Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий

На правах рукописи

ЛЕППЯНЕН Ирина Викторовна БИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ОЛИГОМЕРОВ ХИТИНА И ИХ ТЕРМИНАЛЬНО ДЕАЦЕТИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С ПОМОЩЬЮ ФЕРМЕНТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ 03.02.03 – Микробиология 03.01.05 – Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2013 2

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ) Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург, Пушкин Научные руководители: доктор биологических наук, академик РАСХН Тихонович Игорь Анатольевич кандидат биологических наук Долгих Елена Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, cтарший научный сотрудник Падкина Марина Владимировна (Санкт-Петербургский государственный университет) доктор биологических наук Анисимова Ирина Николаевна (Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии)

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится “ ”_2013 г. в … … ч на заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Биолого-почвенный факультет, ауд. №.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт Петербургского государственного университета.

Факс для отзывов: +7 (812) 470-43-62.

Автореферат разослан “ ”2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е. И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из приоритетных задач современной молекулярной микробиологии является получение высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, синтезирующих разнообразные биологически активные соединения. Развитие этого направления исследования определяется необходимостью перехода от традиционного способа выделения штаммов микроорганизмов с полезными свойствами из природных источников к направленному получению в результате селекции, а также созданию с помощью молекулярных методов микроорганизмов с новыми заданными свойствами. С разработкой новых методических подходов появилась возможность экспрессировать в микроорганизмах новые или измененные гены, которые не могли бы быть получены методами мутагенеза или скрещивания.

Микроорганизмы стали использовать как «биологические фабрики» для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и т.п.

В последние годы значительно вырос интерес к изучению, а также практическому использованию олигосахаридов, которые содержат в своем составе аминосахара D-глюкозамин, D-галактозамин, а также N-ацетил-D глюкозамин и N-ацетил-D-галактозамин. Это связано с особой ролью таких олигосахаридов в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений поверхностными рецепторами клеток у различных организмов (Aam et al., 2010;

Mourya et al., 2011). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются лигандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функцию сигнальных молекул, регулирующих биохимические, иммунологические и морфогенетические процессы.

Среди таких олигосахаридов важную роль играют хитоолигосахариды (олигомеры хитина и хитозана), которые находят широкое практическое применение в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве. Известно, что некоторые хитоолигосахариды (ХОС) обладают противовоспалительным, антибактериальным и противоопухолевым действием. Олигомеры хитозана (n = 10 – 30) используются в качестве носителей для транспортировки белков, ДНК и лекарственных соединений через мембрану. Кроме того, ХОС способны индуцировать защитные реакции при взаимодействии с растениями (являются сигнальными молекулами - элиситорами), а также обладают ростстимулирующим действием. Применение этих соединений и их модифицированных аналогов для развития устойчивости растений к фитопатогенам и стимуляции роста является перспективным направлением в практике защиты растений. При этом ХОС не токсичны в высоких концентрациях и легко утилизируются, что делает их применение предпочтительным по сравнению с химическими соединениями. Основной проблемой при изучении функций олигосахаридов, а также практическом использовании является невозможность выделить их в интактном виде и достаточном количестве из биологического материала. Это диктует необходимость разработки новых подходов для получения этих соединений.

Одним из возможных подходов для получения этих соединений может явиться биологический синтез в клетках микроорганизмов, основанный на создании штаммов – продуцентов. Это определяется тем, что химический и ферментативный гидролиз полимеров хитина и хитозана малоэффективен для получения ХОС с необходимой степенью полимеризации и ацетилирования, так как в результате этого процесса получают смесь соединений с неопределенной структурой, что предполагает дальнейшие очистку и анализ структуры этих соединений. Из-за сложности и низкой эффективности химического синтеза, нецелесообразным является синтез олигосахаридов даже с небольшим количеством мономеров (Кочетков, 2000;

Kiyota, 2006).

Ферментативный синтез ХОС может обладать рядом преимуществ, в частности, он позволит решать такие проблемы синтеза ХОС как региоспецифичность (формирование олигомеров, состоящих только из одного типа аномеров) и стереоспецифичность (образование только -1-4-гликозидной связи между мономерами), что позволяет получать соединения со строго определенной структурой. Для биосинтеза преимущественно используют ферменты гликозилтрансферазы, контролирующие образование гликозидной связи в результате трансгликозилирования, при этом донорами гликозильных остатков могут быть нуклеозиды и фосфаты сахаров. Основные трудности при проведении ферментативного синтеза связаны со сложностью выделения ферментов из природных источников, поэтому гетерологичная экспрессия гликозилтрансфераз в клетках микроорганизмов может решить проблему биосинтеза ХОС.

