Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов pseudomonas и rhodococcus

На правах рукописи

ПЕТРИКОВ КИРИЛЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА,

ПРОДУЦИРУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРАМИ

РОДОВ PSEUDOMONAS И RHODOCOCCUS

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре химии естественнонаучного факультета ФГБОУ ВПО «Тульский государственный университет» и в лаборатории биологии плазмид УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.

Научный руководитель: кандидат химических наук Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук Каплун Александр Петрович кандидат химических наук Руденко Наталья Васильевна

Ведущая организация: Институт биологии Коми научного центра Уральского округа РАН

Защита диссертации состоится «» _ 2011 г. в на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу:

119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru.

Автореферат разослан « » _ 2011 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

*) Актуальность проблемы Решение проблемы антропогенного загрязнения окружающей среды нефтью относится к первоочередным экологическим задачам. Поскольку объёмы добычи, транспортировки и переработки этого сырья очень велики, то и связанные с этим утечки и разливы при авариях имеют глобальный масштаб. В период с 1990 по 1999 гг. приблизительный объём нефтяных загрязнений одних только морских акваторий составил более 3 000 000 тонн (Etkin D.S., 2001). Несмотря на то, что нефть и её компоненты подвергаются естественному разложению, процесс самовосстановления загрязненной среды является очень длительным. Без проведения широкомасштабных и эффективных мероприятий по ликвидации последствий попадания нефти и нефтепродуктов в окружающую среду, количество загрязнённых территорий будет неуклонно расти. Такие распространённые методы, как механический сбор, отжим и выжигание нефти, вывоз и захоронение загрязнённой почвы, не только являются неэффективными, но и могут нанести дополнительный вред окружающей среде. Важными задачами являются разработка и усовершенствование высокоэффективных и безопасных способов очистки загрязнённых территорий, в основе которых лежат процессы, происходящие при ауторемедиации.

Активность микроорганизмов является одним из главных факторов, способствующих естественной очистке почв и водоёмов (Van Hamme J.D. et al., 2003). Способность микроорганизмов к деградации различных загрязнителей, в том числе и углеводородов – основных компонентов нефти, известна давно и интенсивно изучается. Большое внимание уделяется процессам биологической ремедиации природных экосистем. Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную и экологически безопасную очистку, приводящую к уменьшению концентрации поллютантов. Одним из основных методов биоремедиации in situ (на месте загрязнения) является интродукция микроорганизмов в места загрязнения (Вельков В.В., 1995). Суть этого метода заключается во внесении в почву биопрепарата, включающего в себя биомассу жизнеспособных клеток одного или нескольких активных штаммов углеводородокисляющих бактерий. При этом в почве формируется конкурентоспособная ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Известны различные отечественные биопрепараты, используемые для биоремедиации: «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» (ЗАО «Биоойл», г. Новосибрск);

«Биоприн (Олеоворин)» (ВНИИ-Синтезбелок, предприятие «Новые технологии»), «Деворойл» (ООО «Микробные технологии» совместно с ООО «Сити Строй», г. Москва) (Кобзев Е.Н., 2003). Однако, несмотря на широкий спектр предлагаемых продуктов, ведётся постоянный поиск новых микроорганизмов-нефтедеструкторов и их ассоциаций и изучение их свойств с целью повышения эффективности очистки нефтезагрязнённых территорий.

Этого можно достичь, создавая новые биопрепараты, при разработке которых учитывались бы особенности деградации углеводородов нефти различными _ *) Выполнение экспериментальной части работы в лаборатории биологии плазмид УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН осуществлялось под руководством к.б.н., с.н.с. Филонова А.Е.

микроорганизмами. Одним из важнейших механизмов утилизации компонентов нефти, которые слабо- или нерастворимы в воде, является образование микроорганизмами поверхностно-активных соединений (биоПАВ или биосурфактантов) (Desai J., Banat I., 1997). Они способствуют солюбилизации углеводородов, образованию мелкодисперсной эмульсии, в результате чего облегчается контакт микробных клеток с гидрофобным субстратом и поступление его внутрь клетки. В настоящее время биоПАВ являются объектами пристального изучения. Их преимущество перед синтетическими ПАВ состоит в том, что они высокоэффективны, биодеградабельны и обладают низкой токсичностью. Изучение свойств, строения, условий биосинтеза этих соединений позволит создать биопрепараты на основе отобранных микроорганизмов-продуцентов. Помимо этого, потенциал использования биосурфактантов не ограничивается технологиями биоремедиации. Эти вещества находят применение в таких отраслях промышленности, как нефтедобывающая, пищевая, фармацевтическая и косметическая (Banat I. et al., 2010). Таким образом, поиск новых штаммов микроорганизмов, продуцирующих биоПАВ, и изучение свойств этих соединений, является актуальной задачей.

Другим аспектом современной экологической биотехнологии является получение промышленных форм биопрепаратов, отвечающих требованиям экономичности и эффективности. Исходя из этого, для получения биомассы микроорганизмов должны быть подобраны такие условия, при которых достигался бы максимальный выход продукта с высокими численностью живых клеток и углеводородокисляющей активностью. Важен и выбор способа хранения готового биопрепарата, позволяющего сохранить максимальную численность жизнеспособных микроорганизмов, так как суспензия бактерий теряет свои качества, необходимые для использования в биопрепарате, в течение нескольких дней.

Работа выполнялась при частичной поддержке грантов федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы» госконтракты №02.740.11.0296 и №П1749.

Цель работы:

выявление особенностей образования и строения биологических поверхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus, и выбор условий культивирования и хранения этих микроорганизмов нефтедеструкторов как компонентов биопрепарата для ремедиации нефтезагрязнённых экосистем.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить способность микроорганизмов – эффективных нефтедеструкторов к образованию поверхностно-активных веществ в зависимости от условий культивирования.

2. Провести очистку биоПАВ, образуемых выбранными эффективными микроорганизмами-продуцентами.

3. Исследовать особенности строения поверхностно-активных соединений.

