрессии гена при РНК RISC интерференции (RNA induced silencing complex) ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы Специфичная пост-транскрипционная деградация мРНК, происходящая при РНКи, представляет собой новый многообещающий подход для направленного ингибирования экс прессии генов в клеточных культурах и in vivo. Эффекторами этого процесса являются дуп лексы миРНК длиной около 21-26 п.н., которые непосредственно отвечают за специфичный распад целевой мРНК. Метод РНКи считается весьма перспективным в качестве новой тех нологии функциональной геномики, а миРНК – потенциальными терапевтическими агентами при лечении болезней генетической этиологии [Sioud M., 2004;
Sontheimer E. J., 2005;
Gil more I.R., 2006]. Однако из-за большого молекулярного веса (~ 13 кДа) и полианионной структуры (~ 40 отрицательно заряженных фосфатных групп) свободные миРНК не прони кают через клеточную мембрану, что является главным препятствием широкого применения РНКи in vivo. В связи с этим разработка систем направленного транспорта и доставки внутрь клеток-мишеней миРНК приобретает особую актуальность в современной медицине [Akhtar S., 2007;
Pirollo K. Z., 2008].
В настоящей работе при выборе объекта исследования (культуры клеток-мишеней) основным доводом была возможность решить одну из первостепенных проблем нейрофар макологии – создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт лекарственных средств из системного кровотока к клеткам центральной и перифе рической нервных систем [Pardridge W. M., 2004].
Поскольку ОБМ является главным структурным компонентом мембраны миелинобра зующих клеток, этот белок рассматривают в качестве ведущего маркера состояний, сопро вождающихся нарушением целостности миелиновой оболочки [Чехонин В. П., 2000;
Lamers K. J., 1998], таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травмати ческие повреждения головного мозга, опухолевые процессы в ЦНС, затрагивающие ее гли альный компонент [Чехонин В. П., 2007].
Для диагностики и регуляции демиелинизации или детектирования патологического процесса можно использовать транспортные системы, специфически направленные к миели нобразующим клеткам, в частности, к шванновским клеткам.
В настоящее время одним из наиболее популярных и эффективных методов контро лируемого направленного транспорта миРНК и других биологически активных веществ к местам их специфического действия является использование липосом, или липидных вези кулярных систем. Важным достоинством таких транспортных средств является возможность продления их срока жизни в кровотоке посредством введения в состав липосомных мембран конъюгатов липидов с полиэтиленгликолем, т.е. ПЭГилирование липосом, в результате чего происходит значительное замедление системной элиминации таких стерически стабилизиро ванных липосом (“stealth” – липосом) [Lasic D. D., 1995].
Специфичность липосомальных транспортных систем обусловливается наличием в их структуре векторных молекул (МАТ к антигенам клеток-мишеней или белка-лиганда). Век тор является своего рода «троянским конем» [Pardridge W. M., 2006] – он взаимодействует с клеточными мишенями (белковыми и иными антигенами, рецепторами, липопротеидными комплексами и т.п.), что может приводить к поглощению содержимого липосомы клеткой. В частности, для селективного векторного транспорта к миелинобразующим клеткам опти мальной мишенью представляется ОБМ.
Все это дает иммунолипосомальному транспорту миРНК неоценимые преимущества по сравнению с другими системами доставки нуклеиновых кислот в шванновские клетки мишени. В свете вышеизложенного актуальность выбранной темы исследования определяет ся крайней необходимостью в создании иммунолипосомальных систем селективной доставки миРНК, способных подавлять синтез целевого белка в шванновских клетках.
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехноло гии МИТХТ в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-356 “Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные па тологии)”, а также по проекту № 3243 аналитической ведомственной программы Рособразо вания “Развитие научного потенциала высшей школы, 2006-2008”.
Цель и задачи исследования Целью данной работы являлось создание ПЭГилированных иммунолипосомальных систем, способных специфически связываться со шванновскими клетками и осуществлять доставку внутрь клеток миРНК, блокирующих синтез целевого белка.
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следую щие основные задачи:
1. Разработка способа получения ПЭГилированных липосом;
2. Разработка способа загрузки миРНК в синтезированные липосомы;
3. Подбор и тестирование иммунохимического вектора для конструирования транспорт ной системы;
4. Конъюгация полученных липосом с моноклональными антителами;
5. Исследование специфичности полученных иммунолипосомальных транспортных сис тем на фиксированной и нативной культурах клеток in vitro;
6. Оценка эффективности доставки миРНК внутрь клеток-мишеней.
Научная новизна В ходе данной работы впервые была разработана иммунолипосомальная транспортная система, способная специфически связываться со шванновскими клетками. Важно отметить, что специфическое взаимодействие ПЭГилированных иммунолипосом, векторно ориентиро ванных анти-ОБМ-антителами, с ОБМ клеток-мишеней происходило как в условиях фикса ции культуры, так и с нативными шванновскими клетками. Впервые была разработана и оха рактеризована иммунолипосомальная система доставки миРНК, подавляющих синтез ОБМ в шванновских клетках. Для определения эффективности доставки миРНК в клетки-мишени впервые был разработан сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа ОБМ в лизатах шванновских клеток.