В связи с этим основной целью нашей работы являлась разработка подходов для биосинтетического получения ХОС. У клубеньковых бактерий выявлена уникальная гликозилтрансфераза – N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, контролирующая синтез сигнальных молекул Nod-факторов (липохитоолигосахаридов). Этот фермент способен катализировать синтез ХОС, составляющих основу Nod-факторов и состоящих из определенного числа остатков N-ацетил-D-глюкозамина (n = 4 – 6), что может быть удобным для получения соединений с необходимой степенью полимеризации. ХОС со степенью полимеризации не менее 5 и 6 остатков N-ацетил-D-глюкозамина проявляют элиситорную и ростстимулирующую активность по отношению к растениям. Для синтеза таких соединений мы предложили использовать фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу двух видов ризобиальных бактерий – Rhizobium sp. GRH2 (симбионт акации) и Mesorhizobium loti (симбионт лядвенца). Rhizobium sp. GRH2 способен осуществлять синтез Nod факторов, состоящих из шести остатков N-ацетилглюкозамина (наряду с пентамерами), а M. loti синтезирует строго пентамерные молекулы.

Следовательно, ферменты этих бактерий контролируют синтез гекса- и пентамерных ХОС и могут быть использованы для биосинтетических целей.

У ризобий выявлен другой уникальный фермент хитоолигосахарид деацетилаза, способный деацетилировать олигомеры хитина по N терминальному положению. Этим фермент отличается от деацетилазы грибов, которая деацетилирует все остатки аминосахаров. С помощью хитоолигосахарид деацетилазы можно получить терминально N деацетилированные ХОС, что позволило бы ковалентно присоединять к ним через аминогруппу различные соединения. Это свойство может быть использовано для облегчения переноса различных соединений (в частности, лекарственных веществ) в клетку за счет их конъюгации с олигомерами хитина.

Известно, что олигомеры хитина с низкой степенью полимеризации (n 10) свободно проникают через мембраны клеток по механизму облегченной диффузии. Это позволяет рассчитывать, что конъюгация олигомеров с лекарственными соединениями откроет путь для получения препаратов, эффективных при существенно более низких концентрациях. Синтез монодеацетилированных олигомеров хитина химическим путем практически невозможен из-за одинаковой химической активности аминогрупп в сахарных остатках, что не позволяет проконтролировать степень прохождения реакции деацетилирования. Именно поэтому перед нами стояла задача биосинтетического получения терминально N-деацетилированных олигомеров хитина.

Цель исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение возможности биосинтеза гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов, а также их деацетилированных по терминальному положению производных с помощью уникальных ферментов ризобий.

Задачи работы:

1. Получение генетических конструкций, содержащих последовательности полноразмерных генов nodC, кодирующих N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и Mesorhizobium loti 1803.

2. Оптимизация условий для эффективного синтеза олигомеров хитина, состоящих из пяти и шести остатков N-ацетилглюкозамина, в клетках E. coli, трансформированных конструкциями для экспрессии N ацетилглюкозаминилтрансферазы.

3. Разработка методов выделения и анализа синтезированных олигомеров хитина методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

4. Тестирование способности олигомеров хитина (n = 5, 6), полученных в процессе биосинтеза, индуцировать у растений защитные реакции (образование активных форм кислорода и экспрессию фермента фенилаланин аммоний-лиазы).

5. Анализ способности хитоолигосахаридов индуцировать устойчивость у ячменя и томата к фитопатогенному грибу Fusarium culmorum.

6. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы была определена нуклеотидная последовательность ранее не известного гена nodC Rhizobium sp.

GRH2, а также получены конструкции, содержащие полноразмерный ген этого вида ризобий, с помощью которых впервые биосинтетическим способом получены гексамерные ХОС (n = 6). В процессе биосинтеза получена тетра-N ацетилхитопентаоза (деацетилированная по терминальному остатку хитопентаоза), которая может быть использована для конъюгации с биологически активными веществами.

Практическая ценность. Полученные в процессе работы штаммы продуценты могут быть использованы для синтеза олигомеров хитина in vivo (в клетках микроорганизмов) из простых предшественников, либо для очистки экспрессируемых ферментов и синтеза олигомеров хитина in vitro.

Разработанные подходы позволили осуществить синтез значительных количеств ХОС (до 100 мг на 1 л бактериальной культуры). Таким образом, полученные штаммы и разработанные подходы для синтеза ХОС позволят значительно снизить затраты на производство этих соединений.

Показана способность синтезированных ХОС вызывать активацию защитных систем растения, которая определяет развитие устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Полученные соединения могут быть использованы в качестве эффективных элиситоров растений. По результатам работы получен патент РФ на изобретение.

Выполнение работы было поддержано: грантами РФФИ-офи 08-04 12214, РФФИ 07-08-00700-а, РФФИ 12-08-01044-а, Министерством образования и науки (ГК № 16.512.11.2183, соглашение № 8056), грантом Президента РФ для поддержки научных школ (соглашение № 16.120.11.337 НШ), грантами Комитета по науке и высшей школе г. Санкт Петербурга за 2008, 2009, 2010.

