Использование биолюминесцентных систем для изучения закономерностей детоксикации растворов модельных поллютантов гуминовыми веществами
На правах рукописи
Тарасова Анна Сергеевна
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ДЕТОКСИКАЦИИ
РАСТВОРОВ МОДЕЛЬНЫХ ПОЛЛЮТАНТОВ
ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ
03.01.02 – Биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск – 2012
Работа выполнена на кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск.
Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Кудряшева Надежда Степановна
Официальные оппоненты: Новиков Кирилл Николаевич доктор биологических наук.
Московский государственный университет им.
М.В.Ломоносова, Биологический факультет, лаборатория физико-химии биомембран, ведущий научный сотрудник.
Тихомиров Александр Аполлинарьевич доктор биологических наук, профессор.
ФГБУН Институт биофизики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория управления биосинтезом фототрофов, заведующий лабораторией.
Ведущая организация: ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов, Россия.
Защита состоится «25» декабря 2012 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д. 003.007.01. при ФГБУН Институте биофизики Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 660036, г.Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 50, актовый зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН по адресу:
660036, г. Красноярск, ул. Академгородок, 50, стр. 50.
Автореферат разослан «_» ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Франк Л. А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В связи с ростом антропогенной нагрузки на окружающую среду, в настоящее время актуальным является поиск эффективных методов ремедиации природных вод. При этом осознается необходимость изучения механизмов нейтрализации токсичных соединений в природных условиях и использования выявленных закономерностей в ремедиационных мероприятиях.
В связи с этим, актуальными являются исследования токсичности водных растворов поллютантов в присутствии гуминовых веществ – продуктов естественной трансформации органической массы в почве и донных отложениях. В процесс образования гуминовых веществ (гумификацию) вовлекается около 20 Гт углерода в год;
это второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в окружающей среде. Известно, что гуминовые вещества выполняют в природных условиях роль детоксицирующих агентов [1].
Способность гуминовых веществ снижать токсичность растворов является предметом интереса для многих исследователей [1, 2]. Известно, что карбоксильные, хиноидные, фенольные, SH- и другие электронно-донорные группы гуминовых веществ способны связывать, и, следовательно, уменьшать содержание ионов металлов в водных экосистемах. Фенольные, SH- и другие группы макромолекул гуминовых веществ, обладающие восстановительной активностью, снижают токсичность растворов окислителей. Гидрофобные фрагменты гуминовых веществ ответственны за связывание амфифильных молекул поллютантов. Таким образом, в настоящее время предполагается, что детоксицирующая способность гуминовых веществ является следствием гидрофобного связывания, комплексообразовательных и окислительно восстановительных процессов, которые приводят к уменьшению концентрации свободных токсичных соединений в водных растворах. Вместе с тем, термин «токсичность» является не только химическим, но и биологическим.
Токсичность среды определяется реакцией организмов на неблагоприятное воздействие токсичных веществ. В настоящее время именно реакция организмов на воздействие токсичных соединений, а также изменение токсичности в присутствии гуминовых веществ представляют наибольший интерес.
Биолюминесцентные биотесты, основанные на светящихся бактериях, являются удобными системами для мониторинга состояния среды при оценке эффективности детоксикации сточных и природных вод. Эти биотесты характеризуются надежностью, высокой скоростью анализа, чувствительностью, возможностью приборной регистрации и количественной оценки токсичности. Кроме того, возможность использования биолюминесцентных систем различной сложности (биолюминесцентные бактерии и выделенные ферменты), позволяет сравнивать эффекты на клеточном и биохимическом уровнях.
Самыми распространенными загрязнителями окружающей среды являются соли металлов и фенольные соединения, а также продукты окисления фенолов – хиноны. Являясь водорастворимыми отходами различных производств, эти соединения проникают как в природные водоемы, так и в гумусовые горизонты почв.
Цель работы – выявление с помощью биолюминесцентных тестовых систем закономерностей детоксикации гуминовыми веществами водных растворов модельных поллютантов.
В качестве модельных поллютантов использованы неорганические и органические соединения – соли металлов, редокс-пара 1,4-бензохинон – 1,4 гидрохинон.
Постановка задач работы продиктована как прикладным, так и фундаментальным аспектами, а именно, необходимостью поиска условий наиболее эффективной детоксикации растворов гуминовыми веществами и выявлением механизмов этих процессов.
В работе поставлены следующие задачи:
1. Оценка изменения общей и окислительной токсичности растворов модельных поллютантов (Pb(NO3)2, СоСl2, CuSO4, Eu(NO3)3, СrСl3, К3[Fe(СN)6] и пары 1,4-бензохинон – гидрохинон) при воздействии гуминовых веществ.
Расчет коэффициентов детоксикации производили с помощью двух люминесцентных тестовых систем – системы сопряженных ферментативных реакций и лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum.
2. Определение условий наиболее эффективной детоксикации растворов модельных поллютантов путем варьирования концентрации гуминовых веществ и времени предварительного инкубирования модельных поллютантов с гуматами.
3. Доказательство активности биотестовой системы в процессе детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами на основе:
а) изменения скоростей НАДН-зависимых реакций в присутствии гуминовых веществ в растворах модельных токсикантов на примере К3[Fe(СN)6], CuSO4 и СоСl2.
