Нанокомпозитные микрокапсулы, чувствительные к ультразвуку, и их взаимодействие с биологическими объектами
На правах рукописи
КОЛЕСНИКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА
НАНОКОМПОЗИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К
УЛЬТРАЗВУКУ, И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ
ОБЪЕКТАМИ
03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Саратов – 2010
Работа выполнена на кафедре физики полупроводников факультета нано и биомедицинских технологий Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского
Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Горин Дмитрий Александрович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии ин ститута биохимии и физиологии растений и мик роорганизмов РАН, г. Саратов Богатырев Владимир Александрович доктор физико-математических наук, профессор кафедры прикладной оптики и спектроскопии физического факультета Саратовского государ ственного университета им. Н.Г. Чернышевского Петров Владимир Владимирович
Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится 16 ноября 2010 г. в 17 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета Д 212.243.05 по специальности 03.01.02 – «Биофизи ка» при Саратовском государственном университете им. Н.Г Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Саратовского госу дарственного университета им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, ул. Универси тетская, 42).
Автореферат разослан 13 октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, профессор В.Л. Дербов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Разработка новых методов диагностики, лечения и мониторинга различных заболеваний является одним из ведущих направлений в области исследований современной медицины. Основной проблемой, связанной с использованием на номатериалов в этой области, является создание систем адресной доставки ле карственных препаратов, способных осуществлять их контролируемое высво бождение в непосредственной близости от пораженных участков организма.
Это позволит существенно повысить эффективность действия лекарственных препаратов и значительно уменьшить их общую концентрацию в организме, и, как результат, снизить побочные эффекты от их применения.
Адресная доставка может осуществляться при помощи различных типов нано- и микроконтейнеров, пригодных для капсуляции биологически-активных веществ: наночастиц;
липосом;
полимерных мицелл;
различных векторных конструкций, позволяющих направленно связываться и эндоцироваться в клет ки-мишени;
антител, обеспечивающих селективную сорбцию контейнеров на поверхности раковых клеток;
pH-чувствительных носителей. Однако использо вание данных объектов затруднено высокой стоимостью их изготовления и ма лой стабильностью во времени. В связи с этим среди потенциальных средств адресной доставки следует особо выделить полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции [1].
Потенциальное использование полиэлектролитных микрокапсул в биоме дицинских целях требует решения следующих задач: 1) возможность включе ния биологически-активных веществ в объем контейнеров с целью защиты ор ганизма от их несанкционированного действия, предохранения препаратов от внешней активной среды организма, а также обеспечения возможности их про лонгированного действия;
2) модификация свойств микроконтейнеров с целью реализации их адресной доставки к поврежденным органам и тканям, а также их локализации в строго заданных границах и областях;
3) обеспечение контро лируемого высвобождения инкапсулированного вещества в непосредственной близости от пораженных участков организма.
Проницаемость оболочек микрокапсул может изменяться под действием различных факторов (температура, кислотность среды, полярность растворите ля, ионная сила раствора и т.д.) [2]. Известны примеры создания биосовмести мых микрокапсул с иммобилизованными в них биоактивными соединениями (белками, в частности, ферментами, ДНК, экстрактами лекарственных расте ний), применяемыми в биомедицине для репарации тканей [3]. Выбор в качест ве составных компонентов оболочек микрокапсул материалов различной при роды, позволяет получать многофункциональные носители, чувствительные к тому или иному внешнему воздействию (магнитному полю, лазерному излуче нию, ультразвуку и т.п.), что также существенно расширяет перспективы и по вышает эффективность их использования [4-8]. Следует отметить, что не толь ко выбор веществ, но и варьирование размера, структурирование оболочки микрокапсул путем изменения числа слоев в ней, объемной фракции различных включений и т.п. позволяют достаточно точно управлять их физическими и хи мическими свойствами и делают возможной реализацию принципа «снизу вверх».
Однако для достижения желаемого эффекта необходимо иметь механизм высвобождения закапсулированного вещества из объема микроконтейнеров.
Воздействовать на проницаемость оболочек микрокапсул можно различными способами. Так, существуют работы по вскрытию микрокапсул лазерным излу чением внутри клеток (in vitro) [8]. Однако в этом случае для достижения тре буемых плотностей мощности лазерного излучения нужна его фокусировка на поверхности оболочки капсулы, что не всегда достижимо, особенно в биологи ческих средах. В области биомедицинского применения, например, в терапии раковых заболеваний, зачастую требуется менее локальное воздействие, приво дящее к одновременному вскрытию множества микрокапсул. Примером такого дистанционного, группового воздействия является ультразвук [6, 7]. Следует отметить, что ультразвук широко применяется в медицине в качестве средства диагностики и лечения многих (в том числе онкологических) заболеваний (ультразвуковая гипертермия, неинвазивная HIFU хирургия, сонодинамическая терапия). Известна возможность использования твердофазных нановключений соносенсибилизаторов в биологических структурах в качестве концентраторов ультразвуковой энергии [7].
Возможность использования неорганических наночастиц в качестве соно сенсибилизаторов, повышающих чувствительность полиэлектролитных микро капсул к ультразвуку, показана ранее на примере наночастиц магнетита [6].
Однако на данный момент мощности ультразвука, используемого для разруше ния оболочек микрокапсул, намного превышают безопасные терапевтические мощности. Добиться разрушения микрокапсул при меньших мощностях и бо лее высоких частотах ультразвука можно путем подбора соносенсибилизато ров, а также варьирования их объемной фракции в оболочке. Это позволит управлять механическими свойствами капсул и, следовательно, их чувстви тельностью к ультразвуку. В данной работе в качестве соносенсибилизаторов были выбраны наночастицы магнетита и оксида цинка. Магнетит может ис пользоваться для функционализации оболочек микрокапсул с целью обеспече ния их управляемого перемещения под действием магнитного поля. Выбор на ночастиц оксида цинка обусловлен тем, что они являются хорошим антибакте риальным агентом [9] и применяются в терапии онкологических заболеваний [10].
Цель работы и задачи исследования Целью диссертационной работы явилось создание нанокомпозитных мик рокапсул, чувствительных к ультразвуку, повышение их чувствительности пу тем оптимизации состава и структуры оболочек, а также изучение взаимодей ствия капсул с биологическими средами и объектами.
Основными задачами
исследования являлись:
1. Получение нанокомпозитных микрокапсул, содержащих в структуре обо лочки наночастицы магнетита, и исследование их чувствительности к ультразвуку в зависимости от объемной фракции наночастиц магнетита в оболочке.
Формирование и оптимизация структуры и состава оболочек микрокапсул, 2.
модифицированных наночастицами оксида цинка, с целью повышения чувствительности капсул к ультразвуку путем варьирования объемной фракции наночастиц оксида цинка. Изучение взаимосвязи между парамет рами, характеризующими механические свойства оболочек микрокапсул и их чувствительности к ультразвуковой обработке в зависимости от объем ной фракции наночастиц оксида цинка.
Исследование взаимодействия микрокапсул, модифицированных наноча 3.
стицами оксида цинка, с клетками крови и определение влияния физиоло гических свойств среды диспергирования (фосфатного буфера, плазмы крови и цельной крови) на чувствительность микрокапсул к ультразвуко вой обработке.
Изучение процесса фагоцитоза микрокапсул белыми клетками крови в за 4.
висимости от их размера и строения оболочки. Изучение возможности ис пользования фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов обо лочек нанокомпозитных микрокапсул, образованных в результате ультра звуковой обработки.
Определение токсического эффекта, оказываемого ZnO-композитными 5.
микрокапсулами со структурой оболочки (PAH/PSS)2(ZnO/PSS) (PAH/PSS) и их составляющими компонентами на гидробионтов (церио дафний (Сeriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бакте рий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio).
