Изучение воздействия продуктов зрительного цикла на бислойные липидные мембраны
На правах рукописи
Соколов Алексей Владимирович
ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРОДУКТОВ ЗРИТЕЛЬНОГО ЦИКЛА НА
БИСЛОЙНЫЕ ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ
Специальность 03.00.02 – «Биофизика»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009
2
Работа выполнена на кафедре Биофизики Биологического факультета МГУ им.
М.В. Ломоносова и в лаборатории биоэлектрохимии Института Физической Химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН.
Научные руководители:
кандидат физико-математических наук, ведущий научный сотрудник В.С. Соколов член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Ю.А. Чизмаджев
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Антоненко кандидат химических наук А.В. Лебедев
Ведущая организация Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН
Защита диссертации состоится 9 апреля 2009 г. в 14 час. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова по адресу:
119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, аудитория «Новая».
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова
Автореферат разослан «6» _марта_ 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева Актуальность проблемы. В настоящее время стремительно растет количество людей, страдающих заболеваниями зрения, обусловленными нарушениями цикла зрительного родопсина (называемого также зрительным циклом) и накоплением его побочных продуктов в сетчатке глаза. Под зрительным циклом подразумевается последовательность биохимических реакций, в ходе которой молекула родопсина, основного светочувствительного белка сетчатки глаза человека, восстанавливает свою способность к фоторецепции после поглощения кванта света. В результате фотолиза родопсина его хромофорная группа, 11-цис-ретиналь, изомеризуется в полностью-транс-ретиналь (далее сокращенно обозначается «ретиналь», либо «ATR»), отсоединяется от белковой части молекулы и оказывается в свободном состоянии в мембране диска фоторецепторной клетки. При нормальном функционировании зрительного цикла свободный ретиналь сразу же восстанавливается до ретинола, транспортируется в клетки пигментного эпителия сетчатки, там снова превращается в 11-цис-ретиналь и возвращается обратно в фоторецепторную клетку для соединения с молекулой родопсина.
В патологических ситуациях механизм удаления ретиналя из фоторецепторной мембраны нарушается, и он может накапливаться в липидном бислое. Там он способен связываться с одним из мембранных фосфолипидов – фосфатидилэтаноламином, образуя сначала N-ретинилиден-этаноламин, а затем – бис-ретинилиден-этаноламин (A2E). В конечном итоге это приводит к гибели клеток и развитию возрастной деградации сетчатки глаза, болезни Штаргардта, различных ретинопатий и других опасных заболеваний зрения. Помимо этого, A2E и другие продукты взаимодействия ретиналя с белками и липидами мембран дисков фоторецепторных клеток в ходе их обновления фагоцитируются клетками пигментного эпителия сетчатки, но перерабатываются лишь частично и накапливаются в виде гранул так называемого «пигмента старости», или липофусцина.
Известно, что гибель клеток в ходе развития заболеваний сетчатки в первую очередь обусловлена разрушением их мембран. По этой причине наибольший интерес представляют исследования воздействия ретиналя и компонентов липофусцина на биологические мембраны в темновых условиях и при освещении.
Полученные на сегодняшний день данные о воздействии продуктов зрительного цикла на мембраны в большинстве своем носят качественный характер и свидетельствуют, как правило, только о наличии деструктивного эффекта и гибели клеток сетчатки. В то же время, механизмы разрушения мембран можно изучать на модельной системе. Наиболее удобной моделью является бислойная липидная мембрана (БЛМ). Преимущество такой системы контролируемый состав и набор методов, позволяющих изучать физические механизмы разрушения, что и составило предмет данной работы.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы было исследование физических механизмов воздействия A2E и полностью-транс-ретиналя на свойства бислойных липидных мембран. Были сформулированы следующие задачи:
1. Изучить влияние A2E на стабильность и физические свойства мембран различного липидного состава в темновых условиях 2. Изучить воздействие ретиналя на электростатические и механические свойства мембраны. Сравнить влияние ретиналя и A2E на распределение электрического поля внутри БЛМ и ее структурные свойства.
3. Изучить фотодинамическое разрушение мембран под действием ретиналя и A2E и влияние на эти процессы липидного состава мембраны.
4. Изучить механизм фотодинамического воздействия A2E и ретиналя на мембранные белки на примере встроенного в БЛМ грамицидинового канала.
5. Изучить способность ретиналя к автоокислению по изменениям в его спектре поглощения, возникающим при облучении видимым светом, в водном растворе и в липосомах различного липидного состава.
Научная новизна. В данной работе впервые используется БЛМ как модель биологической мембраны для исследования воздействия побочных продуктов зрительного цикла на липидный бислой. Ранее исследования токсичности этих соединений проводились только на живых клетках, либо изучались их фотохимические свойства в различных растворителях, и только в нескольких работах были получены данные об их воздействии на липосомы.
Впервые было изучено влияние A2E на стабильность мембран методом электрического пробоя, что позволило количественно оценить изменение таких параметров, как поверхностное натяжение мембраны, линейное натяжение спонтанно образующихся пор, количество дефектов и скорость изменения радиуса дефекта при наличии в составе мембраны бис-ретинилиден этаноламина.
Впервые было измерено изменение граничного потенциала, возникающего на БЛМ при встраивании в нее ретиналя, и проведено сравнение влияния A2E и ретиналя на профиль распределения электрического поля в мембране.
Впервые было показано влияние липидного состава мембраны на количество ретиналя, накапливающего в БЛМ, а также на его патогенное воздействие на мембрану.
Используемый в работе метод фотоинактивации грамицидинового канала использован впервые для исследования фотореакционной способности A2E и ретиналя.
Достоверность результатов. Достоверность результатов работы и обоснованность выводов обеспечивается тем, что использованные методики и модели успешно использовались ранее для исследования свойств БЛМ и воздействия на них различных биологически активных веществ – ионофоров, фотосенсибилизаторов, липофильных ионов.
Теория необратимого электрического пробоя БЛМ, взятая за основу для оценки влияния A2E на микроскопические структурные параметры мембраны, была разработана еще в 80-е годы и неоднократно проверялась экспериментально в нашей и других лабораториях.