Апробация работы. По результатам работы были представлены доклады на 11 международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (РосХит 2012) в 2012 (г. Мурманск), 17 международном конгрессе по азотфиксации в 2011, г. Перт, Австралия, 10 международной конференции Европейского хитинового общества в 2011, г. Санкт-Петербург, 10 международной конференции РосХит 2010 (г. Нижний Новгород), школе конференции «Агробиотехнология в корневых микробных системах» в рамках программы NOVA University Network в 2008 (г. Тюне, Дания), VIII Санкт Петербургской Ассамблеи молодых ученых в 2008 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ (4 статьи и 1 патент) и 5 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы ( источника). Работа изложена на 127 страницах, содержит 37 рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Штаммы микроорганизмов. Для экспериментальной работы был использован штамм клубеньковых бактерий Mesorhizobium loti 1803 из Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии, WDCM (http://www.arriam.spb.ru/rus/lab10/), а также штамм Rhizobium sp. GRH2, любезно предоставленный профессором Van Brussel (Нидерланды). Для клонирования и синтеза белков использовали штамм Escherichia coli DH5 и С41. Заражение растений проводили штаммом фитопатогенного гриба Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. 333.

Условия культивирования микроорганизмов. Штаммы E. coli культивировали в жидкой среде LB (Bertani, 1951) при 37С. Для селекции устойчивых к антибиотикам бактерий добавляли ампициллин (100 мкг/мл), либо канамицин (50 мкг/мл). Штаммы ризобий культивировали в жидкой среде TY, содержащей необходимый антибиотик, при 28С. Для получения грибного инокулята (суспензии макроконидий) F. culmorum 333 выращивали в течение суток при 25С на агаризованной среде Чапека. Смыв гриба с чашек осуществляли стерильной водой. Полученный инокулят использовали для обработки растений, смешивая с вермикулитом в соотношении 1 л инокулята (при концентрации 3*105 конидий/мл) на 1 кг вермикулита.

Растительный материал. Исследования проводили на растениях томата Solanum licopersicum сорта Сormello и ячменя Hordeum distichum L. сорта Инари, также использовали линию гороха Pisum sativum L. Rondo из генетической коллекции ГНУ ВНИИСХМ.

Условия выращивания растений. Семена томата и ячменя стерилизовали 3-5 % раствором гипохлорита, а семена гороха концентрированной серной кислотой в течение 5 минут. Промывали стерильной водой не менее 5 раз. Обработанные семена томата и гороха помещали на чашки, содержащие 1% водный агар, а семена ячменя – на чашки со стерильной фильтровальной бумагой, смоченной водой. Проращивали растения в темноте в течение 4-5 дней при комнатной температуре. Для изучения индукции защитных реакций проростки растений переносили в сосуды (объемом 30 мл) с агаризованной средой Jensen (Jensen, 1942).

Обрабатывали корни проростков 10-6 М раствором ХОС (в объеме 100-200 мкл) в течение 8, 24 ч и 72 ч. На каждый вариант обработки брали не менее 5 - растений. В экспериментах по изучению способности ХОС влиять на устойчивость растений к фитопатогенам проростки томата и ячменя обрабатывали 10-6 М раствором ХОС на чашках Петри в течение 24 ч.

Переносили растения в сосуды с вермикулитом, смешанным с грибным инокулятом. В качестве контроля использовали проростки, обработанные стерильной водой. Растения выращивали в условиях теплицы при 16-часовом фотопериоде, температуре 21С и относительной влажности 60 %.

Молекулярно-генетические процедуры. Для выделения ДНК ризобий использовали 1,5 мл ночной культуры. Осадок клеток ресуспендировали в мкл буфера ТЕ, к суспензии добавляли 1 мкл раствора лизоцима (1 мг/мл) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Добавляли ДСН до конечной концентрации 0,5% и протеиназу К (0,05 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1:1).

ДНК осаждали двумя объемами этанола, промывали 70% этанолом. ДНК растворяли в 50 - 100 мкл деионизованной воды, ее концентрация составляла ~ 0,5 - 1 мкг/мл. Рестрикцию ДНК эндонуклеазами проводили в течение 3 – 24 ч при необходимой температуре. Плазмидную ДНК E. coli выделяли из 3 мл ночной культуры клеток методом щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979).

Генетические конструкции вводили в клетки E. coli DH5 или С41 методом химической трансформации (Inoue et al., 1990). Выделение РНК из корней растений осуществляли с помощью реагента PureZol (Bio-Rad, США).

Генетические конструкции, использованные в работе.

Наименование Назначение конструкции pRSETb-MlnodC Экспрессия фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti pRSETb-RhGRH2nodC Экспрессия фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH pRSETb-MlnodB Экспрессия фермента хитоолигосахарид деацетилазы M. loti pRSETb-MlnodC-KD Экспрессия каталитического домена фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti pUC19-MlnodC Синтез пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti pK18-MlnodB Синтез тетра-N-ацетилхитопентаозы совместно ферментами хитоолигосахарид деацетилазой и N ацетилглюкозаминилтрансферазой M. loti pUC19-RhGRH2nodC Синтез гекса-N-ацетилхитогексаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH pUC19-MlnodC-Pr- Синтез тетра-N-ацетилхитопентаозы с помощью MlnodB ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M. loti pUC19-MlnodC- Синтез тетра-N-ацетилхитопентаозы с помощью 3`UTR-Pr-MlnodB ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M. loti Синтез и выделение хитоолигосахаридов (ХОС). Для синтеза ХОС культивировали бактерии E. coli, несущие необходимую плазмиду, в 100 - мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мг/л) при температуре 37С до достижения культурой оптической плотности А600 = 0,6, затем индуцировали экспрессию белка при добавлении к среде 0,5 мМ ИПТГ. После культивирования в течение 3 ч в присутствии ИПТГ при 37С, добавляли в среду в качестве источника углерода глицерол до конечной концентрации 4 г/л, а также субстрат для синтеза ХОС - N-ацетилглюкозамин в концентрации 0, г/л. Синтез проводили в течение 24 - 48 часов при температуре 35С. После завершения процедуры синтеза ХОС клетки E. coli осаждали при 3000 об/мин (центрифуга Beckman J2-21, США) в течение 20 минут при 4°С, ресуспендировали осадок клеток в 2 мл воды и кипятили суспензию в течение 30 минут. Водную фазу, содержащую ХОС, адсорбировали на активированном угле (Fluka, Германия). Смыв ХОС с угля проводили 50% этиловым спиртом.