Научная новизна работы Продемонстрирована возможность разрушения нанокомпозитных микро 1.
капсул под действием низкочастотного (27 кГц) ультразвука с плотностью мощности 3.5 Вт/см2 в течение нескольких минут и обнаружена зависи мость чувствительности капсул от объемной фракции наночастиц магнети та в структуре оболочки [Л4, Л6].
Получены нанокомпозитные микрокапсулы, функционализированные на 2.
ночастицами оксида цинка, обнаружена высокая чувствительность данного типа контейнеров к низкочастотному (20 кГц) ультразвуку с плотностью мощности 0.6 Вт/см2, установлена зависимость механических свойств мик рокапсул и их чувствительности к ультразвуку от объемной фракции нано частиц оксида цинка в оболочке [Л8].
Произведено разрушение ZnO-композитных оболочек микрокапсул под 3.
действием низкочастотного (20 кГц) ультразвука с плотностью мощности 0.6 Вт/см2 в физиологических средах – фосфатно-солевом буфере, плазме крови и крови. Показана возможность разрушения ZnO-композитных кап сул в крови под действием ультразвука, не приводящая к нарушению цело стности клеток крови [Л10].
Изучен механизм взаимодействия клеток крови с микрокапсулами в зави 4.
симости от их размера (фагоцитоз капсул) и показана возможность утили зации фрагментов оболочек, образовавшихся после ультразвукового раз рушения капсул, посредством фагоцитоза.
Установлено снижение токсического эффекта, оказываемого нанокомпо 5.
зитными микрокапсулами (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) на гидробио нтов, по сравнению с их составляющими компонентами – полиэлектроли тами и наночастицами оксида цинка.
Научно-практическая значимость работы Созданы нанокомпозитные микрокапсулы с наночастицами магнетита в структуре оболочки, обладающие чувствительностью к магнитному полю и ультразвуковому излучению, что обеспечивает возможность реализации управ ляемой магнитным полем адресной доставки лекарственных веществ с после дующим вскрытием микрокапсул при помощи ультразвука.
Реализовано существенное повышение чувствительности микрокапсул к ультразвуку путем встраивания в структуру их оболочек в качестве соносенси билизатора наночастиц оксида цинка, что значительно повышает перспективы их использования в биомедицинских целях в качестве контейнеров адресной доставки за счет снижения необходимой для разрушения капсул мощности ультразвука и сокращения времени ультразвуковой обработки.
Продемонстрировано взаимодействие нанокомпозитных микрокапсул, со держащих наночастицы оксида цинка, с клетками крови, показана гемосовме стимость данного типа микроконтейнеров и обнаружена зависимость протека ния процесса фагоцитоза от размера капсул, что позволяет использовать явле ние фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микро капсул, образовавшихся после их вскрытия ультразвуком.
Обнаружен эффект разрушения ZnO-композитных микрокапсул в суспен зии эритроцитов в результате ультразвуковой обработки, сопровождающийся частичным разрушением эритроцитов, то есть обнаружены пороговые парамет ры ультразвука, применимого для вскрытия капсул в присутствии биологиче ских объектов, и показана необходимость дальнейшего повышения чувстви тельности микрокапсул путем подбора соносенсибилизаторов или путем опти мизации частоты и мощности ультразвука.
Произведен анализ токсичности ZnO-композитных микрокапсул и их со ставляющих компонент с использованием в качестве тест-систем гидробионтов (цериодафний (Сeriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бакте рий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio). Установлено, что наибольшей токсичностью из всех используемых компонент микрокапсул обладает раствор катионного поли электролита полиалиламина гидрохлорида (PAH) по сравнению с полистирол сульфонатом натрия (PSS), комплексом PAH+PSS, наночастицами оксида цин ка и микрокапсулами. Обнаружено существенное снижение острого токсиче ского эффекта для случая полиэлектролитного комплекса PAH+PSS, a также суспензии микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS).
Достоверность полученных результатов Достоверность полученных результатов обусловлена применением в экс периментах стандартной измерительной аппаратуры и подтверждается воспро изводимостью экспериментальных данных.
Основные положения, выносимые на защиту Изменение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита (-потенциал 1.
12.5 ± 4 мВ, pH 7) позволяет регулировать чувствительность микрокапсул к низкочастотному ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см2). При проведении одно го цикла адсорбции магнетита наблюдается увеличение чувствительности микрокапсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц.
Дальнейшее увеличение числа циклов адсорбции магнетита приводит к снижению ультразвуковой чувствительности капсул, что связано с харак тером адсорбции и распределением наночастиц магнетита в оболочке.
Введение наночастиц оксида цинка (-потенциал +36 ± 5 мВ, pH 7) суще 2.
ственно увеличивает чувствительность полиэлектролитных капсул к низ кочастотному ультразвуку (20 кГц, 0.6 Вт/см2). Увеличение числа циклов адсорбции наночастиц (от 1 до 4) приводит к повышению чувствительно сти капсул, что связано с уменьшением модуля Юнга (от 580 МПа до МПа) и объясняется недостатком полимера, выступающего в нанокомпо зитной оболочке в качестве связующего компонента.
Инкубация в крови нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных 3.
наночастицами оксида цинка, не приводит к гемолизу. Для капсул с диа метром ~10 мкм процесс фагоцитоза затруднен. Фрагменты капсул после ультразвуковой обработки, капсулы диаметром 1 мкм и их агрегаты ус пешно фагоцитируются белыми клетками крови.
Из составляющих компонент нанокомпозитных микрокапсул со структу 4.
рой оболочки (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) максимальный токсиче ский эффект на гидробионтов оказывает катионный полиэлектролит поли алиламин гидрохлорид (PAH). Минимальное токсическое действие на гид робионтов оказывают нанокомпозитные микрокапсулы, что связано с на личием упорядоченного полиэлектролитного комплекса и компенсацией избыточных зарядов молекул полиэлектролитов в структуре оболочки микрокапсулы.
Апробация работы Основные результаты работы были представлены на Всероссийской науч ной конференции «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине (СГУ, 2007);
Международной конференции «Saratov Fall Meeting 2007» в сек ции Nanobiophotonics (Саратов, 2007, устный доклад);
научном семинаре, про водимом в рамках российско-британского проекта BRIDGE (Саратов, 2007, устный доклад);
2-ой школе-семинаре «Наночастицы, наноструктурированные покрытия и микроконтейнеры: технология, свойства, применение» в рамках Фестиваля науки, посвященного празднованию 100-летнего юбилея СГУ (Сара тов, 2009, устный доклад);
1-ой Международной научной школе «Нано 2009.
Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009, победи тель постерной сессии);
Международной конференции «Saratov Fall Meeting 2009» в секции Nanobiophotonics (Саратов, 2009, устный доклад), совместном семинаре Германской службы академических обменов (DAAD) для стипендиа тов российско-германских программ «Михаил Ломоносов» и «Иммануил Кант»
(Москва, 2010), а также на семинарах рабочей группы и кафедры.