Применяемый в работе метод фотоинактивации грамицидинового канала успешно применялся ранее в лаборатории, возглавляемой Ю.Н.Антоненко, в исследованиях активности фотосенсибилизаторов и кинетики формирования самих каналов.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты данного исследования важны для понимания механизмов воздействия ретиналя и A2E на мембраны клеток сетчатки. Полученная новая информация о процессах, лежащих в основе гибели клеток и патогенеза заболеваний зрения, может быть использована для поиска более эффективных способов их профилактики и лечения. Разработанные в ходе выполнения работы методики при исследовании деструктивного воздействия ретиналя и A2E могут быть полезны в дальнейшем для изучения взаимодействия других соединений с БЛМ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на VIII Международном Фрумкинском Симпозиуме (Москва, 2005), 15 Международном Конгрессе Европейского Биофизического Общества (Montpellier, 2005), III Cъезде Биофизиков России (Воронеж, 2004), семинарах кафедры Биофизики Биологического факультета МГУ (Москва, 2004, 2005, 2007), семинарах лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ им. Фрумкина РАН (Москва, 2006) и на Конференции Молодых Ученых в ИФХЭ им. Фрумкина РАН (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них три статьи в российских и зарубежных журналах (из списка ВАК).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), полученных результатов с их обсуждением (главы 3 и 4), выводов и списка цитируемой литературы из наименований. Работа изложена на страницах, иллюстрирована рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение Рассмотрена актуальность выбранной темы, кратко описан объект и перечислены основные методы исследования, обоснованы научная новизна работы, достоверность результатов и выводов, а также теоретическая и практическая значимость.
Глава 1. Обзор литературы В первой части литературного обзора (раздел 1.1) кратко изложены сведения о строении зрительной системы, ее функциональных и структурных элементах и о структуре основного фоторецепторного белка человека – зрительного родопсина, расположенного в мембранах дисков наружного сегмента светочувствительных клеток. Описана структура опсина (белковой части родопсина, лишенной ретиналя), выделенного из наружных сегментов палочек быка.
Далее приведено описание последовательности фотохимических процессов, происходящих в зрительном родопсине в результате поглощения кванта света, кратко описаны конформационные перестройки белковой части родопсина и процесс фототрансдукции, который представляет собой каскад ферментативных реакций, обеспечивающих усиление первичного светового сигнала в 105–106 раз.
Вторая часть обзора (раздел 1.2) посвящена описанию цикла зрительного родопсина и путей образования его побочных продуктов, один из которых, бис ретинилиден-этаноламин (A2E), является объектом исследования в данной работе. Описан процесс накопления липофусцина в клетках зрительного эпителия. Кратко охарактеризованы другие компоненты липофусцина, являющиеся, как и A2E, производными ретиналя.
В третьей части литературного обзора (раздел 1.3) приведены имеющиеся на сегодняшний день данные о возможных механизмах патогенного воздействия продуктов зрительного цикла на сетчатку. Рассмотрены результаты работ по изучению свойств ретиналя как фотосенсибилизатора, его способности генерировать активные формы кислорода и оказывать фотоокислительное воздействие на ненасыщенные липиды и некоторые белки.
В завершение обзора (раздел 1.4) формулируется основная цель работы изучение механизмов воздействия A2E и ретиналя на мембраны и встроенные в них полипептиды. Выбор задачи исследования обусловлен тем, что предполагаемые механизмы развития заболеваний зрения, сопровождающихся появлением в фоторецепторных клетках полностью-транс-ретиналя и A2E, во многом связаны с их разрушительным воздействием на мембраны клеток. В качестве объекта предлагается бислойная липидная мембрана как модель биологической мембраны. Описаны основные преимущества этого объекта для решения проблемы патогенного воздействия ретиналя и A2E, а также проведенные ранее исследования электростатических изменений, возникающих в липидном бислое под действием биологически активных веществ.
Перечислены задачи, которые представляется возможным решить с помощью электрических измерений на БЛМ.
Глава 2. Материалы и методы Формирование БЛМ. Искусственные бислойные липидные мембраны формировались по методике Мюллера-Рудина (Mueller, 1963). Для получения БЛМ применяют ячейку из инертного гидрофобного материала (тефлон), разделенную перегородкой на две равные по объему камеры, в которые добавляется буферный раствор. Бислойная мембрана формируется на круглом отверстии (диаметр 0.8 нм) в центре перегородки, которое предварительно смачивается мембранообразующей смесью и высушивается для увеличения гидрофобности. После этого отсеки ячейки заполняются буфером, а на отверстие в перегородке наносят каплю мембранообразующей смеси. Под действием расклинивающего давления формируется липидный бислой, в то время как растворитель (декан) вытесняется к краям отверстия – уходит в «мениск».
В каждом из отсеков находился хлорсеребряный электрод, контактирующий с буферным раствором через солевые мостики, изготовленные из наконечников для микропипеток. Нижнюю часть наконечника заполняли агаром, приготовленным с 0,1 М КСl, а сверху наливали водный раствор 0,1 М KCl, в который погружали электрод. Сопротивление электродов с мостиками составляло не более 40 – 50 кОм. К одному электроду подключали генератор переменного пилообразного напряжения (выход ЦАП платы L780, Lcard, Россия), а ко второму - усилитель тока Keithley-427 (США), выход которого связан со входом АЦП той же платы. Для контроля формирования БЛМ измеряли ее емкость. Емкость рассчитывалась компьютерной программой как отношение амплитуды скачка тока к скорости изменения приложенного к мембране потенциала, а проводимость – как наклон вольт-амперной характеристики в точке нулевого напряжения. Типичные значения емкости БЛМ в экспериментах составляли 1,5-2,5 нФ.
Буферный раствор готовили на дважды дистиллированной воде из KCl (х.ч.
“Реанал”, Россия) и HEPES (“Calbiochem”, США). В работе использовали буфер следующего состава: 10 мM KCl, 1 мM HEPES, pH 7,5. Для подведения pH использовали KOH (х.ч., «Реанал»). Препараты А2Е были синтезированы и очищены в Институте Биохимической Физики РАН с помощью методов, описанных в работе (Parish, 1998).
Для формирования мембраны использовались дифитаноилфосфатидилхолин (DPhPC) диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), кардиолипин (CL), дифитаноилфосфатидилэтаноламин (DPhPE) и дифитаноилфосфатидилсерин (DPhPS), растворенные в декане в различных концентрациях (15-40 мг/мл).