Практическая значимость Результаты настоящей исследовательской работы демонстрируют высокую специ фичность сконструированных иммунолипосомальных контейнеров к ОБМ, презентирован ному на шванновских клетках. Это говорит о том, что разработанные ПЭГилированные им мунолипосомы в перспективе могут найти применение в качестве препарата для диагностики заболеваний, сопровождающихся нарушением миелинизации.
В ходе работы показано, что полученные иммунолипосомальные контейнеры способ ны селективно доставлять миРНК в нефиксированную культуру клеток, что в будущем мо жет быть использовано при разработке терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии.
С помощью разработанного нами сэндвич-варианта иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях (лизаты шванновских клеток) был подтвержден факт внут риклеточной доставки миРНК посредством ПЭГилированных иммунолипосом, что вносит определенный вклад в понимание до сих пор до конца неизученных основных механизмов проникновения содержимого компартмента иммунолипосом в клетки-мишени.
Апробация работы и публикации Основные результаты исследований были представлены на I Международной конфе ренции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и меди цине» (Россия, Туапсе, 3 – 9 октября 2007), 6-ой Международной научно-практической кон ференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины»
(Россия, Астрахань, 8 – 11 сентября 2008), а также на заседании кафедры биотехнологии фа культета биоорганического синтеза и биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова и на за седании Проблемного совета ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского». По материалам диссерта ции опубликовано семь научных работ, отражающих основное содержание проведенных ис следований.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 150 страницах печатного текста;
содержит 28 рисунков и таблицы;
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 266 наименований.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение препарата ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК В соответствии с целью настоящего исследования была сконструирована иммуноли посомальная транспортная система, способная специфически доставлять миРНК в шваннов ские клетки.
Главными молекулярными компонентами липосом, как известно, являются липиды, которые при эмульгировании в водной среде образуют систему жировых пузырьков, ограни ченных внешней бислойной липидной мембраной и содержащих в своем внутреннем про странстве некоторый объем водной фазы, захваченной при механическом эмульгировании.
В настоящей работе для получения катионных липосом в качестве главных липидных компонентов (рис.1) использовали фосфатидилхолин из желтков куриных яиц – пальми тоилолеоилфосфатидилхолин, холестерин и катионный липид DDAB – диметилдиоктаде циламмоний бромид (Avanti Polar Lipids, Alabaster AL, USA).
Рис. 1. Липиды, используемые для приготовления катионных липосом.
Катионный липид в составе липосом обеспечивает им эффективное связывание с от рицательно заряженными молекулами миРНК. В качестве флуоресцентной метки для прове дения цитохимического анализа культуры клеток к липосомам на стадии смешения липид ных компонентов добавляли индикатор Dil (1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо карбоцианин перхлорат;
Fluka) (возб = 549 нм, исп = 565 нм).
Для устранения основного недостатка липосом первого поколения – их быстрый кли ренс из системного кровотока – в состав липосомных мембран вводили конъюгат липида с химически инертным гидрофильным полимером, DSPE-PEG – 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3 фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]. Данный липид представляет собой дистеароилфосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ-2000 – цепочкой полиэтиленг ликоля с молекулярной массой 2000 Да, присоединенной к этаноламинной группе липида (рис. 2).
Рис. 2. Химическое строение молекулы производного липида DSPE-PEG: 1,2-дистеароил-sn-глицеро 3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000].
За счет цепочек ПЭГ на внешней оболочке липосомы образовывалась как бы допол нительная “щетина”, что приводило к значительному продлению срока жизни таких стериче ски стабилизированных липосом в кровотоке [Lasic D. D., 1995] (рис. 3).
Рис. 3. Схема строения ПЭГилированной Рис. 4. Схема предупреждения процесса опсониза катионной липосомы. ции за счет наличия цепочек ПЭГ у стерически ста билизированных (“stealth”) липосом.
Механизм этого явления остается до конца неизученным и предполагает, что подвиж ные и биохимически инертные цепочки полимера препятствуют опсонизации липосом соот ветствующими компонентами плазмы крови, что необходимо для последующего фагоцитоза (рис. 4).
Эффективность действия любого препарата во многом определяется “адресностью” его доставки, что особенно важно при генетической терапии миРНК, поскольку подавление экспрессии целевого белка в клетках тех органов, для которых оно не предназначено, обу славливает несостоятельность и множественные побочные действия такого рода терапии.
Для эффективного и высокоспецифичного связывания с поверхностью клетки-мишени система направленной доставки должна содержать так называемый “молекулярный адрес”, обеспечивающий слияние липосомальных конструкций с мембранами клеток-мишеней для проникновения их содержимого внутрь клетки. Специфическая направленность липосомаль ных систем обеспечивается присоединением к 1-2% цепочек ПЭГ молекулярных векторов.
Как правило, ими являются МАТ к специфическим рецепторам на поверхности клеток мишеней. Поскольку ОБМ является специфическим маркером шванновских клеток, в каче стве иммунохимического вектора липосомальных систем были выбраны МАТ к ОБМ.
В настоящей работе для дальнейшего конъюгирования МАТ к ОБМ с липосомами в состав последних вводили малеимидное производное фосфатидилэтаноламина DSPE-PEG-M (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000]).
В его молекуле малеимидная группа присоединена к терминальному звену цепочки полиэти ленгликоля, конъюгированного с этаноламинной группой фосфолипида (рис. 5).