После выпаривания этанола осадок, содержащий ХОС, ресуспендировали в необходимом объеме воды и использовали для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Разделение ХОС методом ВЭЖХ. Разделение ХОС проводили на колонке с аминофазой SUPELCOSILTM LC-NH2 (Sigma, США) в системе ацетонитрил :

вода (70% : 30%), скорость элюции составляла 1 мл/мин. Идентификацию полученных соединений проводили посредством сравнения времени выхода пика анализируемого вещества со временем выхода пиков, соответствующих стандартам - пента-N-ацетилхитопентаозе и гекса-N-ацетилхитогексаозе (Medacshop, Германия).

Анализ синтезированных ХОС с помощью метода масс спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ проб проводили на ионно циклотронном масс-спектрометре Varian 902-MS MALDI Mass Spectrometer (ICR FTMS) со сверхпроводящим магнитом 9.4 Тесла. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли с помощью третьей гармоники Nd:YAG лазера (355 нм). Образцы растворяли в 2 мкл 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты, смешивали с насыщенным раствором матрицы – 0,2 М 2,5 дигидрокси-бензойной кислоты (ДГБК), наносили на мишень и сушили на воздухе. Образцы облучали сериями лазерных импульсов (по 5 импульсов в серии). Определение молекулярной массы пробы производили методом внешней калибровки с использованием стандартных образцов.

Анализ экспрессии генов Pal. Оценку уровня экспрессии генов Pal проводили на матрице кДНК методом ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией и определением продуктов реакции в реальном времени. Для синтеза кДНК использовали суммарную РНК, выделенную из корней томата и гороха, собранных на разных сроках после обработки ХОС. Синтез проводили в объеме 20 мкл смеси, содержащей 2,5 мкг РНК, 10 мМ трис-HCl, pH 8.8, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ дНТФ, 100 пМ олиго(dT18), 1 ед. ингибитора рибонуклеаз и 200 ед. обратной транскриптазы M-MLV в течение 1 ч при 42°С.

Для анализа экспрессии генов на матрице кДНК использовали набор SYBR GREEN (Bio-Rad, США). Реакцию проводили по методике, предложенной производителем. Результаты оценки экспрессии генов были представлены как отношение экспрессии изучаемого гена к экспрессии гена убиквитина (Ubiq).

Оценка интенсивности заражения растений. Оценку интенсивности заражения растений фитопатогенными грибами проводили по методу, предложенному Танским и соавт. (Танский и др., 2002). Развитие признаков заболеваемости растений оценивали для томата на 11 и 17 сутки, для ячменя на 8 и 17 сутки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование и анализ последовательностей генов nodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

Нуклеотидная последовательность гена nodC Rhizobium sp. GRH2 была неизвестна, поэтому на первом этапе исследований был амплифицирован фрагмент гена nodC (~1000 п. о.) с помощью вырожденных праймеров, подобранных к наиболее консервативным участкам гена. Далее с помощью ПЦР, основанного на использовании адапторов Vectorette и специфичных праймеров, были амплифицированы последовательности 5 - и 3 - концов гена nodC и проведен их анализ. Таким образом, нам удалось клонировать полноразмерный ген nodC Rhizobium sp. GRH2. Сравнительный анализ последовательности выявленного гена с известными ранее последовательностями генов nodC других штаммов ризобий показал наиболее высокий процент сходства с геном nodC Sinorhizobium meliloti GVPV12 (76% сходства), Sinorhizobium sp. BR816 (75,6%), Rhizobium sp. N33 (74%), M. loti MAFF303099 (70%). В процессе исследований нами также была определена последовательность гена nodC для использованного в работе штамма M. loti 1803. Полноразмерные гены nodC двух видов ризобий были использованы для получения генетических конструкций в векторах pRSETb и pUC19 (pRSETb RhGRH2nodC, pRSETb-MlnodC, pUC19-RhGRH2nodC, pUC19-MlnodC). Кроме того, нами была получена конструкция, содержащая фрагмент гена nodC M. loti 1803 (около 800 п.о.), кодирующий только каталитический домен фермента без гидрофобных сигнального пептида и трансмембранного доменов (pRSETb MlnodC-KD). Полученные конструкции были использованы для экспрессии белков в бактериях E.coli DH5a и C41, а также для синтеза ХОС в культивируемых клетках бактерий.

