Глипролины меланокортинового ряда: процессы биодеградации и взаимодействия с мембранами клеток мозга
На правах рукописи
Вьюнова Татьяна Владимировна
ГЛИПРОЛИНЫ МЕЛАНОКОРТИНОВОГО РЯДА: ПРОЦЕССЫ
БИОДЕГРАДАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МЕМБРАНАМИ КЛЕТОК
МОЗГА
Специальность 03.00.23 - Биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата химических наук
Москва-2008 2
Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН
Научный руководитель: академик РАН, доктор химических наук, профессор Мясоедов Николай Федорович
Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович доктор химических наук, профессор Степанов Александр Евгеньевич
Ведущая организация: Российский Химико-Технологический Университет им. Д.И.Менделеева
Защита состоится «8» декабря 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова.
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru Автореферат разослан «7» ноября 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, к. х. н. А.И. Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
* Актуальность исследования Одной из актуальных задач современных медицины и биотехнологии является создание высокоэффективных лекарственных средств, характеризуемых не только широким спектром действия и минимальным числом побочных эффектов, но и простотой синтеза биологически активных соединений, составляющих препарат, а также возможностью организации массового производства различных лекарственных форм на их основе. Начальным этапом в решении поставленной проблемы является установление истинной причины возникновения и развития конкретного заболевания. В последние годы основным фактором, провоцирующим появление болезни, все в большем числе случаев склонны считать нарушение баланса во взаимодействии систем клеточных химических регуляторов. Совершенствование биотехнологических методов исследования в медицине и биологии позволило не только установить своеобразие регуляторных пептидных пулов, присутствующих в различных тканях, но и обнаружить изменения характерного пептидного состава в случае патологии. Как следствие – все чаще в терапии и профилактике довольно многих заболеваний в качестве лекарственных препаратов используют различные белки и пептиды. В основном пептидосодержащие лекарственные средства представляют собой экстракты из материалов различного биологического происхождения - органов свиньи, лосося, других рыб и млекопитающих. Из более чем 200 запатентованных на сегодняшний день препаратов, всего лишь несколько десятков являются синтетическими аналогами, либо продуктами модификации эндогенных регуляторных пептидов. В их числе семакс и селанк, относящиеся к классу глипролинов. Данные нейропептиды содержат PGP C концевую последовательность (глипролины) и синтезированы на основе фрагмента АКТГ(4-10) и тафтсина, соответственно.
Особенностью пептидных регуляторов является не только полифункциональность, но и довольно быстрая их деградация во внутренних средах организма. В большинстве случаев часть образованых в результате протеолиза коротких фрагментов обладает собственной биологической активностью. Так, не только синтетический аналог АКТГ(4-10) – семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), но и ряд фрагментов этого пептида, также относящихся к семейству глипролинов меланокортинового ряда, обладают * В руководстве работы принимал участие д.х.н. Шевченко В.П.
Список принятых сокращений: AA, АК – арахидоновая кислота;
АААА – амино-ацилариламидаза (Е.С.
3.4.11.2);
AA-Gly – N-арахидоноил-глицин;
AA-Phe - N-арахидоноил-L-фенилаланин;
AA-Pro – N арахидоноил-пролин;
BGE – глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius;
СBR – каннабиноидный рецептор;
DR – дофаминовый рецептор;
HTR – серотониновый рецептор;
MC1R - MC5R - рецепторы меланокортинов;
VR – ванилоидный рецептор.
широким спектром действия, спосбны улучшать внимание, память и способность к обучению, положительно влияют на общее состояние организма. Несмотря на успешное широкое клиническое применение семакса, механизм его действия остается не ясным.
Кроме того, практически не изучены процессы, лежащие в основе действия его коротких производных. Исследование таких процессов на молекулярном уровне, в микро- и нано- молярных концентрациях, требует применения комплексного биотехнологического подхода - использования знаний по физиологии и биохимии, аналитической химии и радиохимии. Разработанный нами метод биосинтеза позволяет приблизить способ получения изучаемых пептидов к процессу их образования в организме, упрощает синтез биологически активных соединений, имеющих в структуре не только пептидные, но и иные составляющие - например, пептиолипинов. Таким образом, изучение молекулярных механизмов действия искусственных аналогов нейропептидов представляет огромный теоретический и практический интерес, позволит не только охарактеризовать процессы, лежащие в основе биологической активности исследуемой группы коротких пептидов, но и приблизиться к пониманию общих закономерностей пептидной регуляции.
Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, НШ-5638.2006.4, НШ-3626.2008.4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» и «Синтез и исследования фармакологически важных пептидов, включая изотопно-модифицированные».
Цель работы Исследовать ключевые моменты механизма биологического действия семакса и его производных (глипролинов меланокортинового ряда), включающие ограниченный пептидолиз с образованием укороченных форм и специфическое связывание с плазматическими мембранами.
В задачи настоящего исследования входило:
1. Изучение процесса биодеградации глипролинов меланокортинового ряда (начиная с гептапептида семакса) при взаимодействии с плазматическими мембранами клеток мозга крысы, определение интенсивности протеолитических процессов в различных тканях мозга, а также последующий анализ условий, необходимых для снижения активности мембранных ферментов протеолиза.
2. Поиск центров специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах клеток мозга крысы, включая характеристику обнаруженных мест взаимодействия.
3. Разработка биотехнологического способа синтеза меченых тритием и немеченых пептидов с применением ферментов различной степени специфичности.
4. Изучение влияния коротких пептидов (продуктов N-концевого протеолиза семакса, содержащих PGP C-концевую последовательность), а также N-ацилпептидов и N ациламинокислот на специфическое связывание глипролинов с мембранами мозга крысы.
5. Исследование конкуренции за места связывания глипролинов со стороны некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов.
6. Изучение взаимодействия с мембранами мозга крысы ряда ацилированных производных семакса, а также их влияния на специфическое связывание глипролинов.
