Влияние аскорбиновой кислоты на обмен гликозамногликанов и резистентность организма к токсическим воздействиям
На правах рукописи
Ерофеева Ольга Евгеньевна
ВЛИЯНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ОБМЕН
ГЛИКОЗАМНОГЛИКАНОВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ
ОРГАНИЗМА К ТОКСИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
03.00.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа - 2007
Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ
Института нефтехимии и катализа РАН
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Башкатов Сергей Александрович Официальные доктор биологических наук, профессор оппоненты: Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Ральченко Ирина Викторовна
Ведущая организация: Ижевская государственная медицинская академия
Защита диссертации состоится «_» 2007 г. в «_» часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.
Автореферат разослан «_» _ 2007 г.
Ученый секретарь Регионального диссертационного совета С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Проблема поиска средств, повышающих адаптационные возможности организма к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в последнее время стала особенно актуальной. Это связано как с ухудшением экологической обстановки, так и с возрастанием информационно-эмоциональной нагрузки на психику человека. Иными словами, даже в случае здорового образа жизни при любом неблагоприятном воздействии в клеточном микроокружении появляются токсические вещества эндогенной или экзогенной природы, что неизбежно требует своей коррекции (Башкатов С.А., 1996). Основным путем обезвреживания этих соединений является их конъюгация с УДФ-глюкуроновой кислотой (УДФ-ГК) с последующим выведением из организма. Однако за УДФ-ГК конкурируют и другие метаболические процессы, основным из которых является биосинтез гетерополисахаридов - гликозаминогликанов межклеточного матрикса, что приводит к снижению эффективности детоксикации (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2004). Таким образом, и глюкуронидные конъюгаты, и гликозаминогликаны (ГАГ) синтезируются из общего предшественника – УДФ глюкуроновой кислоты. После выполнения своей функции гликозаминогликаны метаболизируются в глюкуронат-ксилулозном цикле (ГКЦ), одним из метаболитов которого является аскорбиновая кислота. Из сказанного следует, что метаболизм УДФ-глюкуроновой кислоты, тесно сопряженный с функционированием ГКЦ, обменом ГАГ и аскорбиновой кислоты (АК), имеет большое значение для защиты организма при самых различных неблагоприятных воздействиях.
В методическом плане отметим, что в организме крыс аскорбиновая кислота синтезируется в глюкуронат-ксилулозном цикле в количестве примерно 50 мг/кг и является необходимым метаболитом биосинтеза ГАГ. У приматов (в том числе человека) и морских свинок аскорбиновая кислота не синтезируется из-за отсутствия двух специфических ферментов ГКЦ (L гулонат: гулоно--лактонгидролазы (альдонолактоназы) 3.1.1.18 и гулоно- лактон: кислород-оксидоредуктазы (L-гулонодактоноксидазы) 1.1.3.8 (Дэгли С., Николсон Д., 1973), является витамином, который, однако, по механизму своего действия представляет собой типичный нормальный метаболит. Катаболизм гликозаминогликанов с образованием аскорбиновой кислоты у крыс протекает также в глюкуронат-ксилулозном цикле, поэтому представляется вероятным, что нагрузка этого цикла большим количеством АК должна замедлить катаболизм ГАГ и направить основной предшественник их синтеза УДФ глюкуроновую кислоту в реакции глюкуронидной конъюгации, обеспечивающие процессы детоксикации в организме и тем самым повысить его неспецифическую резистентность.
Дважды нобелевский лауреат Лайнус Полинг отмечал, что систематическое применение больших доз аскорбиновой кислоты улучшает состояние больных различными заболеваниями. Очевидно, это заключение Л.
Полинга свидетельствует в пользу доводов о повышении аскорбиновой кислотой неспецифической резистентности организма.
Для изучения антитоксической эффективности аскорбиновой кислоты нами в качестве модельного агента был выбран фенол, обладающий выраженным нейротоксическим действием и детоксицирующийся организмом в реакциях глюкуронидной конъюгации с превращением в нетоксичные фенилглюкурониды.
Таким образом, выбор нами аскорбиновой кислоты в качестве средства, модулирующего обмен веществ, обусловлен необходимостью предложить новые подходы к регуляции обмена веществ нормальными метаболитами на примере аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимого вида (крыс) и экстраполировать полученные результаты на аскорбат-зависимые виды. С учетом изложенного, представляется обоснованным выдвижение основной эмпирической гипотезы об ингибирующем действии больших дозировок аскорбиновой кислоты на биосинтез гликозаминогликанов, приводящем к перераспределению в организме фонда УДФ-глюкуроновой кислоты в сторону реакций конъюгации и повышающим за счет этого его неспецифическую Целью резистентность к токсическим воздействиям. настоящей экспериментальной работы являлось изучение влияния больших доз аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминогликанов и защитную эффективность при остром отравлении фенолом, а также теоретическое обоснование ее применения в качестве средства, повышающего неспецифическую резистентность организма к неблагоприятным экзо- и эндогенным воздействиям. Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:
1. Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на состояние обмена гликозаминогликанов и их фракций – гиалуроновой кислоты и сульфатированных гликозаминогликанов – в различных органах белых неинбредных крыс.
2. Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на содержание нуклеиновых кислот в различных органах белых неинбредных крыс.
3. Оценить защитную эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых неинбредных крыс 4. Изучить влияние аскорбиновой кислоты на интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации с применением в качестве токсического агента 14С-фенола.
5. Разработать практические рекомендации по дальнейшему изучению аскорбиновой кислоты в качестве средства, повышающего неспецифическую резистентность организма.
Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе фармакологических эффектов аскорбиновой кислоты. Установлено, что в организме белых неинбредных крыс аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг ингибирует анаболизм гликозаминогликанов и их фракций, в дозе 500 мг/кг – ингибирует и анаболизм, и катаболизм этих биополимеров, а в дозе 1000 мг/кг – к блокированию обмена гликозаминогликанов добавляется нарушение соотношения фракционного состава сульфатированных и несульфатированных ГАГ. Установлено защитное действие аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых крыс, одним из биохимических механизмов которого выступает повышение интенсивности реакций глюкуронидной конъюгации, происходящее на фоне увеличения содержания в печени нуклеиновых кислот, что является косвенным подтверждением интенсификации биосинтетических процессов. Теоретически обосновано, что биохимические механизмы фармакологических эффектов именно больших доз аскорбиновой кислоты носят сходный характер у аскорбат-зависимых и аскорбат-независимых видов. Не вызывает сомнений целесообразность проведения дальнейших фундаментальных исследований в этом направлении.
Практическая значимость. Показана возможность принципиально нового подхода к разработке средств, повышающих адаптационные резервы организма. Практически продемонстрировано, что нормальный метаболит (аскорбиновая кислота) может быть использован для биохимического регулирования интенсивности метаболических потоков макроэргических соединений (УДФ-глюкуроновой кислоты) для решения тех или иных фармакологических задач.Предложен как общий принцип повышения адаптационных возможностей организма, так и конкретный методический подход, заключающийся в применении для этих целей аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимых видов, например, в ветеринарии и животноводстве.
Вместе с тем для практического внедрения нашего предложения необходимо проведение большого количества доклинических исследований уточняющего характера.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2003), Конференции ученых Республики Башкортостан «Научный прорыв – 2004» (Уфа, 2004), на Межрегиональной научно-практической конференции «Формирование здорового образа жизни: государственные, национальные, личностные приоритеты» (Уфа, 2005), Всероссийской научно практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины (Уфа, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 27 таблиц, 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 197 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основные эксперименты были выполнены на 640 белых инбредных половозрелых крысах. Исследовали биохимические показатели белых неинбредных крыс весом 180-220 г. Определяли содержание гликозаминогликанов и их фракций, нуклеиновых кислот в головном мозге, легких, сердце, печени и кишечнике. Концентрации фенилглюкуронидов оценивали в печени по реакции Дише на уроновые кислоты и по радиоактивности С-фенильного радикала. Определяли защитную эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом в дозе DL84. Оценивали влияние больших однократных дозировок аскорбиновой кислоты (100, 500 и 1000 мг/кг), введенных внутрибрюшинно, на динамику содержания гликозаминогликанов и нуклеиновых кислот (НК) в вышеперечисленных органах и антитоксическую резистентность организма.
Определение гликозаминогликанов, их фракций и нуклеиновых кислот проводили с использованием гельфильтрации на сефадексе G-25 и анионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе (Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2004). При обработке полученных данных рассчитывали средние значения, стандартные отклонения, вычисляли t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера, U-критерий Манна-Уитни, применяли однофакторный дисперсионный анализ (ОДА).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов и нуклеиновых кислот в органах крыс.
Крысам АК вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг, через 30 мин животных забивали и определяли ГАГ и НК в органах.
В таблице 1 приведены средние значения и стандартные отклонения показателей содержания гликозаминогликанов (ГАГ) в органах интактных крыс и крыс, получавших аскорбиновую кислоту (АК) в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг.
Однофакторный дисперсионный анализ показал, что АК не влияет на уровень ГАГ в кишечнике крыс (F(3, 24)=2,2913;
р=0,10382). Вместе с тем, сравнение средних по t-критерию Стьюдента (t-test) обнаружило статистически значимые различия лишь между группами животных, получавших АК в дозах 500 и мг/кг (р=0,043959). Полученные результаты позволяют заключить, что АК не увеличивает уровень ГАГ в ткани кишечника подопытных крыс.
Таблица 1. Содержание гликозаминогликанов в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты Доза n* Содержание ГАГ, мкг/г ткани АК, Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце мг/кг 0 7 55,38±24,69 76,54±28,21 47,33±17,47 74,01±21,86 52,10±8, 100 7 67,86±30,48 41,52±9,45 28,96±9,36 29,12±8,36 39,62±7, 500 7 89,14±37,56 54,37±11,57 55,47±17,58 95,74±27,85 64,89±12, 1000 7 52,70±20,61 44,98±9,77 28,75±9,53 41,56±12,40 61,19±11, *n – здесь и далее - количество животных в группе.