2. Гетерологичная экспрессия фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном nodC, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

При экспрессии в E. coli генетических конструкций в векторе pRSETb, содержащих полноразмерные гены nodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803, наблюдали синтез белков с молекулярной массой около 50 кДа (Рис. 1 а, б), что соответствовало ожидаемой массе для фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы. Уровень экспрессии белков при этом был достаточно высоким. Максимальное содержание рекомбинантных белков, выделенных из клеток, культивируемых в присутствии ИПТГ, наблюдали в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 4000 об/мин (фракция 1 на Рис. 1 а, б). Обычно при такой скорости центрифугирования осаждаются особые белковые образования - тельца включения. Некоторое количество рекомбинантного белка присутствовало также в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 16000 об/мин (фракция 2 на Рис. 1 а, б). В этой фракции преимущественно находятся мембранные белки. В растворимой фракции (цитозоль) рекомбинантные белки выявлены не были (фракция 3 на Рис. 1 а, б).

Рисунок 1. Выявление белков NodC Rhizobium sp. GRH2 (а) и M. loti (б) в клетках E. coli С41, трансформированных конструкциями pRSETb RhGRH2nodC и pRSETb-MlnodC.

Разделение белков проводили методом ДСН-электрофореза в ПААГ с окраской красителем Кумасси (верхняя панель) или переносили на нитроцеллюлозу и гибридизовали с анти-His антителами (нижняя панель). Обозначения: контроль – нерастворимая фракция клеток, полученная при осаждении при 16000 об/мин (клетки трансформированы вектором pRSETb без вставки);

1, 2, 3 – клетки трансформированы pRSETb-RhGRH2nodC и pRSETb-MlnodC;

1 – нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин;

2 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин;

3 – растворимая фракция, полученная при 16000 об/мин. «–» экспрессия белка в отсутствии ИПТГ;

«+» - экспрессия белка в присутствии ИПТГ.

Стрелками обозначен экспрессируемый белок NodC.

Уровень экспрессии синтезирующихся белков в клетках E. coli был также оценен при использовании генетических конструкций pUC19-MlnodC и pUC19 RhGRH2nodC, полученных в другом типе вектора (Рис. 2 а, б). Так как в составе экспрессируемых рекомбинантных белков, полученных при этом, отсутствовала poly-His последовательность, мы проводили сравнение с белками, полученными с помощью конструкций в pRSETb. Было показано, что уровень синтеза рекомбинантного белка при использовании конструкций в векторе pUC19 был ниже по сравнению с тем, который наблюдался при экспрессии белка с помощью вектора pRSETb. Однако при этом белок не образовывал нерастворимых образований телец включения и был сосредоточен, главным образом, в мембранной фракции, полученной при 16000 об/мин (фракция 3 на Рис. 2 а, б). Кроме того, было показано, что конструкции в векторе pUC19 не являются строго ИПТГ-индуцибельными.

Рисунок 2. Выявление белков NodC Rhizobium sp. GRH2 (а) и M. loti (б) в клетках E. coli DH5, трансформированных pUC19-RhGRH2nodC и pUC19 MlnodC.

Разделение белков проводили методом ДСН-электрофореза в ПААГ с окраской красителем Кумасси. Обозначения: 1 - нерастворимая фракция, полученная при осаждении при 4000 об/мин, выделенная из клеток E. coli С41 при экспрессии в них конструкции pRSETb-RhGRH2nodC;

2 – нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин, выделенная из клеток E. coli DH5 при экспрессии в них конструкции pUC19-RhGRH2nodC;

3 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин, выделенная из клеток E. coli DH5 при экспрессии в них конструкции pUC19 RhGRH2nodC;

«–» - экспрессия белка в отсутствии ИПТГ;

«+» - экспрессия белка в присутствии ИПТГ. Аналогичные обозначения представлены на рисунке 2б для конструкций, содержащих ген MlnodC. Стрелками обозначен экспрессируемый белок NodC.

Таким образом, в результате проведенных исследований был оценен уровень экспрессии фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий M. loti 1803 и Rhizobium sp. GRH2 в клетках E. coli с помощью созданных нами генетических конструкций, полученных на основе векторов pRSETb и pUC19. Наличие синтезируемого белка-фермента в клетках E. coli, позволило нам перейти к следующему этапу исследований. Нами была оценена возможность биосинтеза ХОС в клетках бактерий с помощью N ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий.

Нами был также осуществлен синтез модифицированной формы фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляющей собой каталитический домен. При экспрессии в клетках E. coli конструкции pRSETb-MlnodC-KD нам удалось осуществить синтез укороченной формы фермента белка в растворимом виде, при этом уровень синтеза был достаточно высоким (Рис. а, б). Было показано, что на синтез белка в растворимой форме влияла температура: при 28оС большая часть белка находилась в растворимом состоянии (Рис. 3 а). Таким образом, была получена в растворимом виде модифицированная форма фермента, которую использовали для синтеза ХОС in vitro.

Рисунок 3. Выявление каталитического домена фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803 в клетках E. coli C41 при температуре 28°С (а) и 37°С (б).