Встраивание A2E в БЛМ. А2Е встраивали в мембрану двумя различными способами. В экспериментах по изучению детергентного эффекта A2E (электрический пробой, измерение поверхностного натяжения) его вводили непосредственно в мембранообразующую смесь в концентрации 5-10 мольных процентов от общего количества липидов. Во всех остальных опытах (опыты с фотоэффектами) спиртовой раствор A2E добавляли в водный раствор с одной стороны БЛМ– противоположный по отношению к источнику света. После этого наблюдали за процессом адсорбции по изменению разности граничных потенциалов, измеряемой методом КВП. Адсорбция A2E на мембране длилась в среднем 40-60 минут в условиях непрерывного перемешивания водного раствора в отсеках ячейки. Второй способ (добавление в водный раствор) оказался гораздо более эффективным, поскольку позволял встроить пигмент в мембрану в значительно более высокой концентрации, чем при его предварительном добавлении в мембранообразующую смесь.
Встраивание ретиналя в БЛМ. Проникновение ретиналя в БЛМ регистрировали по изменению либо проводимости бислоя в присутствии ионофоров, либо по разности граничных потенциалов методом компенсации внутримембранного поля (КВП). В первом случае проводимость БЛМ индуцировалась нонактином (N), который является переносчиком катионов, или пентахлорфенолом (PCP), переносящим анионы. В этих опытах ионофоры добавлялись симметрично в оба отсека ячейки. Концентрации нонактина и пентахлорфенола в водном растворе составляли по 50 мкМ. В опытах с ионофорами ретиналь добавлялся симметрично в оба отсека ячейки. В экспериментах по наблюдению фотоэффектов и изменений разности граничных потенциалов его добавляли только в цис-отсек ячейки.
Методы изучения фотодинамического воздействия ретиналя и A2E.
Бислойная липидная мембрана освещалась через прозрачное окошко ячейки с помощью ртутной лампы видимого света мощностью 250 Вт. Ее свет проходил через водный тепловой фильтр и стеклянный светофильтр СЗС-20, ограничивающий спектр синей областью (ниже 550 нм). С помощью линзы свет фокусировался на отверстии тефлоновой ячейки. Интенсивность освещения БЛМ, измеренная с помощью калориметра РТН-31С, составляла 340 Вт/м2.
Опыты по фотоинактивации грамицидина проводились по той же методике, что и в работах с другими фотосенсибилизаторами (Рокицкая, 1993, 1996). В оба отсека ячейки добавлялся грамицидин A (“Sigma-Aldrich Corp.”, США) так, чтобы его концентрация в ячейке составляла 10-10 M. В опытах с тушителем синглетного кислорода в оба отсека добавлялся водный раствор азида натрия NaN3 (“Sigma-Aldrich Corp.”). Концентрация азида в ячейке составляла 20 мМ.
Супероксиддисмутаза (Cu-Zn, лиофилизированный порошок, “Sigma-Aldrich Corp.”) добавлялась тоже в оба отсека ячейки, так что ее концентрация в буферном растворе составляла 0.25 мг/мл. Флорицин, в отличие от грамицидина, добавляли асимметрично, либо в цис-, либо в транс-отсек, и в течение 40-60 минут перед началом освещения наблюдали за его адсорбцией по изменению разности граничных потенциалов, измеряемой методом КВП.
Метод компенсации внутримембранного поля по амплитуде второй гармоники (КВП) основан на способности мембран сжиматься в электрическом поле, тем самым увеличивая свою емкость (Соколов, 1980).
Минимальное значение емкости наступает, когда электрическое поле внутри мембраны равно нулю, поэтому напряжение, при котором оно достигается, равно разности граничных потенциалов БЛМ. К мембране прикладывали сумму синусоидального (с выхода генератора Г3-118, Россия) и постоянного напряжений. Величина постоянного напряжения автоматически подбирается такой, чтобы достичь минимального значения емкости мембраны. Момент, когда мембрана достигает минимальной емкости, регистрируется по отсутствию второй гармоники емкостного тока. Регулирование постоянного напряжения, обеспечивающего нулевую амплитуду сигнала второй гармоники, осуществляется автоматически с помощью обратной связи. Для этого вторая гармоника емкостного тока с выхода преобразователя ток-напряжение (Keithley-427, США) усиливается селективным усилителем (Ф582, Россия) и подается на плату АЦП (L-card), встроенную в компьютер.
Программа, разработанная в лаборатории биоэлектрохимии, осуществляет синхронное детектирование сигнала второй гармоники, превращая переменное напряжение в постоянное, которое подается на мембрану в сумме с синусоидальным напряжением, замыкая петлю отрицательной обратной связи.
В результате наступает устойчивое равновесие, при котором амплитуда второй гармоники поддерживается равной нулю. Соответствующая этому условию постоянная составляющая напряжения на мембране, равная разности граничных потенциалов, непрерывно регистрируется и записывается в память компьютера.
Эксперименты на липосомах. Получение спектров поглощения ретиналя.
Липосомы изготавливались из тех же липидов, которые использовали для формирования БЛМ – DPhPC и DOPC. Липид растворяли в хлороформе ( мг/мл), который после растворения высушивали в пробирке под струей аргона, так чтобы липид оставался в виде тонкого слоя на ее стенках. Пробирку интенсивно встряхивали с буферным раствором (10 мM KCl, 1 мM HEPES, pH 7.5, 1 мг сухой массы липида на 1 мл буфера) в течение 5-10 минут для получения взвеси мультиламеллярных липосом. После встряхивания полученную суспензию 19 раз пропускали через экструдер “LiposoFast” (Avestin Inc., Канада) с диаметром фильтра 100 нм для получения суспензии моноламеллярных липосом, которую впоследствии разбавляли еще в 200 раз для снятия спектров поглощения.
