Биологическое действие пептидов лактоферрина и -лактальбумина на желудочно-кишечный тракт
На правах рукописи
САМОХИНА Людмила Сергеевна
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
ПЕПТИДОВ ЛАКТОФЕРРИНА И -ЛАКТАЛЬБУМИНА
НА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ
Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2013 2
Работа выполнена в ФГБУ Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в лаборато рии молекулярной инженерии и ФГБОУ ВПО «Московский государственный универ ситет пищевых производств» на кафедре «Технология молока и молочных продук тов»
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Комолова Галина Сергеевна доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович
Официальные оппоненты:
Донская Галина Андреевна доктор биологических наук, профессор Заведующая лабораторией ресурсосберегающих про цессов и специальной тематики Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт молочной про мышленности Гунар Людмила Эдуардовна доктор биологических наук, доцент Заведующая кафедрой технологии хранения и переработки плодов и овощей Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия К.А.Тимирязева
Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно- исследовательский инсти тут генетики и селекции промышленных микроорга низмов
Защита диссертации состоится 11 июня 2013 г в 15.30 на заседании диссертаци онного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете им.
Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1.
Тел. 8(495)939-54-83, эл. почта: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан мая 2013 года.
ученый секретарь Диссертационного совета, к.б.н. Пискункова Нина Федоровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы.
В условиях неблагоприятной экологии рост вторичных иммунодефицитных со стояний, определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем де токсикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организ ма. Это становится возможным за счет использования в качестве активной основы в продуктах профилактического и лечебного назначения природных физиологически активных соединений. Молоко и его компоненты, прежде всего белки - продукты пи тания животного происхождения, потребляемые с первых дней жизни. Они участвуют в энергетических и транспортных процессах, осуществляют регуляторную и защит ную функции.
Особое внимание заслуживают сывороточные белки молока лактоферрин (ЛФ) и -лактальбумин (-ЛА). Лактоферрин в последние годы привлекает большое внима ние исследователей в связи с его полифункциональностью, направленной на поддер жание гомеостаза животного организма. Он обладает антибактериальным, противови русным, бифидогенным действием, является фактором роста, переносчиком железа, участвует в метаболических процессах, способен катализировать различные биохи мические реакции, обладая РНКазной, ДНКазной, лактопероксидазной активностями.
Что касается -ЛА, второго после -лактоглобулина по содержанию в молоке белка, то это прежде всего белок, который содержится в высоких концентрациях в молоке, при этом практически не иммуногенен и обладает целым рядом значимых защитных свойств: антимикробным, иммуномодулирующим, опоидным, антиоксидантным, про тивоязвенным, противоопухолевым, антигипертензивным, противострессовым, регу лирующим клеточный рост.
В последние годы японскими исследователями было показано, что образующие ся при протеолизе пептиды по целому ряду показателей, оказались более активными, чем нативные белки. Открывается перспектива получения новых, более эффективных лечебных и профилактических средств на основе пептидных комплексов. Однако в этом аспекте требуются углубленные структурно-функциональные исследования пеп тидов при различных условиях протеолиза.
Современные работы в основном направлены на лечение пептидными препара тами заболеваний, в то время как, отсутствуют данные касающиеся их профилактиче ского действия. Есть основание полагать, что наряду с созданием лечебных средств на основе высокоочищенных пептидов, практически целесообразно, в том числе и эко номически, разрабатывать профилактические средства на основе комплексов пепти дов с различными функциональными свойствами. Это расширяет их физиологическое действие. Данное исследование проводилось с учетом этих положений.
Список сокращений: ЖКТ-желудочно-кишечный тракт;
ЛФ-бычий лактоферрин;
-Ла бычий -лактальбумин;
БСА-бычий сывороточный альбумин;
ЛФц - лактоферрицин;
ЛФп лактоферрампин;
-ЛГ--лактоглобулин;
ЛП-лактопероксидаза;
ГT-галактозилтрансфераза;
ИПХИ-интегральный показатель хронической интоксикации;
CAMP- база данных антимик робных пептидов;
АА-антимикробная активность;
RF- классификационное древо;
SVM векторная машина;
DA - дискриминантный анализ;
АОЕ- антиоксидантная ёмкость;
TEAC антиоксидантная ёмкость по отношению к катион - радикалу АБТС;
ORAC - метод анализа антиоксидантной ёмкости по отношению к пероксильному радикалу;
АБТС – 2,2’-азинобис (3-этил-бензотиазолинсульфонат);
Mr- молекулярная масса;
а.о. – аминокислотный остаток;
Цель и задачи исследований.
Целью настоящей работы являлось изучение защитного влияния пептидов ЛФ и -ЛА на желудочно-кишечный тракт и обоснование состава пептидного комплекса противоязвенного, антидисбактериозного, антиоксидантного действия. В соответ ствии с поставленной целью последовательно решались следующие задачи:
Изучить пептидный состав гидролизатов ЛФ и -ЛА и их защитные свойства против повреждений желудочно-кишечного тракта в зависимости от условий протео литического процесса;
Установить функциональную связь между пептидным составом гидролизатов и их биологической активностью: противоинфекционной, бифидогенной, противояз венной, антиоксидантной;
Изучить совместное защитное действие относительно желудочно-кишечного тракта пептидов ЛФ и -ЛА;
Разработать рекомендации по созданию полифункциональной пептидной ком позиции с защитным действием против повреждений желудочно-кишечного тракта.
Научная новизна.
Впервые показано профилактическое и защитное действие пептидов ЛФ, -ЛА и их комплекса относительно повреждений ЖКТ (противоязвенное, антидисбактериоз ное);
Установлено наличие в мембране Bifidobacterium Adolecsentis B-1 белка (58 кДа), связывающего лактоферрин и его пептиды;
Теоретически и экспериментально обоснован состав нового пептидного ком плекса, рекомендуемого в качестве биологически активной основы средств относи тельно защиты ЖКТ.
Практическая значимость работы.
С учетом установленных в работе биологических свойств пептидов ЛФ и -ЛА результаты исследований могут быть использованы в биотехнологических схемах разработок физиологически эффективных препаратов медицинского, косметического, пищевого назначения.
Примененные в работе методологические подходы в исследовании структурно функциональных свойств пептидов ЛФ и -ЛА могут рассматриваться как адекватные в разработках методов скрининга пептидов различной функциональной направленно сти.