4. Подобрать условия получения биомассы бактерий-нефтедеструкторов, продуцирующих биосурфактанты, при раздельном и совместном культивировании.

5. Определить условия хранения полученной биомассы, выбрав наиболее эффективные консерванты и криопротекторы.

Научная новизна В рамках комплексного подхода к разработке биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий изучена способность микроорганизмов нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящих в состав биопрепаратов «МикроБак» и «ВиО», к образованию поверхностно-активных веществ. Установлено, что все изученные бактерии являются продуцентами биоПАВ. Наибольшее количество биосурфактантов экзо-типа образуется при росте псевдомонад и родококков на гексадекане.

Впервые показано, что клетки микроорганизмов рода Rhodococcus, полученные при культивировании на гидрофильных субстратах (глюкоза, бакто триптон), способны стабилизировать эмульсию гексадекан-вода за счёт образования клеточносвязанных биоПАВ.

Исследованы особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями-нефтедеструкторами. Установлено, что биоПАВ экзо-типа имеют гликолипидную природу. У микроорганизмов видов Pseudomonas putida (штамм BS3701(pBS1141)(pBS1142)) и Pseudomonas fluorescens (штамм 142NF(pNF142)) впервые показана способность к биосинтезу гомологичных рамнолипидов.

Впервые продемонстрирована возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы.

Выявлено, что консервирующее действие бензоата и глутамата натрия на микроорганизмы родов Pseudomonas и Rhodococcus позволяет сохранить жизнеспособность бактериальных клеток в концентрированной суспензии при хранении.

Научно-практическая значимость Выбранные условия культивирования бактерий-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus на полноценной среде, содержащей кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат и глюкозу, позволяют за короткое время с высокой эффективностью получить основу биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий: биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов. При осуществлении ферментации бактерий в смешанной культуре значительно снижаются энергетические и материальные затраты.

Разработанные режимы культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов применяются для наработки биомассы запатентованного биопрепарата «МикроБак», используемого для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Определены условия хранения получаемой биомассы микроорганизмов, обеспечивающие высокую численность и деградативную активность. Для сохранения наибольшей выживаемости бактерий в концентрированной суспензии в течение двух-четырёх недель оптимальным является использование консервирующих агентов: 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия при поддержании низкой положительной температуры (2-4С). Для получения товарной формы биопрепарата, пригодной для длительного хранения, транспортировки и применения, наиболее подходящим способом обработки биомассы является контактная сушка с перлитовым сорбентом и выбранной защитной средой: 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты. Этот метод позволяет повысить выживаемость микроорганизмов в 1,5-2 раза по сравнению с лиофилизированными образцами. Хранение сухого препарата при отрицательной температуре (-20С) обеспечивает наилучшее сохранение численности и деградирующей активности микроорганизмов.

Авторские права на способ культивирования и хранения защищены патентом РФ 2378090 «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения». Получено решение о выдаче патента РФ «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами».

Апробация работы Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» «Нанобио- и другие перспективные биотехнологии»

(Пущино, 2007 г.);

VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008 г.);

XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008 г.);

III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008 г.);

Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.);

III Общероссийской студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2011» (диплом за лучшую работу);

IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.);

Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?»

(Пущино, 2011 г.).

Публикации Опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций. Выдан патент РФ 2378090. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке №2010121688.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 256 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Литературный обзор содержит анализ научно-технической литературы, посвященной видам образуемых микроорганизмами биологических поверхностно активных веществ, особенностям их строения и закономерностям образования.

Описаны методы культивирования микроорганизмов и их хранения, способы увеличения выживаемости бактерий.

Материалы и методы исследования В качестве объектов изучения были выбраны следующие микроорганизмы:

грамотрицательные Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142), Pseudomonas putida BS3701(pBS1141)(pBS1142), содержащие плазмиды биодеградации моно- и полиароматических углеводородов;

грамположительные Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S26. Данные штаммы являются высокоэффективными нефтедеструкторами и входят в запатентованные ассоциации и биопрепараты для очистки территорий от нефтезагрязнений.

Для наработки биосурфактантов микроорганизмы выращивали на жидкой среде Эванса с различными источниками углерода и энергии. Образование биоПАВ оценивали по поверхностному натяжению, индексу эмульгирования и эмульгирующей активности. Индекс эмульгирования рассчитывали как отношение объёма плотной эмульсии, образуемой при перемешивании изучаемого раствора с гексадеканом, к общему объёму раствора. Эмульгирующую активность выражали как оптическую плотность эмульсии при 540 нм. Содержание гликолипидов в культуральной среде определяли фотоколориметрически фенол-сернокислым методом.

Для выделения и очистки биоПАВ их экстрагировали из бесклеточного супернатанта смесью хлороформ:метанол (3:1 об.). Органическую фракцию собирали и упаривали. Полученный экстракт очищали колоночной хроматографией на силикагеле L 40/100. Элюирование образцов, содержащих биосурфактанты родококков, проводили вначале хлороформом, затем смесью хлороформ:метанол (10:2 об.);

содержащих биосурфактанты псевдомонад – смесью хлороформ:метанол (10:1 об.), затем смесью хлороформ:метанол (10:4 об.). Наличие гликолипидных биосурфактантов обнаруживали тонкослойной хроматографией (ТСХ) с обнаружением -нафтолом с серной кислотой при нагревании.

Масс-спектры выделенных соединений получали на масс-спектрометре с ионной ловушкой LCQ Deca XP («ThermoFinnigan», США). Регистрацию инфракрасных спектров проводили на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек», Санкт-Петербург).

Наработку биомассы для изучения динамики роста микроорганизмов и условий хранения осуществляли путём глубинного периодического культивирования в ферментёре АНКУМ-2М объёмом 10 л на средах, содержащих кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, глюкозу, набор минеральных солей, добавку салицилата натрия или дизельного топлива.