Для получения спектров использовали флюориметр «Флюорат 02 Панорама»
(«Люмэкс», Россия), работающий в режиме снятия спектров поглощения и подключенный к компьютеру. В кварцевую кювету наливали 1 мл буферного раствора, снимали спектр его поглощения (нулевую линию), после чего вместо буферного раствора ту же кювету заполняли суспензией липосом, в которую впоследствии добавляли 1-5 мкл спиртового раствора ретиналя (конечная концентрация ретиналя в кювете составляла 16 мкМ в буфере). Нулевая линия (спектр поглощения исходного буферного раствора без добавок) вычиталась из полученного спектра ретиналя с липосомами. Для освещения кюветы использовали ту же ртутную лампу, что и при наблюдении фотоэффектов в опытах с БЛМ.
Глава 3. Изучение воздействия бис-ретинилиден-этаноламина на бислойные липидные мембраны.
3.1 Детергентное воздействие A2E на БЛМ.
Целью первого этапа работы было исследование механизма «детергентного»
(темнового) воздействия A2E на бислойные липидные мембраны различного липидного состава. В первую очередь было исследовано влияние бис ретинилиден-этаноламина на время жизни мембран во внешнем электрическом поле. К БЛМ прикладывалось постоянное напряжение и измерялся ток через мембрану (рис.1). Момент лавинообразного увеличения тока свидетельствовал о разрушении мембраны в результате ее электрического пробоя. Время жизни БЛМ измерялось с момента включения напряжения до момента ее разрушения, и строилась зависимость среднего времени жизни либо десятичного логарифма среднего времени жизни, от приложенного напряжения (каждая точка – результат усреднения по 5-10 измерениям),.
Рис.1. Зависимость величины регистрируемого тока от времени (данная кривая была получена для мембраны из DPhPC), находящейся в постоянном электрическом поле.
Лавинообразное увеличение тока свидетельствует об электрическом пробое БЛМ.
Была получена зависимость среднего времени жизни мембран, сформированных из насыщенного незаряженного липида DPhPC (рис.2а) и из ненасыщенного незаряженного липида DOPC от приложенного напряжения (рис.2б), без A2E (кривая 1) и в его присутствии (кривая 2). Бис-ретинилиден этаноламин добавлялся предварительно в раствор липида в декане, так что мольная доля пигмента от общего количества липида составляла 5%.
40 tср, мс tcр, мс 20 300 400 400 U, мВ U, мВ а) б) Рис.2. Зависимость среднего времени жизни БЛМ, сформированных из DPhPC (а) либо DOPC (б), в отсутствие A2E (контрольная кривая 1) и после предварительного добавления 5% A2E в мембранообразующую смесь.
Из полученных кривых видно, что присутствие A2E не вызывало уменьшения стабильности мембран, сформированных из DPhPC, и приводило лишь к незначительному уменьшению времени жизни мембран из DOPC.
Аналогичные измерения проводились и со смесью заряженных липидов, близкой по составу к мембранам дисков наружного сегмента DPhPC/DPhPE/DPhPS (липиды в массовом соотношении 45:45:10). На рис.3а приведены зависимости десятичного логарифма среднего времени жизни мембран от приложенного напряжения, построенные при разной концентрации A2E в мембранообразующей смеси – 0%:, 5% и 10% по массе от общего количества липидов.
ln (t, сек) Gср, нСм - - -6 200 400 Без A2E 5% A2E 10% A2E а) б) U, мВ Рис.3. Детергентное воздействие A2E на мембраны, содержащие фосфатидилсерин а) Зависимость логарифма среднего времени жизни БЛМ, сформированных из смеси липидов DPhPC/DPhPE/DPhPS в весовом соотношении 45:45:10, от приложенного напряжения.
Кривая 1 – контроль (без A2E), кривая 2 – 5% A2E, кривая 3 – 10% A2E б) Проводимости БЛМ, сформированных из DPhPC/DPhPE/DPhPS (45:45:10) с разным количеством A2E. Каждый столбец иллюстрирует среднюю проводимость по 15- мембранам. В качестве погрешности взята стандартная ошибка. Различные столбцы соответствуют разному количеству A2E, добавленного в раствор липидов: «Контроль» (без A2E);
«5% A2E» – мольная доля A2E в липидной смеси 5%;
«10% A2E» – мольная доля A2E в липидной смеси 10 %.
Было обнаружено значительное (на 1-2 порядка) уменьшение времени жизни БЛМ, сформированных из смеси DPhPC/DPhPE/DPhPS, которое зависело от количества введенного в мембрану пигмента. Обнаруженное детергентное воздействие A2E на мембраны такого состава, предположительно, обусловлено электростатическим взаимодействием его положительно заряженных молекул с отрицательно заряженными молекулами фосфатидилсерина. В результате такого взаимодействия может образоваться комплекс А2Е с DPhPS, дестабилизирующий мембрану. Поскольку в мембранах клеток зрительного эпителия фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин содержатся примерно в таком же соотношении (45:45:10), естественно предположить, что A2E может оказывать детергентное воздействие и на эти мембраны.
Метод электрического пробоя позволяет не только зафиксировать уменьшение стабильности БЛМ, но и выяснить, на какие именно физические параметры бислоя воздействует встроенный в него A2E. Для этого зависимость среднего времени жизни БЛМ от приложенного натяжения, полученная экспериментально для смеси DPhPC/DPhPE/DPhPS, была аппроксимирована теоретической функцией зависимости среднего времени жизни мембраны от приложенного напряжения (Чизмаджев и др., 1982):
3/ 2 (kT ) t ср = exp CU 2 1 / 2 kT ( + CU ) 4c0 Am D ( + ) 2 (1) Зависимость среднего времени жизни мембраны tср от приложенного напряжения U определяется несколькими параметрами: поверхностным натяжением, линейным натяжением спонтанно образующихся пор, площадью мембраны Am (которая считается постоянной), концентрацией дефектов на единицу площади с0 и скоростью изменения радиуса дефекта (коэффициент диффузии поры D в пространстве радиусов). Поверхностное натяжение мембраны было измерено с помощью метода выдувания (Benz, 1975) и составило 4.1±0.5 эрг/м2 и 3.5±0.5 эрг/м2 для мембран в отсутствие A2E и в присутствии 10% A2E, соответственно. Экспериментальные кривые аппроксимировали теоретическими по формуле (1), подбирая значения двух параметров - линейного натяжения поры и произведения C0AmD. Результаты представлены в таблице 1.