Рис. 5. Химическое строение молекулы производного липида DSPE-PEG-M: 1,2-дистеароил sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[малеимидо(полиэтиленгликоль)-2000].
Отобранные в соответствии с расчетом количества липидных компонентов (фосфати дилхолина, холестерина, DDAB, DSPE-PEG-M, DSPE-PEG, Dil) растворяли в смеси хлоро форма с метанолом (9:1) в концентрации 10-20 мг суммарных липидов в 1 мл растворителя.
Эти растворы смешивали в молярном соотношении 23 : 16 : 4,4 : 1 : 1,6 : 0,4. Растворитель удаляли упариванием на роторном испарителе при пониженном давлении в атмосфере арго на. Затем смесь липидов растворяли в сухом циклогексане, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали. Все манипуляции по приготовлению липосом (за исключением кратковре менных – взвешивание и т.п.) осуществляли в атмосфере аргона высокой чистоты.
Для загрузки в липосомы нуклеиновых кислот (миРНК длиной 21 п.н., блокирующие синтез ОБМ, – Syntol) за основу была выбрана методика N. Shi [Shi N., 2000]. Модификация заключалась в том, что загрузка миРНК проводилась на стадии эмульгирования липидной пленки. Обработка ультразвуком и серия циклов замораживания – оттаивания исключались за ненадобностью. Таким образом, модифицированная методика оказалась менее трудоемкой и адекватно обеспечивала выполнение поставленных задач.
Полученный липоплекс пропускали через поликарбонатные фильтры (Nucleopore) с размерами пор 400, 200, 100 и 50 нм с помощью ручного мини-экструдера (Avanti) для полу чения липосом определенного размера (рис. 6).
Рис. 6. Схема загрузки миРНК в липосомы на этапе эмульгирования липидной пленки.
После этого эмульсию ПЭГилированных липосом можно разбавлять до необходимых концентраций, подвергать мягкой химической модификации, операциям гель-фильтрации, центрифугирования и т.п.
Количество связавшихся с липосомами миРНК определяли люминесцентным методом следующим образом: полученный препарат липосом, загруженных миРНК, подвергали ульт рафильтрации через конические поликарбонатные мембраны с порогом отсечения 50 кДа (CentriFlo, Amicon, Голландия) при центрифугировании в течение 1 ч при 3000 об/мин. В ультрафильтрате определяли количество РНК с помощью коммерческой системы Quant-iT RNA Assay Kit (Invitrogen, США) и флуориметра Qubit (Invitrogen, США). Результаты пока зали, что в ультрафильтрате РНК обнаружено не было (предел чувствительности данной флуориметрической системы 20 нг/мл), т.е. все молекулы миРНК связались с липосомами.
Конъюгацию липосом с векторным белком (МАТ) проводили малеимидным способом в соответствии со стандартной методикой [Benzinger P., 2000]. Сохранность иммунокомпе тенции антител на всех этапах тиолирования и конъюгации тестировали методом иммуноги стохимии на срезах мозга крыс.
Малеимидная группа DSPE-PEG-M, входящего в состав полученных липосом, спо собна связываться со свободной сульфгидрильной группой белка, образуя прочный тио эфирный конъюгат. По этой причине молекулы белка перед конъюгацией с липосомами не обходимо тиолировать, т.е. ввести в них дополнительные свободные сульфгидрильные груп пы. Для этого МАТ подвергали взаимодействию с 2-иминотиоланом (реактив Траута), кото рый реагировал со свободными первичными аминогруппами белка, например, с аминогруппами остатков лизина, присоединяя к ним SH-содержащий радикал (рис. 7).
Рис. 7. Реакция тиолирования антител реактивом Траута.
Реакцию проводили в атмосфере инертного газа, чтобы избежать окисления введен ных сульфгидрильных групп и побочных реакций неспецифического конъюгирования. Ан титела инкубировали с 20-кратным молярным избытком тиолирующего агента. Отделение продукта реакции проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G25 (su perfine) (рис. 8 А). Контроль за движением препарата осуществляли фотометрическим детек тором при = 280 нм.
Рис. 8. Хроматограмма гельфильтрации смеси тиолированных моноклональных антител к ОБМ с избытком тиолирующего агента на колонке с сефадексом G25 (А) и смеси ПЭГилированных иммунолипосом, монокло нальных антител к ОБМ и стоп-реагента на колонке с сефарозой CL-4В (Б).
Для конъюгирования с векторным белком свежеприготовленные липосомы инкубиро вали 12 ч со свежетиолированными антителами в темноте при слабом перемешивании в ат мосфере инертного газа (рис. 9).
Рис. 9. Реакция конъюгирования малеимидного производного липида липосомы с тиолированным мо ноклональным антителом.
Реакцию останавливали введением 100-кратного молярного избытка (по отношению к белку) N-этилмалеимида, который блокировал оставшиеся несвязанными сульфгидрильные группы. После этого целевые иммунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакци онной смеси с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой СL-4B (рис. 8 Б). Контроль за движением образца осуществляли визуально по окраске Dil.
В результате получен препарат ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК (рис. 10), размером 100 нм в виде эмульсии. Процедура приготовления таких транс портных систем была основана на методике, предложенной нидерландской группой исследо вателей [Kamps J.A.A.M, 2000], и оказалась вполне адекватной поставленным целям и зада чам работы, о чем свидетельствуют характеристики полученного препарата.