Научная новизна В работе впервые удалось установить существование положительной корреляции между наличием и плотностью специфических мест связывания глипролинов и их концентрацией в различных отделах головного мозга крысы. На плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа крысы было установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса, пентапептида HFPGP и арахидоноил-семакса, на плазматических мембранах базальных ядер трипептида Pro-Gly-Pro. Впервые изучено влияние ряда коротких пептидов, N ацилпептидов и N-ациламинокислот, а также некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание меченых семакса и пентапептида с мембранами гиппокампа крысы. Установлено, что многие эффекторные молекулы известных нейрорецепторов, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны значительно вытеснять трипептид с мест специфических связывания.
Разработан биотехнологический способ синтеза коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, из соответствующих модифицированных пептидов, при помощи высокоспецифических ферментов различного типа.
Несомненный научный интерес представляют обнаруженные в данном исследовании особенности и общие характеристики процессов взаимодействия глипролинов меланокортинового семейства, а также их ацилированных производных, с плазматическими мембранами мозга крысы.
В совокупности, полученные данные позволили сформулировать новую гипотезу, объясняющую один из возможных молекулярных механизмов действия семакса, эффективность которого связана, по-видимому, с действием целой группы коротких биологически активных пептидов и аминокислот – продуктов деградации семакса.
Практическая значимость работы Разработанный и описанный в работе биотехнологический способ получения представляет собой перспективный метод получения коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, и, благодаря высокой специфичности фермента, позволяет проводить реакции с большим количеством исходного реагента сразу (с очень высоким выходом 96% – 100%), использовать в качестве субстрата различные соединения на основе Glu – содержащих пептидов, избегая образования множественных побочных продуктов. При помощи данного метода была синтезирована группа меченных и немеченных пептидов, необходимых для изучения механизмов действия глипролинов радиолигандным методом анализа.
Апробация работы Основные положения работы были представлены на российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе: II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 8th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), VI симпозиуме “Химия протеолитических ферментов” (Москва, 2007).
IV международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 статей в российских и зарубежных журналах, 5 публикаций представлено в тезисах материалов российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания синтеза обьектов и методов их исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 23 рисунка. Библиографический список включает 222 наименования.
Объекты и методы исследования Меченые по С-концевому пролину пептиды ([3H]PGP, [3H]Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]His Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, [3H]Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) с молярной радиоактивностью 56 Ки/ммоль и радиохимической чистотой не менее 95% синтезированы в ИМГ РАН в лаборатории изотопно-меченых физиологически активных веществ из соответствующих защищенных пептидов и [3H]пролина, либо получены путем биосинтеза с использованием глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius (MEROPS ID S01.443). Анализ и очистку меченых препаратов проводили высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Химически синтезированный [3H]PGP обладал молярной радиоактивностью 130 Ки/ммоль и радиохимической чистотой не менее 95%, [3Н8]арахидоноил-MEHFPGP - Ки/ммоль. Соответствующие немеченые пептиды синтезированы в ИМГ РАН. Ацил аминокислоты и ацил- пептиды (AA-PGP, AA-TA-PGP, AA-His, AA-Phe, AA-Pro, AA Met) синтезированы в Институте биоорганической химии им. академиков М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН в лаборатории оксилипинов по методу, описанному авторами (Безуглов В. В. и соавт., 2006).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Вопрос о механизме действия семакса не решен до настоящего времени, однако, физиологические эффекты гептапептида (в частности, его влияние на процессы восприятия информации и консолидации памятного следа) предполагают существование специфических мест связывания семакса на цитоплазматической мембране клеток мозга. Ранее уже предпринимались попытки обнаружить такие места связывания (Арефьева И.А. и др., 1992;
Долотов О.В. и др., 2004), однако в этих исследованиях авторы использовали меченый семакс, в котором тритиевая метка содержалась во всех аминокислотах пептида. Такой радиоактивный лиганд не является оптимальным для легкогидролизуемых пептидов, поскольку различить связывание нативного семакса и его гидролитических фрагментов с изучаемым гипотетическим рецептором практически невозможно. Поэтому в данном исследовании использовали пептиды, меченные тритием по С-концевому пролину. Такой вариант локализации метки позволяет исключить ряд проблем, связанных с деградацией и значительно снизить погрешности в количественном определении изучаемого пептида. Кроме того, локализация метки в С-концевом пролине позволила разработать метод получения коротких фрагментов семакса и ряда радиоактивно меченых пептидов при помощи ферментов. Все полученные таким способом глипролины меланокортинового ряда обладают одинаковой удельной активностью, что ценно при проведении сравнительных экспериментов.
1. Биодеградация глипролинов 1.1. Деградация глипролинов под действием мембранных ферментов Биодеградация нейропептидов является, одновременно, и процессом образования более коротких и, зачастую, биологически активных молекул. Семакс подвергается значительному протеолизу (рис. 1): уже через 20 мин инкубирования с плазматическими мембранами мозга крысы при 30°С остается не более 30% интактного пептида. В течение первых 10 мин инкубирования основными продуктами деградации являются короткие N-концевые фрагменты (из трех и менее аминокислот), тогда как в следующие 10 минут заметно увеличивается лишь содержание тетрапептида Phe-Pro-Gly-Pro.
Чтобы воспрепятствоватоь быстрому разрушению интактной молекулы под действием протеолитических ферментов, необходимо было подобрать особые условия инкубирования.
Доля от 50 количества меченого гептапептида, % Sm- Sm- время, 10 Sm- Sm- мин Sm- Рисунок 1. Содержание некоторых пептидных фрагментов семакса в фильтрате инкубационной смеси через 10, 20 и 30 мин. после начала инкубирования с плазматическими мембранами мозга крысы (Sm-7 (MetGluHisPheProGlyPro), Sem- (GluHisPheProGlyPro), Sem-5 (HisPheProGlyPro), Sem-4 (PheProGlyPro), Sem-3 (ProGlyPro)).