Биомассу микроорганизмов в жидкой форме хранили при 2-4°С с добавлением консервирующих растворов: 20% раствором сахарозы, 0,2% раствором бензоата натрия и 0,2% раствором глутамата. В замороженном виде биомассу хранили при 20°С с предварительным добавлением 20% раствора сахарозы в качестве криопротектора (1:1 по массе). Перед лиофилизацией и контактной сушкой биомассу смешивали с защитными средами различного состава. Контактную сушку проводили с сорбентом (перлитовый песок) при температуре 37С. Хранили сухие образцы при комнатной температуре, при 2-4°С и при -20°С.

Деградативную активность определяли после двух недель культивирования на минимальной минеральной среде с 2% нефти. Суммарное массовое содержание остаточных нефтепродуктов определяли ИК-спектрофотометрическим методом на концентратомере АН-2 по ПНД Ф 14.1:2:4.168-2000.

Основные результаты и их обсуждение Среди методов очистки окружающей среды от загрязнений углеводородами, в том числе нефтью и продуктами её переработки, наиболее перспективным являются методы, основанные на внесения биомассы одного или нескольких активных жизнеспособных микроорганизмов-нефтедеструкторов на место загрязнения.

Эффективность биоремедиации может быть повышена за счёт использования новых биопрепаратов, разработанных с учётом особенностей микробиологической деструкции компонентов нефти. Характерным свойством углеводородокисляющих микроорганизмов является образование биоПАВ, что делает актуальным изучение строения, свойств и закономерностей образования таких соединений. Исследование способов получения биопрепаратов и сохранения численности и деградирующих свойств входящих в них микроорганизмов при хранении позволит выбрать наиболее оптимальные. Это обеспечит экономическую рентабельность производства и использования биопрепаратов. В рамках такого комплексного подхода в данной работе были изучены свойства образуемых микроорганизмами-нефтедеструкторами поверхностно-активных веществ и способы культивирования и хранения этих бактерий.

Способность микроорганизмов к продуцированию биоПАВ Способность к образованию внеклеточных биосурфактантов широко распространена среди микроорганизмов. Однако, несмотря на многочисленные сообщения о новых штаммах-продуцентах поверхностно-активных соединений, до сих пор не выработано единого методологического подхода к направленному поиску и выделения из природы таких микроорганизмов, отсутствуют общепринятые критерии оценки поверхностной активности микробных культур.

Поэтому для выбора наиболее эффективных продуцентов биологических поверхностно-активных веществ необходимо проводить скрининг различных микроорганизмов, отбирая для дальнейшего изучения наиболее эффективные продуценты.

При проведении отбора микроорганизмов, способных эффективно продуцировать ПАВ, обычно оценивают поверхностное натяжение культуральной жидкости (Satpute S.K. et al., 2010). Кроме этого, используют простые и экспрессные методы, основанные на измерении эмульгирования гидрофобного соединения, например, гексадекана: индекс эмульгирования и эмульгирующую активность.

Определение содержания гликолипидных биоПАВ проводят фотоколориметрически по реакциям, типа реакции Молиша. Для изучения продуцентов биосурфактантов в нашей работе использовали все указанные методы.

Известно, что источник углерода может оказывать значительное влияние на образование биоПАВ (Muthusamy K. et al., 2008). Синтез биосурфактантов часто наблюдается у различных микроорганизмов при росте на гидрофобных субстратах:

углеводороды, растительные жиры. С другой стороны, интенсивное образование биосурфактантов наблюдается и при росте микроорганизмов на гидрофильных источниках углерода (глюкоза, глицерин), как, например, у представителей вида P.

aeruginosa (Abdel-Mawgoud A.M. et al., 2010). При этом отмечают, что закономерности образования биоПАВ одними и теми же микроорганизмами на водорастворимых и нерастворимых субстратах могут принципиально различаться. В данной работе проводили сравнение продуцентов биоПАВ, выращивая их на двух различных субстратах: гексадекан, как гидрофобный субстрат, и глюкоза, как гидрофильный.

Из полученных данных видно (табл. 1), что гексадекан стимулирует интенсивное образование биоПАВ. Содержание биосурфактантов в культуральной среде для всех микроорганизмов, достигнутое при использовании этого субстрата достаточно высоко, до 740 мг/л для штамма Rhodococcus sp. S26. Наблюдалось и значительное снижение поверхностного натяжения: до 34-31 мН/м (в контроле мН/м). При культивировании на гексадекане также отмечены наибольшие значения эмульгирующей активности (у штамма Rhodococcus sp. S26) и индексов эмульгирования (у штаммов Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5). Анализ этих характеристик свидетельствуют о том, что родококки более эффективные продуценты биосурфактантов при росте на гидрофобном источнике углерода и энергии, чем псевдомонады. Исходя из совпадения индексов эмульгирования культуральной жидкости и бесклеточного супернатанта, а также высоких значений эмульгирующей активности, можно заключить, что биоПАВ, образуемые микроорганизмами на гексадекане относятся к экзо-типу, то есть выделяются в среду культивирования. Это позволяет проводить экстракцию биосурфактантов из бесклеточного супернатанта, что упрощает процедуру очистки.

При использовании глюкозы в качестве источника углерода и энергии содержание гликолипидов не превышает 50 мг/л, а значения поверхностного натяжения значительно выше, чем при росте на гексадекане. Это свидетельствует о том, что рост изучаемых микроорганизмов на гидрофильных субстратах не сопровождается интенсивным образованием экзо-биоПАВ. Таким образом, для получения биосурфактантов с высоким выходом при культивировании продуцентов оптимально использование водонерастворимых субстратов.