В легких АК, по результатам ОДА, статистически значимо уменьшала содержание ГАГ (F(3, 24)=0,00276;
р=0,00276). Так, t-test показал, что введение крысам АК в дозе 100 мг/кг приводило к уменьшению содержания АК в 1, раза (р=0,008933), в дозе 500 мг/кг – в 1,41 раза (р=0,078379, тенденция различий) и в дозе 1000 мг/кг- в 1,70 раза (р=0,016123). АК в дозах 100 и мг/кг уменьшала содержание ГАГ в головном мозге крыс (F(3, 24)=6,3763;
р=0,00248): по t-test, соответственно в 1,63 (р=0,030475) и 1,65 (р=0,029469) раза. Аналогичная картина наблюдалась и в печени: АК снижала содержание ГАГ в печени (F(3, 24)=17,490;
р=0,000001): по t-test, в дозе 100 мг/кг в 2, раза (р=0,000273), а в дозе 1000 мг/кг – в 1,78 раза (р=0,005109). АК уменьшала содержание ГАГ в сердце крыс (F(3, 24)=8,6218;
р=0,00046). По t-test, введение АК в дозе 100 мг/кг привело к снижению концентрации ГАГ в 1,31 раза (р=0,012280).
Анализируя общие закономерности влияния аскорбиновой кислоты на уровень гликозаминогликанов в органах крыс, можно отметить, что в контрольной группе интактных животных наибольшее содержание ГАГ отмечалось в легких и печени, соответственно 76,54 и 74,01 мкг/г ткани.
Меньшие значения этого показателя наблюдались в кишечнике, мозге и сердце:
соответственно 55,38, 47,33 и 52,10 мкг/г. Введение аскорбиновой кислоты в дозе 100 мг/кг приводило к уменьшению уровня ГАГ в легких, мозге, печени и сердце в 1,84;
1,63;
2,54 и 1,31 раза. Из этого можно сделать заключение об уменьшении биосинтеза ГАГ в этих органах. Биохимический механизм этого процесса, очевидно, заключается в ингибировании по механизму обратной связи биосинтеза ГАГ аскорбиновой кислотой как метаболитом глюкуронат ксилулозного цикла.
Увеличение дозы аскорбиновой до 500 мг/кг приводило к следующим биохимическим эффектам. Так, содержание ГАГ по сравнению с показателями животных, получивших АК в дозе 100 мг/кг, в органах резко возрастало: при этом в легких наблюдалось увеличение показателя в 1,31 раза, в мозге – в 1,92, в печени – 3,29 и в сердце – 1,64. Представляется важным, что абсолютные значения концентраций ГАГ животных, получивших аскорбиновую кислоту в дозе 500 мг/кг, оставались в пределах контрольных значений этого показателя.
По нашему мнению, полученные результаты можно объяснить тем, что введение столь большой дозы аскорбиновой кислоты по механизму обратной связи через глюкуронат-ксилулозный цикл полностью блокирует как анаболизм, так и катаболизм гликозаминогликанов в органах и тканях.
Дальнейшее увеличение дозировки аскорбиновой кислоты до 1000 мг/кг приводило к уменьшению содержания ГАГ в легких, мозге и печени соответственно в 1,70;
1,64 и 1,78 раза. Хотя внешне картина напоминала ситуацию при введении аскорбиновой кислоты в дозе 100 мг/кг, однако, по видимому, полученные результаты свидетельствуют о последствиях токсического эффекта АК в этой дозировке. В пользу этого можно привести следующие аргументы. Во-первых, известно, что суточная потребность в аскорбиновой кислоте организма составляет примерно 1 мг/кг. Во-вторых, в дозе 100 мг/кг аскорбиновая кислота уменьшала содержание ГАГ в органах, что можно объяснить уменьшением их биосинтеза, а в дозе 500 мг/кг не влияла на их уровень, что мы интерпретировали как ингибирование обмена ГАГ в целом.
Поэтому повторное снижение не может по своему механизму быть аналогичным эффекту аскорбиновой кислоты в дозе 100 мг/кг. Можно предположить, что аскорбиновая кислота в дозе 1000 мг/кг обладает токсическим действием, в результате которого настолько нарушается структура органов, что они теряют гликозаминогликаны. Иными словами, ГАГ из межклеточного матрикса с тканевой жидкостью попадают в лимфу и далее в кровяное русло. Поскольку гликозаминогликаны являются полимерными кислотами, свойства которых обусловлены карбоксильными группами гексуроновых кислот, представляется весьма вероятным, что положительно заряженные анионы аскорбиновой кислоты, накопившиеся в тканях в чрезмерно большой концентрации, способствуют вытеснению ГАГ из межклеточного матрикса органов сначала в тканевую жидкость, затем в лимфу и далее в систему кровообращения.