С0AmD, м2/сек, Н (6,5 ± 0,13) x 10-12 (5,7 ± 1,52) x 10- Контроль (7,1 ± 1,37) x 10-12 (1,4 ± 0.47) x 10- 5% A2E (8,0 ± 0,83) x 10-12 (1,3 ± 0,31) x 10- 10% A2E Таблица 1. Рассчитанные значения параметров (линейное натяжение спонтанно образующихся пор) и С0AmD (произведение общего количества дефектов в мембране на коэффициент диффузии дефекта в пространстве радиусов) для мембраны, сформированной из смеси липидов DPhPC:DPhPE:DPhPS с добавлением A2E: 0 (контроль), 5 и 10 % от общей массы липидов.
Из значений параметров, полученных в результате аппроксимации, следует, что при увеличении количества A2E в мембране происходит незначительное увеличение линейного натяжения спонтанно образующихся пор (левая колонка в табл.1) и гораздо более значительное (на 2-3 порядка) увеличение количества дефектов либо коэффициента их диффузии в пространстве радиусов (правая колонка в табл.1).
Помимо уменьшения времени жизни, было обнаружено, что мембраны из смеси DPhPC/DPhPE/DPhPS, содержащие A2E, обладают значительно более высокой проводимостью по сравнению с контрольными «чистыми» мембранами. На рис.3б показаны средние стационарные проводимости БЛМ, которые достигались через 10-15 минут после их формирования. Увеличение проводимости зависело от мольной доли A2E в смеси липидов, используемой для формирования БЛМ. Так, средняя проводимость мембран, содержащих 10% A2E, составила около 110 нСм, а с 5% A2E в мембранообразующей смеси – только 30 нСм. Проводимость «чистых» мембран, не содержащих A2E, не превышала 5 нСм. Проводимость мембран, сформированных из незаряженных липидов (DPhPC либо DOPC), не зависела от наличия в составе мембраны A2E и не превышала 20-30 нСм (не показано на рисунке). Обнаруженное увеличение интегральной проводимости БЛМ в присутствии A2E подтверждает гипотезу об увеличении числа спонтанно образующихся пор, предложенную выше.
Таким образом, было показано, что нарушение стабильности мембран в темноте в присутствии А2Е сильно зависит от их липидного состава. При этом решающую роль играет наличие в мембране липидов с отрицательно заряженными полярными группами. Это подтверждает полученные в других работах данные об увеличении детергентного эффекта A2E при наличии в составе мембраны фосфатидилсерина (De, 2002). В соответствии с теорией электрического пробоя БЛМ, уменьшение времени жизни при наличии в мембране A2E обусловлено локальными искривлениями бислоя, которые в конечном итоге приводят к увеличению вероятности появления в мембране спонтанно образующихся пор и росту скорости изменения их радиуса.
3.2. Фотодинамическое воздействие A2E на мембраны и встроенные в них полипептиды 3.2.1. Фотодеструктивное воздействие A2E на мембраны С целью изучения фотодинамического воздействия А2Е на БЛМ, измеряли ее время жизни в темноте и при освещении. Встраивание A2E и эксперименты по измерению времени жизни проводилось в условиях компенсации внутримембранного поля (КВП). Это позволило не только исключить возможность пробоя мембраны под действием внутримембранного поля, улучшив тем самым воспроизводимость измерений, но и контролировать изменения граничного потенциала (а значит, и процесс адсорбции A2E) на протяжении всего эксперимента.
Ретиналь A2E t, мин t, мин Темнота Освещение Темнота Освещение а) б) Рис.5. Средние времена жизни мембран, сформированных из DOPC, в присутствии A2E (а) и ретиналя (б), в темновых условиях («темнота») и при освещении видимым светом («освещение») После формирования БЛМ из DPhPC либо DOPC в декане, в один из отсеков добавляли спиртовый раствор А2Е (начальная концентрация A2E в ячейке – мкМ), Достижение разности граничных потенциалов стационарного уровня (60 80 мВ) свидетельствовало об окончании адсорбции A2E. Мембраны, сформированные из DPhPC, практически не разрушались в присутствии A2E ни в темноте, ни при освещении – их время жизни всегда составляло более 2 часов и не зависело от добавления пигмента (не показано на рисунках). В случае DOPC время жизни мембраны с A2E при освещении значительно уменьшалось.
Если в отсутствие освещения время жизни таких БЛМ составило в среднем около 80 минут, то при освещении видимым светом – 18 минут (рис.5а), то есть в 4 раза меньше. В отсутствие A2E время жизни мембран из DOPC от освещения не зависело (на рисунках не показано). Обнаруженное уменьшение стабильности мембран, сформированных из ненасыщенных липидов, в присутствии A2E при освещении согласуется с существующими литературными данными о фототоксичности компонентов липофусцина (Sparrow, 2000;
Sparrow, 2002). Таким образом, A2E может проявлять свойства слабого фотосенсибилизатора, вызывая фотоокисление двойных связей углеводородных «хвостов» DOPC в составе БЛМ.
3.2.2. Фотоинактивация встроенных в БЛМ грамицидиновых каналов в присутствии A2E Грамицидин A является удобной моделью мембранного белка (ионного канала), подвергающегося разрушению (инактивации) при освещении в присутствии фотосенсибилизаторов (Rokitskaya, 1993). В данной части работы было проведено исследование фотодеструктивного воздействия A2E на грамицидиновый канал, встроенный в БЛМ. Это позволило количественно оценить эффективность этого воздействия на грамицидин, который в данном исследовании может служить моделью мембранных белков.
С С G, нСм Т 0 30 t, мин Рис.6. Фотоинактивация грамицидина под действием A2E. Зависимость проводимости БЛМ (DPhPC) от времени после адсорбции A2E и формирования грамицидиновых каналов.
Стрелками отмечены моменты включения («С») и выключения («Т») освещения.