Гранты Работа, представленная в диссертации, выполнена при финансовой под держке следующих проектов: «Создание нанокомпозитных планарных слоев и оболочек микрокапсул методом полиионной самосборки и исследование их фи зических свойств» (Мин. образования и науки РФ РИ-19.0/002/227 ГК №02.442.11.7183) (2005 г.);
«Формирование нанокомпозитных микро- и нано размерных структур и исследование их физических свойств» (Мин. Образова ния и науки РФ 6РИ-19.0/001/051 ГК №02.442.11.7249) (2006 г.);
«Функциона лизованные наночастицы с настраиваемым плазмонным резонансом и поли электролитные микрокапсулы с наночастицами в составе оболочки» (Мин. Об разования и науки РФ 2007-3-1.3-07-01-081 ГК №02.513.11.3043) (2007 г.);
Ин новационно-образовательная программа СГУ (2007-2008 гг.);
«Исследование возможности создания водных суспензий микрокапсул с нанокомпозитными оболочками, чувствительными к микроволновому и ультразвуковому облуче нию» (совместный российско-немецкий проект РФФИ № 06-02-04009 и DFG 436 RUS 113/844/0-1) (2008-2009 гг.);
совместная программа Министерства об разования и науки РФ и Германской службы академических обменов (DAAD) «Михаил Ломоносов II» (проект A/08/96088) (2009-2010 гг.).
Личный вклад диссертанта Личный вклад автора состоит в самостоятельном выполнении представ ленных в диссертации экспериментальных исследований и расчетов, связанных с получением микрокапсул, изучением их физических и механических свойств различными методами, а также анализом полученных результатов. Постановка задач исследования и обсуждение результатов проведены под руководством доцента Д.А. Горина. При использовании результатов других авторов или по лученных в соавторстве результатов даются соответствующие ссылки на ис точник.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах списка ВАК, 1 статья в сборнике конференций, 3 тезисов докладов, 1 учебно-методическое пособие и 1 глава в монографии, изданной за рубежом. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 221 источник. Общий объем диссертации составляет 166 страниц, включая 75 рисунков и 11 таблиц.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, рассмотрена новизна, прак тическая значимость, сформулированы цель работы, основные задачи исследо ваний, приведены основные положения, выносимые автором на защиту.
Первая глава содержит аналитический обзор по теме диссертации. В ней сформулированы основные принципы создания и изучения физико-химических свойств оболочек полиэлектролитных и нанокомпозитных микрокапсул, описа ны различные методики капсуляции органических реагентов и рассмотрены способы реализации адресной доставки. Описаны методики изучения механи ческих свойств микрокапсул, а также их зависимость от различных факторов (выбора материала и размера ядра, растворителя, комбинации полиэлектроли тов и их концентрации, числа слоев и толщины оболочки микрокапсулы, нали чия соли и ее концентрации, pH среды, присутствия неорганических нановклю чений в оболочке и их объемной фракции и т.д.). Проведен анализ принципов, лежащих в основе построения математических моделей для расчета механиче ских свойств оболочек микрокапсул. Описаны эффекты, возникающие в раз личных средах при распространении ультразвуковых волн в зависимости от их частоты и интенсивности, а также механизм акустической кавитации и приме нение УЗ в терапии онкологических заболеваний. Приведен анализ результатов работ по изучению взаимодействия микрокапсул с живыми клетками, исследо ванию их цитотоксичности, изучению поглощения капсул клетками методом проточной цитометрии.
Вторая глава посвящена описанию результатов создания и характериза ции нанокомпозитных микрокапсул, модифицированных наночастицами маг нетита, углеродными нанотрубками и наночастицами магнетита, а также нано частицами оксида цинка. Формирование оболочек полиэлектролитных микро капсул во всех случаях проводили с использованием синтетических полиэлек тролитов полиалиламина гидрохлорида (PAH) и полистиролсульфоната натрия (PSS) (молекулярная масса 70 кДа, концентрация 2 мг/мл, Sigma-Aldrich, Гер мания) в виде солевых растворов (0.5 М NaCl).
Микрокапсулы с наночастицами магнетита Микрокапсулы с наночастицами магнетита получены с использованием в качестве ядер частиц полистирольного латекса диаметром 5.3 ± 0.1 мкм и 9.6 ± 0.1 мкм. Характерные размеры наночастиц магнетита, оцененные по изображе ниям просвечивающей электронной микроскопии, составили 8-20 нм. потенциал наночастиц магнетита был отрицательным (-12.5 ± 4.0 мВ, pH 7), что определило их положение в структуре получаемых покрытий между слоями ка тионного полиэлектролита.
На основе исследования полученных микрокапсул методами оптической, просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии установлено, что минимальное и максимальное число слоев в структуре оболочек, необходимое для формирования стабильных недеформированных микрокапсул, равно 10 и 16 для 10-мкм капсул и 10 и 14 для 5-мкм капсул, соответственно. Полученные данные хорошо согласуются с результатами работы [11]. Таким образом, выяв лена зависимость стабильности капсул от числа слоев, которая является функ цией толщины их оболочки.
Экспериментальные образцы микрокапсул, синтезированных на ядрах по листирольного латекса диаметром 9.6 ± 0.1 мкм, были разделены на три груп пы. Первая группа состояла из образцов, не содержащих в структуре оболочек магнитных наночастиц. Структура образцов: (PAH/PSS)n, где n = 5;
6;
7;
8 – число полиэлектролитных бислоев. Вторая группа различалась общим числом слоев в оболочке капсул (10, 12, 14 и 16) при одинаковом значении числа слоев магнитных наночастиц (2 слоя). Третья – числом слоев наночастиц магнетита (от 1 до 5) при одинаковом значении общего числа слоев в оболочке (16 слоев).
Методом ПЭМ были исследованы микрокапсулы с наночастицами магне тита, и показано, что для наночастиц характерно островковое расположение в структуре оболочки.
Морфологию поверхности микрокапсул в зависимости от их строения ис следовали средствами атомно-силовой микроскопии (АСМ). По профилям вы соты была рассчитана толщина оболочек микрокапсул (Таблица 1).
Таблица 1. Изменение толщины микрокапсул в зависимости от структуры их оболочек [Л4].
Общее Число Толщина число слоев Структура оболочки оболочки, слоев нм Fe3O 10 2 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )2 (PAH/PSS) 23 ± 12 2 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )2 (PAH/PSS)2 26 ± 14 0 (PAH/PSS)7 47 ± 14 2 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )2 (PAH/PSS)3 39 ± 16 0 (PAH/PSS)8 59 ± 16 1 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )(PAH/PSS)5 51 ± 16 2 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )2 (PAH/PSS)4 60 ± 16 3 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )3 (PAH/PSS)3 66 ± 16 4 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )4 (PAH/PSS)2 52 ± 16 5 (PAH/PSS)2 (PAH/Fe3 O4 )5 (PAH/PSS) 55 ± Результаты показали, что встраивание наночастиц магнетита в структуру оболочки приводило к уменьшению ее толщины по сравнению с капсулами, не содержащими наночастиц. Так, значение толщины для 14-слойных капсул (PAH/PSS)7 без наночастиц магнетита составило 47 ± 4 нм, тогда как толщина капсул (PAH/PSS)2(PAH/Fe3O4)2(PAH/PSS)3 с тем же общим числом слоев, но с двумя слоями магнитных наночастиц составила 39 ± 3 нм. В данном случае различие в толщине, скорее всего, связано с более слабым электростатическим взаимодействием между поликатионом и наночастицами, нежели между моле кулами противоположно заряженных полиэлектролитов [Л4]. В результате ана лиза зависимости толщины оболочек микрокапсул от общего числа полиэлек тролитных слоев в их структуре (при одинаковом числе слоев магнитных нано частиц) установлен нелинейный рост толщины, наблюдаемый при увеличении общего числа ПЭ-слоев в оболочке, причем характер нелинейности выражен сильнее для меньшего числа слоев (Рис. 1). Данная зависимость хорошо согла суется с литературными данными, полученными для планарных слоев на твер дых подложках [12].
Рис. 1. Зависимость толщины оболочки микрокапсул от общего числа полиэлектролит ных слоев [Л4].