1.2. Введение дополнительных компонентов инкубационного буфера, снижающих протеолиз гептапептида Наиболее известными способами снижения активности протеолитических ферментов являются: изменение pH, температуры или введение ингибиторов (Варфоломеев С.Д., 1999). Снижение температуры инкубирования до 0-4°С резко повысило стабильность пептида, хотя и замедлило кинетические параметры взаимодействия (рис. 2). В этих условиях, даже по истечении 4 ч степень деградации [3H]семакса не превышала 15%.
Поиск эффективных ингибиторов протеолиза, не влияющих на процессы взаимодействия глипролинов с местами связывания на мембранах, позволил определить комбинацию ингибиторов (PepstatineA 10 mkM + Bacitracine 10 mkM + AEBSF mkM), позволяющую проводить инкубирование семакса при температуре 30°C.
Таким образом, эксперименты по изучению биодеградации семакса и производных пептидов позволили установить, что основными продуктами деградации гептапептида являются, по-видимому, С- концевые фрагменты семакса, несущие меченый атом.
Данное предположение подтверждает и тот факт, что высокую эффективность в отношении пептидаз проявили соединения, способные подавлять активность именно N концевых протеолитических ферментов (Pankov Y.A. et.al., 1986).
Содержание пептида, % 0 30 60 90 120 150 180 210 Время, мин Рисунок 2. Изменение относительного содержания нативного [3H]семакса в процессе инкубирования с плазматическими мембранами мозга крысы при температуре 4° С 2. Биотехнологический способ получения радиоактивно меченых пептидов (обладающих равной удельной радиоактивностью), а также их немеченых аналогов В последние годы появляется все больше публикаций, демонстрирующих, что так называемые белки-предшественники нейропептидов обладают собственной биологической активностью, зачастую, отличной от действия образуемого гормона (Paterson A.C. et.al., 2002;
Salas M.A. et.al, 1997). (Долгое время считалось, что предшественники не имеют в организме иной роли, кроме участия в качестве субстрата в процессе образования нейропептидов.) В то же время к физиологическим свойствам большинства нейропептидов тоже можно добавить функцию предшественника малых активных молекул. Изучение механизма их действия требует получения достаточного для работы количества пептидов.
Довольно часто синтезы коротких аминокислотных последовательностей (три- или тетра- пептидов) осуществляют конденсацией из нескольких аминокислотных фрагментов, используя в качестве катализаторов различные протеиназы, например, хемотрипсин, бромелаин, или папаин (Shen H.Y. et.al., 1996, 2005;
Clapes P. et.al.,1995;
Tian G.L. et.al., 2005;
Fite M. et.al., 2002). Другой метод получения (более крупных пептидов) объединяет технологии рекомбинантных ДНК, для наработки про-белка в клетках (E.coli), методы химической очистки, для выделения пептида, а также использование ряда протеиназ, для процессинга аминокислотной последовательности и получения необходимых фрагментов. Более сложный вариант метода подразумевает химический синтез модифицированного предшественника и использование специфических ферментов для получения строго определенных продуктов протеолиза (Schellenberger V. et.al, 1992, 1993).
Группа изучаемых глипролинов меланокортинового ряда представляет собой достаточно небольшие пептиды, наиболее длинный из которых (гептапептид семакс), является синтетической молекулой. Характер проводимых экспериментов требует от получаемых соединений практически полного отсутствия побочных продуктов, в том числе – следовых количеств реагентов и солей различных металлов. Меченые пептиды должны обладать очень высокой степенью радиохимической чистоты и одинаковой удельной радиоактивностью, а способ их получения, по возможности, должен быть максимально приближенным к процессу образования описанных глипролинов в организме. Всем этим требованиям вполне удовлетворяет биотехнологический способ получения.
2.1. Синтез пептидов при помощи мембранных аминопептидаз Поскольку при взаимодействии семакса с мембранами мозга крысы образуются преимущественно С- концевые фрагменты, в качестве действующего агента для биотехнологического получения коротких пептидов глипролинового ряда были выбраны ферменты, относящиеся к классу мембранных аминопептидаз (амино ацилариламидаза (Е.С. 3.4.11.2) (АААА) и лейцинаминопептидаза (Е.С. 3.4.11.1) (ЛАП)). В качестве субстрата использовали семакс. По результатам сравнения протеолитической активности выбранных ферментов (данные получены с применением метода ВЭЖХ) установлено, что наилучшими рабочими параметрами в данных условиях обладает АААА, при этом дальнейший протеолиз пептида (на примере Sem-4) протекает менее интенсивно.
В качестве субстрата для получения меченых глипролинов, обладающих равной удельной радиоактивностью, использовали гептапептид, содержащий тритиевую метку в С-концевом пролине. Поскольку АААА не является высокоспецифическим ферментом, в результате протеолиза семакса образуется полный набор С-концевых фрагментов: от Glu-His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro до Pro-Gly-[3H]Pro и отдельных аминокислот. Количественное содержание того или иного фрагмента зависит от времени инкубирования субстрата.
Оценку чувствительности фермента к модификациям субстрата проводили, используя в качестве исходного реагента смесь: 25% [3H]Pro-семакса (56 Ки/ммоль) и 75% меченого гептапептида, окисленного по сере в метионине. Анализ реакционной смеси методом ВЭЖХ показал, что количество [3H-Pro]Sm-4 мало (~ 4%), а количество не подвергшегося протеолизу окисленного [3H-Pro]Sm-7 - значительно (~ 85%). Лишь десятикратное увеличение количества фермента в смеси (с 0.18 ед. до 1.8 ед.
активности) позволило получить (даже из сульфоксида семакса) ряд меченых по С концевому пролину пептидов, обладающих равной удельной радиоактивностью.
Однако, использование данного фермента для получения большого количества пентапептида (как наиболее интересного из группы) осложнено методическими трудностями, связанными с подбором условий и времени выделения необходимого соединения в достаточном количестве, обилием побочных продуктов деградации.