Получив столь интересные данные при изучении влияния больших дозировок аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов в органах, мы решили оценить, как при этом будет меняться фракционный состав гликозаминогликанов, а именно: несульфатированная фракция, представленная гиалуроновой кислотой (ГК) и сульфатированная фракция (СГАГ), представленная в основном хондроитин- и гепарансульфатами. Средние значения и стандартные отклонения показателей содержания гиалуроновой кислоты в органах крыс, получивших различные дозы аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 2.
Таблица 2. Содержание гиалуроновой кислоты в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты Доза АК, n Содержание ГК, мкг/г ткани мг/кг Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце 0 6 27,90±6,61 38,32±8,65 21,62±5,49 31,83±5,11 25,81±8, 100 6 28,70±7,54 18,20±2,95 14,56±3,72 11,21±2,15 17,64±3, 500 6 27,95±4,36 17,33±3,19 33,02±8,99 32,77±6,47 36,10±5, 1000 6 26,55±6,81 8,95±1,61 15,25±4,29 13,88±2,49 32,78±5, АК не влияла на уровень ГК в кишечнике крыс (F(3, 20)=0,11528;
р=0,95012).
Сравнение средних значений по t-критерию Стьюдента также не выявило статистически значимых различий. АК во всех дозировках уменьшала содержание ГК в легких крыс (F(3, 20)=38,700;
р=0,000001) (рис. 1), по t-test, в дозе 100 мг/кг - в 2,11 раза (р=0,000305), в дозе 500 мг/кг – в 2,20 раза (р=0,000236), в дозе 1000 мг/кг – в 4,28 раза (р=0,000010).
АК снижала уровень ГК в головном мозге крыс (F(3, 20)=12,236;
р=0,00009): по t-test, в дозе 100 мг/кг - в 1,48 раза (р=0,026340), в дозе мг/кг – в 1,42 раза (р=0,049216). В этих же дозировках АК снижала концентрацию ГК в печени крыс (F(3, 20)=40,0614;
р=0,000001): по t-test, в дозе 100 мг/кг АК уменьшала уровень ГК в 2,84 раза (р=0,000004), а в дозе мг/кг – в 2,29 раза (р=0,000016). АК статистически значимо уменьшала уровень ГК в сердце крыс (F(3, 20)=11,724;
р=0,00012): в дозе 100 мг/кг в 1,46 раза (р=0,045071).
Гиалуроновая кислота, мгк/г ткани 0 100 500 Аскорбиновая кислота, мг/кг Рис. 1. Влияние аскорбиновой кислоты на уровень гиалуроновой кислоты в легких крыс.
Таким образом, аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг снижала содержание ГК в легких, мозге, печени и сердце соответственно в 2,11;
1,48;
2,79 и 1,46 раза. Увеличение дозы АК до 500 мг/кг повышало ее содержание относительно показателей воздействия в дозе 100 мг/кг в мозге, печени и сердце соответственно в 2,27;
2,92 и 2,05 раза. Введение в дозе 1000 мг/кг вновь снижало показатели ее содержания в мозге, печени и сердце относительно показателей воздействия в дозе 500 мг/кг соответственно в 2,17 и 2,36 раза. В целом, динамика изменений содержания ГК под влиянием возрастающих доз аскорбиновой кислоты была аналогична динамике ГАГ и может быть объяснена теми же причинами.
Средние значения и стандартные отклонения содержания сульфатированных гликозаминогликанов (СГАГ) в органах крыс, получавших различные дозировки аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 3.
Таблица 3. Содержание сульфатированных гликозаминогликанов в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты Доза АК, n Содержание СГАГ, мкг/г ткани мг/кг Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце 0 6 26,86±5,49 37,77±6,53 25,43±6,23 41,90±7,38 26,02±4, 100 6 34,57±5,88 37,02±6,94 17,56±4,90 18,03±3,71 25,19±4, 500 6 52,12±9,00 37,50±6,84 26,28±7,26 53,67±11,73 27,00±5, 1000 6 32,74±5,34 37,50±9,22 16,38±4,01 28,25±6,16 28,03±5, АК в дозах 100 и 500 мг/кг статистически значимо увеличивала уровень СГАГ в кишечнике крыс (F(3, 20)=16,287;
р=0,00001): по t-test, соответственно в 1,29 раза (р=0,040949) и в 1,94 раза (р=0,000158). АК не влияла на содержание СГАГ в легких крыс (F(3, 20)=0,01053;
р=0,99847): все дозировки АК не изменяли уровня этого показателя (р=0,851028;
р=0,946282;
р=0,955039). АК в дозах 100 и 1000 мг/кг уменьшала содержание СГАГ в головном мозге крыс (F(3, 20)=4,8697;
р=0,01057), по t-test, соответственно в 1,49 раза (р=0,035203) и в 1,55 раза (р=0,013491). АК в дозах 100 и 1000 мг/кг снижала концентрацию СГАГ в печени крыс (F(3, 20)=23,914;
р=0,000001). По t-test, количественно содержание СГАГ снизилось соответственно в 2,32 раза (р=0,000034) и 1, раза (р=0,005934). АК во всех дозировках не влияла на содержание СГАГ в сердце крыс (F(3, 20)=0,32958;
р=0,80401). Сравнение средних не выявило различий между контрольной и экспериментальными группами.