Сравнение значений эмульгирующей активности и индекса эмульгирования при росте псевдомонад на глюкозе позволило сделать вывод об образовании экзо биоПАВ (табл. 2). В то же время, в бесклеточном супернатанте родококков наблюдалась близкая оптическая плотность и отсутствие плотного эмульсионного слоя, а в культуральной жидкости значения индексов эмульгирования высоки, что могло свидетельствовать об образовании родококками биоПАВ, ассоциированных с клеточной стенкой (эндо-тип), при росте на глюкозе. Для проверки этого предположения были определены индексы эмульгирования суспензий целых клеток микроорганизмов, выращенных на гидрофильных субстратах. Клеточные суспензии родококков (Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26) способны эффективно стабилизировать эмульсии гексадекана с водой (табл. 3), а для целых клеток псевдомонад (P. fluorescens 142NF, P. putida BS3701) эмульгирования не наблюдалось. Анализируя полученные данные, можно заключить, что при росте на глюкозе родококки способны синтезировать биосурфактанты, относящиеся к эндо-типу.

Таблица 1 – Поверхностно-активные свойства микроорганизмов при росте на гексадекане.

Эмульгирующая Индекс Содержание Поверхностное активность эмульгирования, Штамм гликолипидов, натяжение, (=540 нм), % мг/л мН/м ед. опт. плотн.

КЖ1) БС2) P. fluorescens 142NF 190±10 34±1 50±5 50±4 0,9±0, P. putida BS3701 250±20 34±1 53±5 53±6 0,6±0, Rhodococcus sp. S67 310±20 33±1 78±6 78±9 0,7±0, Rhodococcus sp. X5 400±30 31±1 75±7 75±6 1,0±0, Rhodococcus sp. S26 740±50 32±1 47±3 47±3 1,5±0, 1) – индекс эмульгирования измерен для культуральной жидкости 2) – индекс эмульгирования измерен для бесклеточного супернатанта Таблица 2 – Поверхностно-активные свойства микроорганизмов при росте на глюкозе.

Эмульгирующая Индекс Содержание Поверхностное активность эмульгирования, Штамм гликолипидов, натяжение, (=540 нм), % мг/л мН/м ед. опт. плотн.

КЖ1) БС2) P. fluorescens 142NF 10±2 54±1 33±4 33±4 1,1±0, P. putida BS3701 19±2 61±1 33±3 33±3 0,5±0, Rhodococcus sp. S67 49±9 53±1 7±2 0 0,2±0, Rhodococcus sp. X5 42±8 56±1 29±4 0 0,2±0, Rhodococcus sp. S26 19±5 49±1 29±3 0 0,2±0, 1) – индекс эмульгирования измерен для культуральной жидкости 2) – индекс эмульгирования измерен для бесклеточного супернатанта Таким образом, все микроорганизмы-нефтедеструкторы, входящие в состав биопрепаратов для биоремедиации, способны синтезировать биоПАВ. Наиболее эффективными продуцентами биосурфактантов экзо-типа являются родококки при росте на гексадекане, а при росте на глюкозе они образуют клеточносвязанные биоПАВ (эндо-тип). Псевдомонады продуцируют только внеклеточные биосурфактанты.

Таблица 3 – Эмульгирующие свойства суспензий клеток, выращенных на агаризованных средах.

Питательная Е24, Штамм среда % среда Е+глюкоза P. fluorescens 142NF среда ЛБ среда Е+глюкоза P. putida BS среда ЛБ Rhodococcus sp. S67 среда Е+глюкоза 35± среда ЛБ 40± Rhodococcus sp. X5 среда Е+глюкоза 38± среда ЛБ 46± Rhodococcus sp. S26 среда Е+глюкоза 46± среда ЛБ 48± Определение особенностей строения биосурфактантов Очистку биоПАВ проводили колоночной хроматографией после их экстракции из бесклеточного супернатанта. Обнаружение гликолипидных компонентов осуществляли методом ТСХ. Основными биосурфактантами, продуцируемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus, являются, соответственно, рамнолипиды и трегалолипиды (Desai J., Banat I., 1997). Наличие в молекулах этих соединений углеводной части позволяет использовать специфические реагенты для обнаружения сахаров при проявлении пластин. После сравнения нескольких систем для элюирования гликолипидов были выбраны обладающие наилучшей разделяющей способностью: система хлороформ:метанол:вода (65:25:4 об.) для рамнолипидов псевдомонад и хлороформ:метанол:вода (65:15:2 об.) для трегалолипидов родококков.

По результатам ТСХ можно предположить, что псевдомонады продуцируют одинаковые рамнолипиды. В образцах биоПАВ, образуемых псевдомонадами, присутствует единственное пятно с Rf 0,32. Известно, что при проведении ТСХ в описанных условиях, гликолипиды псевдомонад разделяются в зависимости от количества содержащихся в молекуле остатков рамнозы. Монорамнолипиды обладают большей подвижностью, известные значения удерживания для них составляют 0,7 (Zhang Y., Miller R.M., 1994;

Robert M. et al., 1989), а для дирамнолипидов – 0,32 (Matsufuji М. et al., 1997), 0,45 (Zhang Y., Miller R.M., 1994).

Сравнивая эти данные с полученными в нашей работе результатами, можно предположить, что микроорганизмы штаммов P. fluorescens 142NF и P. putida BS продуцируют дирамнолипиды. Поскольку известно, что другим распространённым типом биоПАВ, продуцируемым микроорганизмами рода Pseudomonas, являются липопептиды (Desai J., Banat I., 1997), то для проверки наличия этих соединений в экстрактах проявление хроматограмм осуществляли также нингидрином.

Отсутствие характерной фиолетово-розовой окраски свидетельствует об отсутствии липопептидных биосурфактантов.

ТСХ трегалолипидов показала наличие четырёх (штамм Rhodococcus sp. S67) или пяти (штаммы Rhodococcus sp. Х5 и S26) компонентов со значениями Rf: 0,32;

0,46;

0,51 (отсутствует у штамма S67);

0,57;

0,63. Идентификация трегалолипидов, продуцируемых представителями рода Rhodococcus, по величине удерживания затруднена, поскольку объём опубликованных данных недостаточен для полноценного сравнения. При проведении ТСХ сукциноилтрегалолипидов, продуцируемых бактериями штамма Rhodococcus sp. MS11, было получено единственное пятно с Rf 0,41 (Rapp P., Gabriel-Jurgens L.H.E., 2003). Точно такого значения удерживания у выделенных в нашей работе соединений нет, наиболее близки к нему пятна с Rf 0,32 и 0,46. Результаты других работ о величине удерживания трегалолипидов в выбранной нами системе хлороформ:метанол:вода (65:15:2) отсутствуют. Следует отметить, что разделение биоПАВ родококков на четыре-пять компонентов при проведении ТСХ ранее не было описано. На основании этого можно предположить наличие в полученных образцах соединений, отличных от ранее изученных трегалолипидов.