После формирования БЛМ из DPhPC и окончания адсорбции A2E (аналогично опытам, описанных в предыдущем разделе) в оба отсека добавляли спиртовой раствор грамицидина A. В течение 40-60 минут после добавления грамицидина проводимость БЛМ достигала стационарного значения порядка десятков или сотен нСм, что свидетельствовало о формировании достаточно большого количества каналов в мембране (рис.6). После этого включали освещение и продолжали регистрировать зависимость проводимости БЛМ от времени. В присутствии A2E наблюдалось значительное уменьшение проводимости, которое было обратимым (после выключения света проводимость снова увеличивалась за счет встраивания нового грамицидина из раствора). Таким образом, A2E в данной системе функционирует как фотосенсибилизатор, индуцируя разрушение грамицидина при освещении. Кинетика уменьшения проводимости при освещении БЛМ с адсорбированным на ней A2E и встроенным грамицидином хорошо аппроксимируется моноэкспоненциальной функцией. В качестве параметра, характеризующего скорость фотоинактивации, было взято обратное характерное время этой экспоненты, которое в присутствии A2E составляло в среднем 0,33±0,051 мин-1.
На основании полученных результатов и имеющихся данных о фотоокислительном воздействии A2E было сделано предположение о том, что основной причиной наблюдаемой фотоинактивации грамицидина и уменьшения времени жизни БЛМ, описанного в предыдущем разделе, являются генерируемые пигментом активные формы кислорода. Для проверки этой гипотезы была измерена зависимость проводимости от времени в присутствии тушителя синглетного кислорода (азид натрия, NaN3) и супероксиддисмутазы (СОД). Сравнение обратных характерных времен кинетики фотоинактивации показало, что в присутствии азида фоторазрушение грамицидиновых каналов происходит в 2-2.6 раза медленнее, а в присутствии СОД – в 1.5 раза медленнее по сравнению с контрольными экспериментами без тушителей. Обнаруженное ингибирование фотоинактивации грамицидина свидетельствует о том, что фотоокислительное воздействие A2E обусловлено как синглетным кислородом, так и супероксидными анион-радикалами, но ведущая роль в этом процессе принадлежит синглетному кислороду. Предположительно, по такому же механизму происходит описанное в предыдущем разделе нарушение стабильности мембран, сформированных из ненасыщенного липида – генерируемый пигментом синглетный кислород способен окислять углеводородные «хвосты» липидов, содержащих двойные связи.
Глава 4. Изучение воздействия полностью-транс-ретиналя на бислойные липидные мембраны 4.1. Встраивание ретиналя в БЛМ Встраивание ретиналя в мембрану регистрировалось по изменению проводимости БЛМ, обусловленной ионофорами – нонактином (N) и пентахлорфенолом (PCP). На рис.7а приведена кинетика изменения проводимости БЛМ, содержащей нонактин, который переносит ионы калия.
Было обнаружено, что проводимость мембран различного липидного состава (DPhPC либо смесь DPhPC с DPhPE в массовом соотношении 3:5) увеличивалась в течение 30-40 мин после добавления ретиналя в оба отсека ячейки, после чего достигала стационарного значения. Относительный прирост проводимости (нормированный на начальную проводимость БЛМ с ионофором) усреднялся по результатам 4-5 измерений (рис.7б). В опытах на мембранах, сформированных из DPhPC, проводимость увеличивалась в среднем в 1,5 раза, а на мембранах из смеси DPhPC/DPhPE - в 3 раза.
Зависимость эффекта от липидного состава свидетельствует о том, что он обусловлен именно наличием ретиналя в БЛМ, а не его взаимодействием с ионофором. Полученный результат косвенно указывает на то, что ретиналь не только встраивается в БЛМ, но в случае присутствия в ней фосфатидилэтаноламина может образовывать с ним комплекс. Это предположение согласуется с данными работы (Eldred, 1993), в которой показано образование устойчивых комплексов ретиналя с фосфатидилэтаноламином, входящим в состав фоторецепторных мембран зрительных клеток.
Как известно, проводимость мембраны определяется концентрацией в ней носителей заряда (например, комплекса нонактина с катионами калия) и их подвижностью. Появление ретиналя в липидном бислое может привести к изменению как неэлектрических свойств мембраны (толщина или микровязкость), так и скачков электрического потенциала на ее границах.
Последнее может быть связано с тем, что молекула ретиналя, хотя и является электронейтральной и липофильной, содержит альдегидную группу, обладающую дипольным моментом, благодаря чему встраивание ретиналя может вызывать изменение дипольного потенциала. В соответствии с подходом, использованным ранее в работе (Szabo, 1974), а также многими другими авторами, разделить вклады электрических и неэлектрических факторов можно, сравнивая изменения проводимости, вызванные противоположно заряженными носителями тока. С этой целью нами было проведено аналогичное измерение проводимости с PCP – ионофором, переносящим через мембрану заряды противоположного знака - анионы. В случае PCP добавление ретиналя в ячейку приводило к уменьшению проводимости БЛМ в 4 раза (рис.7в).
Противоположные изменения проводимости с ионофорами разного знака при проникновении различных веществ в бислой наблюдались ранее в работах (Szabo, 1974;
Симонова, 1986) и объяснялись изменением граничных потенциалов мембраны. В рамках такой интерпретации в нашем случае можно сделать предположение об уменьшении граничных потенциалов с обеих сторон БЛМ, что приводит к понижению потенциального барьера в мембране для ионофоров катионного типа и его повышению для анионов. Тем самым увеличивается проводимость мембраны, модифицированной катионными ионофорами, и уменьшается в случае анионных ионофоров.
G/G0 2 G/G 0 20 40 DPhPC DPhPC/DPhPE Время, мин а) б) 1, b, мВ G/G 0, - 0 0 Время, мин Время, мин в) г) Рис.7. Воздействие ретиналя на проводимость БЛМ, модифицированных ионофорами, и на разность граничных потенциалов, измеряемую методом КВП а) Изменение проводимости БЛМ с нонактином, сформированных из DPhPC (1) или смеси DPhPC/DPhPE в соотношении 3:5 (2) после добавления в ячейку спиртового раствора ретиналя до концентрации 80 мкМ в момент, указанный стрелкой.
б) Относительное изменение проводимости БЛМ разного состава с нонактином, вызванное введением ретиналя в ячейку (усреднение по результатам 5 измерений).
в) Относительное изменение проводимости БЛМ с пентахлорфенолом после добавления в водный раствор ретиналя до концентрации 80 мкМ в момент, указанный стрелкой.
г) Разность граничных потенциалов на БЛМ из DPhPC, измеренная методом КВП. Стрелкой указан момент добавления ретиналя (80 мкМ) в цис-отсек ячейки.