Рис. 10. Схема строения ПЭГилированной иммунолипо сомы, загруженной миРНК.
2. Характеристика полученного препарата иммунолипосом 2.1. Определение размера липосом Методом динамического светорассеяния на гониометре, оборудованном He-Ne лазе ром (Photocor Instruments), проводили измерение гидродинамических радиусов невекторных катионных липосом и ПЭГилированных иммунолипосом, конъюгированных с векторными антителами (рис. 11). Флуктуации интенсивности света регистрировали с помощью 288 канального коррелятора Photocor FC. Для обработки полученных данных использовали про граммное обеспечение Dyna LS. Величины гидродинамических радиусов рассчитывали с ис пользованием уравнения Стокса в приближении для сферических частиц.
Рис. 11. Распределение по размерам ПЭГилиро- Рис. 12. Средние диаметры невекторных липосом ванных иммунолипосом, эмульгированных в и ПЭГилированных иммунолипосом.
фосфатно-солевом буфере рН 7,4.
Распределение по размеру ПЭГилированных невекторных катионных липосом и ПЭГилированных иммунолипосом, конъюгированных с МАТ, в обоих случаях было узким унимодальным. Средний диаметр невекторных липосом составил 70±10 нм, а ПЭГилированных иммунолипосом – 100±12 нм (рис. 12).
Важной частью настоящей работы являются разделы, посвященные методам аналити ческого контроля состава и качества каждого получаемого препарата ПЭГилированных им мунолипосом, загруженных миРНК, блокирующих синтез ОБМ. Для этой цели были прове дены количественные определения фосфолипидов и конъюгированного белка. Все эти мето дики обеспечивают высокое качество контроля и соответствуют стандартам, принятым в данной области.
2.2. Количественное определение фосфолипидов в водных эмульсиях Определение суммарных фосфолипидов основано на спектрофотометрической реги страции окрашенных комплексных соединений, образованных молекулами липидов и ферро тиоцианатом (роданидом) аммония. Определение фосфолипидов с тиоцианатом железа (III) позволяет избежать ненадежной процедуры кислотного разложения анализируемого препа рата и последующего определения неорганического фосфата.
В работе использовали 0,1 н раствор ферротиоцианата аммония, приготовленного пу тем смешения гексагидрата хлорного железа и тиоцианата аммония (рис. 13).
Рис. 13. Реакция получения ферротиоцианата аммония и образование его комплекса с фосфатидил холином для колориметрического определения фосфолипидов.
Окрашенный в красный цвет ферротиоцианат аммония нерастворим в хлороформе, однако, он образует комплекс с хорошо растворимым в хлороформе фосфатидилхолином.
Когда хлороформный раствор липида при комнатной температуре тщательно перемешивает ся с водным раствором ферротиоцианата аммония, в результате ионного взаимодействия об разуется окрашенный комплекс (макс = 488 нм), который распределяется между водной и ор ганической фазами.
Предварительно строили калибровочный график для серии растворов лецитина раз личной концентрации в хлороформе (рис. 14).
Рис. 14. Калибровочный график для определения фосфолипидов (р0,0001).
В указанном диапазоне оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации с коэффициентом пропорциональности, равным 0,0168 мл/мг (при длине оптического пути в измерительной кювете спектрофотометра, равной 10 мм). Линейный регрессионный анализ показал очень высокую достоверность корреляции (вероятность ее отсутствия меньше 0,0001, коэффициент определенности R2 = 0,9863), а также достаточно высокую точность анализа — коэффициент вариации в середине рассмотренного диапазона составляет 4,2%.
В ходе работы определение липидов в водных эмульсиях проводили вышеописанным методом и с тем же калибровочным графиком, но с предварительной экстракцией липидов из водной фазы. Преимуществом такой экстракции является то, что она позволяет отделить ли пиды от многих компонентов анализируемой системы, нерастворимых в органических рас творителях (неорганические соли, белки и пр.).
В частности, был проанализирован препарат ПЭГилированных иммунолипосом, за груженных миРНК, полученный после гельфильтрации (~ 10-тикратное разведение исходной эмульсии). Были взяты три аликвоты (по 50 мкл) разведенной еще в 80 раз липосомальной эмульсии. Среднее значение ОП образцов составило 0,464. Среднее значение концентрации липидов в разведенной водной эмульсии по калибровочному графику – 27,6 мкг/мл. Таким образом, количество липидов в 1 мл анализируемой эмульсии составило 22,08 мг. Истинная концентрация липидов в эмульсии при приготовлении липосом составляла 21,45 мг/мл, что лишь на 2,9 % отличается от величины, полученной в ходе количественного определения фосфолипидов. Приведенные данные показывают, что используемый метод колориметриче ского определения фосфолипидов с ферротиоцианатом аммония достаточно чувствителен и точен..
2.3. Определение общего белка с бицинхониновой кислотой Определение общего белка в препаратах ПЭГилированных иммунолипосом проводи ли с бицинхониновой кислотой по методике P.K. Smith и R. Brown [Smith P.K., 1985;
Brown R., 1989] с предварительным отделением белка от липидов при использовании коммерческой тест-системы BCA Protein Assay Reagent Kit 23227 фирмы Pierce (США). Метод основан на известной биуретовой реакции и на высокочувствительной спектрофотометрической регист рации образующихся окрашенных хелатных комплексов меди (I) с бицинхониновой кисло той (рис. 15).