Поэтому потребовался фермент, осуществляющий протеолитическое расщепление семакса строго на ди- (Met-Glu) и пента- (His-Phe-Pro-Gly-Pro) пептиды. Такой фермент был найден: это глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius (MEROPS ID S01.443).
2.2. Cинтез HFPG[3H]P при помощи глутамат-специфичной пептидазы Данная высокоселективная сериновая протеиназа распознает в аминокислотной последовательности белка остаток глутаминовой кислоты, что позволяет, используя меченный семакс в качестве субстрата, получать дипептид ME и меченный пентапептид HFPG[3H]P, без образования побочных продуктов (рис.3).
Таблица 1. Использование глутамат специфичной пептидазы для получения His-Phe Pro-Gly-Pro и His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro (37OС, рН 8.94) Время, Исходное соединение Конечное соединение Выход, % мин Семакс His-Phe-Pro-Gly-Pro 180 N-арахидоноил-семакс His-Phe-Pro-Gly-Pro 180 Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro 180 98* Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro, His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro 300 окисленный по сере в метионине * - анализ реакционной смеси приведен на рисунке 3.
2577 mV Sem-5 97. Semax 2. UV Rad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 мин Рисунок 3. Анализ методом ВЭЖХ реакционной смеси после протеолиза меченого семакса глутамат-специфичной пептидазой. Условия хроматографического разделения: колонка Supercosil ABZ+Plus (4.6х250 мм, 5 мкм), градиент MeOH ( – 40%) в {(NH4)H2PO4+H3PO4 (50 mM, pH 2.8)}. Скорость подачи элюента: 1 мл/мин.
Выход пентапептида остается очень высоким (около 100%) как при инкубировании смеси в соотношении фермент/субстрат = 1/100 (в течение 3 час.), так и в соотношении 1/10000 (через 22 час. инкубирования). При использовании в качестве исходного реагента окисленного по сере семакса, а также арахидоноил-семакса, действие фермента осталось столь же эффективным (выход Sm-5 достигал 96 и 100%, соответственно), а в качестве второго продукта протеолиза удалось выделить арахидоноил – дипептид (AA ME) (табл. 1).
Таким образом, использование высокоспецифичного фермента позволяет (в данных условиях) эффективно осуществлять протеолитическое расщепление производных семакса по остатку Glu, вне зависимости от N-концевых модификаций пептида. Это позволило разработать способ получения радиоактивно меченых пептидов и их производных, используя в качестве субстрата различные, в том числе и модифицированные белки и пептиды с заведомо известным сайтом расщепления, не опасаясь образования побочных продуктов. Зачастую, биосинтез характеризуется как более простой и быстрый путь получения комплексных соединений (например, арахидоноил-пептидов), чем химический синтез.
3. Изучение взаимодействия глипролинов с плазматическими мембранами мозга Механизм действия большинства нейропептидов включает этап специфического связывания с рецептором, либо с определенной белковой структурой на плазматической мембране клетки-мишени, и последующие усиление и передачу полученного сигнала внутрь клетки. Для пептидных регуляторов характерны специфическая локализация и определенная плотность рецепторов, обладающих сродством к изучаемому лиганду, а также индивидуальный набор мембранных протеолитических ферментов (в зависимости от типа клеток) (Kitabgi P., 2006). Стоит также отметить, что для ряда рецепторов (например, тахикинина, брадикинина) было показано, что совместная экспрессия (Okamoto A.. et.al., 1994) или тесная ассоциация рецептора и пептидазы чрезвычайно важны для его функционирования и последующей ресенситизации (Deddish P.A. et.al., 2002;
Erdos E.G. et.al., 2001). В связи с этим, основными задачами на данном этапе изучения стали: определение существования мест специфического связывания, их локализация по отделам мозга, а также характеристика обнаруженных центров для каждого из глипролинов.
3.1. Изучение специфического связывания [3H]семакса В недавнем исследовании (Шевченко К. В. и др., 2006) приведены данные о распределении семакса в мозжечке, базальных ганглиях, коре и гиппокампе мозга крыс после интраназального введения пептида, меченного тритием по С-концевому пролину.
В работе показано, что уже через 2 мин. после введения концентрация семакса в мозжечке и гиппокампе примерно в 2 раза выше, чем в базальных ганглиях и в коре. Это дало основания предположить, что наблюдаемые закономерности связаны с локализацией мест специфического связывания преимущественно в этих отделах мозга.
Действительно, проведенные нами исследования показали, что семакс специфически связывается с мембранами гиппокампа (рис. 4) и мозжечка, а в базальных ганглиях и коре мозга мест специфического связывания не обнаружено (табл. 2).
Равенство значений констант ассоциации лиганд-рецепторного комплекса позволяет предположить, что места специфического связывания семакса в гиппокампе и мозжечке имеют одинаковую природу.
1, Количество специфически связанного 1, [ Н]семакса, пмоль/мг белка 1, 1, 0, Kd =106 +/- 3 нМ 0, 0, 0, 0 50 100 150 200 250 концентрация [3Н]семакса, нМ Рисунок 4. Специфическое связывание [3H]семакса с мембранами гиппокампа крысы при температуре 30°С Таблица 2. Характеристика связывания [3H]семакса в отделах мозга крысы Специфическое Константа Число мест связывания, Отдел мозга связывание связывания, нМ пмоль/мг белка 104 ± 10 0.89 ± 0. Мозжечок есть Базальные не обнаружено - ганглии Кора не обнаружено - 106 ± 3 1.5 ± 0. Гиппокамп есть Поскольку присутствие в инкубационном буфере комбинации ингибиторов могло оказать влияние на точность определения параметров специфического связывания семакса, необходимо было удостовериться в отсутствии побочных эффектов со стороны ингибиторов, то есть охарактеризовать взаимодействие гептапептида с мембранами без каких-либо дополнительных компонентов в реакционной смеси. Проведение экспериментов при температуре инкубации 0 – 4° С показало, что специфическое связывание [3H]семакса обратимо и насыщаемо при концентрации выше 300 нМ, Kd=100 ± 19 нM и Bmax = 2,26 пмоль/мг белка. Константа связывания Kd при 30°С оказалась близка по значению к величине, полученной при 4°С. Это свидетельствует об отсутствии прямого влияния ингибиторов на процессы взаимодействия гептапептида с местами специфического связывания на плазматических мембранах мозга крысы.