На основе пептидного комплекса разработан препарат «ЖКТ-НОРМ», обладаю щий антимикробным, бифидогенным, антидисбактериозным, антиоксидантным, про тивоязвенным действием.
Результаты исследования включены в учебный курс лекций по дисциплине «Биологически активные вещества молока».
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях: Международной научной конференции студентов и моло дых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010 г.);
Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012 г.);
10-й международной научно практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (в конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу получен ди плом и присуждена медаль);
Пленарном заседании 10-й международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая без опасность населения» (Москва, 2012);
Работа выполнялась в рамках гранта РФФИ 10 04-01005-А.
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 публикаций (из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 5 тезисов докладов конференций).
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литерату ры, объектов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Основной текст работы изложен на страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 32 рисунка. Библиография представлена 288 источниками, в том числе 199 зарубежных.
Благодарности Автор выражает благодарность зав. каф. «Технология молока и молочных про дуктов» проф., д.т.н. В.И. Ганиной, проф., д.т.н. Н.А. Тихомировой, доц., к.т.н. И.И.
Ионовой, аспиранту Е.С. Шаталовой, аспиранту М.А. Головину, проф. каф. «Химия пищи и пищевая биотехнология» Т.И.Громовых за помощь, оказанную при работе над диссертацией;
руководителю лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук проф., д.б.н. О.В. Коро левой за предоставление базы лаборатории для проведения экспериментальных ис следований;
к.б.н. И.В. Николаеву, аспиранту А.А. Торковой за помощь в проведении исследований;
к.ф.-м.н. Кононихину А.А. и сотрудникам лаборатории масспектромет рии биомакромолекул Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Российской академии наук.
Благодарность сотрудникам ООО «Афродита» - Сторожук Л.Н., Карпову А.Б, Величко Е.А;
сотрудникам ЗАО «Захаровский молочный завод»- Коеву Р.А., Косоруковой Л.Н., Тереховой Е.Г., Мишиной Е.В. Благодарность за безграничную помощь, терпение и поддержку к.т.н. С.Н. Лисицыну, к.х.н. А.Б. Лисицыной.
Отдельная благодарность научным руководителям проф., д.б.н. Г.С. Комоловой, проф., д.х.н. В.И. Тишкову за неоценимую помощь, понимание, терпение и поддержку на всех этапах работы над диссертацией.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Пептиды ЛФ Получение и характеристика Лактоферрин получали катионнообменной хроматографией на сорбенте Macro Prep СМ - Support (рис.1).
Концентрация NaCl, M A Время, мин Рисунок 1 - Хроматографическая очистка ЛФ из коровьего молока на катионо обменнике Macro Prep СМ – Support (Sigma, США) Белок, соответствующий на хроматограмме пику 2, согласно электрофоретиче скому и иммуноферментному анализу - ЛФ. Полученный белок гидролизовали сви ным пепсином (Sigma, США) с активностью 90 U/мг при 37 °С, рН 2,0 (рис.2).
Рисунок 2 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе ЛФ пепсином: А - 2ч (I ЛФ), Б – 4ч (II ЛФ), В – 8ч (III ЛФ), Г – 24 ч (IV ЛФ). М – маркерные белки При протеолизе пепсином бычьего ЛФ в реакционной среде уже в первые часы отмечалось накопление продуктов распада ЛФ с молекулярной массой ниже 4 кДа. К 4 часам пептидное пятно увеличилось за счет накопления низкомолекулярных пепти дов, образующихся при пролонгировании протеолитического процесса. В интервале - 24 часа уровень низкомолекулярной компоненты гетерогенной популяции пептидов существенно не менялся.
Хроматомасспектрометрический анализ полученных гидролизатов ЛФ показан в табл. 1.
Таблица 1 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов ЛФ протеолиза, ч Длина пепти ная масса, Да щепления, № Позиция рас Гидролизаты Скор Мascot Молекуляр Экспозиция да, а.о.
Аминокислотная последовательность пептидов AAPRKNVRWCTISQPEW [19-35] 17 2039 GTEYVTAIAN [680-690] 10 1038 LAEDVGDVA [552-560] 9 883 I ЛФ 2 ACTASTTDDCIV [201-212] 11 1653 LRETAEEVKA [237-246] 10 1057 LRPVAAEIYGTKESPQTHYYAVAVVKKGSN [93-122] 30 3279 AQVPSHAVVARSVDGKEDL [267-285] 19 1976 NNSRAPVDA [252-260] 9 1945 DKCVPNSKEKYYGYTGA [397-413] 17 1924 DGGYIYTAGKCGLVPVL [527-543] 17 1728 LSKAQEKSGKNKSRS [290-304] 15 1649 AENRKSSKHSSL [431442] 12 1338 4 II ЛФ PEKADRDQYE [698-707] 10 1254 AVAVVKKANEG [454-464] 11 1085 LQDGAGDVA [218-226] 9 844 GKNGKNCPDK [638-647] 10 1061 KDKKSCHTAVDRTAGWNIPMG [320-340] 35 3318 LGAPSITCVRRAFA [48-61] 21 2377 VKNDTVWENTNGESTADWAKN [364-384] 15 1568 III DGTRKPVTEAQSCH [594-607] 14 1525 ЛФ 8 WCAVGPEEQKKCQQW [467-480] 14 1464 SQSCAPGADPKSRL [507-520] 14 1415 IVNQTGSCA [493-501] 9 894 CKGEGENQCACSSREPYF [573-590] 18 2005 FSASCVPCIDRQAYPNL [172-188] 17 1887 KCRRWQWRMKK [36-47] 11 1604 ECIPGIAEKKADAVT [63-77] 15 1547 IV GRSAGWIIPMGI [139-150] 12 1258 ЛФ QGRKSCHTGL [129-138] 10 1084 GGRPTYEEY [671-679] 9 1075 - остатки редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His), входящих в со став ответственных за антиоксидантную активность пептидов.
Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов представленных в табл.1 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большин стве случаев пептиды прогнозируемы. Присутствуют и не прогнозируемые. Образо вание их может быть обусловлено тем, что в процессе вторичного протеолиза, за счет изменения вторичной структуры, может изменением доступа сайтов для атаки фер ментов. Используя базу данных CAMP на основании аминокислотной последователь ности пептиды ЛФ были прогнозированы на наличие или отсутствие антимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классифи кационному древу (RF), дискриминантному анализу (DA) (табл.2).