Таким образом, в дозе 500 мг/кг АК увеличивала уровень СГАГ по отношению к показателям группы, получавшей АК в дозе 100 мг/кг, кишечнике, мозге и печени соответственно в 1,51;
1,50 и 2,98 раза. В дозе мг/кг АК уменьшала содержание СГАГ в сравнении с группой, получавшей АК в дозе 500 мг/кг, в кишечнике, мозге и печени соответственно в 1,59;
1,60 и 1, раза.
Анализируя динамику содержания ГАГ, ГК и СГАГ под воздействием различных доз аскорбиновой кислоты, можно отметить общие закономерности, выражающиеся в уменьшении этих показателей для доз 100 и 1000 мг/кг и в их увеличении в дозе 500 мг/кг. Как мы отмечали выше, выявленные закономерности можно объяснить тем, что в дозе 100 мг/кг АК ингибирует биосинтез ГАГ и их фракций, в дозе АК 500 мг/кг ингибируется не только анаболизм, но и катаболизм этих соединений, а в дозе АК 1000 мг/кг происходит интоксикация, сопровождающаяся вытеснением ГАГ и их фракций из межклеточного матрикса органов, вероятно, по ионообменному механизму.
Выявив и обсудив общие закономерности динамики изучаемых биополимеров, нам представляется важным проанализировать особенности изучаемых процессов по отдельным органам и по соотношениям концентраций сульфатированных и несульфатированных ГАГ (табл. 4).
Таблица 4. Соотношение концентраций несульфатированных и сульфатированных гликозаминогликанов в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты Доза АК, Соотношение концентраций мг/кг Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце 0 1,04 1,01 0,85 0,76 0, 100 0,83 0,49 0,83 0,62 0, 500 0,54 0,46 1,26 0,61 1, 1000 0,81 0,27 0,93 0,49 1, Аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг уменьшала соотношение ГК/СГАГ во всех органах, кроме мозга. В легких этот показатель снижался до 0,49. В дозе 500 мг/кг эта картина сохранялась в кишечнике (0,54), легких (0,46) и печени (0,61), а в мозге и сердце, наоборот, соотношение ГК/СГАГ стало существенно превышать единицу. В дозе 1000 мг/кг аскорбиновая кислота чрезвычайно сильно уменьшала соотношение ГК/СГАГ в легких и печени - до 0,27. Также низким оставался этот показатель в печени (0,49).
Таким образом, можно заключить, что аскорбиновая кислота в дозе мг/кг, очевидно, ингибирует анаболизм ГАГ и их фракций, в дозе 500 мг/кг блокируется как анаболизм, так и катаболизм этих биополимеров, в дозе мг/кг отмечается обеднение органов ГАГ и их фракций, по-видимому, за счет токсических эффектов аскорбиновой кислоты. Следует подчеркнуть, что одним из возможных токсических механизмов больших дозировок аскорбиновой кислоты может выступать вытеснение ГАГ и их фракций из межклеточного матрикса по анионообменному механизму.
Средние значения и стандартные отклонения показателей содержания в органах крыс, получивших различные дозировки аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 5. АК во всех дозировках снижала содержание НК в кишечнике крыс (F(3, 20)=20,887;
р=0,000001): по t-test, в дозе 100 мг/кг в 1, раза (р=0,007397), в дозе 500 мг/кг – в 1,56 раза (р=0,000013), в дозе 1000 мг/кг – в 1,20 раза (р=0,007503). В легких АК также изменяла содержание НК (F(3, 20)=20,725;
р=0,000001). При этом, по t-test, АК в дозе 500 мг/кг в 1,18 раза (р=0,003033) уменьшала уровень НК, а в дозе 1000 мг/кг в 1,18 раза (р=0,003054) увеличивала этот показатель.
Таблица 5. Содержание нуклеиновых кислот в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты Доза АК, n Содержание НК, мкг/г ткани мг/кг Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце 0 6 811±76 642±50 411±50 534±65 464± 100 6 676±63 651±47 292±35 1127±143 422± 500 6 520±49 542±39 350±42 1025±130 325± 1000 6 676±64 758±54 432±59 1019±114 487± Нуклеиновые кислоты, мкг/г ткани 0 100 500 Аскорбиновая кислота, мг/кг Рис. 2. Влияние аскорбиновой кислоты на уровень нуклеиновых кислот в печени крыс.