На примере 16-слойных микрокапсул обнаружена зависимость толщины оболочки от числа стадий адсорбции наночастиц магнетита (таблица 1). Так, при увеличении числа стадий адсорбции наночастиц от 1 до 3 происходил рост толщины оболочки, а для 4 и 5 слоев магнетита наблюдалось ее уменьшение.
Характер данной немонотонной зависимости связан с тем, что увеличение чис ла слоев магнитных наночастиц приводило, с одной стороны, к увеличению толщины оболочек капсул, а с другой стороны – к уменьшению числа блоки рующих полиэлектролитных слоев и, как следствие, к увеличению вероятности десорбции наночастиц из оболочки в процессе растворения ядер. Это в свою очередь вызывало уменьшение толщины ПЭ-оболочки. Поскольку данные про цессы являлись конкурирующими, максимум по толщине достигался при нали чии в структуре оболочки трех слоев наночастиц магнетита.
С целью изучения влияния ультразвука на свойства сформированных полиэлектролитных и нанокомпозитных оболочек микрокапсул водную суспензию капсул обрабатывали ультразвуком различной длительности с частотой ~ 27 кГц и плотностью мощности ~ 3.5 Вт/см2 с использованием установки УРСК N070 (Россия). При данных параметрах основное влияние ультразвук оказывает за счет возникновения явления кавитации. Для жидкостей и биологических тканей кавитационный порог составляет 0.3 Вт/см2.
Реакцию капсул на облучение ультразвуком контролировали средствами оптической и атомно-силовой микроскопии. Обнаружили возможность дистанционного разрушения капсул, модифицированных наночастицами магнетита, под действием ультразвука (Рис. 2). При этом методом атомно силовой микроскопии фрагментов оболочек микрокапсул установлено, что ультразвуковая обработка приводит к нарушению целостности оболочек, а их толщина и состав остаются неизменными.
Рис. 2. Результаты оптической микроскопии нанокомпозитных микрокапсул со структурой оболочки (PAH/PSS)2(PAH/Fe3O4)2(PAH/PSS)2 до (А) и после (Б) ультразвуковой обработки [Л4].
Обнаружено, что введение магнитных наночастиц в состав оболочек микрокапсул на этапе синтеза увеличивает их чувствительность к ультразвуку, тогда как рост их объемной фракции приводит к снижению данной чувствительности. Повышение УЗ-чувствительности, наблюдаемое при встраивании наночастиц магнетита в структуру оболочки капсул, может быть связано с уменьшением их толщины по сравнению с толщиной полиэлектролитных капсул. Следовательно, для их разрушения ультразвуком требуется меньшее время воздействия. При увеличении числа стадий адсорбции наночастиц от 2 до 5 требовалось увеличивать время УЗ-воздействия от 2.5 до 4.5 минут для полного разрушения микрокапсул. Снижение УЗ чувствительности скорее всего связано с более равномерным распределением наночастиц магнетита в структуре оболочки при увеличении числа стадий их адсорбции, которое вызвано взаимопроникновением слоев наночастиц и полимера. В результате однородность оболочки повышается, что приводит к увеличению ее эластичности и уплотнению структуры, т.е. повышению механической прочности микрокапсул и их устойчивости к действию ультразвука.
Показано, что увеличение общего числа полиэлектролитных слоев в структуре оболочек микрокапсул требует более продолжительного времени ультразвукового воздействия для их разрушения. Это объясняется увеличением толщины оболочек микрокапсул с ростом числа ПЭ-слоев. Кроме того, обнаружено, что чувствительность капсул к ультразвуку зависит от их размера – для капсул большего диаметра чувствительность к ультразвуку выше, чем для капсул меньшего диаметра. Это объясняется изменением устойчивости микрокапсул к ультразвуку, которая определятся соотношением между толщиной оболочки капсулы и ее диаметром. Чем больше данное соотношение, тем устойчивее капсула к внешнему воздействию.
Микрокапсулы с наночастицами магнетита и углеродными нанотруб ками Второй раздел посвящен созданию многофункциональных микрокапсул модифицированных (PAH/PSS)3(PAH/Fe3O4)(PAH/PSS)3(PAH/CNTs/PAH), наночастицами магнетита и углеродными нанотрубками. ПЭМ-изображения микрокапсул показывают неравномерное, островковое расположение наночастиц магнетита в структуре оболочки и их склонность к агрегации (Рис.
3). При этом поверхность капсул покрыта сеткой из углеродных нанотрубок.
Даная структура приводит к увеличению механической прочности капсул в целом.
Рис. 3. ПЭМ-изображения общего вида микрокапсул (А) и их оболочки (Б) для образ ца состава (PAH/PSS)3(PAH/Fe3O4)(PAH/PSS)3 (PAH/CNTs/PAH).
Морфологию поверхности микрокапсул исследовали средствами атомно силовой микроскопии. Значение толщины оболочки составило 50 ± 3 нм.
Следует отметить, что полученное значение хорошо согласуется с толщиной 16-слойных капсул с одним слоем наночастиц магнетита в структуре оболочки Так, для капсул со структурой оболочки (Таблица 1).
(PAH/PSS)2(PAH/Fe3O4)(PAH/PSS)5 значение толщины составило 51 ± 3 нм.
Ультразвуковую обработку мультифункциональных оболочек микрокапсул производили с использованием установки УРСК N070 (Россия), работающей на частоте 27 кГц и плотности мощности 3.5 Вт/см2. Установили, что для разрушения данного типа микроконтейнеров требуется более длительное воздействие ультразвука (порядка 10 минут), чем в случае микрокапсул, функционализированных наночастицами магнетита. Снижение чувствительности оболочек микрокапсул к УЗ подтвердило предположение об увеличении механической прочности капсул за счет наличия на их поверхности плотной сетки из углеродных нанотрубок.
Микрокапсулы с наночастицами оксида цинка Данный раздел посвящен формированию и исследованию нанокомпозит ных микрокапсул, модифицированных наночастицами оксида цинка (ZnO).
Значение -потенциала для наночастиц оксида цинка составило +36.2 ± 5 мВ (при pH 7), что определило положение наночастиц ZnO между слоями анионно го полиэлектролита.
Выбор наночастиц оксида цинка в качестве соносенсибилизатора был обу словлен тем, что наночастицы ZnO являются хорошим антибактериальным агентом [9] и применяются в терапии онкологических заболеваний [10].
Образцы микрокапсул, сформированные на поверхности частиц полисти рольного латекса диаметром 10.25 ± 0.09 мкм, различались наличием или от сутствием в структуре оболочки наночастиц оксида цинка, а также числом сло ев наночастиц (от 1 до 4). Адсорбцию противоположно заряженных молекул полиэлектролитов и наночастиц ZnO контролировали путем измерения потенциала коллоидных частиц. Наночастицы оксида цинка и ZnO композитные микрокапсулы исследовали методом просвечивающей электрон ной микроскопии (Рис. 4). Результаты ПЭМ выявили увеличение объемной фракции наночастиц оксида цинка в оболочке капсул при увеличении числа стадий их адсорбции от 1 до 3, однако обнаружили отсутствие существенных различий для капсул с 3 и 4 слоями ZnO, что свидетельствовало о насыщении оболочки микрокапсул наночастицами уже после проведения трех стадий ад сорбции ZnO.
Рис. 4. Результаты исследования наночастиц (а) и микрокапсул (б-е) методом просве чивающей электронной микроскопии. Структуры оболочек микрокапсул:
б – (PAH/PSS)6;
в – (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)(PAH/PSS)3;
г – (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)2(PAH/PSS)2;
д – (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS);
е – (PAH/PSS)(ZnO/PSS)4(PAH/PSS) [Л8].