3.2. Изучение специфического связывания других [3H]Pro-глипролинов Проведенные эксперименты позволили установить наличие в головном мозге крысы мест специфического связывания пентапептида и PGP (табл. 3). Сходство физиологических эффектов рассматриваемых глипролинов, а также характеристик центров специфического взаимодействия (например, константы связывания) позволяют сделать предположение о единой природе этих мест для гепта- и пента- пептидов.
Таблица 3. Характеристики мест специфического связывания глипролинов Константа Число мест связывания Пептид Отдел мозга крысы связывания Kd, нМ Bmax, пмоль/мг белка 106 ± 3 1.5 ± 0. MEHFPGP гиппокамп, мозжечок EHFPGP Специфическое связывание не обнаружено 82 ± 8 16.6 ± 1, HFPGP гиппокамп, мозжечок Специфическое связывание не обнаружено FPGP 37 ± 2 0,86 ± 0. базальные ядра PGP Об этом же косвенно свидетельствуют единая локализация центров связывания пептидов в мозге и не слишком значительное различие в значениях Kd, при этом сродство Sem-5 к гипотетическим рецепторам, по-видимому, выше.
1, Количество специфически связанного 1, пептида, пмоль/мг белка 0, 0, замороженные 0, охлажденные 0, 0, 0 50 100 150 200 250 300 Концентрация пептида, нМ Рисунок 5. Специфическое связывание PG[3H]P с мембранами клеток базальных ядер.
Необходимо отметить ряд общих для всех изучаемых глипролинов характеристик:
высокая чувствительность к присутствию в инкубационном буфере таких растворителей, как EtOH и DMSO, нестойкость гипотетических рецепторов при хранении мембранных препаратов (не более 3 - 5 дней). При этом сам факт замораживания на свойства мембранных препаратов практически не влияет (рис. 5).
4. Изучение особенностей специфического связывания семакса и пентапептида с плазматическими мембранами мозга крысы Довольно часто пептиды одного семейства взаимодействуют с одними и теми же типами рецепторов, хотя и с разной степенью сродства (Roselli-Rehfuss L. et.al., 1993;
Suzuki I. et.al., 1996;
Mountjoy K.G. et.al., 1994). Это обусловлено существованием в структуре таких лигандов близких по строению участков связывания, образованных вследствие частичного совпадения аминокислотных последовательностей у родственных пептидов. Поскольку исследуемые глипролины представляют собой довольно небольшие и родственные молекулы, в их структуре возможно достаточно точно определить минимальную аминокислотную последовательность, ответственную за специфическое взаимодействие с гипотетическим рецептором.
0.1 мкМ 1 мкМ 10 мкМ 100 мкМ Доля от специфически связанного [3H]семакса, % MEHFPG EHFPG FPG HFPGP FPGP PGP Semax Рисунок 6. Влияние коротких пептидов на специфическое связывание [3H]семакса (50 нМ) с мембранами гиппокампа крысы Для выполнения поставленной задачи были синтезированы различные немеченые фрагменты глипролинов, включая продукты не только N-, но и С- концевого протеолиза, а также трипептид FPG, формирующий центральную часть молекул Sm-7 и Sm-5. На рис. 6 показано, каким образом данные пептиды влияют на специфическое связывание семакса с мембранами гиппокампа крысы.
Все используемые в эксперименте пептиды, в той или иной степени, способны конкурировать с семаксом за места связывания на мембранах. При этом наибольшей эффективностью обладают фрагменты, состоящие из пяти аминокислотных остатков:
EHFPG, HFPGP (вытесняют семакс с мест специфического связывания даже эффективнее, чем немеченый гептапептид).
По результатам экспериментов с меченым Sem-5, среди пептидов удалось выделить три группы отличных по активности молекул: фрагменты, не оказывающие никакого влияния на специфическое связывание пентапептида (даже при концентрации 50 мкМ) это PGP, FPGP и FPG;
пептиды, способные вытеснять с мест специфического связывания до 60-66% Sm-5 (при 50 мкМ) – это семакс и фрагмент MEHFPG;
а также фрагменты, активно конкурирующие с Sem-5 за места взаимодействия на мембранах EHFPG (около 35%) и EHFPGP (до 15%) (рис.7).
0,03 мкМ 0,5 мкМ 1 мкМ 5 мкМ 50 мкМ Доля от специфически связанного HFPG[3H]P, % EHFPG HFPGP EHFPGP Рисунок 7. Влияние коротких пептидов на специфическое связывание [3H]пентапептида (30 нМ) с мембранами гиппокампа крыс Таким образом, минимальная аминокислотная последовательность, необходимая для создания специфического взаимодействия глипролинов меланокортинового ряда с гипотетическими рецепторами на мембранах гиппокампа крысы, вероятнее всего, представляет собой пентапептид HFPGP. В связи с этим, особый интерес представляет изучение взаимного влияния данных пептидов на специфическое взаимодействие их меченых аналогов (рис. 8). Нами было показано, что в представленном диапазоне концентраций немеченых пептидов, пентапептид (HFPGP) вытесняет [3H-Pro]Sm- практически полностью, а семакс (MEHFPGP) - лишь наполовину. При этом, указанные немеченые пептиды способны вытеснить около 90% специфически связанного [3H Pro]Sm-7.