Полученные образцы биоПАВ исследовали с помощью масс-спектрометрии электронного распыления в режиме положительной ионизации. Для гликолипидов микроорганизмов P. fluorescens 142NF, P. putida BS3701 ряд сигналов наблюдается в диапазоне 700-900 Да (рис. 1). Одним из наиболее интенсивных является пик, который соответствует псевдомолекулярному иону [M+H+] массой 803 Да.

Известно, что массой 802 Да обладает рамнолипид В, похожий по строению на распространенный дирамнозил--гидроксидеканоил--гидроксидеканоат, но содержащий ещё один остаток жирной кислоты – деценовой, соединенный с углеводом сложноэфирной связью (рис. 3а) (Abdel-Mawgoud A.M. et al., 2010).

Разница в массах для каждой пары соседних пиков составляет 14 Да, что соответствует массе фрагмента (–СН2–). Для псевдомонад характерно образование рамнолипидов, содержащих гомологичные жирные кислоты. Анализируя полученные данные, можно предположить, что микроорганизмы штаммов P. fluorescens 142NF и P. putida BS370 образуют смесь рамнолипидов, гомологичных рамнолипиду типа В.

В масс-спектре биоПАВ, продуцируемых Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26, присутствуют одинаковые пики: 866,4;

871,5;

877,2;

894,4;

899,9 (рис. 2). В ряде исследований при изучении биоПАВ родококков основные сигналы в масс-спектрах электронного спрея были представлены + псевдомолекулярными ионами [М+Na ] массами 871,5 и 899,6 (Rapp P., Gabriel Jurgens L.H.E., 2003;

Tuleva B. et al., 2008). Было установлено, что им соответствуют гомологичные сукциноилтрегалолипиды: диоктаноил-деканоил (848 Да) и октаноил дидеканоил (876 Да), различающиеся на 28 Да, то есть на удвоенный метиленовый фрагмент (–СН2–)2 (рис. 3б). Сравнение этих результатов с полученными в нашей работе, позволяет заключить, что изучаемые бактерии Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26 продуцируют трегалолипиды аналогичного строения.

Остальные три сигнала не удалось сопоставить с определёнными структурами.

Можно отметить, что разница между двумя пиками 866,4 и 894,4 также равна 24 Да, что может свидетельствовать о наличии гомологичных соединений.

Рисунок 1 – Масс-спектр гликолипидных биоПАВ, продуцируемых штаммом P. fluorescens 142NF.

Рисунок 2 – Масс-спектр гликолипидных биоПАВ, продуцируемых штаммом Rhodococcus sp. X5.

O H CH2 C O O CH O OH CH3 O CH CH2 C C7H H H OH C7H H H H OH O O OH CH H H H H O OH C7H C CH CH O а) O CH 2 OH CH 3 (CH 2)n1 C O H H H H O O CH 3 (CH 2)n2 C O O H HOOC H 4 C2 C O CH 2OH O H H H OH H O HO O H C H 19 C O б) Рисунок 3 – Предполагаемая структура гликолипидных биоПАВ.

а) Рамнолипид B (Abdel-Mawgoud A.M. et al., 2010);

б) Сукциноил-диоктаноил-деканоил трегалоза: n1=n2=6;

сукциноил-октаноил-дидеканоил трегалоза: n1, n2 = 6, (Rapp P., Gabriel-Jurgens L.H.E., 2003;

Tuleva B. et al., 2008).

В биоПАВ, выделенных из псевдомонад и из родококков, методом ИК спектроскопии показано наличие функциональных групп, характерных для предполагаемых структур гликолипидов. На полученных спектрах можно выделить широкую полосу поглощения гидроксильной группы при 3450 см-1. Полосы валентных колебаний карбонильных групп сложных эфиров и карбоновых кислот наблюдаются в областях 1745 см-1 и 1630 см-1, соответственно. Пик 1047 см- относится к ассиметричным валентным колебаниям связей C–O–C. В спектре наблюдаются пики валентных колебаний алифатических С–Н связей в области и 2852 см-1, поглощение деформационных колебаний указанных связей присутствует при 1380 см-1.

Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов Культивирование микроорганизма P. fluorescens 142NF проводили с добавлением салицилата натрия, поскольку известно, что салицилат является индуктором ферментов деградации полиароматических углеводородов, входящих в состав тяжёлых фракций нефти (Van Hamme J.D. et al., 2003). Следовательно, выращенные в таких условиях микроорганизмы будут обладать способностью к наиболее полной деградации компонентов нефти. В другом случае использовали добавку дизельного топлива (ДТ), как одного из наиболее распространённых нефтепродуктов. Микроорганизмы, выращенные в присутствии ДТ, предположительно, должны быть адаптированы к росту в условиях нефтезагрязнения.

Динамика роста псевдомонад в первые 10 часов практически одинакова для первого и второго культивирования (рис. 4). Однако после добавления в культуральную среду салицилата (на 10 часу) скорость роста возросла, что сопровождалось быстрым увеличением численности микроорганизмов. После же добавления ДТ в другом процессе, скорость роста снизилась, а к 16 часу наблюдалось снижение численности бактерий, так что рост пришлось поддерживать путём дополнительного внесения легко окисляемого субстрата – глюкозы. Такое воздействие ДТ объясняется наличием в нём примесей, оказывающих токсическое воздействие на микроорганизмы.

Таким образом, наилучшие результаты были получены при выращивании псевдомонад с салицилатом. За счёт индукции ферментных систем удельная скорость роста после внесения добавки возросла более чем в два раза, в результате чего культивирование продолжалось всего 14 ч.