Таблица 2 - Insilico анализ антимикробной активности пептидов идентифициро ванных в гидролизатах ЛФ DА SVM RF Гидролизат Вероят Вероят Вероят ность* Последовательность ность ность АА* АА* АА* пептида GTEYVTAIAN - 0,965 - 0,506 - 0, AAPRKNVRWCTISQPEW - 0,623 - 0,562 - 0, ACTASTTDDCIV - 0,707 - 0,712 - 1, I ЛФ LRETAEEVKA - 0,914 + 0,718 - 1, LAEDVGDVA + 0,689 + 0,768 - 0, LRPVAAEIYGTKESPQTHYYAVAVVKKGSN - 0,922 - 0,834 - 0, AQVPSHAVVARSVDGKEDL - 0,967 - 0,968 - 0, LSKAQEKSGKNKSRS - 0,858 - 0,660 - 0, PEKADRDQYE - 0,802 - 0,688 - 1, LQDGAGDVA - 0,571 - 0,748 - 0, AENRKSSKHSSL - 0,974 - 0,644 - 0, GKNGKNCPDK - 0,954 - 0,568 - -1, AVAVVKKANEG - 0,888 - 0,608 - -0, II ЛФ NNSRAPVDA - 0,932 + 0,842 - 0, DGGYIYTAGKCGLVPVL + 0,533 + 0,550 + -1, DKCVPNSKEKYYGYTGA + 0,652 - 0,610 + -0, VKNDTVWENTNGESTADWAKN - 0,859 - 0,978 - 1, LGAPSITCVRRAFA - 0,622 + 0,696 + -0, WCAVGPEEQKKCQQW - 0,945 - 0,844 - 0, DGTRKPVTEAQSCH - 0,886 - 0,990 - 0, IVNQTGSCA + 0,534 + 0,566 + -0, III KDKKSCHTAVDRTAGWNIPMG - 0,795 - 0,630 + -0, ЛФ SQSCAPGADPKSRL - 1,000 - 0,802 - 1, ECIPGIAEKKADAVT - 0,848 - 0,848 - 0, QGRKSCHTGL + 0,743 + 0,700 + -1, FSASCVPCIDRQAYPNL - 0,798 - 0,756 - 0, CKGEGENQCACSSREPYF - 0,956 - 0,780 - 0, GGRPTYEEY - 0,781 + 0,804 - 0, IV GRSAGWIIPMGI - 0,766 + 0,586 + -0, ЛФ KCRRWQWRMKK + 0,976 + 0,596 + -1, * - антимикробная активность пептида;
** - пептид по прогнозам считается ан тимикробным, если дискриминант балл меньше – 0,251.
- совпадает 1 тест;
- совпадает 2 теста;
- совпадает 3 теста При совпадении 2, 3 тестов (табл.2) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании анализа полученных данных следует заключить, что гидролизаты отличаются по антимикробной активности и наиболее активным является IV ЛФ, что подтверждается, в частности, ингибировани ем E. coli O157:Н7 - чувствительного к ЛФ микроорганизма (рис.3).
Контроль lg КОЕ/см ЛФ I ЛФ II ЛФ 1 III ЛФ IV ЛФ 0 1 2 Культирование, час Рисунок 3 - Влияние на рост E. coli O157:Н7 ЛФ и его гидролизатов Доза 6 мкг/см3 соответствует ID30 для ЛФ.
Пептиды ЛФ вызывают антибактериальное действие, более выраженное, чем на тивный белок. Эффект наиболее выражен для пептидов образующихся на позднем этапе протеолитического процесса в период от 4 часов до 24 часов. Значение ID 100%-ной инактивации гидролизатами IV ЛФ на несколько порядков ниже, чем соот ветствующая величина полученная для нативного ЛФ (табл. 3).
Таблица 3 - Ингибирующая активность ЛФ и его гидролизатов (относительно E. coli O157:Н7) Обозначение Антибактериальная активность ID*, мкг/см ЛФ 20,0 ± 1, I ЛФ 1,8 ± 0, II ЛФ (2,1 ± 0,3) 10- III ЛФ (1,9 ± 0,4) 10- IV ЛФ (1,6 ± 0,2) 10- *- минимальная концентрация активного вещества, соответствующая 100% ингибированию роста бактерий (E. coli O157:Н7).
Влияние на рост и бактерицидность микроорганизмов полезной микрофло ры кишечника Чувствительность и характер реакции разных пробиотических клеток на ЛФ и продукты его протеолиза может значительно отличаться. Имеет место выраженная штаммозависимость, которая в значительной мере отражает многофакторность меха низмов защиты микроорганизмов от агентов, способных нарушать структуру и функ цию клеточных систем. По крайней мере два основных механизма, вероятно, опреде ляют характер и выраженность реакций пробиотических культур на ЛФ и его гидро лизаты. Это механизмы: 1. реализуемый через связывание ЛФ с мембранными рецеп торами клетки, 2 связанный с передачей клеткам Fe3+ - важного для процессов кле точного метаболизма элемента. Из изучаемых нами пробиотических бактерий под действием ЛФ активировался рост, например, L. Acidophilus АТ-44, однако, только в том случае если ЛФ был в достаточной степени насыщен железом. Для апо - формы эффект отсутствовал. О роли в механизме действия на пробиотические клетки рецеп торного механизма свидетельствуют данные о корреляции между эффектами ЛФ по активации роста и связыванием его с поверхностными структурами пробиотических клеток. Было установлено, что ЛФ действует на исследуемые пробиотики согласно следующему порядку: Bifidobacterium adolescentis В-1 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus plantarum 885 Lactobacillus fermentum LFM-2. В том же порядке располагаются клетки по связыванию с меченным люминисцентной меткой ЛФ-м (рис.4).
Рисунок 4 - Связывание бЛФ с поверхностными структурами бактериальных клеток:
1 - Bifidobacterium adolescentis В-1;
2- 1Lactobacillus acidophilus 887;
3 - Lactobacillus plantarum 885;
4 - Lactobacillus fermentum LFM-2.