Рис. 15. Реакция образования биурета и окрашенных хелатных комплексов меди (I) с бицинхонино вой кислотой для количественного определения белка.
Эти комплексы характеризуются высокой экстинкцией при 562 нм, которая линейно зависит от концентрации белка в широком рабочем диапазоне. Данный метод не допускает использования одного и того же калибровочного графика для неодновременных анализов, но коэффициент пропорциональности для всех графиков оказался одинаков и равен 0,0013 (при длине оптического пути в измерительной кювете спектрофотометра, равной 10 мм) (рис. 16).
Рис. 16. Калибровочный график для серии растворов бычьего сы вороточного альбумина для коли чественного определения белка с бицинхониновой кислотой (p 0,0001).
Для анализа были взяты три аликвоты (по 50 мкл) эмульсии ПЭГилированных имму нолипосом, которые разводили 0,1 моль/л фосфатным буфером в 8 раз. Среднее значение ОП образцов составило 0,338. Средняя концентрация белка в разведенной пробе по калибровоч ному графику – 260 мкг/мл. Таким образом, количество антител в 1 мл составило 1,824 мг.
Если учесть, что одну липосому диаметром 100 нм составляют 100.000 молекул липидов, средняя молекулярная масса липидов 760, а молекулярная масса иммуноглобулинов 150.000, зная соотношение фосфолипидов и белка в полученном препарате, можно вычислить, сколь ко антител приходилось на одну липосому:
, где N – число молекул, m – масса вещества, взятого согласно методике приготовления им мунолипосом, М – молекулярная масса вещества.
N липидов = 20*10-3 * 6,02*1023/760 = 16*1018 молекул N липосом = 16*1018/1*105 = 16*1013 липосом N МАТ = 1,824*10-3 * 6,02*1023/1,5*105 = 7,32*1015 молекул N МАТ/ N липосом ~ 46 молекул МАТ на одну липосому Аналогичным образом при известной молекулярной массе РНК рассчитывается число моле кул миРНК, приходящихся на одну липосому:
N миРНК = 15*10-6 * 6,02*1023/6,5*103 = 15*1014 молекул на партию липосом N миРНК/ N липосом ~ 10 молекул миРНК на одну липосому.
Таким образом, определение липидного и белкового состава полученного препарата ПЭГилированных иммунолипосом показало, что в среднем на одну липосому приходилось около 50 молекул конъюгированных антител и 10 молекул миРНК, что соответствует рефе ренсным данным по использованной процедуре приготовления иммунолипосом [Lasic D. D., 1995].
2.4. Определение стабильности липосом в сывороточной среде Стабильность ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК, была проана лизирована после инкубации в 50% плазме в течение 1 ч по методике Lasic D. D. и соавт.
[Lasic D. D., 1997]. ОПсред ультрафильтрата иммунолипосомальной эмульсии составила 0, единиц, в то время как ОПсред ультрафильтрата плазмы – 0,004. Флуориметрически было подтверждено отсутствие миРНК в ультрафильтрате иммунолипосом. Следовательно, раз рушение иммунолипосомальных систем и высвобождение содержимого контейнеров прак тически не происходило. Согласно полученным данным, можно сделать вывод, что иммуно липосомы в присутствии плазмы не разрушаются.
2.5. Определение срока сохранности липосом Срок сохранности стерильных невекторных липосом, загруженных миРНК, определя ли методом ускоренного старения при инкубации в термостате при 370С в течение 3 месяцев и 2 недель. Стерилизацию липосом проводили методом фильтрования через ацетатцеллю лозные фильтры (Millipore) с диаметром отверстий 0,22 мкм в условиях стерильного бокса.
ОПсред фильтрата липосомальной эмульсии после инкубации составила 0,005 единиц, ОПсред фильтрата фосфатно-солевого буфера – 0,006, из чего следует, что липосомы не разру шились. Количественное определение миРНК в ультрафильтрате липосомальной эмульсии методом флуориметрии показало отсутствие миРНК в исследуемых образцах. Исходя из по лученных данных согласно требованиям, установленным Фармакопейным Комитетом, срок сохранности полученного препарата липосом составляет один год.
3. Исследование специфичности ПЭГилированных иммунолипосом на культуре шванновских клеток 3.1. Иммунопероксидазный анализ препарата культуры шванновских клеток Культуру шванновских клеток, полученную из спинальных ганглиев крысиных эм брионов на сроке гестации 19 дней [Brockes J. P., 1980], любезно предоставили сотрудники лаборатории иммунохимии ФГУ “ГНЦ ССП им. В.П. Сербского”.
Шванновские клетки являются одним из редких клеточных типов, который может быть весьма определенно фенотипически идентифицирован в культуре. Но для более точной верификации полученной культуры, а также для подтверждения наличия в клетках цито плазматического и мембранного ОБМ и способности этого белка специфически связываться с анти-ОБМ-антителами, используемыми в настоящей работе в качестве векторных состав ляющих липосом, проводили иммунопероксидазный анализ как фиксированной, так и не фиксированной клеточной культуры (рис. 17).