Морфологию поверхности микрокапсул, различающихся числом слоев на ночастиц ZnO, также исследовали средствами сканирующей электронной мик роскопии (СЭМ) (Рис. 5). Анализ результатов ПЭМ и СЭМ показал, что с уве личением числа слоев ZnO в структуре оболочки микрокапсулы происходило увеличение ее диаметра после высыхания, что свидетельствовало об изменении механических свойств микрокапсул. Методом атомно-силовой микроскопии была проведена количественная характеристика некоторых морфологических параметров микрокапсул, таких как диаметр, толщина оболочки (dsh), эффек тивная толщина, приходящаяся на один полиэлектролитный слой (в случае кап сул без наночастиц), эффективная толщина слоя наночастиц ZnO (в случае ZnO-композитных капсул) (dNP), средняя шероховатость поверхности (Ra) и объемная фракция наночастиц в оболочке (NP) (Таблица 2).
Рис. 5. Изображения микрокапсул с различным числом слоев наночастиц ZnO в обо лочке, полученные методом сканирующей электронной микроскопии [Л8].
Таблица 2. Параметры микрокапсул с различным числом слоев наночастиц ZnO, рассчитан ные по анализу результатов атомно-силовой микроскопии [Л8].
Средняя ше Число Диаметр Толщина Эффективная Объемная роховатость слоев оболочки, оболочки толщина слоя фракция (Ra), нм мкм (dsh), нм ZnO (dNP), нм ZnO ZnO (NP) 0 10.2 ± 0.2 32 ± 2 - 9±1 1 11.1 ± 0.5 38 ± 7 8 43 ± 8 0. 2 12.9 ± 0.3 56 ± 6 15 31 ± 4 0. 3 13.1 ± 0.3 97 ± 7 24 25 ± 8 0. 4 14.8 ± 0.3 104 ± 4 21 26 ± 4 0. Данные таблицы количественно подтверждают обнаруженное ранее мето дами ПЭМ и СЭМ увеличение диаметра оболочки капсул после высушивания с увеличением числа слоев ZnO. Кроме того установлено, что толщина оболочки нелинейно увеличивается с ростом числа слоев наночастиц оксида цинка (рис.
6). Данный характер приведенной зависимости для толщины хорошо согласует ся со значениями шероховатости и эффективной толщины, приходящейся на слой наночастиц оксида цинка. Достаточно малое значение эффективной тол щины для капсул с одним слоем ZnO (dNP = 8 нм) говорит о преимущественной адсорбции наночастиц из наиболее мелкой фракции. В то же время, шерохова тость поверхности капсул с 1 слоем ZnO (43 нм) резко увеличивается по срав нению с полиэлектролитными капсулами без наночастиц (9 нм), что, скорее всего, свидетельствует об «островковом» заполнении оболочки наночастицами на начальной стадии адсорбции. Дальнейшее уменьшение шероховатости кап сул при увеличении числа слоев ZnO свидетельствует о заполнении наночасти цами промежутков между «островками» и сглаживании неровностей оболочки.
Также следует отметить, что шероховатость капсул с 3 и 4 слоями наночастиц практически не меняется в пределах погрешности и составляет 25 ± 8 нм и 26 ± 4 нм, соответственно. Следовательно, при адсорбции большого количества на ночастиц возникает недостаток полиэлектролита для их закрепления в оболоч ке.
Рис. 6. Изменение толщины оболочки нанокомпозитных капсул в зависимости от числа слоев наночастиц ZnO в оболочке [Л8].
Для расчета объемной фракции наночастиц ZnO в оболочке микрокапсул была получена следующая формула:
d NP N NP d NP = 1 PE N PE, (1) d sh d sh где dNP – эффективная толщина, приходящаяся на один слой наночастиц ZnO в оболочке, NNP – число слоев наночастиц ZnO, dsh – полная толщина оболочки микрокапсулы, dPE и NPE – эффективная толщина полиэлектролитного слоя и число полиэлектролитных слоев в структуре оболочки микрокапсулы, соответ ственно. Расчет показал, что объемная фракция наночастиц росла с увеличени ем числа слоев ZnO от 1 до 3, однако при добавлении 4 слоя не происходило каких-либо существенных изменений, что объяснялось недостатком полиэлек тролитного «клея» в оболочке капсулы.
Механические свойства ZnO-композитных микрокапсул в зависимости от объемной фракции наночастиц исследовали средствами атомно-силовой спек троскопии. Экспериментальные кривые зависимости силы от деформации для капсул с различным числом слоев наночастиц оксида цинка в структуре обо лочки представлены на рисунке 7. Жесткость микрокапсул определяли по на чальному наклону кривых деформации (Таблица 3). На основе полученных зна чений для жесткости и в предположении, что для микрокапсул в первом при ближении может применяться аппроксимирующая модель тонкой оболочки [13], были рассчитаны значения эффективного модуля Юнга для микрокапсул с различной объемной фракцией наночастиц ZnO в оболочке. В результате уста новлено, что увеличение объемной фракции наночастиц ZnO приводило к не линейному уменьшению эффективного значения модуля Юнга и, соответствен но, снижению сопротивления капсул деформации.
Рис. 7. Экспериментальные кривые зависимости силы от деформации для капсул с раз личным числом слоев наночастиц ZnO в структуре оболочки [Л8].
Таблица 3. Механические свойства микрокапсул в зависимости от структуры оболочки [Л8] Число Жесткость, Модуль Юн слоев Структура оболочки Н/м га, МПа ZnO 0 (PAH/PSS)6 0.303 ± 0.149 580 ± 1 (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)(PAH/PSS)3 0.259 ± 0.100 403 ± 2 (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)2(PAH/PSS)2 0.339 ± 0.112 275 ± 3 (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) 0.098 ± 0.032 27.1 ± 8. 4 (PAH/PSS)(ZnO/PSS)4(PAH/PSS) 0.112 ± 0.022 30.5 ± 5. Ультразвуковую обработку микрокапсул производили с использованием установки Bandelin Sonopuls HD 200 (Германия), с частотой ультразвука 20 кГц и плотностью мощности 0.6 Вт/см2. При таких параметрах основное действие ультразвука связано с возникновением кавитации, которая, как было показано ранее, может вызывать нарушение целостности оболочек микрокапсул. Мето дом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии было показано, что присутствие наночастиц ZnO в оболочке приводит к существенному увеличе нию чувствительности капсул к УЗ по сравнению с полиэлектролитными кап сулами без наночастиц (Рис. 8).
Рис. 8. Исследование влияния ультразвука на оболочки микрокапсул в зависимости от времени облучения и объемной фракции наночастиц ZnO (конфокальная лазерная скани рующая микроскопия, режим просвета) [Л8].
Так, в результате действия ультразвука в течение нескольких секунд на блюдается лишь небольшая деформация оболочек полиэлектролитных капсул, тогда как ZnO-композитные капсулы (даже с одним слоем наночастиц) начи нают разрушаться уже через 3 сек после начала облучения, а 9 сек воздействия УЗ оказывается достаточно для полного разрушения оболочек ZnO композитных капсул.
Обнаружено, что с увеличением числа стадий адсорбции наночастиц ZnO, т.е. с увеличением объемной фракции наночастиц в оболочке капсул, происхо дит уменьшение размера фрагментов оболочек, образовавшихся в результате их УЗ-обработки, следовательно, возрастает чувствительность капсул к ультразву ку. Кроме того, размер фрагментов оболочек микрокапсул зависит не только от объемной фракции наночастиц ZnO, но и от времени их облучения – размер фрагментов уменьшается с увеличением продолжительности УЗ-обработки.