На основании результатов исследования различных пробиотиков по активации роста и связыванию их клеточной стенкой меченого люминисцентной меткой ЛФ в качестве модельной клетки в исследовании рецептора ЛФ была принята B.
adolescentis B-1. Эта бифидобактерия проявляет положительную дозозависимую ро стовую реакцию на ЛФ независимо от содержания Fe3+ в его молекуле. Пептиды ЛФ более активное действие на рост B. adolescentis В-1 чем нативный ЛФ. Наиболее ак тивным является гидролизат IV ЛФ. Как следует из диаграммы, представленной на рис.5. эффект дозозависим. Существенно отметить, что ростовые эффекты ЛФ и его пептидов не сказываются на других функциях бифидобактерий и, прежде всего, бак терицидности относительно патогенных микроорганизмов. Как следует из результа тов, приведенных на рис.6, синтез бактериоцинов B. adolescentis B-1 под влиянием гидролизата IV ЛФ значительно превышает интактный контроль и эффективнее на тивного ЛФ.
Рисунок 5 - Активация роста B. adolescentis В-1 ЛФ-ом и пептидным комплексом (IV ЛФ). За 100% принята концентрация клеток в логарифмической фазе роста в кон троле (без активирующих агентов) см Рисунок 6 - Влияние ЛФ и IV ЛФ на образование бактериоцинов культурой B. Adolescentis. Варианты: 1-интактный контроль (без воздействия);
2 - ЛФ;
3 – IV ЛФ.
Заслуживает внимание тот факт, что не чувствительные к ЛФ бифидобактерии оказались также инертны и относительно его пептидов, что может указывать на воз можность реализации действия на клеточную мишень ЛФ и продуктов его ограничен ного протеолиза через единый механизм, скорее всего рецепторный.
Из мембраны бактерий B. adolescentis В-1 были выделены белки, которые были проверены методом Western-блоттинга на наличие ЛФ – связывающих (рис.7).
М М 1 1 А Б Рисунок 7 - Идентификация рецептора ЛФ А. Электрофоретическое разделение мембранных белков (1). Б. Western-блоттинг с биотинилированным ЛФ (1) и IV ЛФ (2) в качестве тест-пробы на ЛФ-связывающий белок. М-маркерные белки.
Согласно электрофореграммы в мембране исследуемого пробиотика содержатся белки с различной молекулярной массой (А). Блоттирование показало, что нативный бЛФ связывается только с одним белком. Его молекулярная масса около 58 кДа. Ана логичные результаты получены и для биотинилированных фрагментов бЛФ. Они свя зываются с тем же белком клеточной мембраны пробиотика (Б), что соответствует представлению о рецепторном механизме действия на бактерию как лактоферрина, так и его пептидов.
Защитные свойства пептидов ЛФ относительно ЖКТ Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки возникает в результате дисбаланса между действием в них вредных и защитных факторов. Индуцировать яз венные повреждения в желудке могут патогенные микроорганизмы, агрессивные хи мические вещества, стресс и другие агенты. Наиболее общими нарушениями в слизи стой желудка при индукции язвы является возникновение некротических поврежде ний слизистой за счет снижения кровотока. Из-за нарушений функции слизистая меньше синтезирует слизи, выполняющей барьерную роль. В желудке повышается кислотность, снижается уровень предшественников антиоксидантов и, как следствие, повышается уровень активных форм кислорода. Эти характерные для патогенеза язвы различной природы нарушения не исключают безусловно и специфических, прису щих преимущественно данному некротизирующему агенту. В настоящей работе рас сматривается цитопротекторное действие пепсиновых гидролизатов ЛФ в экспери ментальной модели - индуцирование in vivo язвенных повреждений подкисленным этанолом. Слизистая желудка крыс группы интактного контроля не имеет некротиче ских повреждений (Рис.8А). Введение орально физиологического раствора в объеме мл не оказывало влияния на её состояние (Рис.8Б). Глубокие и обширные некротиче ские повреждения, однако, отмечались уже через 60 мин при введении в желудок 5 мл смеси: 100мМ НСl+60%C2Н5ОН (Рис.8В).
Б - Через 60 мин после введения 5 мл A - интактный контроль физиологического раствора В - Через 60 мин после введения 5 мл: Г- За 30 мин до индуцирования язвы индуцирующей язву смеси: 100мМ вводили 5 мл пептидов IV ЛФ НСl+60%C2Н5ОН Рисунок 8 - Слизистая желудка крыс Если за 30 минут до введения индуктора язвы крысам внутрижелудочно вводить ЛФ или его пептиды в зависимости от дозы «индекс язвы», интегральный показатель длины образующихся в слизистой желудка некротических повреждений, снижался или повреждения вообще не проявлялись (Табл.4-6). Как в случае нативного ЛФ, так и его пептидов, отмечалась четкая дозовая зависимость протекторного эффекта.
Таблица 4 -Защитное действие ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Доза ЛФ, мг/кг массы тела 0 50 100 150 200 250 «Индекс язвы», мм 160 132 93 71 47 24 Таблица 5 - Защитное действие II ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Доза II ЛФ, мг/кг массы тела 0 20 40 60 80 «Индекс язвы», мм 160 128 89 77 58 Таблица 6 - Защитное действие IV ЛФ против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс Доза IV ЛФ, мг/кг массы тела 0 1 2 3 4 «Индекс язвы», мм 160 126 95 62 31 Минимальная доза ЛФ, при которой некротические повреждения в желудке практически уже отсутствовали, составляла приблизительно 300 мг/кг массы тела животного. Пептиды ЛФ, согласно полученным данным, значительно эффективнее нативного ЛФ. Их протекторная активность различна и зависит от времени протеоли за ЛФ, проявляясь, наиболее выражено при длительной обработке пепсином. Для пептидов II ЛФ минимальная доза, снимающая индукцию язвенных повреждений слизистой желудка приблизительно в 3 раза ниже установленной для нативного ЛФ.
Пептиды IV ЛФ практически на порядок оказались эффективнее, чем II ЛФ. Уже при дозе 5 мг/кг массы тела у крыс с введенным в желудок пептидов IV ЛФ не было от мечено индуцируемых этанолом повреждений (Табл.4-6). Не исключено, что высво бождаясь из сложной структуры нативного белка соответствующие функциональные домены становятся более контактными с клеточными системами, обуславливающими устойчивость слизистой к повреждениям, в том числе и индуцируемым этанолом.
Следует учитывать гетерогенность популяции полученных пептидов. Значимой со ставляющей в механизме патогенеза язвы, в том числе и индуцируемой этанолом, яв ляется потеря антиоксидантов слизистой при повышении уровня активных форм кис лорода. Супероксид (О2 -) и гидроксил (-ОН) – радикалы приводят к перекисному окислению липидов, что чревато образованием в желудке раковых опухолей. Проти востоять этому могут химические соединения с антиокислительным действием. Из вестно, что ЛФ обладает антиоксидантным свойством.