АК в дозах 100 и 500 мг/кг уменьшала содержание НК в головном мозге крыс (F(3, 20)=10,725;
р=0,00020): по t-test, соответственно в 1,41 раза (р=0,000735) и в 1,17 раза (р=0,045449). Введение АК приводило к увеличению содержания НК в печени крыс (F(3, 20)=31,153;
р=0,000001) (рис. 3.2). По t-test, в дозе 100 мг/кг АК увеличивала показатель содержания НК в 2,11 раза (р=0,000003), в дозе мг/кг – в 1,92 раза (р=0,000009), в дозе 1000 мг/кг – в 1,91 раза (р=0,000004). АК уменьшала уровень НК в сердце крыс (F(3, 20)=6,0930;
р=0,00406). При этом АК в дозе 500 мг/кг снижала этот показатель в 1,43 раза (р=0,004666).
Полученные данные убедительно свидетельствуют, что в тканях кишечника, мозга и сердца наблюдалось умеренное снижение концентрации нуклеиновых кислот. В легких уровень нуклеиновых кислот был достаточно стабильным. Однако в печени картина была по истине впечатляющей. Так, все дозировки аскорбиновой кислоты: и 100, и 500, и 1000 мг/кг увеличивали содержание в печени нуклеиновых кислот. По нашему мнению, это можно объяснить интенсивным биосинтезом, направленным на выведение из организма токсических веществ.
Защитная эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых неинбредных крыс.
Выше по тексту мы отмечали, что аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг ингибирует анаболизм, а дозе 500 мг/кг - и катаболизм гликозаминогликанов в печени. В дозе 1000 мг/кг АК проявляет токсическое действие, заключающееся в снижении общего содержания гликозаминогликанов в печени и доли в ГАГ гиалуроновой кислоты. Известно, что ГК выполняет структурообразующую функцию, объединяя протеогликаны в макромолекулярные комплексы, которые и придают ткани органов соответствующие ей физико-химические свойства.
Поэтому снижение доли ГК в печени в 1,55 раза, то есть соотношения ГК/СГАГ свидетельствует о серьезном нарушении структуры этого органа. Нами установлено, что АК во всех использованных дозировках повышает в печени интенсивность биосинтеза нуклеиновых кислот, что является необходимым условием повышения интенсивности биосинтеза белка, в том числе для нужд реакций детоксикации. Также, учитывая тот факт, что снижение интенсивности биосинтеза ГАГ и их фракций в печени имеет место при введении аскорбиновой кислоты в дозах 100 и 500 мг/кг без нарушения соотношения ГК/СГАГ, мы предположили, что однократное введение АК в этих дозировках повысит антитоксическую эффективность печени за счет повышения резервов реакций глюкуронидной конъюгации, поскольку известно, что биосинтез гликозаминогликанов и реакции глюкуронидной детоксикации конкурируют за один и тот же метаболит – УДФ-глюкуроновую кислоту.
В качестве модельного токсического соединения нами был выбран фенол, который, детоксицируется в реакции глюкуронидной конъюгации и выводится из организма в виде фенилглюкуронида. В экспериментах на крысах была определена доза, которая при однократном внутрижелудочном введении вызывала в течение 1 суток падеж 84% животных (DL84). Она составила мг/кг. Три экспериментальные группы крыс по десять животных массой 180 – 200 г получали профилактически аскорбиновую кислоту в дозах 50, 100 или мг/кг внутрибрюшинно и затем через 10 мин внутрижелудочно фенол в дозе DL84. Эксперименты по выявлению защитного эффекта АК при введении фенола в дозе DL84 показали, что АК в дозе 50 мг/кг практически не влияет на выживаемость животных, в дозе 100 мг/кг обеспечивает выживаемость 80% подопытных крыс, а в дозе 500 мг/кг доводит показатель защиты до 100%.
Таким образом, наибольшая защитная эффективность аскорбиновой кислоты, проявляемая в дозе 500 мг/кг, согласуется с ингибированием ею обмена гликозаминогликанов в той же дозировке. Неэффективность профилактической дозировки 50 мг/кг, очевидно, объясняется тем, что естественная продукция аскорбиновой кислоты в организме крысы, по данным литературы, составляет примерно 50 мг/сутки и введение нами дополнительно 50 мг существенно не изменяет концентрацию этого метаболита в организме, что сказывается на отсутствии различий в результатах с контрольной группой.
Влияние аскорбиновой кислоты на детоксикацию 14С-фенола.
Гипотеза об ускорении детоксикации фенола под воздействием аскорбиновой кислоты была доказана в экспериментах с радиоактивно меченным 14С-фенолом. Животные опытной группы получали 14С-фенол в дозе 50 мг/кг, радиоактивность которого составляла 4•108 Бк/кг массы тела, за мин до введения аскорбиновой кислоты в дозе 500 мг/кг. Животные контрольной группы получали только радиоактивный фенол. Животных забивали через 15, 30, 60, 90 и 120 минут после начала эксперимента. Из печени хроматографически выделяли фенилглюкуронидную фракцию и определяли ее радиоактивность на сцинтилляционном счетчике. Результаты исследования приведены на рисунке 3. В связи с малыми объемами выборок (по три животных в группе) мы обработали данные с помощью непараметрического U критерия Манна-Уитни. Было установлено, что суммы рангов в опытных группах превышают суммы рангов контрольных групп на 60 и 90 мин от начала эксперимента (р0,05). К 120 минуте картина меняется на противоположную:
сумма рангов контрольной группы превышает сумму рангов опытной группы (р0,05). К 150 минуте показатели контрольной и опытной группы перестают различаться. Таким образом, скорость выведения фенилглюкуронидов из печени животных опытной группы выше, чем у животных контрольной группы.
cpm 1200 Контроль 1000 Опыт 30 мин 60 мин 90 мин 120 мин 150 мин Рис. 3. Влияние аскорбиновой кислоты на динамику содержания в печени С-фенилглюкуронидов (cpm – счет импульсов в минуту).