Это вызвано изменением механических свойств микрокапсул. Так, увеличение объемной фракции наночастиц ZnO приводит к уменьшению эффективного значения модуля Юнга, т.е. к уменьшению эластичности капсул. В результате повышается чувствительность микрокапсул к УЗ обработке.
Третья глава посвящена исследованию взаимодействия ZnO композитных микрокапсул с клетками крови, их совместной реакции на облу чение ультразвуком, а также зависимости протекания фагоцитоза от размера и состава оболочек микроконтейнеров. Так как все известные на данный момент работы по облучению капсул ультразвуком проводились в водной среде [6, Л4, Л8], то на начальном этапе исследования было изучено влияние свойств среды диспергирования на чувствительность микрокапсул к ультразвуку. В качестве модельной среды, свойства которой наиболее близки к физиологическим, был выбран фосфатно-солевой буфер (PBS). Изучения влияния вязкости и химиче ского состава дисперсной среды на чувствительность капсул к ультразвуку проводили в плазме крови.
Эксперимент проводили с использованием 10-мкм микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS). Облучение капсул ультразвуком осуществ лялось посредством ультразвуковой установки Bandelin Sonopuls HD 200 (Гер мания) (20 кГц, 0.6 Вт/см2). Отмечалось незначительное снижение чувствитель ности ZnO-композитных микрокапсул к ультразвуку в PBS и плазме крови по сравнению с результатами, полученными в водной среде [Л8, Л11].
На следующем этапе микрокапсулы подвергали ультразвуковой обработке в присутствии клеток крови. Исследование взаимодействия капсул с живыми клетками целесообразно проводить на примере клеток крови, так как при ис пользовании микрокапсул в качестве средств адресной доставки и их дистанци онном вскрытии в организме помредством ультразвука основное его влияние, в первую очередь, будет сказываться именно на кровеносной системе. Было ус тановлено, что инкубация капсул с клетками крови в течение 30 и 60 минут при 37 не вызывает повреждения и гибели последних и не приводит к гемолизу.
Таким образом, было показано отсутствие негативного влияния 10-мкм капсул на клетки крови (что подтверждало их гемосовместимость).
Ультразвуковая обработка микрокапсул в присутствии клеток крови обна ружила, что ультразвук с частотой 20 кГц и плотностью мощности 0.6 Вт/см оказывает разрушающее воздействие на 10-мкм микрокапсулы (PAH/PSS) (ZnO/PSS)3(PAH/PSS) уже через 3 секунды после начала облучения и при этом вызывает лишь частичное повреждение клеток крови (Рис. 9). При этом повре жденные и живые белые клетки крови присутствовали в образце как до, так и после УЗ-обработки. Маркирование оболочек микрокапсул производили с ис пользованием декстрансульфата с молекулярной массой 4 кДа, меченного флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Окрашива ние поврежденных клеток крови проводили с использованием флуоресцентного красителя пропидиум йодида (PI), который способен проникать через мембра ны погибших и поврежденных клеток, связываться с ДНК и окрашивать ядра клеток.
Рис. 9. Исследование микрокапсул с 3 слоями наночастиц ZnO в структуре оболочки в суспензии клеток крови до и после ультразвуковой обработки в течение 3 секунд (конфо кальная лазерная санирующая микроскопия) [Л11].
На дальнейшем этапе работы был исследован механизм взаимодействия клеток крови с микрокапсулами в зависимости от их размера (фагоцитоз кап сул). Было показано отсутствие фагоцитоза капсул с диаметром ~ 10 мкм, так как максимальный размер объектов, способных участвовать в процессе фагоци тоза, составляет 5-7 мкм (Рис. 10).
Рис. 10. Исследование процесса фагоцитоза ZnO-композитных 10-мкм микрокапсул в зависимости от числа слоев наночастиц ZnO в структуре их оболочек (конфокальная микро скопия, суперпозиция флуоресцентного и просвечивающего режимов) [Л11].
Однако, несмотря на превышение данного размера, в случае инкубации клеток крови с 10-мкм капсулами наблюдалась попытка их захвата фагоцитами.
При этом встречались случаи объединения нескольких фагоцитов в группы.
Следует отметить увеличение степени деформации оболочек микрокапсул фа гоцитами в зависимости от числа слоев наночастиц ZnO в их оболочке (Рис. 10), что связано с изменением механических свойств микрокапсул, обна руженным ранее.
Успешное протекание фагоцитоза было показано на примере микрокапсул (PAH/PSS)(ZnO/PSS)(PAH/PSS) диаметром 1 мкм, а также для фрагментов обо лочек, оставшихся от 10-мкм капсул после их разрушения ультразвуком (Рис.
11). Метод конфокальной микроскопии позволяет качественно определять на личие фагоцитоза, однако не дает возможности получить точные данные о ме сторасположении микрокапсул после его завершения, так как они могут быть полностью поглощены клетками или же только закреплены на поверхности клеточных мембран.
Рис. 11. Исследование процесса фагоцитоза ZnO-содержащих 1-мкм микрокапсул (сле ва), а также фрагментов оболочек, оставшихся от больших капсул после их разрушения ультразвуком (справа) (конфокальная микроскопия, суперпозиция флуоресцентного и про свечивающего режимов) [Л11].
Количественное исследование процесса фагоцитоза проводили методом проточной цитометрии при 37°C (физиологические условия, когда фагоциты активны) и 4°C (контрольный эксперимент) (Рис. 12). Анализ проводили по следующим основным параметрам – показателю прямого светорассеяния (FSC), который характеризует размеры клеток, и показателю бокового светорассеяния (SSC), который позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы клетки. Кроме того проводили одновременное считывание сигнала флуорес ценции от маркированных оболочек микрокапсул и клеток крови. Анализ дан ных светорассеяния позволяет разделить лейкоциты периферической крови на три популяции – лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характери зуются наименьшими размерами, наиболее крупные клетки – гранулоциты, мо ноциты занимают промежуточное положение по параметрам FSC. Наиболее низкие характеристики SSC имеют лимфоциты, промежуточные – моноциты и высокие показатели SSC – у гранулоцитов.
Таблица 4. Численные результаты исследования фагоцитоза микрокапсул и фрагментов их оболочек белыми клетками крови человека методом проточной цитометрии [Л11].
Гранулоциты Моноциты Разбавление +37°C +4°C +37°C +4°C 1:2 10.8 0.1 26.4 Капсулы 1 мкм 1:5 4.8 0.4 15.7 1:10 6.6 2.8 14.3 9. Фрагменты оболочек 10 мкм - 4.8 1.5 6.6 4. капсул Рис. 12. Результаты исследования процесса фагоцитоза для ZnO-содержащих микро капсул диаметром 1 мкм (A, B) и фрагментов оболочек 10-мкм капсул (C, D) при +37°C и +4°C [Л11].
Инкубация при низкой температуре препятствовала протеканию фагоцито за и позволяла определить местоположение микрокапсул (поглощение клетка ми или закрепление на их поверхности). В таблице 4 приведены численные значения, соответствующие количеству клеток (гранулоцитов или моноцитов) в процентах, поглотивших капсулы или фрагменты их оболочек. Результаты при 37°C показали успешное поглощение 1-мкм микрокапсул и фрагментов оболо чек 10-мкм капсул. При этом исследование при низкой температуре обнаружи ло отсутствие закрепления капсул на поверхности клеток.
Таким образом, в данной части работы было обнаружено отсутствие фаго цитоза для ZnO композитных микрокапсул диаметром 10 мкм, возможность их разрушения ультразвуком в присутствии клеток крови, а также возможность использования явления фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул, образовавшихся в результате их ультразвуковой обра ботки.