Вестерн-блот гибридизация с использованием анти-His антител. 1 – нерастворимая фракция, полученная при 4000 об/мин;

2 - нерастворимая фракция, полученная при 16000 об/мин;

3 – растворимая фракция, полученная при об/мин. «–» - экспрессия белка в отсутствии ИПТГ;

«+» - экспрессия белка в присутствии 0,5 мМ ИПТГ.

3. Синтез ХОС в культуре клеток E. coli с помощью конструкций, кодирующих полноразмерную форму фермента.

Для оценки ферментативной активности экспрессируемых в бактериях E.

coli белков была изучена их способность синтезировать ХОС. Для синтеза ХОС штаммы E. coli, несущие конструкции с клонированным полноразмерным геном nodC двух видов ризобий, инкубировали в среде с субстратом N ацетилглюкозамином. Для выявления синтезированных соединений использовали метод ВЭЖХ.

Рисунок 4. Хроматографическое разделение ХОС, полученных при синтезе в культуре клеток E. coli DH5, несущих плазмиды pUC19-RhGRH2nodC и pUC19-MlnodC (а, б, в) и E. coli C41, несущих плазмиду pRSETb-MlnodC (г).

В верхней части каждой панели (а-г) представлено разделение смеси ХОС от мономера до гексамера (обозначены цифрами). а и б – разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp.

GRH2, а – синтез в течение 24 ч, б – синтез в течение 48 ч;

в и г – разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента NodC M. loti 1803. Стрелками указаны пики, соответствующие пента-N-ацетилхитопентаозе и гекса-N ацетилхитогексаозе.

Было показано, что уровень синтеза ХОС отличается при использовании разных конструкций. При культивировании бактерий E. сoli, несущих плазмиду pUC19-RhGRH2nodC со встроенным геном nodC Rhizobium sp. GRH2, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина были синтезированы соединения, время выхода которых при разделении соответствовало стандартам - гекса-N-ацетилхитогексаозе и пента-N-ацетилхитопентаозе (Рис. 4 а,б). После культивирования в течение 24 ч основным синтезируемым продуктом была пентаоза, а после 48 ч – гексаоза. Количество синтезируемых ХОС составляло до 20 - 30 мг/л бактериальной культуры. При культивировании бактерий E.

сoli, несущих плазмиду pUC19-MlnodC со встроенным геном nodC M. loti была синтезирована пента-N-ацетилхитопентаоза (Рис. 4 в), количество которой в среднем составляло до 100 мг на 1 л. Таким образом, мы показали, что рекомбинантные ферменты обладают всеми свойствами нативных ферментов и могут быть использованы для синтеза олигомеров хитина (n = 5 и 6).

Напротив, при использовании культуры клеток E. coli, содержащих плазмиду pRSETb-RhGRH2nodC или pRSETb-MlnodC, нам не удалось выявить сколько-нибудь значительного синтеза ХОС (Рис. 4 г). Вероятно, при использовании конструкций в векторе pRSETb уровень синтеза рекомбинантных белков-ферментов является высоким, но из-за формирования нерастворимых телец включения ферментативной активности они не проявляют.

При анализе каталитической активности модифицированной формы фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы также была выявлена способность синтезировать пента-N-ацетилхитопентаозу (данные не представлены).

4. Масс-спектрометрический анализ ХОС, полученных биосинтетическим способом.

Для подтверждения того, что синтезированные в клетках E. coli соединения являются гекса-N-ацетилхитогексаозой и пента-N ацетилхитопентаозой, нами был использован метод масс-спектрометрии.

Проведенный анализ показал присутствие соединений с соотношением массы к заряду (m/z) равным 1259,5 и 1056,7, что соответствовало массе гекса-N ацетилхитогексаозы и пента-N-ацетилхитопентаозы (Рис. 5).

5. Анализ элиситорной активности ХОС.

Для анализа защитных реакций со стороны растений в ответ на обработку хитоолигосахаридами в качестве маркера был использован ген Pal, кодирующий фермент L-фенилаланин-аммоний-лиазу (ФАЛ, КФ 4.3.1.5).

Анализ экспрессии данного гена был проведен на томате сорта Cormello, и горохе линии Rondo. Для проверки активности ХОС были выбраны растения томата, которые, согласно литературным данным, восприимчивы к влиянию гекса- и пентамерных олигомеров хитина. Для анализа были также использованы растения гороха, для которых гекса- и пентамерные олигомеры не являлись эффективными элиситорами (негативный контроль).

Рисунок 5. Масс-спектрометрический анализ соединений, полученных в результате синтеза и хроматографической очистки.

а - гекса-N-ацетилхитогексаоза;

б - пента-N-ацетилхитопентаоза.

У томата известно шесть генов, кодирующих фермент ФАЛ, экспрессия двух из них Pal3 и Pal6, по литературным данным, наиболее сильно изменяется в ответ на обработку элиситорами. Действительно, в наших экспериментах было показано значительное усиление экспрессии генов Pal3 и Pal6 в ответ на обработку пента-N-ацетилхитопентаозой (Рис. 6 а). Максимальный уровень индукции экспрессии генов Pal3 и Pal6 наблюдали через 8 ч после обработки (увеличение экспрессии в 5 раз), хотя статистически достоверное увеличение было выявлено также через 24 ч после обработки.