Анализ полученных нами гидролизатов ЛФ показал, что они обладают антиокси дантным действием, более выраженным, чем нативный белок. Наиболее эффектив ными оказались пептиды с низкой молекулярной массой, образующиеся при длитель ном протеолизе ЛФ за счет содержания остатков редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His) (табл.7).
Таблица 7 - Антиоксидантная емкость пепсиновых гидролизатов ЛФ Обозначение АОЕ по отношению к АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г ТЕАС, мкмольТЭ/г ЛФ 72,68 ± 4,44 284,87 ±19, I ЛФ 118,17 ± 7,07 346,94 ± 7, II ЛФ 164,12 ± 6,57 391,01 ± 12, III ЛФ 192,63 ± 6,45 405,74 ± 17, IV ЛФ 257,63 ± 12,54 612,88 ± 14, Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей пепси новых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими показа телями. Не исключено, что пептиды, по сравнению с нативным белком, более легко in vivo проникают в клетки слизистой, взаимодействуя с системами, отвечающими за уровень антиоксидантов, в значительной мере обуславливающими ее устойчивость к повреждениям. Согласно современным представлениям, основная роль в патогенезе язвенных повреждений желудка и двенадцатиперстной кишки принадлежит грамот рицательной бактерии Helicobacter pylori (H. Pylori). Используемая в работе модель язвы с этанолом в основном предусматривает острые повреждения слизистой желуд ка, вызываемые например агрессивными химическими соединениями, сильным стрессом. Острые нарушения предшествуют хроническим, в патогенезе которых ве дущая роль может принадлежать H.pylori. Во всяком случае, при условии инфециро вания этой бактерией нарушения в слизистой желудка благоприятствуют реализации индуцирования ею хронической язвы и пептиды могут её предотвратить.
Пептиды -ЛА Получение и характеристика Нативный -ЛА был получен анионообменной хроматографией на сорбенте Macro-Prep DEAE Support (рис.9).
Рисунок 9. Хроматограмма разделения анионных сывороточных белков на Macro-Prep DEAE Support при ступенчатом градиенте элюента Электрофоретические исследования показали, что по молекулярной массе белок, вышедший первым пиком соответствовал -ЛА, вторым и третьим БСА и -ЛГ соот ветственно. Протеолиз -ЛА проводили трипсином (Sigma-Aldrich, США) с активно стью 90 U/мг при 37 °С, рН 7,8. Как следует из электрофореграммы (рис.10), при об работке трипсином -ЛА через 6 часов уже отсутствует нативный белок. Глубокое расщепление белка отмечено в период с 12 по 24 часа – молекулярная масса гетеро генной популяции пептидов ниже 1,4 кДа. Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов -ЛА показан в табл. 8.
Рисунок 10 - Трицин-ПААГ электрофорез пептидных композиций, полученных при гидролизе -ЛА трипсином: 1 - 6ч (I -ЛА), 2 – 12ч (II -ЛА), 3 – 24ч (III -ЛА).
М – маркерные белки Таблица 8 - Хроматомасспектрометрический анализ гидролизатов -ЛА Молекулярная расщепления, протеолиза, ч Обозначение пептида, а.о.
Скор Mascot Экспозиция масса, Да Позиция Длина Аминокислотная № последовательность пептидов GYGGGVSLPEWVCTAFNTSGYDT [17-39] 22 4623 I DDQNPNSSNICNISCDK [63-79] 17 1890 -ЛА KILDKVGINYW [94-104] 11 1548 QNNDSTEYGLFQINNK [43-58] 16 2302 FLDDDLTDDIMCVKK [80-94] 15 2292 FLDDDLTDDI [80-89] 10 1181 KILDKVGINY [94-103] 10 1162 [80-88] 9 1067 FLDDDLTDD II [80-87] 8 952 FLDDDLTD -ЛА [80-90] 11 1328 FLDDDLTDDIM [95-104] 10 1220 ILDKVGINYW ALCSEK [109-114] 6 649 FLDDDLTDDIMCV [80-92] 13 1125 EQLTK [1-5] 5 617 CEVFR [6-10] 5 652 FLDDD [80-84] 5 623 FLDDDL [80-85] 6 736 FLDDDLT [80-86] 7 837 III [17-27] 11 1163 GYGGVSLPEWV -ЛА 24 [115-122] 8 1033 LDQWLCEK [99-108] 10 1200 VGINYWLAHK [94-98] 5 615 KILDK ILDKVGINY [95-103] 9 1034 - остатки редокс-активных аминокислот (Tyr, Trp, Met, Cys, His), входящих в со став ответственных за антиоксидантную активность пептидов.
Проанализированы данные в сравнении с Insilico моделированием протеолиза ЛФ с помощью программы Peptide Cutter. Сравнение результатов, представленных в табл.8 с модельными данными позволяет заключить, что в гидролизатах в большин стве случаев пептиды прогнозируемые, некоторые из прогнозируемых отсутствовали.
Выявлены непрогнозируемые пептиды.
Используя базу данных CAMP исследуемые пептиды ЛФ были на основании аминокислотной последовательности прогнозированы на наличие или отсутствие ан тимикробной активности (АА) по трем алгоритмам прогноза: векторной машине (SVM), классификационному древу - Random Forest (RF), дискриминантному анализу Discriminant analysis (DA) (табл.9).