С учетом полученных результатов, можно заключить, что радиоактивные фенилглюкурониды определялись в печени животных во временном диапазоне 1-2,5 часа после введения фенола. Максимум концентрации фенилглюкуронидов приходился в контрольной группе на 120 мин, а в опытной группе, получавшей аскорбиновую кислоту, на 90 мин. Статистическая обработка полученных данных позволила констатировать достоверность различий в показателях радиоактивности сравниваемых групп и доказать ускорение аскорбиновой кислотой детоксикации фенола. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что аскорбиновая кислота в дозе мг/кг в организм крыс способствует замедлению обмена гликозаминогликанов, одновременно увеличивает интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации и повышает общую (неспецифическую) резистентность организма к токсическим воздействиям.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Теоретической основой выполненной работы было предположение о способности аскорбиновой кислоты в больших дозировках ингибировать обмен гликозаминогликанов в организме аскорбат-независимых видов и тем самым сохранять фонд УДФ-глюкуроновой кислоты для использования в реакциях глюкуронидной конъюгации. Подчеркнем, что печень и легкие являются органами, выполняющими основной объем реакций детоксикации, основным механизмом которых выступает глюкуронидная конъюгация. Представляется важным, что в наших исследованиях именно в печени и легких аскорбиновая кислота по мере повышения дозы сначала ингибировала биосинтез гликозаминогликанов и их фракций, затем их катаболизм, а в максимальной дозе существенно нарушала нормальное соотношение фракций ГАГ. В дозе мг/кг АК обеспечивала повышение биосинтеза нуклеиновых кислот, а также 100% защиту подопытных крыс при остром отравлении фенолом в дозе DL84 и стимулировала его детоксикацию по фенилглюкуронатному механизму.
По нашим данным и сведениям литературы, аскорбиновая кислота увеличивает биосинтез нуклеиновых кислот. Однако в отличие от авторов, также изучавших влияние аскорбиновой кислоты на ткани крыс, мышей и быка, принадлежащих к аскорбат-независимым видам животных, наблюдавших увеличение или неизменность синтеза ГАГ, мы, наоборот, наблюдали его угнетение. Это можно объяснить тем, что в наших исследованиях концентрация аскорбиновой кислоты в органах и тканях была существенно выше, и по механизму отрицательной обратной связи, который широко распространен в метаболических процессах, замедляла биосинтез ГАГ.
Поскольку аскорбиновая кислота не относится к лекарственным препаратам, проявляющим антидотные свойства (Голиков С.Н. и др., 1986), она не способна проявлять специфический антагонизм в отношении действия какого-либо токсиканта. Поэтому обнаруженную нами ее антитоксическую эффективность по отношению к экспериментальному отравлению фенолом можно объяснить только с позиций неспецифического опосредованного действия. По нашим данным, большие дозировки аскорбиновой кислоты повышали интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации, и, очевидно, именно этот биохимический механизм лежит в основе защитной эффективности аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом.
По своей сути любой патологический процесс в организме сводится к появлению в клеточном микроокружении токсических веществ экзо- или эндогенной природы. Гидрофильные токсиканты немедленно включаются в реакции конъюгации и в виде нетоксичных конъюгатов выводятся из организма. Гидрофобные токсические соединения предварительно метаболизируются монооксигеназной системой цитохрома Р-450 с образованием полярных нуклеофильных группировок и после этого детоксицируются в реакциях конъюгации (Coon M.J., Persson A.V., 1980). Из этого следует, что любой лекарственный препарат, стимулирующий реакции конъюгации, будет проявлять адаптогенную активность, то есть повышать неспецифическую резистентность организма к любым неблагоприятным ситуациям, чем и можно объяснить многочисленные фармакологические эффекты аскорбиновой кислоты.
Представляется важным сравнить биологическую активность малых и больших дозировок аскорбиновой кислоты. В настоящее время официальной медицинской литературой признается суточная потребность человека в аскорбиновой кислоте в размере 50 – 100 мг (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 2001).
Это так называемая минимальная антискорбутная доза. В указанной связи все дозировки АК, превышающие для человека 100 мг в сутки можно отнести к большим дозам этого препарата. Для среднего человека весом 70 кг доза в мг/сутки составит примерно 1,4 мг/кг. Установлено, что в организме крысы синтезируется 26 - 58 мг/кг АК, и если пересчитать на средний вес человека ( кг), это даст 1,8 - 4,1 г. Сходные данные получены и для других животных.