При обработке растений гороха олигомерами хитина, полученными биосинтетическим способом, как мы и ожидали, не было выявлено статистически достоверного увеличения экспрессии генов Pal через 24 ч после обработки (Рис. 6 б). Для этих растений наиболее эффективным элиситорами являются олигомеры хитозана (n = 8 – 10). При использовании нами для сравнительного анализа коммерческого препарата олигомеров хитозана, уровни экспрессии генов Pal возрастали через 24 часа после обработки (приблизительно в 1, 6 – 2 раза) (Рис. 6 в). Таким образом, анализ экспрессии гена, кодирующего фермент ФАЛ, показал, что обработка растений ХОС в концентрации 10-6 M приводит к активации защитных систем растения. Этот тест явился специфичным для проверки влияния на растения ХОС различной структуры.

Рисунок 6. Анализ уровня экспрессии генов Pal методом ПЦР с детекцией в реальном времени при действии на растения ХОС в концентрации 10-6 M.

Контроль: обработка корней водой. Опыт: обработка растений пента-N ацетилхитопентаозой (ХП) и октамером хитозана (ОХ). а – анализ экспрессии гена Pal в корнях проростков томата, обработанных ХП. б и в - анализ экспрессии гена Pal в корнях проростков гороха, обработанных ХП и ОХ.

6. Анализ способности олигомеров хитина индуцировать устойчивость растений томата и ячменя к фитопатогенному грибу F. culmorum 333.

Нами был проведен анализ влияния предобработки растений ХОС, полученных биосинтетическим способом, на их устойчивость к заражению фитопатогенным грибом F. culmorum 333 (биологическая активность).

Проведенный анализ показал, что предварительная обработка растений - 10 М ХОС позволяет значительно уменьшить проявление признаков заболеваемости фузариозом - поражение корней гнилями, подавление развития корневой системы. У растений томата, предварительно обработанных ХОС перед заражением фитопатогенным грибом F. culmorum 333, признаки заболевания практически полностью отсутствовали (Рис. 7 а). У растений ячменя происходило значительное снижение интенсивности заражения (Рис. б). Влияние ХОС, полученных биосинтетическим способом, было сравнимо с коммерческими аналогами.

Кроме того, в наших экспериментах было показано, что ХОС способны оказывать ростстимулирующее действие на растения. Длина корней проростков томата, которые были предварительно обработаны ХОС, превышала длину корней обработанных водой растений на 11 сутки в 4,6 (ХП) и 3,8 раз (ХГ) (данные не представлены). Длина корней проростков ячменя, обработанных ХП и ХГ, также превышала длину корней необработанных растений в 1,5 и 1,7 раза на 8 сутки после обработки.

Рисунок 7. Анализ признаков заболеваемости фузариозом у проростков томата сорта Cormello (а) и ячменя сорта Инари (б), предобработанных ХОС (10- М) перед заражением F. culmorum 333.

Контроль – растения обработанные водой;

Fusarium – растения, зараженные F.culmorum 333;

Fus/ХП, Fus/ХГ – растения, зараженные F.culmorum 333 и предобработанные пента-N-ацетилхитопентаозой и гекса-N-ацетилхитогексаозой, полученными биосинтетическим способом;

Fus/ХПК – растения, зараженные F.culmorum 333 и предобработанные коммерческой пента-N-ацетилхитопентаозой.

Заболеваемость растений оценивали на 11 и 17 день (томат) и 8 и 17 день (ячмень) после обработки. На графиках представлены значения среднего, бары представляют стандартные отклонения среднего. * - варианты, достоверно отличающиеся от контроля (растений без обработки ХОС перед заражением фитопатогеном).

7. Биосинтез терминально N-деацетилированных ХОС с помощью двух ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы.

Важной задачей работы являлось получение терминально N деацетилированных ХОС.

Для этого были получены штаммы E. coli, экспрессирующие одновременно два фермента: N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (NodC) и хитоолигосахарид деацетилазу (NodB). В нашей работе были использованы две стратегии получения деацетилированных соединений: синтез с использованием отдельных конструкций для каждого гена (с помощью плазмид pK18, содержащей ген MlnodB и pUC19, содержащей ген MlnodC), а также синтез ХОС с помощью конструкции pUC19-MlnodC-MlnodB, содержащей два гена в составе одной плазмиды.

Рисунок 8. Масс-спектрометрический анализ соединений, полученных в результате синтеза в клетках E. coli и хроматографической очистки бактериальных экстрактов.

Синтез ХОС осуществляли в культуре клеток штаммов E. coli DH5, содержащих конструкцию pUC19-MlnodC-3`UTR-Pr-MlnodB. Соединение с соотношением m/z, равному 1056, соответствует пента-N-ацетилхитопентаозе.

Соединение с соотношением m/z, равному 996,4, соответствует тетра-N ацетилхитопентаозе.