Выращивание родококка Rhodococcus sp. S67 проводили в условиях, сходных с условиями культивирования псевдомонад. Лаг-фаза составила 8 ч. (рис. 5), что в раза больше, чем для псевдомонад. Общее время процесса составило 24 ч.

1,00E+10 внесение микроорганизмов, КОЕ/мл внесение глюкозы салицилата 1,00E+ Численность 1,00E+ внесение ДТ 1,00E+ 1,00E+ 0 5 10 15 20 Время культивирования, часы с салицилатом с дизельным топливом Рисунок 4 – Динамика численности микроорганизмов P. fluorescens 142NF при ферментации в монокультуре с различными добавками.

Сравнение динамики роста двух данных микроорганизмов в одинаковых условиях позволило оценить возможность осуществления их совместного культивирования. Было показано, что микроорганизмы P. fluorescens 142NF и Rhodococcus sp. S67 способны к эффективному росту монокультур, следовательно, эти же условия можно использовать для выращивания смешанной культуры. Кроме этого, по данным различных исследований известно, что микроорганизмы родов Pseudomonas и Rhodococcus не только не ингибируют рост друг друга, но даже способны повышать эффективность окисления нефти при совместном росте (Van Hamme J.D. et al., 2001).

1,00E+ микроорганизмов, КОЕ/мл 1,00E+ Численность 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 0 5 10 15 20 Время культивирования, часы Рисунок 5 – Динамика численности микроорганизмов Rhodococcus sp. S67 при ферментации в монокультуре.

1,00E+ Численность микроорганизмов, Засев штамма P. fluorescens 142NF 1,00E+ КОЕ/мл 1,00E+ 1,00E+ 0 5 10 15 20 Время культивирования, часы Rhodococcus sp. S67 P. fluorescens 142NF Рисунок 6 – Динамика численности микроорганизмов Rhodococcus sp. S67 и P. fluorescens 142NF при их совместной ферментации.

Поскольку скорость роста псевдомонад выше, чем родококков, посевной материал быстрорастущей культуры P. fluorescens 142NF вносили с задержкой, составившей 12 часов. До инокуляции культуры псевдомонад динамика роста родококков аналогична их росту в монокультуре (рис. 6). После внесения культуры псевдомонад сразу произошло значительное снижение скорости роста родококков.

Скорость роста псевдомонад при росте в смешанной культуре так же ниже, чем в монокультуре, но при этом отсутствует лаг-фаза. Достижение стационарной фазы роста произошло одновременно для обоих микроорганизмов при близкой численности, что оптимально для использования в биопрепарате.

Совместное культивирование микроорганизмов используют для снижения себестоимости готового продукта. В ряде работ было показано успешное применение смешанных культур для приготовления бактериальных препаратов, что позволяло решить проблему адаптации культур в микробной ассоциации, а также реализовать экономические преимущества этого метода (Куюкина М.С. и др., патент 2180276 РФ;

Мурыгина В.П. и др., патент 2174496 РФ).

По основным показателям (табл. 4) совместная ферментация почти не уступает раздельным, а её преимущества очевидны: число большинства необходимых технологических операций сокращается почти в два раза. Таким образом, для получения биопрепаратов на основе исследуемых штаммов нефтедеструкторов целесообразно применять совместное культивирование.

Таблица 4 – Сравнение основных характеристик микроорганизмов P. fluorescens 142NF и Rhodococcus sp. S67 при ферментации в монокультуре и в смешанной культуре.

Удельная Общее время Выход Численность скорость Ферментация процесса, биомассы, микроорганизмов, роста, 1) ч г КОЕ/мл ч- P. fluorescens 142NF 14 1,2 (6-12) 160 (4,20,6) (с салицилатом) P. fluorescens 142NF (1,10,1) 23 0,5 (6-20) (с ДТ) (1,30,3) Rhodococcus sp. S67 24 0,5 (12-22) P.2) - 0,5 (12-22) P. - (3,40,4) В смешанной 26 R.3) - 0,3 (6-22) R. - (3,80,4) культуре 1) – в скобках указаны часы – границы временного интервала, для которого рассчитана скорость 2) – P. fluorescens 142NF 3) – Rhodococcus sp. S Хранение микроорганизмов Хранение биомассы микроорганизмов в жидкой форме осуществляли при температуре 2-4°С с различными консервантами и без внесения добавок для контроля. В результате изучения динамики численности бактерий было показано, что 0,2% раствор бензоата натрия обладает наилучшим консервирующим эффектом (рис. 7, 8), проявляющемся в сохранении жизнеспособных организмов. Через два месяца хранения в варианте с использованием бензоата была показана максимальная выживаемость среди всех исследованных вариантов как для псевдомонад, так и для родококков: 0,17% и 3,0%, соответственно. Известно, что механизм действия бензоата как консерванта основан на ингибировании фосфофруктокиназы при проникновении внутрь микробной клетки (Krebs H.A. et al., 1983). Очевидно, что такое замедление жизнедеятельности клетки способствует её наилучшему сохранению. Такие же значения выживаемости были показаны в варианте с глутаматом: 0,15% и 2,8%.

Рисунок 7 – Сравнение выживаемости микроорганизмов штамма P. fluorescens 142NF при хранении в жидкой форме: 1 – контроль (нативная биомасса);

2 – с 0,2% бензоатом натрия;

3 – с 0,2% глутаматом натрия;

4 – с 20% сахарозой.

Рисунок 8 – Сравнение выживаемости микроорганизмов штамма Rhodococcus sp. S67 при хранении: 1 – контроль (нативная биомасса);

2 – с 0,2% бензоатом натрия;

3 – с 0,2% глутаматом натрия;

4 – с 20% сахарозой.