Таблица 9 - Insilico анализ антимикробной активности пептидов идентифициро ванных в гидролизатах -ЛА SVM RF DA Обозначение гидролизата Вероятность** Вероятность Вероятность Аминокислотная последовательность АА* АА* АА* пептидов GYGGVSLPEWVCTAFNTSGYDI - 0,963 - 0,862 - 0, I DDQNPNSSNICNISCDK - 0,795 + 0,824 - 0, -ЛА KILDKVGINYW + 0,614 - 0,558 + -2, QNNDSTEYGLFQINNK - 0,613 - 0,852 - 0, FLDDDLTDDIMCVKK - 0,948 - 0,972 - 0, FLDDDLTDDI + 0,508 + 0,736 - 1, FLDDDLTDD - 0,928 + 0,736 - 1, FLDDDLTD - 0,774 + 0,756 - 1, FLDDDLTDDIM - 0,700 - 0,752 - 1, II -ЛА KILDKVGINY + 0,657 + 0,6 + -2, ILDKVGINYW + 0,718 + 0,63 + -1, ALCSEK - 0,993 + 0,632 + -0, FLDDDLTDDIMCV - 0,928 - 0,862 - 1, EQLTK + 0,985 + 0,738 + -0, CEVFR - 0,603 + 0,648 + -0, FLDDD - 0,895 + 0,80 - 0, FLDDDL + 0,505 + 0,816 - 1, FLDDDLT - 0,965 + 0,906 - 0, GYGGVSLPEWV - 0,790 - 0,658 - 0, III LDQWLCEK - 0,709 + 0,746 - 1, -ЛА VGINYWLAHK + 0,906 + 0,688 + -2, KILDK - 1,000 + 0,586 + -1, ILDKVGINY + 0,865 + 0,716 + -2, * -антимикробная активность пептида;
**- пептид по прогнозам считается анти микробным, если дискриминант балл меньше – 0,251.
- сопадает 3 теста;
- совпадает 2 теста;
- совпадает 1 тест При совпадении 2, 3 тестов (табл.9) есть основание предположить, что пептид обладает антимикробной активностью. На основании полученных данных можно счи тать, что в гидролизате III -ЛА содержится больше, обладающих антимикробной ак тивностью пептидов, чем в других гидролизатах.
Защитные свойства пептидов -ЛА против повреждений желудка Представлены медико-биологические исследования по изучению профилактиче ского действия трипсиновых пептидов -ЛА на профилактику индуцирования этано лом язвенных повреждений в слизистой желудка крыс. Если за 30 минут до индуци рования язвы внутрижелудочно вводили -ЛА или его пептиды в зависимости от до зы повреждения были менее выраженны или вообще отсутствовали (рис. 11, Б - Г).
А - Через 60 мин после введения в Б - За 30 минут до индукции язвенных желудок крыс смеси повреждений в желудок введен -ЛА в 100мМ НСl+ 60%C2Н5ОН дозе 84 мг/кг массы тела В - За 30 минут до индукции язвен- Г- За 30 минут до индукции язвенных ных повреждений в желудок крыс повреждений в желудок крыс введен введен -ЛА в дозе 300 мг/кг массы гидролизат III -ЛА в дозе 5 мг/кг массы тела тела Рисунок 11 - Слизистая желудка крыс Согласно данным, приведенным на рис. 12, защитный эффект дозозависим. Для нативного -ЛА минимальная доза, при которой имела место 100% защита, составля ла 280 мг/кг, для пептидных комплексов - I -ЛА и III -ЛА соответственно и 2 мг/кг массы тела животного.
Рисунок 12 Дозовая зависимость противоязвенной активности нативного -ЛА и гидролизатов Следует заметить, что сопутствующие проведению эксперимента факторы и, прежде всего, введение в желудок 5 мл жидкости, в том числе двухкратное с интерва лом в 30 минут, согласно исследованиям животных соответствующих контрольных групп, не оказывали влияние как на морфологическое состояние слизистой желудка, так и на степень язвенных повреждений в желудке крыс обеих опытных групп (без введения и с введением протекторов). Вероятно, этому способствовали условия и спе циальные процедуры, предусматривающие минимизацию при инстилляции в желудок жидкостей, стрессовых явлений. Полученные данные свидетельствуют о том, что трипсиновые пептиды -ЛА, так же как и нативный белок, оказывают противоязвен ное действие, причем более эффективное. Сравнение протекторного эффекта гидро лизатов при дозе, соответствующей 50%- ной защите, -ЛА-ом (140 мг/кг массы тела) показало, что наиболее выраженное противоязвенное действие оказывают пептиды с более низкой молекулярной массой. Исследование пептидов -ЛА на антиоксидант ную активность методом определения антиоксидантной емкости по двум радикалам:
пероксильному и катион-радикалу АБТС показало, что гидролизаты обладают более высокой антиоксидантной активностью, чем нативный белок. Наиболее эффективны ми оказались пептидные комплексы с низкой молекулярной массой, содержащие остатки редокс-активных аминокислот (табл.10).
Таблица 10 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов -ЛА Обозначение АОЕ по отношению к АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г ТЕАС, мкмольТЭ/г -ЛА 104,68 ± 11,46 208,16 ±11, I -ЛА 157,71 ± 6,52 351,53 ± 4, II -ЛА 245,15 ± 16,93 475,97 ± 6, III -ЛА 310,46 ± 5,30 719,82 ± 13, Сравнение результатов антиоксидантной и противоязвенной активностей трип синовых гидролизатов позволяет заключить о наличии корреляции между этими пока зателями.
Комплекс лечебно-профилактической направленности на основе пептидов ЛФ+ -ЛА Интегральным показателем состояния микрофлоры кишечника (патогенная и по лезная) можно рассматривать дисбактериоз. Дисбактериоз - качественное изменение бактериальной микрофлоры организма, главным образом, кишечника. Дисбактериоз возникает в результате нарушения равновесия кишечной микрофлоры из-за различ ных причин: применения антибактериальных средств, в частности антибиотиков, не правильного питания, нарушения функции иммунитета. Как уже установлено пепти ды ЛФ и -ЛА действуют сильнее на патогенную и полезную микрофлору, чем натив ные белки. С учетом к тому же расширяющей биоактивный спектр штаммоспецифич ности компонентов, есть основание полагать, что их комплекс окажется средством с повышенной эффективностью против дисбактериоза. Дисбактериоз у крыс индуциро вали введением в желудок антибиотика-10 % фторхиналон байтрила (Bayer HealthCare Animal Health), содержащего в качестве действующего вещества энрофлоксацин ( мг/мл) в дозе 10 мг на 1 кг массы тела. При оральном введении крысам фторхиналон байтрила, уже через 5 суток в ЖКТ имеют место, по сравнению с интактным контро лем, изменения, свидетельствующие о развитии умеренного дисбактериоза. Прежде всего, это касается состава микрофлоры кишечника. Наряду с вызываемым антибио тиком частичном ингибированием патогенной отмечено и подавление полезной мик рофлоры. Так, в толстом кишечнике уровень лактобацилл снижался на 33,4%, бифи добактерий – на 49,8%. Изменения касались и морфологических показателей слизи стой как тонкого, так и толстого отделов кишечника. На фотографиях видны струк турные изменения в ткани кишечника, особенно четко проявляемые относительно длины, а также диаметра ворсинок и крипт. Они существенно снижены. Ведение жи вотным орально в объеме 5 мл физиологического раствора или воды не выявило ка ких-либо изменений в ЖКТ, по сравнению с интактным контролем. Следовательно, отмеченные при введении крысам антибиотика изменения в ЖКТ не обусловлены со путствующими факторами, связанными с процедурой инстилляции препарата в желу док с использованием зонда. Если за 30 мин до введения антибиотика крысы получи ли орально комплексные препараты ЛФ и -ЛА или их гидролизаты (в соотношении 1:1 по весу) характерных для дисбактериоза нарушений по морфологическим и мик робиологическим показателям было меньше. На основании дозовых закономерностей установлено, что для комплекса нативных белков доза, соответствующая 100%-й про филактики дисбактериоза, составляла 350 мг/кг, для гидролизатов - в 100 раз меньше.