При культивировании бактерий E. coli, содержащих плазмиду pUC19 MlnodC-MlnodB, были получены соединения, анализ которых методом масс спектрометрии показал присутствие вещества с соотношением массы к заряду (m/z) 1056.7 (ацетилированная пента-N-ацетилхитопентаоза), а также - с m/z, равному 996,4 (Рис. 8). Таким образом, нам впервые удалось получить с помощью ферментов M. loti терминально деацетилированную хитопентаозу (тетра-N-ацетилхитопентаозу), которую можно использовать для конъюгации с биологически активными веществами.

ВЫВОДЫ 1. Выявлена последовательность гена nodC Rhizobium sp. GRH2, кодирующего фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу. Осуществлена эффективная гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий в клетках E. coli с помощью генетических конструкций pRSETb-RhGRH2nodC, pRSETb-MlnodC, pUC19-RhGRH2nodC, pUC19 MlnodC, содержащих полноразмерные гены nodC Rhizobium sp. GRH2 и M.

loti 1803.

2. Получена в растворимом виде в E. coli редуцированная форма фермента N ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляющая собой каталитический домен, которая использована для синтеза олигомеров хитина in vitro.

3. С помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp.

GRH2 осуществлен синтез in vivo гекса-N-ацетилхитогексаозы и пента-N ацетилхитопентаозы (до 20 - 30 мг на литр бактериальной культуры), высокий уровень синтеза пента-N-ацетилхитопентаозы (до 100 мг на 1 л) достигнут при использовании фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803.

4. Синтезирован терминально N-деацетилированный хитоолигосахарид – тетра-N-ацетилхитопентаоза – при культивировании штамма E. coli, экспрессирующего одновременно два фермента M. loti N ацетилглюкозаминилтрансферазу и хитоолигосахарид деацетилазу.

5. Анализ изменений в уровне экспрессии генов Pal, кодирующих защитный фермент фенилаланин-аммоний-лиазу показал, что элиситорная активность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, сравнима с активностью коммерческих аналогов этих соединений.

6. Показана способность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, снижать заболеваемость фузариозом растений томата и ячменя.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Леппянен И.В., Артамонова Т.О., Лопатин С. А., Варламов В. П., Тихонович И. А., Долгих Е.А. Биосинтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобиальных бактерий // Экологическая генетика. 2013. Т. XI. № 2.

2. Долгих Е.А., Леппянен И.В., Жуков В.А., Цыганов В.Е., Тихонович И.А.

Экспрессия рекомбинантных белков-рецепторов SYM10 и SYM37 Pisum sativum, вовлеченных в связывание липохитоолигосахаридов Nod-факторов // Экологическая генетика. 2010. Т. VIII. № 1. С. 16-23.

3. Dolgikh E.A., Leppyanen I.V., Osipova M.A., Tikhonovich I.A. Role of signal exchange in control of Rhizobium – legume symbiosis specificity // Ecological genetics. 2008. V. 6. N 2. P. 27-34.

Статьи в других изданиях:

4. Леппянен И.В., Долгих Е.А.. Ферментативный синтез олигомеров хитина и изучение способности этих соединений стимулировать защитные реакции растений // Коллективная монография. Книга 2. Актуальные проблемы химии, биологии и медицины. Издательство «Научно-инновационный центр», г. Красноярск. 30 июня 2011 г. С. 149-175.

Патент:

5. Долгих Е.А., Долгих В.В., Леппянен И.В., Варламов В.П., Лопатин С.А., Тихонович И.А. Способ ферментативного получения пента-N ацетилхитопентаозы // Патент на изобретение № 2460800 от 04.08.2010.

Тезисы:

1. Леппянен И.В., Лопатин С.А., Варламов В.П., Долгих Е.А. Биологический синтез терминально N-деацетилированных олигомеров хитина с помощью ферментов почвенных бактерий Rhizobium. Тезисы десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2012). г Мурманск, 25 – 30 июня 2012. С. 263-267.

2. Dolgikh E.A., Leppyanen I.V., Lopatin S.А., Varlamov V.P., Tikhonovich I.A.

Molecular approaches for synthesis of chitin oligosaccharides and their N deacetylated derivatives, which are required in medicine, biotechnology and agriculture // In: Proceedings of 10th International Conference of the European Chitin Society. St.-Petersburg. May 20-24, 2011. P. 59.

3. Долгих Е.А., Леппянен И.В., Овцына А.О., Лопатин С.А., Варламов В.П., Тихонович И.А. Биологический синтез олигомеров хитина из простых предшественников с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы почвенных бактерий Rhizobium. Тезисы десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2010). г Нижний Новгород. 29 июня – 2 июля 2010. С.

263-267.

4. Leppyanen I.V., Ovtsyna A.O., Dolgikh E.A. New approach to the synthesis of chitin olygomers - elisitors of plant defense reactions. Heterologous expression of Mesorhizobium loti unique enzymes controlling this synthesis. In: Proceedings of the fourth Baltic sea region AB-RMS symposium and PhD-Course: novel technologies for management of the beneficial and harmful microbes in the root system. November 30 – December 5 2008. Tune, Denmark. P. 41.

5. Леппянен И.В. Гетерологичная экспрессия уникальных ферментов Rhizobium, контролирующих синтез хитиновых олигомеров – элиситоров защитных реакций растений. Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. VIII Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов. Санкт-Петербург. 2008. С. 41.