Добавление сахарозы вызвало значительное снижение численности микроорганизмов обоих изученных штаммов микроорганизмов по сравнению с контролем. Консервирующее действие сахара основано на обезвоживании клеток за счёт повышения осмотического давления среды. Скорость процессов метаболизма в микроорганизмах при этом снижается. Но, как видно из полученных данных, такой способ консервирования приводит не просто к остановке жизнедеятельности, но и к гибели клеток, поэтому его использование нерационально.

В настоящей работе установлено, что микроорганизмы рода Rhodococcus хранятся лучше Pseudomonas. Через два месяца хранения выживаемость родококков в контроле в 10 раз превышала выживаемость псевдомонад. Это соответствует литературным данным, так как известно, что грамположительные бактерии, к которым относятся родококки, лучше переносят воздействие различных повреждающих факторов, чем грамотрицательные (Miyamoto-Shinohara Y. et al., 2001).

Таким образом, показано, что в жидкой форме хранение биомассы рационально осуществлять не более двух недель для псевдомонад и одного месяца для родококков. При этом штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов P. fluorescens 142NF и Rhodococcus sp. S67 лучше хранить с добавлением 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия.

К способам подготовки микроорганизмов для длительного хранения относятся: заморозка, лиофилизация, высушивание на носителе (контактная сушка).

Концентрированную суспензию микроорганизмов подвергали заморозке при -20° с, предварительным добавлением криопротектора – 20% раствор сахарозы. Через месяца хранения выживаемость бактерий P. fluorescens 142NF составила 3%, а родококков – 39%, что значительно превышает результаты, полученные при хранении жидкой биомассы. Однако замораживание не всегда может удобно, а именно при наработке больших объёмов биопрепарата.

Лиофилизацию микроорганизмов проводили с использованием различных вариантов защитных сред: 20% сахароза;

10% сахароза и 6% тиомочевина;

8% сахароза, 4% тиомочевина и 4% полиглюкин. Эффективность защитных растворов оценивали по проценту жизнеспособных клеток в сухом материале сразу после высушивания. Максимальная выживаемость после лиофилизации биомассы микроорганизмов штамма P. fluorescens 142NF, достигнута при использовании раствора сахарозы (рис. 9). Для бактерй штамма Rhodococcus sp. S67 наиболее сильное защитное воздействие отмечено в варианте «сахароза + тиомочевина + полиглюкин». Полученные образцы хранили при комнатной температуре.

Численность жизнеспособных микроорганизмов в сухом материале проверяли через 1, 2 и 6 месяцев хранения. За шесть месяцев хранения количество микроорганизмов в лучших вариантах снизилось примерно на три порядка как для псевдомонад, так и для родококков, составив 1,2107 и 1,7109 КОЕ/мг, соответственно.

1 2 3 4 Выживаемость, % 60 40 20 10 P. fluorescens 142NF Rhodococcus sp. S Штамм Рисунок 9 – Сравнение выживаемости микроорганизмов после лиофилизации и после контактной сушки: 1 – лиофилизация с сахарозой;

2 – лиофилизация с сахарозой и мочевиной;

3 – лиофилизация с сахарозой, мочевиной и полиглюкином;

4 – контактная сушка.

В качестве другого способа длительного хранения микроорганизмов применяли контактную сушку на носителе (перлитовый песок). Для этого биомассу, смешанную с защитной средой (10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты), а затем с перлитовым песком, сушили до постоянной массы при 37С. Полученные результаты (рис. 9) говорят о том, что такой способ подготовки биомассы к хранению более выгоден, чем сублимационное высушивание, так как выживаемость микроорганизмов при контактной сушке выше, чем при лиофильной: в 2 раза для псевдомонад и в 1,5 раза для родококков.

При хранении образцов при различных температурах, показано, что максимальная численность жизнеспособных микроорганизмов наблюдалась в образцах, содержащихся при -20С (рис.10-11). Несмотря на резкое падение выживаемости в первый месяц, далее она стабилизировалась, и к концу шестого месяца составляла 24% для псевдомонад и 20% для родококков.

Выживаемость, % 40 24 0 1 2 3 4 5 6 Время хранения, месяцы комнатная 2-4С –20С Рисунок 10 – Динамика выживаемости микроорганизмов P. fluorescens 142NF при хранении после контактной сушки при разных температурах.

Выживаемость, % 22 0 1 2 3 4 5 6 Время хранения, месяцы комнатная 2-4С –20С Рисунок 11 – Динамика выживаемости микроорганизмов Rhodococcus sp. S67 при хранении после контактной сушки при разных температурах.

Для количественной оценки эффективности действия препаратов после хранения проводили лабораторный модельный эксперимент по определению деградирующей способности микроорганизмов. Как видно полученных данных (рис.

12), для P. fluorescens 142NF наблюдается снижение степени деструкции нефти при использовании сухого биопрепарата. Однако общий уровень убыли нефти, составивший 14%, говорит о сохранении достаточно высокой нефтеокислительной активности. Степени деградации нефти для сухого биопрепарата и свежей культуры штамма Rhodococcus sp. S67 практически совпадают, что свидетельствует о высокой эффективности выбранного способа хранения в отношении данного микроорганизма.

Выживаемость, % P. fluorescens 142NF Rhodococcus sp. S Нативная биомасса Сухой препарат Рисунок 12 – Деградация нефти исследуемыми бактериями при внесении в нативной биомассы и после двух недель хранения в виде сухого препарата.

Для хранения микроорганизмов-нефтедетрукторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в течение шести месяцев предпочтительней использовать контактную сушку. Наибольшая выживаемость клеток достигается при хранении сухих препаратов в условиях низких температур (-20°С). При этом микроорганизмы сохраняют свою деградативную активность в отношении углеводородов нефти.

Выводы:

1. Микроорганизмы-нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящие в состав биопрепаратов для биоремедиации «МикроБак» и «ВиО», являются эффективными продуцентами поверхностно-активных веществ при росте как на гидрофильных (глюкоза), так и на гидрофобных (гексадекан) субстратах. Впервые показано, что при росте на глюкозе родококки образуют эндо-биоПАВ, связанные с клеточной стенкой бактерий.