Рис. 17. Микрофото графии фиксированной (а – опыт, б – отрица тельный контроль, уве личение 400) и нефик а б сированной (в – опыт, г – отрицательный кон троль, увеличение 200) культуры шванновских клеток крысы после иммунопероксидазного окрашивания на 10 день культивирования.
в г Иммуноцитохимический анализ анти-ОБМ-антител, использованных в настоящей ра боте для синтеза иммунолипосом, показал их высокую аффинность и авидность, а также полную пригодность для применения в данных системах доставки к шванновским клеткам.
3.2. Оценка специфичности связывания препарата иммунолипосом со шванновскими клетками Адекватность векторной функции приготовленных иммунолипосом была подтвер ждена в экспериментах in vitro.
Исследовали специфичность связывания препарата ПЭГилированных иммунолипо сом, содержащих в липидной мембране флуоресцентный индикатор Dil и моноклональные антитела к ОБМ в качестве вектора, с нефиксированными эмбриональными шванновскими клетками крысы.
Интенсивную флуоресценцию препарата нативных шванновских клеток, возбуждае мую светом с длиной волны 515-560 нм, наблюдали после инкубации с исследуемыми ПЭГилированными векторными липосомами, что обусловлено специфическим связыванием анти-ОБМ-антител на поверхности иммунолипосом с ОБМ, презентированным на мембране клеток-мишеней (рис. 18).
а б в Рис. 18. Микрофотографии культуры эмбриональных шванновских клеток крысы (увеличение 400, флуоресцентная окраска индикатором Dil):
а, б – инкубация с препаратом ПЭГилированнных иммунолипосом, меченных Dil и конъюгированных с анти-ОБМ-антителами, в течение 3 (а) и 6 (б) ч;
в – инкубация в течение 6 ч с препаратом ПЭГилированнных иммунолипосом, меченных Dil и со держащих в качестве вектора неспецифические мышиные иммуноглобулины IgG.
Важно отметить, что такое взаимодействие не наблюдалось при следующих условиях, взятых в качестве отрицательных контролей:
1. Инкубация шванновских клеток с ПЭГилированными липосомами, меченными Dil и не конъюгированными ни с какими белками (невекторные липосомы);
2. Инкубация с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и конъюгирован ными с неспецифическими мышиными иммуноглобулинами;
3. Инкубация с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и содержащими в качестве вектора неспецифические анти-NSE-антитела;
4. Преинкубация культуры со свободными анти-ОБМ-антителами (без липосом) с после дующей инкубацией с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченными Dil и содер жащими в качестве вектора анти-ОБМ-антитела;
5. Инкубация культуры фибробластов с ПЭГилированными иммунолипосомами, меченны ми Dil и содержащими в качестве вектора анти-ОБМ-антитела.
Результаты иммунофлуоресцентного анализа показали, что малеимидный метод свя зывания ПЭГилированных липосом с анти-ОБМ-антителами, используемый в настоящей ра боте, обеспечивает сохранность иммунокомпетентности конъюгированного вектора.
Кроме того, доказана специфичность связывания иммунолипосомальных систем со шванновскими клетками без нарушения их жизнеспособности, обусловленная аффинным взаимодействием между иммунохимическим вектором липосом (МАТ к ОБМ) и ОБМ, пре зентированным на поверхности шванновских клеток.
Результаты проведенных исследований in vivo по определению токсичности катион ного липида DDAB и катионных невекторных липосом, содержащих DDAB [Якушев В. А., 2007], демонстрируют, что используемое в настоящей работе количество катионного липида DDAB при получении иммунолипосом нетоксично. В экспериментах in vitro было установ лено, что внесение катионных иммунолипосомальных систем, содержащих DDAB в преду смотренном методикой количестве, не влияет на выживаемость шванновских клеток.
Таким образом, следует отметить в качестве достоинства полученной им мунолипосомальной транспортной системы ее безопасность для живых клеток.
Резюмируя вышесказанное, следует сделать вывод о том, что конъюгация монокло нальных анти-ОБМ-антител с ПЭГилированными липосомами позволяет создать высокоспе цифичную безопасную контейнерную систему, способную направленно доставлять диагно стические и лекарственные препараты к шванновским клеткам.
Нет сомнений, что решение этой задачи открывает перспективы создания диагности ческих и лекарственных препаратов векторного типа действия, способных специфически воздействовать на ОБМ-продуцирующие клетки центральной и периферической нервной системы, вовлеченные в патологический процесс.
3.3. Иммунолипосомальная доставка миРНК, подавляющих синтез ОБМ, в шванновские клетки Для направленной доставки миРНК в шванновские клетки была сконструирована транспортная система, представляющая собой ПЭГилированные иммунолипосомы, вектор но-ориентированные моноклональными антителами к ОБМ, которые загружали препаратом миРНК, специфически подавляющих синтез ОБМ в клетках.
Эффективность доставки в шванновские клетки препарата, загруженного в ПЭГилированные иммунолипосомы, оценивали по физиологическому ответу клеток мишеней на проникновение в них миРНК, — непосредственно по снижению уровня синтеза ОБМ (рис. 19).
Рис. 19. Схема по давления синтеза целевого белка при запуске миРНК механизма РНК интерференции.