Полученные результаты объясняются тем, что при встраивании ретиналя происходит изменение дипольной составляющей граничного потенциала (так называемый дипольный эффект), причем знак эффекта соответствует ориентации отрицательного полюса диполя молекулы ретиналя, направленного внутрь мембраны.
Важно отметить, что в наших опытах относительное увеличение проводимости с нонактином и ее уменьшение с пентахлорфенолом существенно различались, а именно, с нонактином проводимость мембраны изменилась в 1.5 раза, а с пентахлорфенолом - в 4 раза. В то же время, если бы влияние ретиналя ограничивалось только изменением граничного потенциала (поверхностной или/и дипольной компонентой), то эти относительные изменения проводимости должны были бы практически совпадать по абсолютной величине. Полученный результат свидетельствует о том, что помимо изменения электростатических свойств БЛМ, при проникновении ретиналя в бислой меняются и структурные характеристики мембраны (например, микровязкость).
Предположение об изменении дипольного потенциала было проверено с помощью метода КВП, который позволяет регистрировать изменение разности граничных потенциалов при добавлении ретиналя в цис-отсек ячейки. Запись соответствующего опыта приведена на рис.7г. Добавление ретиналя приводило к появлению разности граничных потенциалов, причем ее знак соответствовал предположению об отрицательном изменении дипольного потенциала, что качественно согласуется с полученными выше результатами с ионофорами.
Однако количественного согласия не было: наблюдаемое изменение разности граничных потенциалов оказалось чрезвычайно малым и не превышало 2.5 мВ.
Если считать, что все изменение проводимости в присутствии ионофоров при встраивании ретиналя вызвано только изменением дипольного потенциала, то это изменение должно было бы составлять 10-30 мВ, что на порядок больше величины, измеренной методом КВП. Для сравнения, адсорбция A2E на БЛМ приводила к изменению потенциала до +80 мВ (Соколов и др., 2005).
Зарегистрированное незначительное изменение разности граничных потенциалов может быть обусловлено липофильностью ретиналя, благодаря которой он способен свободно проникать через мембрану, симметрично в ней распределяясь. Из-за проникновения ретиналя через БЛМ измеряемая методом КВП разность граничных потенциалов оказывается меньше изменения потенциала на одной границе, что делает невозможным его прямое измерение.
4.2. Фотодеструктивное воздействие ретиналя на БЛМ и встроенные в нее соединения 4.2.1. Фотодинамическое разрушение БЛМ в присутствии ретиналя В рамках изучения фотодеструктивного воздействия ретиналя на мембраны, было изучено его влияние на время жизни БЛМ в темноте и при освещении видимым светом, аналогично тому, как это делалось при исследовании фотодинамического разрушения БЛМ в присутствии A2E. Так же как и в случае A2E, мембраны, сформированные из насыщенного липида (DPhPC), не разрушались ни при освещении, ни в темноте, независимо от присутствия ретиналя. Мембраны из ненасыщенного липида (DOPC) разрушались в присутствии ретиналя при освещении примерно втрое быстрее, чем в темноте – средние времена жизни составили 13 минут на свету и 40 мин в темноте (рис.5б). Предположительно, это обусловлено способностью ретиналя к генерации активных форм кислорода при освещении, которая отмечалась в ряде исследований (Delmelle, 1977, 1979). Для получения более точных количественных данных и сравнения его фототоксичного воздействия с другими фотосенсибилизаторами были проведены исследования фотоинактивации грамицидинового канала, результаты которых приведены ниже.
4.2.2. Фотоинактивация грамицидинового канала под действием ретиналя Аналогично описанным в разделе 3.2 исследованиям A2E, было проведено исследование фотоинактивации грамицидинового канала в присутствии ретиналя в тех же условиях. Для количественной оценки скорости фотоинактивации грамицидинового канала рассчитывали величину обратного характерного времени экспоненты, аппроксимирующей кинетику уменьшения проводимости. Как и в случае A2E, были проведены эксперименты по фотоинактивации грамицидина в присутствии азида натрия и супероксиддисмутазы. Полученные средние значения обратного характерного времени фотоинактивации грамицидиновых каналов под действием A2E и ретиналя приведены в табл.2.
Ретиналь A2E 97 ± 2 % 1/, сек-1 100 Условия A2E 0,332 ± 0, 62 ± 4 % A2E/NaN3 0,128 ± 0, 50 A2E/СОД 0,225 ± 0,014 32 ± 4 % Ретиналь 0,949 ± 0, 8±4% Ретиналь/NaN3 0,027 ± 0, 0 Азид СОД Азид СОД Ретиналь/СОД 0,873 ± 0, Рис.8. Относительное ингибирование фотоинактивации грамицидина, обусловленное Таблица 2. Средние значения присутствием A2E (диаграмма слева) и обратных характерных времен ретиналя (диаграмма справа), азидом натрия и фотоинактивации грамицидина под суперксиддисмутазой, в процентах. Каждый действием ретиналя и A2E, в столбец иллюстрирует, на сколько процентов присутствии азида натрия (20 мМ) и уменьшилась скорость падения проводимости в супероксиддисмутазы (0.25 мг/мл) присутствии соответствующего тушителя АФК.
Видно, что в данных условиях ретиналь оказывает гораздо более сильное фотодеструктивное воздействие на БЛМ, чем A2E. В присутствии ретиналя фотоинактивация грамицидина происходит быстрее примерно в 3 раза, чем в присутствии A2E. Это может быть связано как с большим количеством ретиналя в составе БЛМ, так и его большей фотодинамической активностью.
Чтобы оценить количественно относительный вклад синглетного кислорода и супероксиданионрадикала в процесс фотоинактивации грамицидина, было рассчитано относительное уменьшение скорости фотоинактивации грамицидина в присутствии азида натрия либо СОД, выраженное в процентах (рис.8). Более высокая степень ингибирования эффекта ретиналя в присутствии азида и СОД по сравнению со степенью ингибирования воздействия A2E может свидетельствовать о том, что в исследуемой модельной системе ретиналь при освещении генерирует большее количество АФК. Возможно, при освещении A2E в составе БЛМ задействованы также и другие механизмы фотоокисления, т.к. оба тушителя вызывали лишь частичное ингибирование эффекта.