0,01 мкМ 0,1 мкМ 1 мкМ 10 мкМ 100 мкМ Доля от специфически связанного меченого пептида, % 5 + 5* 7 + 5* 5 + 7* 7 + 7* Рисунок 8. Влияние гепта- и пента- пептидов на специфическое связывание MEHFPG[3H]P (50 нМ) и HFPG[3H]P (30 нМ) соответственно 7 + 7* - специфическое связывание MEHFPG[3H]P в присутствии Sm-7, 5 + 7* - специфическое связывание MEHFPG[3H]P в присутствии Sm-5, 7 + 5* - специфическое связывание HFPG[3H]P в присутствии Sm-7, 5 + 5* - специфическое связывание HFPG[3H]P в присутствии Sm-5.
5. Описание возможного механизма взаимодействия семакса с плазматическими мембранами клеток-мишеней мозга Как было показано выше, инкубирование глипролинов с мембранами клеток мозга крысы сопровождается образованием набора фрагментов, способных, в ряде случаев, конкурировать за места специфического связывания нативного пептида. Если воспрепятствовать протеолизу изучаемого пептида (введением ингибиторов), то кривые кинетической и концентрационной зависимостей связывания меченого пептида имеют «классический» вид кривых насыщения. В противном случае, попытка построить графики кинетической зависимости связывания [3H]семакса с плазматическими мембранами переднего мозга крысы в присутствии и в отсутствие избытка немеченого пептида приводит к получению колоколообразных кривых зависимостей с максимумом на 30 мин инкубирования (рис. 9). Эффект повышения связывания [3H]семакса на мин инкубирования возникает и в условиях, когда немеченый пептид вносят после получасового инкубирования с [3H]cемаксом. При совмещении кривых II и III, видно, что участки подъемов на графиках попадают в один и тот же временной интервал.
Интересно отметить, что подобные «колоколообразные» кривые обнаруживают и при изучении кинетики связывания других коротких пептидов, например дерморфина.
10 мин 20 мин Имп./мин.
2000 I 30 мин II III 3 0 20 40 60 Время, мин.
Рисунок 9. Кинетическая зависимость связывания [3H]семакса, меченного по С концевому пролину, с плазматическими мембранами переднего мозга крысы I – общее связывание;
II - cвязывание в присутствии избытка (0,1 мМ) немеченого семакса;
III - cвязывание после внесении избытка (0,1 мМ) немеченого семакса через мин. после начала инкубирования [3H]семакса. 1-6 – описание участков приведено в тексте. На врезке показано содержание пептидных фрагментов семакса в фильтрате инкубационной смеси через 10, 20 и 30 мин. после начала инкубирования (см. рис.1).
Участок (1). В первые минуты после начала инкубирования, нейропептид специфически связывается на плазматических мембранах гиппокампа с высокой скоростью ассоциации, но параллельно идущий процесс деградации семакса приводит к уменьшению количества нативного пептида в инкубационной смеси и, как следствие снижению скорости ассоциации меченого гептапептида. Кривая связывания на графике идет вниз, поскольку количество [3H]семакса падает, а образующийся гексапептид EHFPG[3H]P не способен в данных условиях к специфическому взаимодействию на мембранах. При инкубировании в присутствии немеченого пептида (кривая II), активность протеолитических ферментов уравновешивается высокой концентрацией семакса (как следствие - пик на кривой получается более пологий).
Участок (2). Примерно к 15-20-й минуте инкубирования накапливается некоторое количество пентапептида HFPG[3H]P (обладающего большим, чем у семакса числом мест специфического связывания на мембранах гиппокампа), что соответствует подъему на графике кривой общего связывания (при избытке немеченого гептапептида это происходит быстрее).
Участок (3). Параллельно, в инкубационной смеси также накапливается довольно много тетрапептида FPG[3H]P (способного, вероятно, и к необратимому связыванию и к открыванию дополнительных мест связывания семакса и пентапептида).
Максимум на графике кривой общего связывания приходится на 30 минуту инкубирования (участок 4), когда одновременно детектируют некоторое количество (связанных на мембранах) [3H]тетрапептида, [3H]пентапептида и [3H]семакса (в комплексе с гипотетическими рецепторами пептиды не доступны для ферментов деградации), а также трипептида PG[3H]P, специфическое взаимодействие которого с мембранами базальных ядер, по-видимому, и составляет разницу между амплитудами пиков кривых I и II. Отметим, что такой разницы не существует при инкубировании семакса с мембранами только гиппокампа.
Дальнейший ход кривой I вниз (участок 5) обусловлен, по-видимому, процессом деградации трипептида и других пептидных фрагментов. Наряду с этим, диссоциация [3H]семакса и [3H]пентапептида приводит к образованию дополнительных количеств FPG[3H]P, HFPG[3H]P и PG[3H]P. Как следствие – небольшой рост кривой общего связывания, своего рода «вторая волна» специфических взаимодействий.
Таким образом, сочетание процессов протеолиза гептапептида, а затем и других коротких пептидов - фрагментов семакса, и их специфического взаимодействия на мембранах лежит, по-видимому, в основе молекулярного механизма действия нейропептида. Отметим, что под действием протеолитических ферментов может происходить образование не только глипролинов, рассмотренных в данной работе, но и других пептидных фрагментов обладающих, возможно, собственной биологической активностью (например, актона меланокортинов – MEHF).
6. Изучение влияния некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание пента- и три- пептидов с плазматическими мембранами мозга крысы Большое число и разнонаправленность биологических эффектов, наблюдаемых после введения глипролинов, отражает регуляторную природу данных пептидов и свидетельствует, по-видимому, об изменении активности целого ряда других медиаторных систем организма. Известно, например, о влиянии семакса на нейрохимические показатели дофамин- и серотонин- эргических систем, способности увеличивать скорость оборота серотонина (Себенцова Е.А. и др., 2006;
Еремин К.О. и др., 2005), активировать гены раннего ответа (в том числе, с-fos) в ядрах ряда нейронов (Умрюхин П.Е. и др., 2001), влиять на уровень цАМФ, концентрацию ионов Са2+ в цитоплазме (Асташкин Е.И. и др., 2000). Вероятно, активация данных систем происходит за счет включения внутренних биохимических каскадных процессов и не является следствием прямого специфического взаимодействия глипролинов с соответствующими рецепторами. Так, для выяснения такой возможности было исследовано влияние некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание пента- и три- пептидов с плазматическими мембранами мозга крысы. Были использованы агонисты и антагонисты каннабиноидных (CB1, CB2), ванилоидного, глутаматного, NMDA, дофаминовых (D1, D2), серотониновых (5HT2, 5HT3), адрено- (альфа, бета), ацетилхолинового, опиоидных и меланокортинового рецепторов, а также рецептора гамма-аминомасляной кислоты.