Для определения концентрации ОБМ в лизате шванновских клеток нами был разрабо тан сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (рис. 20). При этом на подложке лунок 96 луночного планшета (Sarsdedt, USA) иммобилизовали поликлональные антитела человека к ОБМ, полученные из сыворотки крови пациентов с рассеянным склерозом при проведении терапевтической процедуры плазмофереза. В качестве стандартного антигена для построения калибровочной прямой использовали нативный ОБМ (полученный ранее в нашей лабора тории [Чехонин В. П., 2007]) в концентрациях от 0,25 до 32 нг/мл, шестикратно измеряя оп тическую плотность при каждом варианте концентрации. В качестве вторых антител исполь зовали моноклональные анти-ОБМ антитела мыши, с которыми реагировали антивидовые (к IgG мыши) антитела козы, конъюгированные с пероксидазой VI типа из хрена (Sigma, USA).
Рис. 20. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа ОБМ.
1. Адсорбция поликлональных антител к ОБМ на твердой фазе.
2. Внесение образцов биологических жидкостей (лизаты шванновских клеток);
комплементар ное связывание молекулы ОБМ с поликлональными антителами к ОБМ.
3. Внесение МАТ к ОБМ;
их комплементарное связывание с ОБМ из лизата шванновских кле ток. Внесение конъюгата антивидовых антител к IgG с пероксидазой.
4. Внесение субстратной смеси и изменение цвета субстратной смеси, регистрируемое фотометром.
Количество связанного конъюгата оценивали с помощью хромогенного субстрата ор то-фенилендиамина. При этом интенсивность окрашивания субстратной смеси пропорцио нальна количеству антигена в лизате клеток. ОП продукта ферментативной реакции изме ряли при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра «Elx 800»
(«Bio Tek Instruments Inc.», USA).
Калибровочный график по стандартному антигену представляет собой линейную за висимость ОП от концентрации ОБМ в исследуемом образце. Рабочий диапазон определен в интервале концентраций ОБМ от 0,5 до 16 нг/мл (рис. 21).
1, y = 0,0724x + 0, 1, R = 0, O D 45 Рис. 21. Калибровочный график 0, иммуноферментного определения 0, ОБМ.
0, 0, 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Концентрация О Б M, нг/мл С помощью сэндвич-варианта иммуноферментного анализа определили концентра цию ОБМ в образце лизата двух миллионов шванновских клеток после инкубации с ПЭГилированными иммунолипосомами, векторно-ориентированными анти-ОБМ антителами и нагруженными препаратом миРНК, которые подавляют синтез ОБМ. Иммуно липосомы вносили из расчета 1 мл готовой эмульсии на 2106 клеток культуры. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Среднее значение концентрации ОБМ составило 0, ± 0,02 нг/мл (n=4), что в 10 раз меньше значений, полученных в следующих контрольный системах:
• лизат 2 млн шванновских клеток после инкубации с иммунолипосомами, конъюгирован ными с неспецифическими IgG мыши (использованными вместо специфического имму нохимического вектора) и загруженными миРНК, – 9,55 ± 0,27 нг/мл;
• лизат 2 млн нативных шванновских клеток (без внесения липосом) – 9,05 ± 0,18 нг/мл;
• лизат 2 млн шванновских клеток после инкубации со свободными миРНК (без системы доставки) – 9,43 ± 0,28 нг/мл.
В ходе этого эксперимента было установлено, что степень подавления синтеза ОБМ зависела от дозы липосом, загруженных миРНК (точнее, от соотношения их количества и количества клеток). Для выяснения этого обстоятельства одинаковое количество полученных иммунолипосом вносили в клеточные препараты, содержавшие 2 млн и 4 млн шванновских клеток. Концентрации ОБМ в этих лизатах составили 0,93 ± 0,02 и 3,50 ± 0,14 нг/мл, соответ ственно.
Представленные результаты доказывают, что полученный препарат ПЭГилированных иммунолипосом, загруженных миРНК, за счет векторной ориентации, определяемой анти ОБМ-антителами, способен специфически доставлять нуклеиновые кислоты к живым клет кам-мишеням, а также способствует проникновению миРНК внутрь клеток. Важно отметить, что доставленные миРНК сохраняют способность специфически ингибировать трансляцию ОБМ, т.е. после высвобождения из липосом они запускают в клетках механизм РНК интерференции, что приводит к 90%-ному подавлению синтеза целевого белка.
Резюмируя вышесказанное, следует сделать вывод о том, что технология получения векторных иммунолипосомальных систем позволяет создать высокоспецифичный контей нерную транспортную систему, способную направленно доставлять нуклеиновые кислоты в шванновские клетки. При этом факт внутриклеточной доставки малых интерферирующих РНК подтверждается детектированием 10-кратного снижения интенсивности биосинтеза це левого белка. Есть основания предполагать, что подобные системы окажутся эффективными при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией миелина, таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травматические повреждения головного мозга, глиальные опухоли [Чехонин В. П., 2007].
Кроме того, разработанная система направленной доставки миРНК может быть ис пользована в дальнейшем в качестве модели при создании терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии. Поскольку для большинства таких болезней уже идентифицированы конкретные белковые системы, нарушение функций кото рых способно инициировать патологический процесс, возможно проводить коррекции бел кового метаболизма на генетическом уровне, что позволило бы получить длительный тера певтический эффект.