На рис.13 показано протекторное действие комплекса «ЛФ + -ЛА» и пептидных ком плексов «IVЛФ+III -ЛА» на морфологические показатели тонкого отдела кишечника.
Микроструктура гистологических срезов тонкого отдела кишечника крыс Увеличение 40 - слева, 200 - справа А – Интактный контроль Б - Оральное введение антибиотика (10% фторхиналон байтрила) В - Оральное введение за 30 мин до ан- Г - Оральное введение за 30 мин до анти тибиотика комплекса (50% ЛФ + 50% биотика комплекса (50% IV ЛФ + 50% -ЛА) доза 350 мг/кг массы тела III -ЛА) доза 3,5 мг/кг массы тела Рисунок 13 - Морфологические показатели слизистой тонкого отдела кишечника Аналогичные данные получены и для толстого кишечника. В случае пептидного варианта исследуемые величины даже превышают установленные для интактного контроля, то есть пептиды проявляют свое свойство, как фактор роста. Измерение длины ворсинок, крипт и величины их диаметров показало, что у крыс с предше ствующим антибиотику введением комплексных препаратов повышается длина тка невых органелл (Рис.14). Запуск механизма активации клеточной пролиферации мо жет быть компенсаторной адаптационной реакцией клеток на отрицательное влияние антибиотика относительно рассматриваемых показателей. Более выраженное защит ное действие гидролизатных комплексов установлено также относительно микрофло ры кишечника. Заслуживает внимания тот факт, что уровень лактобацилл и бифидо бактерий в случае предварительного введения животным пептидного комплекса, со держащего «IV ЛФ + III -ЛА» не только нормализовался, но и превысил более чем в 2 раза соответствующие показатели интактного контроля.
Рисунок 14 - Влияние комплексов «ЛФ + -ЛА» и «IVЛФ + III-ЛА» на некото рые морфологические показатели тонкого отдела кишечника крыс при индуцировании дисбактериоза. Варианты: А – Без введения защитных средств (Контроль, принятый за 100%);
Б – Ведение «ЛФ + -ЛА» в дозе 350 мг/кг массы тела);
В - Введение «IV ЛФ + III -ЛА» в дозе 3,5 мг/кг массы тела).
Протекторный эффект, характеризующийся аддитивным взаимодействием ком понентов, установлен также и по противоязвенному действию пептидных комплексов (рис.15).
Рисунок 15 - Протекторное действие пептидного комплекса IV ЛФ и III -ЛА (1:1) против индуцирования этанолом повреждений в желудке крыс.
Пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством (табл.11) Таблица 11 - Антиоксидантная емкость пептидных комплексов Обозначение АОЕ по отношению к АОЕ по отношению к ORAC, мкмольТЭ/г ТЕАС, мкмольТЭ/г ЛФ + -ЛА 89,45 ± 7,95 247,84± 14, II ЛФ + I -ЛА 161,92± 6,55 372,61± 8, III ЛФ + II -ЛА 219,98 ± 11,69 441,87± 12, IV ЛФ + III -ЛА 284,05 ± 8,48 667,35 ± 11, Как следует из данных представленных в табл. 11 пептидный комплекс обладает антиоксидантным свойством. Максимальное действие оказывает комплекс IV ЛФ + III -ЛА, что коррелирует с его противоязвенной активностью. С одной стороны, ан тиоксидантная активность – один из компонентов механизма повышения противояз венного действия пептидов, с другой - ее следует рассматривать как самостоятельный защитный фактор в биоактивности пептидного комплекса.
Пептидный комплекс как активная основа полифункционального препарата «ЖКТ-НОРМ»
Полученные данные о биоактивных свойствах пептидного комплекса ЛФ и -ЛА позволяет рассматривать его в качестве основы профилактического препарата с анти микробным, противоязвенным, антидисбактериозным, антиоксидантным действием.
Принципиальная схема производства пептидного комплекса, названного «ЖКТ НОРМ» приведена на рис.16.
Молоко обезжиренное коровье Получение ЛФ с использованием катио- Получение -ЛА с использованием анио нообменника Мacro Prep High Q-Support нообменника Macro-Prep-DEAM-Support Получение протеолизом пепсином водных Получение протеолизом трипсином вод растворов целевых пептидов ЛФ ных растворов целевых пептидов -ЛА Холодная стерилизация Асептическая процедура смешивания пептидов ЛФ и -ЛА в соотношении 1: Асептический розлив в стерильные флаконы Жидкая форма препарата Лиофильная сушка Сухая форма Закупорка, маркировка Хранение:жидкая форма:(20±2)0С-6 мес.;
(4±2)0С-12 мес.;
сухая форма:
-200С – 1 год Рисунок 16 - Принципиальная схема получения пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»
Характеристика выработанного в лабораторных условиях образца «ЖКТ-НОРМ»
приведена в табл.12-14.
Таблица 12 - Органолептические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»
Наименование показателя Результаты контроля Прозрачная жидкость или однородный сыпу чий порошок. Допускается присутствие не Внешний вид, консистенция больших комочков, легко рассыпающихся при механическом воздействии.
Цвет молочно-белый равномерный по всей Цвет, вкус, запах массе порошка. Вкус сладковатый, без запаха Таблица 13 - Физико-химические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»
Показатели Показатели, нормируемые Наименование показателя препарата по СанПиН 2.3.2.2351- Массовая доля влаги, % не более 1,70±0, Растворимость, сек не более 43± Активная кислотность восста 6,7-6,9 — новленного продукта, рН, ед.