Четвертая глава посвящена исследованию токсичности микрокапсул и их составляющих компонент с использованием в качестве тест-систем гидробио нтов (цериодафний (Сeriodaphnia affinis), люминесцентных генноинженерных бактерий Escherichia coli, 1885, М-17, личинок хирономид (Chironomus riparius) и аквариумных рыб D. rerio). Острое токсическое действие исследуе мых токсикантов на гидробионтов оценивали по критерию выживаемости на основании величины полулетальной концентрации (ЛК50) и безвредной концен трации (БК10). Определение интегрального экотоксикологического показателя – класса опасности для окружающей природной среды (ОПС) – для всех тест объектов производили в соответствии с критериями отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей среды Расчет полулетальных (ЛК50) и безвредных (БК10) концентраций показал, что среди исследуемых веществ наибольшей токсичностью по отношению ко всем рассматриваемым тест-объектам обладает раствор поликатионного поли электролита PAH. Данный факт можно объяснить с точки зрения электростати ческого взаимодействия исследуемых полимеров и мембран клеток тестируе мых объектов. Поскольку в большинстве случаев клеточные мембраны имеют отрицательный заряд, адгезия и дальнейшее взаимодействие с катионным поли электролитом (PAH) происходит более эффективно по сравнению с анионным полиэлектролитом (PSS) или незаряженным полимером. Так, PSS показал прак тическое отсутствие токсического действия на каждый выбранный тип тест объекта.
При этом установлено, что наибольшей чувствительностью к действию ка тионного полиэлектролита PAH обладали цериодафнии (Ceriodaphnia affinis), для которых значение полулетальной концентрации ЛК50-48 составило 0.34 мг/л.
Личинки хирономид (Chironomus riparius) проявили максимальную резистив ность по отношению к раствору PAH (ЛК50-48 для них составляет 400 мг/л). Од нако, при исследовании токсического действия наночастиц оксида (ZnO) уста новили, что на личинок хирономид наночастицы оказывали максимальное ток сическое действие.
В ходе эксперимента было обнаружено, что ZnO-композитные микрокап сулы проявляют наименьшую токсичность среди всех тестируемых веществ.
Это, во-первых, связано с наличием упорядоченного полиэлектролитного ком плекса, который образуется в результате послойной адсорбции молекул проти воположно заряженных полиэлектролитов при формировании оболочек микро капсул. Во-вторых, так как формирование оболочек микрокапсул завершается нанесением слоя отрицательно заряженных молекул PSS, то наличие преиму щественно отрицательного заряда на поверхности капсул препятствует их элек тростатическому взаимодействию с мембранами клеток гидробионтов и приво дит к снижению токсическое действия. При этом встраивание наночастиц ZnO в структуру оболочек микрокапсул приводит к существенному снижению их токсичности по сравнению с наночастицами в коллоидном растворе.
Таким образом, обнаружено, что возможности полиионной сборки позво ляют существенно снизить токсичность раствора катионного полиэлектролита PAH и наночастиц ZnO, выступающих в качестве составляющих компонентов оболочек нанокомпозитных микрокапсул, что связано с формированием упоря доченной полиэлектролитной структуры, выступающей в качестве защитного покрытия.
В заключении сформулированы основные результаты и выводы, получен ные в ходе выполнения диссертационной работы.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ Ультразвук (27 кГц, 3.5 Вт/см2) оказывает разрушающее воздействие как 1.
на полиэлектролитные, так и на нанокомпозитные микрокапсулы. Присут ствие наночастиц магнетита (-потенциал -12.5 ± 4 мВ, pH 7) в структуре оболочки повышает чувствительность капсул к ультразвуку по сравнению с капсулами без наночастиц. Увеличение общего числа полиэлектролит ных слоев в оболочке микрокапсул приводит к снижениюих чувствитель ности к ультразвуковой обработке, что объясняется ростом толщины их оболочек при увеличении числа циклов адсорбции полиэлектролитов.
Увеличение числа циклов адсорбции наночастиц магнетита от 1 до 5 дела ет оболочку капсул более устойчивой к ультразвуковому воздействию.
На примере нанокомпозитных микрокапсул, функционализированных на 2.
ночастицами магнетита и углеродными нанотрубками, показано, что одно го цикла адсорбции наночастиц магнетита достаточно для придания капсу лам чувствительности к магнитному полю. Формирование плотной сетча той структуры из углеродных нанотрубок на поверхности капсул обеспе чивает увеличение их механической прочности и приводит к снижению чувствительности капсул к ультразвуку (27 кГц, 3.5 Вт/см2).
Встраивание наночастиц оксида цинка (-потенциал +36 ± 5 мВ, pH 7) в 3.
структуру оболочек микрокапсул приводит к существенному увеличению их чувствительности к ультразвуку (20 кГц, 0.6 Вт/см2) по сравнению с по лиэлектролитными капсулами без наночастиц, а также микрокапсулами, функционализированными наночастицами магнетита. Для разрушения микрокапсул с наночастицами ZnO требуется гораздо более низкие мощ ности и время воздействия ультразвука (3-9 секунд), чем для капсул с на ночастицами магнетита.
Изменение числа стадий адсорбции наночастиц ZnO от 1 до 4 приводит к 4.
увеличению объемной неорганической фазы в оболочке от 21 до 79%. При этом отмечается отсутствие существенных различий для микрокапсул с 3 и 4 слоями наночастиц ZnO, что говорит о «насыщении» оболочки наноча стицами ZnO вследствие недостатка полиэлектролита, выступающего в ка честве связующего компонента для их закрепления. Изменение механиче ских свойств микрокапсул в зависимости от объемной фракции наночастиц ZnO в структуре оболочки (уменьшение жесткости и эффективного значе ния модуля Юнга (от 580 до 31 МПа) при увеличении числа стадий ад сорбции наночастиц ZnO от 1 до 4) приводит к повышению чувствитель ности микрокапсул к ультразвуку.
Чувствительность к ультразвуку нанокомпозитных микрокапсул, модифи 5.
цированных наночастицами ZnO, незначительно снижается при их облуче нии в средах с физиологическими свойствами (фосфатном буфере, плазме крови и крови) по сравнению с водой. Инкубация ZnO-композитных мик рокапсул с клетками крови не вызывает повреждения и гибели клеток и не приводит к гемолизу эритроцитов. Установлена зависимость протекания фагоцитоза от размера фагоцитируемых ZnO-композитных микрокапсул:
микрокапсулы большого диаметра (10 мкм) распознаются иммунной сис темой, однако фагоцитоз таких капсул отсутствует, в результате вероят ность преждевременного уничтожения 10-мкм капсул иммунной системой организма мала, что открывает перспективы использования данных сис тем, например, в качестве контейнеров для адресной доставки. Микрокап сулы малого диаметра (1 мкм) и фрагментов оболочек, образовавшихся в результате ультразвуковой обработки 10-мкм капсул, успешно поглоща ются фагоцитами, что открывает возможности использования фагоцитоза в качестве средства утилизации фрагментов оболочек микрокапсул.
Раствор поликатионного полиэлектролита полиалиламин гидрохлорида 6.
(PAH), используемого в качестве составляющего компонента для форми рования оболочки микрокапсул, обладает максимальной токсичностью по отношению к гидробионтам (цериодафниям (Сeriodaphnia affinis), люми несцентным генноинженерным бактериям Escherichia coli, 1885, М-17, ли чинкам хирономид (Chironomus riparius) и аквариумным рыбам D. rerio).