Весьма перспективными представляется лечение миРНК опухолевых заболеваний.
Например, при раке молочной железы с помощью соответствующих миРНК проводить бло каду синтеза белка межклеточного вещества тенасцина С и транскрипционного фактора SOX4, специфических для опухолевых клеток и отвечающих за развитие метастаз [Смирнов П.А., 2007]. Системы доставки миРНК могут рассматриваться как основа терапевтических препаратов для повышения эффективности химиотерапии опухолевых заболеваний. Напри мер, при введении синтетических анти-MDR1-миРНК, можно добиться восстановления чув ствительности раковых клеток к цитостатику винбластину [Логашенко Е.В., 2007].
Другой областью применения липосомальных систем доставки миРНК может служить терапия сердечно-сосудистых заболеваний. Например, введение в кровяное русло липосом, загруженных дуплексами миРНК, подавляющих экспрессию гена аполипопротеина Б (ApoB), может привести к снижению уровня аполипопротеина Б – фактора, участвующего в транс порте холестерина, что, следовательно, приведет к замедлению формирования атеросклеро тических бляшек в сосудах [Tracy S. Zimmermann, 2006].
ВЫВОДЫ 1. Эмульсионно-экструзионная технология обработки липидной смеси из лецитина, холе стерина, катионного липида, малеимидного производного фосфатидилэтаноламина и фосфатидилэтаноламина, конъюгированного с ПЭГ-2000, в молярном соотношении 23:16:4,4:1:1,6 позволяет создавать стерически стабилизированные катионные липосомы.
2. Введение в состав липосом малеимидного производного фосфатидилэтаноламина позво ляет проводить его конъюгацию с тиолированными моноклональными антителами к ос новному белку миелина для получения иммунолипосомальных контейнеров.
3. Стерически стабилизированные иммунолипосомы, векторно-ориентированные монокло нальными антителами к основному белку миелина, способны специфически связываться с эмбриональными шванновскими клетками крысы, что делает возможным их примене ние в качестве наноконтейнеров для векторной доставки биологически активных веществ в ОБМ-продуцирующие клетки центральной и периферической нервной системы.
4. Технология пассивной загрузки малых интерферирующих РНК позволяет ввести в имму нолипосомы не менее 0,714 мкг миРНК на 1 мг суммарных фосфолипидов (не менее молекул миРНК на одну липосому).
5. Стерически стабилизированные иммунолипосомы, загруженные миРНК, способны осу ществлять направленную доставку нуклеиновых кислот в шванновские клетки, что пред полагает эффективность подобных систем для диагностики и лечения заболеваний, ассо циированных с патологией миелина, а также при заболеваниях различной генетической этиологии.
ПУБЛИКАЦИИ 1. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б., Цибулькина Е.А. Монокло нальные антитела к нейроспецифическим антигенам как векторы при транспортировке микроконтейнерных систем к клеткам-мишеням нервной ткани. Глава в книге: Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б. “Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам”. М.: ОАО “Издательство “Медицина”. – 2007. – 344 с.: ил.
2. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А., Цибулькина Е.А., Буланов К.А., Рябинина А.Е., Павлов К.А., Швец В.И. Направленный транспорт генетического материала в мозг.
// Биотехнология. – 2007. – №5. – С. 14-23.
3. Чехонин В.П., Цибулькина Е.А., Рябинина А.Е., Жирков Ю.А., Савченко Е.А., Швец В.И.
Иммунолипосомальные контейнеры как системы направленного транспорта малых ин терферирующих РНК в шванновские клетки.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 145. – № 10. – С. 431-435.
4. Чехонин В.П., Гурина О.И., Ухова О.В., Рябинина А.Е., Цибулькина Е.А., Жирков Ю.А.
Иммунолипосомы, конъюгированные с полиэтиленгликолем, специфичные к обкладоч ным глиальным клеткам обонятельного эпителия.// Бюллетень экспериментальной биоло гии и медицины. – 2008. – Т. 145. – № 4. – С. 427-431.
5. Чехонин В.П., Буланов К.А., Юсубалиева Г.М., Цибулькина Е.А., Швец В.И. Исследова ние биодеградации меченных 125I моноклональных антител при системном введении кры сам с экспериментальной глиомой С6. // Биомедицинская химия. – 2007. – Т. 53. – Вып. 5.
– С. 532-540.
6. Жирков Ю.А., Рябинина А.Е., Лохонина А.В., Цибулькина Е.А., Максимова М.А., Павлов К.А., Ухова О.В., Семенова А.В. Направленный транспорт ПЭГилированных липосом в клетки-мишени.// Программа и тезисы докладов I Международной конференции «Физи ко-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине». – Туапсе, 3-9 октября 2007. – С. 54.
7. Чехонин В.П., Цибулькина Е.А., Рябинина А.Е., Жирков Ю.А., Савченко Е.А., Швец В.И.
Иммунолипосомальные системы направленного транспорта малых интерферирующих РНК, блокирующих синтез основного белка миелина в шванновских клетках.// Материа лы 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаменталь ных наук в решении актуальных проблем медицины».//Астраханский медицинский жур нал. – 2008. – №3. – С. 51-55.