Таблица 14 - Микробиологические свойства пептидного комплекса «ЖКТ-НОРМ»
Показатели, нормиру Показатели Наименование показателя емые по СанПиН препарата 2.3.2.2351- КМАФАнМ, КОЕ/г 1,2х102 Не более 5* Содержание дрожжей и плесневых Не обнаружены Не более грибов в 1,0 г препарата, КОЕ Бактерии группы кишечных палочек в Не обнаружены Не допускаются 1,0 г препарата S. aureus в 0,1 г препарата Не обнаружены Не допускаются Патогенные микроорганизмы, в т.ч.
Не обнаружены Не допускаются сальмонеллы, в 25,0 г препарата Для исследования возможного негативного действия пептидного комплекса про водили медико-биологическим исследования его токсичности. Крысы были разделены на две группы: контрольную и опытную. Животные опытной группы в течение дней непосредственно перед едой перорально получали препараты в десятикратной дозировке, в то время как животные группы интактного контроля пищевую добавку не получали. В обеих группах отмечалась хорошая поедаемость корма. Выживаемость всех подопытных животных была полной (100 %). В течение всего эксперимента у животных опытной группы не отмечали каких-либо клинических отклонений в состо янии здоровья. Двигательная активность не снижена. Случаев изменения поведенче ских реакций (угнетения, возбуждения) не выявлено. В ходе всего эксперимента шерсть животных, получавших препарат, сохраняла блеск и плотное прилегание, кожа - бледно-розовый цвет без сыпей и повреждений. Признаков воспаления не обнаруже но. По окончании эксперимента патологоанатомическое исследование животных (табл.15), не выявило внешних проявлений патологических процессов во внутренних органах – пищеварительном тракте, поджелудочной железе и печени, дыхательной си стеме, органах кровообращения и кроветворения, мочевыделительной системе. Не происходило изменений в массе тимуса, чувствительном, как известно, показателе на стресс.
Таблица 15 - Абсолютная масса тела и интегральный показатель хронической интоксикации лабораторных животных Группы животных Показатели Контрольная Опытная Абсолютная масса тела, г 105,00±3,90 118,00±5, ИПХИ селезенки,% 0,58±0,07 0,62±0, ИПХИ почек,% 0,48±0,02 0,45±0, ИПХИ печени,% 4,54±0,41 4,69±0, ИПХИ сердца,% 1,00±0,03 0,56±0, Рассчитанный показатель хронической интоксикации селезенки, почек, печени и сердца не выявил каких-либо значимых различий у животных опытной и контрольной групп. Полученные данные свидетельствует о том, что десятикратное увеличение ре комендуемой физиологически эффективной дозы препарата не оказывает токсичного действия на животный организм. Введение в рацион животных пептидного комплекса не оказало негативного влияния на массу тела, подтверждая отсутствие кумулятивно го токсического его эффекта. При соотношении компонентов 1:1 минимальная доза рассматриваемых пептидов составляет 3,5 мкг на 1 кг массы тела животного. Разрабо танная технология получения «ЖКТ-НОРМ» в принципе применима и в промышлен ных условиях. Производство нового биологически-активного препарата на основе пептидного комплекса сывороточных белков молока целесообразно рекомендовать для включения в качестве одного из звеньев в схему безотходной переработки молоч ного сырья.
ВЫВОДЫ 1. Пептиды ЛФ и -ЛА молока обладают противоязвенным, антидисбактериоз ным, антиоксидантным действием в значительной мере более выраженным, чем нативные белки.
2. Установлена функциональная связь между составом пептидных комплексов полученных при различных условиях протеолиза и их биологической активно стью: противоязвенной, противоинфекционной, бифидогенной, антиоксидант ной.
3. Пептиды -ЛА, по сравнению с пептидами ЛФ, более эффективны против по вреждений слизистой желудка, но менее эффективны против дисбактериозной профилактики. В комплексных препаратах эффекты в отношении профилакти ки язвенных повреждений и дисбактериоза показывают аддитивность.
4. Обоснован состав пептидной композиции «IV ЛФ + III -ЛА», названной «ЖКТ-НОРМ».
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи 1. Самохина Л.С., Головин М.А., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Ша талова Е.С. Антибактериальная активность лактоферрина из коровьего молока // Молочная промышленность.-2012.- №7.- С. 56-57.
2. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ионова И.И., Семенов Г.В. // Противоязвенное действие лактоферрина и его гидролизатов. Хранение и переработка сельхоз сырья.- 2012.- №9.- С.21-23.
3. Самохина Л.С., Комолова Г.С., Ганина В.И., Ионова И.И., Семенов Г.В.// Про тиводисбактериозное действие композиции гидролизатов -лактальбумина и лактоферрина // Известия вузов. Пищевая технология.- 2012.- № 5-6.- С.17-20.
4. Самохина Л.С., Ионова И.И., Тишков В.И., Комолова Г.С. Защитное действие продуктов протеолиза -лактальбумина против язвенных повреждений слизи стой желудка крыс // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтиче ской химии (в печати) Тезисы конференций 1. Самохина Л.С., Шаталова Е.С. Выделение и идентификация препарата лакто феррина. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 8 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.:
МГУПБ, 2010.- С.20-21.
2. Петров Д.А., Александрова А.А., Кузьмина А.Л., Кислова В.А., Самохина Л.С., Овчинникова О.Е. Очистка -лактальбумина из коровьего молока с использо ванием гель-фильтрации. Живые системы и биологическая безопасность насе ления: Материалы 8 международной научной конференции студентов и моло дых ученых.- М.: МГУПБ, 23-24 ноября 2010.- С.71-72.
3. Самохина Л.С., Петрова С.Н., Комолова Г.С., Ионова И.И. Изучение динамики образования в процессе протеолиза лактоферрина пептидов, активных против E.Coli. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.:
МГУПБ, 2011.- С.54-55.
4. Самохина Л.С. Противоязвенное действие пептидов -лактальбумина и лакто феррина. Фармацевтические и медицинские биотехнологии: Материалы международной научно-практической конференции.- М.: 2012.- С. 175-176.
5. Самохина Л.С., Кузьмина А.А., Комолова Г.С. Влияние -лактальбумина и его гидролизатов на защитную функцию ЖКТ. Живые системы и биологическая безопасность населения: Материалы 10 международной научной конференции студентов и молодых ученых.- М.: МГУПБ, 2012, С.63-64.