2. Подобраны условия для продуцирования, выделения и очистки биоПАВ, синтезируемых изучаемыми микроорганизмами-нефтедеструкторами, что позволяет получать природные биосурфактанты для дальнейшего практического использования.

3. Выявлены особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus.

Показано образование гомологичных дирамнолипидов микроорганизмами вида P.

putida (штамм BS3701) и вида P. fluorescens (штамм 142NF). Исследованные штаммы родококков: Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp.

S26, образуют соединения гликолипидной природы, два из которых отнесены к сукциноилтрегалолипидам.

4. Впервые показана возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы. Индукция метаболизма псевдомонад салицилатом способствует увеличению урожая микроорганизмов. Выбранные условия культивирования были использованы при получении запатентованного биопрепарата «МикроБак» для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

5. Определён наилучший способ подготовки биомассы штаммов нефтедеструкторов к длительному хранению: контактная сушка с защитной средой, содержащей сахарозу, тиомочевину, полиглюкин и аскорбиновую кислоту, и c сорбентом перлитовым песком. Разработанный способ сушки может быть использован для получения сухой формы биопрепарата с высокой выживаемостью и деградативной активностью входящих в его состав микроорганизмов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Петриков К.В., Власова Е.П., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Якшина Т.В., Нечаева И.А., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Самойленко В.А., Филонов А.Е.

Сохранение жизнеспособности и деградативной активности микроорганизмов нефтедеструкторов при различных способах хранения биомассы // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. – 2008. – Вып. 2.

– С. 226-237.

2. Филонов А.Е., Петриков К.В., Якшина Т.В., Пунтус И.Ф., Власова Е.П., Нечаева И.А., Самойленко В.А. Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus // Биотехнология. – 2008. – №6. – С. 80-85.

3. Власова Е.П., Петриков К.В., Пунтус И.Ф., Понаморева О.Н., Алферов В.А.

Среды и условия культивирования Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) для получения биомассы с максимальной активностью фермента салицилатгидроксилазы // Известия Тульского государственного университета.

Естественные науки. – 2008. – Вып. 1. – С. 197-203.

4. Петриков К.В., Власова Е.П, Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Понаморёва О.Н., Алфёров В.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е. Получение сухой формы биопрепарата для очистки от нефтяных загрязнений и изучение его свойств при долговременном хранении // Известия Тульского государственного университета.

Естественные науки. – 2010. – Вып. 1. – С. 186-195.

5. Петриков К.В., Власова Е.П., Нечаева И.А., Понаморева О.Н., Филонов А.Е., Алферов В.А., Боронин А.М. Получение биомассы и сохранение активности микроорганизмов-нефтедеструкторов при раздельном и совместном периодическом культивировании // Нанобио и другие перспективные биотехнологии: Материалы IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес». Пущино, 15-18 октября 2007. С.126-129.

6. Петриков К.В., Якшина Т.В., Власова Е.П., Пунтус И.Ф., Нечаева И.А., Самойленко В.А., Филонов А.Е. Изучение выживаемости микроорганизмов деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Материалы VI Междунар. науч. конф. В 2 т. Т.2. Минск, 2-6 июня / Под ред. Э.И. Коломиец. 2008. Минск: Изд. И.П. Логвинов. С. 223-225.

7. I. Puntus, A. Filonov, L. Akhmetov, E. Vlasova, K. Petrikov, I. Nechaeva, M. Vainstein, A. Boronin. Cultivation and storage conditions of oil-degrading strains of genera Pseudomonas and Rhodococcus // XII International congress of bacteriology and applied microbiology / Istanbul, 5-9 august 2008. P. 359-360.

8. Филонов А.Е., Нечаева И.А, Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Власова Е.П, Петриков К.В., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Ахметов Л.И. // Биоремедиация нефтеразливов в условиях холодного климата: разработка биопрепаратов и их применение. Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал: Материалы III Междунар. конф. Пермь – Н. Новгород – Пермь, 28 сентября–5 октября 2008 / Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. 2008. С. 105-106.

9. Петриков К.В., Филонов А.Е., Сурин А.К., Понаморёва О.Н. Гликолипидные биосурфактанты микрооорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus // Экотоксикология-2010: Тезисы докладов всероссийской конференции. Тула, 18-19 октября 2010 / Тула: Изд-во ТулГУ. С. 27.

10. Делеган Я.А., Петриков К.В., Кучумов П.В., Ростовцев Г.Р., Барабанов А.Ю.

Оценка способности микроорганизмов-нефтедеструкторов продуцировать биосурфактанты в зависимости от условий культивирования методами хроматографии и фотоколориметрии // Экотоксикология-2010: Тезисы докладов всероссийской конференции, Тула, 18-19 октября 2010 / Тула: Изд-во ТулГУ.

С. 35.

11. Петриков Образование гликолипидных биосурфактантов К.В.

микроорганизмами-нефтедеструкторами // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы IV международного конгресса. Москва, 21- марта 2011. С. 53.

12. Филонов А.Е., Овчинникова А.А., Ветрова А.А., Нечаева И.А., Петриков К.В., Власова Е.П., Росс Д.В., Ахметов Л.И., Пунтус И.Ф., Забелин В.А., Боронин А.М.

Микроорганизмы и биопрепараты для очистки окружающей среды от нефтяных загрязнений // Окружающая среда и человек: друзья или враги? Материалы международной конференции, сборник статей. Пущино, 22-24 июня 2011. С. 189-192.

Патенты 13. Патент 2378060 РФ. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения / Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самойленко В.А., Шкидченко А.Н., Нечаева И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Якшина Т.В., Боронин А.М., Петриков К.В. Опубл. 10.01.2009. Бюл. №1.

14. Заявка № 2010121688 на патент РФ Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами / Петриков К.В., Овчинникова А.А., Ветрова А.А., Понаморева О.Н., Самойленко В.А, Якшина Т.В., Боронин А.М. Заялв. 27.05.2010. Получено положительное решение о выдаче патента.