6.1. Изучение особенностей взаимодействия Pro-Gly-[3H]Pro с плазматическими мембранами базальных ядер крысы Таблица 4. Специфическое связывание PG[3H]P в присутствии 10 мкМ некоторых эффекторных молекул известных рецепторов Вносимый % от специфического Тип рецептора агонист/антагонист связывания GABA 49 GABA SR141716A (SR1) 29 CB SR144528 (SR2) 10 CB WIN -10 CB1, CB CP5594 -25 CB1, CB MK801 -26 NMDA NMDA -27 NMDA Capsazepine -12 VR Cyproheptadine -18 5HT Yohimbine -19 alfa-adreno Nicotin -17 AchR (nicotine) Naloxon 82 any opioid R ACTH (4-10) 102 MCR Таблица 5. Специфическое связывание HFPG[3H]P в присутствии 10мкМ некоторых эффекторных молекул известных рецепторов Вносимый % от специфического Тип рецептора агонист/антагонист связывания SR141716A (SR1) 40 CB SR144528 (SR2) 49 CB WIN 56 CB1, CB CP5594 49 CB1, CB MK801 86 NMDA NMDA 73 NMDA Capsazepine 64 VR Haloperidol 84 D2, D3, D Isoproterenol 44 -adreno Yohimbine 48 Alfa-adreno Naloxon 99 Any opioidR ACTH(4–10) 84 MCR Перечень использованных в работе эффекторных молекул известных рецепторов: SR1 (SR 141716A) - селективный ингибитор каннабиноидного рецептора первого типа;
SR2 (SR 144528) - селективный ингибитор каннабиноидного рецептора второго типа;
WIN, CP5594 неселективные агонисты каннабиноидных рецепторов;
Capsazepine - селективный ингибитор ванилоидного рецептора;
MK801 - селективный антагонист NMDA рецепторов, блокирующий ионный канал;
Spiperone – селективный антагонист дофаминового рецептора второго типа, антагонист 1 – адрено, 5-HT2A и 5-HT1 серотониновых рецепторов;
Haloperidol антагонист дофаминовых рецепторов второго и третьего типов;
Ritanserine – селективный антагонист 5-HT2A серотониновых рецепторов;
GABA - -аминомасляная кислота;
Cyproheptadine - антагонист 5-HT2/5-HT1 серотониновых, H1 гистаминовых рецепторов;
Yohimbine - селективный антагонист 2- адрено рецепторов;
Isoproterenol - селективный антагонист - адрено рецепторов;
Naloxon - антагонист,, и опиоидных рецепторов;
Tropisetron - селективный антагонист 5-HT3 рецепторов.
Из всего набора соединений только фрагмент АКТГ(4-10), налоксон и гамма аминомасляная кислота практически не оказывали влияния на связывание трипептида.
Все другие соединения в той или иной степени уменьшали специфическое связывание PGP (табл. 4). Однако это, по-видимому, не свидетельствует о способности трипептида специфически связываться со всеми типами рецепторов за исключением меланокортинового и опиоидных рецепторов, а также рецепторов к гамма аминомасляной кислоте. Скорее наоборот, полученные данные показывают, что многие молекулы, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны вытеснять его со специфических мест связывания.
His-Phe-Pro-Gly-[3H]Pro 6.2. Изучение особенностей взаимодействия с плазматическими мембранами гиппокампа крысы Практически все соединения снижали специфическое связывание HFPGP (табл. 5).
Полученные данные показывают, что многие эффекторные молекулы известных рецепторов, по-видимому, содержат в своей структуре фрагменты, пространственно похожие на HFPGP и способны вытеснять его со специфических мест связывания. Это не исключает и возможности пентапептида взаимодействовать с соответствующими рецепторами на мембранах гиппокампа, хотя и с менее высокой степенью сродства.
7. Изучение взаимодействия ацилированных пептидов и аминокислот с центрами специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах гиппокампа крысы Последнее время, все больший интерес вызывают эндогенные аминокислоты, ацилированные жирными кислотами, в частности – арахидоновой. Арахидоновая кислота (АА), входящая в состав фосфолипидов плазматических мембран, является биологически активным соединением, служит предшественником эйкозаноидов, которые образуются почти во всех клетках организма.
Так, менее десяти лет назад в организме млекопитающих были найдены глицин и аланин, ацилированные арахидоновой кислотой (Huang S. M. et.al., 2001;
Burstein S.H.
et.al., 2000). Известно о существовании ациламинокислот у обитающих на суше (Kawazoe R. et.al., 1991) и морских бактерий (Yagi H., 1997). На примере АА-Gly следует подчеркнуть, что ни АА, ни Gly (в качестве самостоятельных соединений) не демонстрируют эффектов, свойственных пептолипину АА-Gly ( Wiles A.L. et.al., 2006).
Изучение различных свойств синтетических аналогов арахидоноил-аминокислот позволит, по-видимому, в будущем включить ацильные производные не только аминокислот, но и пептидов, в ряд новых полифункциональных регуляторов биологической активности организма (Безуглов В. В. И др., 2006). Одним из подобных перспективных соединений является арахидоноил-семакс, в состав которого входят семакс и АА-кислота, присоединенная с N-конца.