Полученные данные согласуются с результатами работы (Pawlak, 2003), где сравнивались способности A2E и ретиналя к генерации активных форм кислорода. Там было показано, что ретиналь гораздо более фотореакционноспособен – количество образующихся АФК в его присутствии было в 73 раза больше по сравнению с A2E. Наши результаты указывают также на то, что супероксидный анион-радикал тоже может участвовать в фототоксичном воздействии A2E, но в гораздо меньшей степени, чем синглетный кислород.
4.3. Изучение фотохимических превращений ретиналя в искусственных мембранных системах при длительном освещении В предыдущем разделе было исследовано воздействие ретиналя как фотосенсибилизатора на различные мишени, а вопрос о его собственных фотоиндуцированных превращениях не затрагивался. Однако нельзя исключать, что и сам ретиналь, находящийся в составе БЛМ, способен подвергаться фотолизу и автоокислению под действием генерируемых им активных форм кислорода, подобно тому, как это происходит с A2E (Sparrow, 2002). Для проверки этой гипотезы и определения устойчивости ретиналя в условиях описанных выше экспериментов были получены спектры его поглощения в водном растворе и в суспензии липосом, сформированных из DPhPC (рис.9_ либо DOPC (не показано на рисунках), до и после освещения видимым светом того же источника, который использовался в описанных выше опытах на БЛМ.
Как в липидном окружении, так и в водном растворе после облучения в течение нескольких десятков минут максимум поглощения ретиналя на 380 нм практически полностью исчезал. На 280 нм появлялся новый максимум, который увеличивался при более длительном облучении кюветы с суспензией.
0, Поглощение 0, 300 400, нм Рис.9. Спектры поглощения ретиналя в суспензии липосом, сформированных из DPhPC в зависимости от длительности освещения видимым светом. 1 –липосомы из DPhPC без ретиналя. 2 – ретиналь 16 мкМ в суспензии липосом, до освещения. 3- та же суспензия после 10 минут освещения. 4 – после 45 минут освещения видимым светом Подобные изменения в спектре поглощения ретиналя были обнаружены и ранее (Логинова, 2008), в результате инкубации в течение нескольких дней. Эти спектральные изменения, очевидно, свидетельствуют об образовании продуктов фотоокисления ретиналя. Известно, что в отличие от эпокси-A2E, образующегося в результате окисления бис-ретинилиден-этаноламина, продукты фотоокисления ретиналя достаточно гидрофобны, а значит не покидают БЛМ, и сами по себе тоже обладают свойствами фотосенсибилизаторов. Это, как и более высокая фотореакционная способность самого ретиналя, может быть одной из причин его большей, по сравнению с A2E, фототоксичности.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что A2E практически не проникает через мембрану и адсорбируется на ней только с одной стороны, вызывая значительное изменение разности граничных потенциалов. Ретиналь свободно проникает через мембрану, распределяясь в ней практически симметрично.
Эффективность встраивания ретиналя заметно увеличивается при наличии в составе БЛМ фосфатидилэтаноламина, что согласуется с литературными данными об образовании комплекса ретиналя с этим липидом.
2. Обнаружено, что А2Е уменьшает стабильность БЛМ в отсутствие освещения (на 2-3 порядка уменьшается время жизни мембраны во внешнем электрическом поле) только если мембрана содержит отрицательно заряженные липиды. Это объясняется взаимодействием A2E с их полярными группами с образованием комплексов, влияющих на спонтанную кривизну бислоя. Предположительно, по такому же механизму A2E способен разрушать и мембраны клеток, в состав которых входят заряженные липиды.
Ретиналь подобного воздействия на мембрану не оказывает.
3. Показано, что уменьшение времени жизни БЛМ в присутствии A2E обусловлено увеличением вероятности образования спонтанно образующихся дефектов и/или скорости изменения их радиуса. При этом незначительно уменьшается натяжение бислоя и увеличивается линейное натяжение спонтанно образующихся пор.
4. Показано, что A2E и ретиналь при освещении способствуют разрушению мембран, содержащих ненасыщенные липиды, а также вызывают инактивацию встроенных в БЛМ грамицидиновых каналов. В обоих случаях ретиналь оказался более фотоактивен, чем A2E.
5. Обнаружено, что фотодинамическое воздействие ретиналя и А2Е на грамицидиновый канал ингибируется азидом натрия. Это свидетельствует о том, что разрушение грамицидина вызвано генерацией синглетного кислорода. Предположительно, те же механизмы действуют при фотодеструктивном воздействии исследуемых соединений на мембранные белки клеток сетчатки.
6. Показано, что фотодеструктивное воздействие ретиналя на мембраны может быть обусловлено и продуктами его фотоокисления, образование которых обнаруживается по изменениям спектра поглощения в суспензии липосом.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Соколов В.С., Соколенко Е.А., Соколов А.B., Финогенова О.А., Донцов А.Е., Островский М.А. Взаимодействие бис-ретинилиден этаноламина (А2Е) с бислойными липидными мембранами в темноте и при действии света.// Биологические мембраны.
2005. Т.22. С.336-345.
2. Sokolov V.S., Sokolenko E.A., Sokolov A.V., Finogenova O.A., Dontsov A.E., Ostrovsky M.A. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes // J.Photochem. Photobiol. B: Biol. 2006. V.86. P.177-185.
3. Соколов А.В., Соколов В.С., Фельдман Т.Б., Островский М.А. Взаимодействие полностью-транс-ретиналя с бислойными липидными мембранами. // Биологические мембраны. 2008. т.25, C.499-507.
4. Соколенко, Е. А., Соколов, А. B., Финогенова, О. А., Соколов, В. С., and Донцов, А. Е.
Влияние продуктов фотолиза зрительного родопсина на бислойные липидные мембраны. 2, 458-459. 2004. Воронеж. 111 Cъезд биофизиков России,2004.
5. Sokolenko, E. A., Sokolov, V. S., Sokolov, A. V., Finogenova, O. A., Dontsov, A. E., and Ostrovsky, M. A. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes.
Eur.Biophys.J. 34[6], 772, 2005.
6. Sokolenko, E. A., Sokolov, V. S., Sokolov, A. V., Finogenova, O. A., Dontsov, A. E., and Ostrovsky, M. A. Interaction of bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes.. 8th International Frumkin Symposium "Kinetics of electrode processes", Moscow, 2005.