В современном обзоре литературы, посвященном цинге и действию мегадоз аскорбиновой кислоты, А.Ш. Зайчик и Л.П. Чурилов (2001) отмечают, что хотя минимальная потребность в аскорбиновой кислоте и составляет 50- мг/сутки, но она сильно повышается при разнообразных состояниях, связанных со стрессами и напряженной адаптацией, поэтому многие авторы рекомендуют более значительные дозы как минимально необходимые.
В антискорбутных дозах аскорбиновая кислота в организме человека участвует в реакциях гидроксилирования биомолекул, синтеза простагландина PGE1, стимуляции иммунной системы, синтеза кортикостероидов и некоторых катехоламинов и т.д. Однако в минимальных антискорбутных дозировках АК мы не наблюдаем повышения резистентности организмов ни к неблагоприятным воздействиям, ни к заболеваниям. Эти фармакологические эффекты – прерогатива «сверхдоз» аскорбиновой кислоты. В этой связи становится понятным, почему в научной литературе в течение последних двух десятилетий присутствуют различные мнения относительно полезности больших дозировок аскорбиновой кислоты для человека, в зависимости от того, о чем идет речь: о профилактике авитаминоза аскорбиновой кислоты или о повышении неспецифической резистентности организма к неблагоприятным воздействиям.
В заключение отметим, что, очевидно, аскорбиновая кислота в антискорбутных дозировках обеспечивает весь комплекс биохимических реакций, описанный классической медицинской биохимией. При повышенных уровнях ее воздействия начинают наблюдаться эффекты повышения неспецифической резистентности организма к неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей и внутренней среды. В связи с этим представляется целесообразным проведение дополнительных биохимических исследований, направленных на уточнение механизмов фармакологической активности больших дозировок аскорбиновой кислоты у аскорбат-зависимых видов, а также теоретических и экспериментальных разработок, направленных на обоснование методического подхода к решению фармакологических задач на основе применения больших дозировок эндогенных соединений для целенаправленного перераспределения метаболических потоков. Полученные нами результаты убедительно свидетельствуют в пользу того, что одним из существенных механизмов этих эффектов является интенсификация реакций глюкуронидной конъюгации, позволяющей выводить из организма токсиканты самой разнообразной экзо- и эндогенной природы.
ВЫВОДЫ 1. Аскорбиновая кислота в больших дозировках: 100, 500 и 1000 мг/кг введенная в организм белых крыс, доза-зависимо ингибирует обмен гликозаминогликанов и их фракций – гиалуроновой кислоты и сульфатированных ГАГ, соответственно сначала подавляя анаболизм, затем и катаболизм этих биополимеров.
2. Аскорбиновая кислота во всех больших дозировках – 100, 500 и 1000 мг/кг - увеличивает биосинтез нуклеиновых кислот в печени крыс.
3. Аскорбиновая кислота в диапазоне доз 100 – 500 мг/кг проявляет защитную эффективность при остром отравлении белых крыс фенолом в дозе DL84.
4. Аскорбиновая кислота в дозировке 500 мг/кг повышает интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации в печени крыс на модели острого отравления фенолом.
5. Теоретически и экспериментально обоснована принципиальная возможность повышения адаптационных возможностей аскорбат независимых видов путем применения больших дозировок аскорбиновой кислоты.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ерофеева О.Е. Влияние больших доз аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов и глюкуронидных конъюгатов в печени крыс / Хуснутдинова С.Б., Ерофеева О.Е. //Материалы Пироговской научной конференции студентов и молод ученых.- М.: РГМУ, 2003.- С.59.
2. Ерофеева О.Е. Модуляция аскорбиновой кислотой обмена гликозаминогликанов в организме крыс / Ерофеева О.Е., Хуснутдинова С.Б., Башкатов С.А., Гилязов А.Ф. //Сборник научных трудов конференции ученых Республики Башкортостан «Научный Прорыв - 2004».-Уфа:БГМУ, 2004.- С.15.
3. Ерофеева О.Е. Содержание и метаболизм гликозаминогликанов в органах и тканях белых крыс различного возраста / Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., Хуснутдинова С.Б., Петренко Е.Г., Ерофеева О.Е. //Биомедицинская химия.-2004.-Т.50.-№6.-С.592-599.
4. Ерофеева О.Е. Новый биохимический механизм фармакологической активности аскорбиновой кислоты / Башкатов С.А., Ерофеева О.Е., Зимницкий А.Н., Хуснутдинова С.Б. // Материалы Всероссийской научно практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины».- Уфа: БГАУ, 2006.-С.14-16.
5. Ерофеева О.Е. Уточнение локализации биосинтеза гликозаминогликанов и его динамики с применением 14С-глюкозы, меченной по С1 /Ерофеева О.Е., Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. //Материалы Всероссийской научно практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины».- Уфа: БГАУ, 2006.-С.48-50.