[3H]АА-семакса 7.1. Изучение взаимодействия с плазматическими мембранами гиппокампа крысы Нам удалось обнаружить существование мест специфического связывания [3H]АА семакса (рис. 10) на мембранах мозжечка и гиппокампа крысы в присутствии гептапептида (Kd = 51 ± 3 нМ, Bmax = 35 ± 1 пмоль/мг белка). Связывание пептолипина обусловлено, по-видимому, специфическим взаимодействием пептидного участка молекулы. АА-семакс (в концентрации 50 мкМ) способен наполовину блокировать специфическое связывание семакса и пентапептида (47% и 46% соответственно), в то время как ацил- аминокислоты и ацил- пептиды (AA-PGP, AA-TA-PGP, AA-His, AA Phe, AA-Pro, AA-Met) не влияют на специфическое связывание семакса и пентапептида, а лишь на 10-20% увеличивают число неспецифических взаимодействий. Это подтверждает ведущую роль крупного пептидного фрагмента (пентапептида) в образовании специфического взаимодействия АА-семакса на мембранах гиппокампа.
Количество связанного [3Н]АА-семакса, пмоль/мг. белка Kd = 51 ± 3 нМ 0 20 40 60 80 100 120 140 Концентрация [3Н]AA-семакса, нмоль Рисунок 10. Специфическое связывание [3H]AA-семакса с мембранами гиппокампа крысы Большее число мест специфического связывания, а также меньшее значение Kd для пептолипина (чем для семакса или пентапептида) обусловлено, по-видимому, тем, что комбинированная молекула, за счет присутствия жирной кислоты в составе соединения, использует для специфического взаимодействия не только места связывания пептида.
Причём дополнительное место взаимодействия может быть расположено как на белке, так и в мембране. Выяснение этого требует проведения отдельных экспериментов, что вероятно, будет являться одним из предметов дальнейших исследований.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что семакс (при инкубировании с плазматическими мембранами клеток мозга крысы) подвергается значительному протеолизу с образованием преимущественно С-концевых фрагментов пептида. Определена комбинация ингибиторов протеаз, присутствие которой гарантирует сохранение достаточного количества интактного семакса в течение всего времени инкубирования.
2. Установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса (Kd = 106 ± 3 нМ) и пентапептида HFPGP (Kd = 82 ± 8 нМ) на плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа;
на плазматических мембранах базальных ядер мозга установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания трипептида PGP (Kd = 37 ± 2 нМ).
3. Разработан биотехнологический способ получения коротких пептидов (производных семакса), меченных тритием по С-концевому пролину, а также их немеченых аналогов. Метод основан на применении высокоспецифичного фермента (глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius) и позволяет получать пептиды (в данном случае, HFPGP) с высоким выходом и без образования побочных продуктов.
4. Установлено, что инкубирование глипролинов с мембранами клеток мозга крысы сопровождается образованием набора фрагментов, способных в ряде случаев конкурировать за места специфического связывания интактного пептида. Так, пептиды EHFPG и HFPGP вытесняют меченый семакс с мест специфического связывания даже эффективнее, чем немеченый MEHFPGP.
5. Показано существование конкуренции за места специфического связывания пентапептида HFPGP и трипептида PGP со стороны некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов (канабиноидных, ванилоидного, адрено- и др.).
6. На мембранах мозжечка и гиппокампа крысы обнаружены места специфического связывания меченного по арахидоновой кислоте [3H]АА-семакса и определены характеристики центров специфического взаимодействия (Kd = 51 ± 3 нМ, Bmax = 35 ± 1 пмоль/мг. белка).
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение особенностей связывания нейропептида семакс, меченного по концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // Нейрохимия. – 2006. - № 1. – С. 290 – 295.
2. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф. Специфическое связывание семакса в различных отделах мозга крыс // ДАН. – 2006. – Т. 410. - № 1. – С. 1 – 2.
3. Безуглов В. В., Грецкая Н. М., Блаженова А. В., Андрианова Е. Л., Акимов М. Г., Бобров М. Ю., Назимов И. В., Кисель М. А., Шарко О. Л., Новиков А. В., Краснов Н.
В., Шевченко В. П., Шевченко К. В., Вьюнова Т. В., Мясоедов Н. Ф.
Aрахидоноиламинокислоты и арахидоноилпептиды: синтез и свойства // Биоорган.
хим. – 2006. – Т. 32. - №3. – С. 258 – 267.
4. V’unova T. V., Shevchenko K. V., Shevchenko V. P., Bobrov M. Yu., Bezuglov V. V., Myasoedov N. F. Studies of peculiarities of binding of the Semax neuropeptide, with a labeled terminal proline residue to plasma membranes of rat brain // Neurochemical J. – 2007. - Vol. 1. - № 1. – P. 37 - 42.
5. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф.
Взаимодействие трипептида Pro-Gly-Pro, меченного по С концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // ДАН. – 2008. - Т. 419. - № 1.
– С. 136 – 137.
6. V’unova T. V., Shevchenko K. V., Shevchenko V. P., Bobrov M. Yu., Bezuglov V. V., Myasoedov N. F. Binding of regulatory neuropeptide [3H]-Semax (MEHFPGP), labeled in terminal Pro, to plasma membranes of the rat forebrain // European Neuropsychopharmacology Meeting. – 2005. – Р. 68.
7. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение особенностей связывания нейропептида семакс, меченного по концевому остатку пролина, с плазматическими мембранами мозга крыс // Тезисы II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. - 2005. - С-Пб. – С. 38.
8. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф.
Биотехнологический способ получения коротких пептидов и их радиоактивно меченых аналогов. // Тезисы VI симпозиума “Химия протеолитических ферментов”.
- 2007. – Москва. – С. 54.
9. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф. Семакс как лекарственный препарат и источник уникального регуляторного комплекса. // Тезисы IV-го международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии».– 2008. – Судак, Украина. – С. 86.
10. Вьюнова Т.В., Шевченко К.В., Шевченко В.П., Безуглов В.В., Мясоедов Н.Ф.
Нейропептиды – индивидуальные регуляторы и предшественники комплекса биологически активных молекул. // Тезисы конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». - 2008. - С-Пб. – С. 26.