Это связано с электростатическим взаимодействием катионного полимера с отрицательно заряженными клеточными мембранами тестируемых объ ектов. Формирование полиэлектролитного комплекса PAH+PSS приводит к снижению токсического эффекта за счет нейтрализации зарядов молекул полиэлектролитов, участвующих в комплексообразовании. Возможности полиионной сборки позволяют существенно снизить токсичность наноча стиц оксида цинка за счет их встраивания в структуру оболочек микрокап сул, что связано с формированием на их поверхности защитного покрытия из полиэлектролитных слоев. Наличие упорядоченной послойной структу ры в оболочке микрокапсул (PAH/PSS)2(ZnO/PSS)3(PAH/PSS) проявляется также в минимальном токсическом действии на гидробионтов. При этом безопасная для гидробионтов концентрация микрокапсул в водной среде не превышает 250 мг/л.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Decher G. // Science. – 1997. – Vol. 277. – P. 1232-1237.
2. Sukhorukov G.B., Antipov A.A., Voigt A., Donath E., Mhwald H. // Macromol. Rapid Commun. – 2001. – Vol. 22. – P. 44-46.
3. Borodina T., Markvicheva E., Kunizhev S., Mhwald H., Sukhorukov G.B., Kreft O. // Ma cromol. Rapid Commun. – 2007. – Vol. 28. – N. 18-19. – P. 1894-1899.
4. Hu S.-H., Tsai C.-H., Liao C.-F., Liu D.-M., Chen S.-Y. // Langmuir. – 2008. – Vol. 24. – P.
11811-11818.
5. Bukreeva T.V., Parakhonsky B.V., Skirtach A.G., Susha A.S., Sukhorukov G.B. // Crystallo graphy Reports. – 2006. – Vol. 51. – N. 5. – P. 863-869.
6. Shchukin D.G., Gorin D.A., Mhwald H. // Langmuir. – 2006. – Vol. 22. – P. 7400-7404.
Николаев А.Л., Гопин А.В., Божевольнов В.Е., Трещалина Е.М., Андронова Н.В., Ме 7.
лихов И.В. // Акустический журнал. – 2009. – Т. 55. – № 4-5ю – С. 565-574.
8. Skirtach A.G., Javier A.M., Kreft O., Khler K., Alberola A.P., Mhwald H.,. Parak W.J, Sukhorukov G.B. // Angew. Chem. – 2006. – Vol. 118. – P. 4728-4733.
9. Reddy K.M., Feris K., Bell J., Wingett D.G., Hanley C., Punnoose A. // Appl. Phys. Let. – 2007. – Vol. 90. – P. 213902-1–213902-3.
10. Hanley C., Layne J., Punnoose A., Reddy K.M., Coombs I., Coombs A., Feris K., Wingett D.
// Nanotechnology. – 2008. – Vol. 19. – P. 1-10.
11. Dong W., Ferri J., Adalsteinsson T., Schonhoff M., Sukhorukov G.B., Mhwald H. // Chem.
Mater. – 2005. – Vol. 17. – P. 2603-2611.
12. Porcel C., Lavalle P., Ball V., Decher G., Senger B., Voegel J.-C., Schaaf P. // Langmuir. – 2006. – Vol. 22. – P. 4376-4383.
13. Fery A., Weinkamer R. // Polymer. – 2007. – Vol. 48. – P. 7221-7235.
14. Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Khlebtsov B.N., Kogan B.Ya., Akchu rin G.G., Shantrocha A.V., Maksimova I.L., Khlebtsov N.G., Tuchin V.V. // Journal of Bio photonics. – 2009. – Vol. 2. – N. 5. – P. 292-302.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Л1. Портнов С.А., Ященок А.М., Губский А.С., Горин Д.А., Невешкин А.А., Климов Б.Н., Ломова М.В., Колесникова Т.А. Автоматизированная установка для получения нано композитных покрытий методом полиионной сборки // Федеральная школа конференция по инновационному малому предпринимательству в приоритетных на правлениях науки и высоких технологий. Сборник материалов докладов. – М., РГУИТП. – 2006. – C. 22-27.
Л2. Портнов С.А., Иноземцева О.А., Колесникова Т.А., Ломова М.В., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А. Нанокомпозитные микрокапсулы и перспективы их применения в медицине // Ме тоды компьютерной диагностики в биологии и медицине: Материалы ежегодной Все российской научной школы-семинара. Под ред. Проф. Д.А. Усанова – Саратов: Изд-во Саратовского университета. – 2007. – C. 140-143.
Л3. Портнов С.А., Иноземцева О.А., Горин Д.А., Колесникова Т.А. Формирование и физи ко-химические свойства полиэлектролитных нанокомпозитных микрокапсул // Россий ские нанотехнологии. – 2007. - Т. 2. – №9-10. – C. 68-80.
Л4. Колесникова Т.А., Горин Д.А., Хлебцов Б.Н., Щукин Д.Г. Характеризация чувстви тельных к ультразвуковому воздействию нанокомпозитных микрокапсул методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. – 2008. – Т. 3. – № 9-10. – C. 48-57.
Л5. Климов Б.Н., Штыков С.Н., Горин Д.А., Иноземцева О.А., Глуховской Е.Г., Ященок А.М., Колесникова Т.А. Физико-химия наноструктурированных материалов // Учеб ное пособие для студентов факультета нано- и биомедицинских технологий Саратов ского государственного университета. Под ред. Климова Б.Н., Штыкова С.Н. – Саратов:
Изд-во «Новый ветер». 2009. 218 с. ISBN 978-5-98116-055-4.
Л6. Колесникова Т.А., Хлебцов Б.Н., Горин Д.А., Щукин Д.Г. Создание чувствительных к ультразвуковому воздействию полиэлектролитных микрокапсул, функционализиро ванных наночастицами магнетита // 1-я Международная научная школа - Нано 2009.
Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Сборник материалов докладов.
Московская область. 2009. с. 246-249.
Л7. Gorin D.A., Yashchenok A.M., Manturov A.O., Kolesnikova T.A., Mhwald H. Effect of Layer-by-Layer electrostatic assemblies on the surface potential and current voltage characte ristic of MIS structures // Langmuir. – 2009. – Vol. 25. – N. 21. – P. 12529-12534.
Л8. Kolesnikova T.A., Gorin D.A., Fernandes P., Kessel S., Khomutov G.B., Fery A., Shchukin D.G., Mhwald H. Nanocomposite Microcontainers with High Ultrasound Sensitivity // Ad vanced Functional Materials. – 2010. – Vol. 20. – P. 1189-1195.
Л9. Inozemtseva O.A., Portnov S.A., Kolesnikova T.A., Gorin D.A., Sukhorukov G.B. Layer by Layer microencapsulate technology as basis for fabrication of drug delivery nanosystems with remote controlling properties // Handbook of Materials for Nanomedicine (Vol. 1, Chapter 3) by Vladimir Torchilin & Mansoor M. Amiji. World Scientific Pub Co. in English. 2010. p. ISBN-10: 9814267554, ISBN-13: 978-9814267557.
Л10. Колесникова Т.А., Георгиева Р., Горин Д.А., Щукин Д.Г., Мевальд Х. Формирование высокочувствительных к ультразвуковой обработке нанокомпозитных микрокапсул с наночастицами оксида цинка в структуре оболочки и их взаимодействие с клетками крови // Сборник материалов научного семинара стипендиатов программ «Михаил Ло моносов II» и «Иммануил Кант II» 2009/2010 года. Москва, 2010. – 4 с.
Л11. Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Горин Д.А., Колесникова Т.А., Портнов С.А., Скиртач А.Г., Сухоруков Г.Б., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Способ селективного разрушения ра ковых клеток с помощью магнитных микроконтейнеров с фотодинамическими или фо тотермическими красителями // Положительное решение о выдаче патента на изобре тение №2009106672/14(008911) Российской Федерации, опубл. 01.04.2010, Бюл. №95. – 5 с. (Приор. от 25.02.2009).