б) изменений ультраструктуры бактериальных клеток под действием гуминовых веществ в растворах модельных неорганических токсикантов на примере CrCl3.
Положения, выносимые на защиту.
1. В процессах детоксикации растворов гуминовыми веществами, наряду с химическими и физико-химическими процессами (комплексообразование, гидрофобное связывание, редокс-процессы), определяющимися полифункциональностью макромолекул гуматов и уменьшающими содержание токсикантов в растворе, важную роль играют процессы с участием биотестовой системы, такие как:
а) увеличение скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе;
б) стабилизация слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на неблагоприятное воздействие токсикантов.
2. Гуминовые вещества способны как снижать токсичность растворов за счет перечисленных выше эффектов, так и увеличивать ее за счет увеличения скоростей автоокисления НАДН в растворе. Уменьшению токсичности способствует использование низких концентраций гуминовых веществ и предварительное инкубирование токсикантов с гуматами.
3. Биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.
Научная новизна. На основе анализа скоростей НАДН-зависимых реакций в растворах модельных неорганических окислителей CuSO4 и K3[Fe(CN)6], показано, что в процессе детоксикации гуминовые вещества ускоряют реакции с участием эндогенного окислителя (ФМН) и не влияют на скорости реакций с участием экзогенных неорганических окислителей, тем самым увеличивая конкурентоспособность эндогенных процессов. Продемонстрирована стабилизация гуминовыми веществами слизистого слоя на внешней поверхности клеток в растворе CrCl3, используемого в качестве модельного поллютанта, что связано с активизацией гуминовыми веществами защитной реакции клеток на неблагоприятное воздействие. Таким образом, продемонстрировано, что детоксикация является сложным процессом, включающим не только «внешние» по отношению к тестовому организму физико-химические процессы (связывание и окисление поллютантов в водном растворе), но и «внутренние» процессы.
Показано, что гуминовые вещества способны не только снижать, но и увеличивать токсичность растворов, что вероятно связано со способностью гуминовых веществ увеличивать скорость автоокисления НАДН и диффузионными затруднениями в растворах полимерных молекул – гуминовых веществ.
На примере гуминовых веществ экспериментально продемонстрированы способы оценки изменений общей и окислительной токсичности с помощью биолюминесцентных тестовых систем.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки биолюминесцентных методик оценки эффективности детоксикации неорганических и органических поллютантов гуминовыми веществами – детоксикантами природного происхождения.
Результаты работы способствуют пониманию механизмов природных процессов, нейтрализующих антропогенное воздействие на водные экосистемы, и определяют возможность разработки новых ремедиационных технологий.
Подобраны условия для эффективной детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами в водных экосистемах. Использование бактериального биотеста показывает, что для наилучшего детоксицирующего действия растворов солей металлов необходимо применять гуминовые вещества следующих концентраций: 10-5 – 2·10-2 г/л. Продемонстрирована необходимость предварительного инкубирования растворов с гуминовыми веществами в течение 10 и более минут.
Показано, что биолюминесцентная система сопряженных ферментативных реакций является удобным инструментом оценки изменений как общей, так и окислительной токсичности растворов при использовании гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов.
Апробация работы. Основные положения работы представлены на российских и международных конференциях: Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере»
(Санкт-Петербург, 2010);
Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010);
13-ой Международной конференции по химии и окружающей среде (Цюрих, Швейцария, 2011);
VI-ом Съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011);
17-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции» (Гуэлф, Канада, 2012);
16-ом Съезде международного гуминового общества (Ханджоу, Китай, 2012);
3-ем Международном симпозиуме по Химии окружающей среды (Скиатос, Греция, 2012).
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ № 2.2.2.2/5309, гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, контракт № 02.740.11.0766;
гранта РФФИ 10-05-01059-а;
программы РАН «Молекулярная и клеточная биология»;
мега-проекта «Биотехнологии новых биоматериалов» по пост.
Правительства РФ № 220 от 9 апреля 2010 (договор № №11.G34.31.0013).
Работа удостоена государственной премии Красноярского края в 2010 году;
стипендии Президента Российской Федерации на 2011/2012 учебный год.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах ВАК и 24 тезиса конференций.
Личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных результатов, анализе литературных данных.
Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Федоровой Е.С., Кисланом С.Л., Могильной О.А., Стомом Д.И. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, проиллюстрирована таблицами, 24 рисунками и приложением. Библиография включает источника.
Обозначения:
НАД+ – никотинамидденинуклеотид окисленный НАДН – никотинамидденинуклеотид восстановленный ФМН – флавинмононуклеотид ФМН·Н2 – флавинмононуклеотид восстановленный – тетрадеканаль RCHO RCHOOH – тетрадекакарбоновая кислота – интенсивность биолюминесценции I К – коэффициент детоксикации, рассчитанный по изменению общей токсичности раствора КOxT – коэффициент детоксикации, рассчитанный по изменению окислительной токсичности раствора Е – окислительно-восстановительный потенциал СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В первой главе диссертации рассмотрены свойства и основные источники экологически опасных и наиболее распространенных поллютантов – солей металлов, хинонов и фенолов. Описаны наиболее распространенные методы детоксикации растворов поллютантов. Показаны преимущества использования детоксикантов природного происхождения – гуминовых веществ. Приведены две основные концепции строения гуминовых веществ, описаны их свойства.
Показано, что механизм детоксицирующего действия гуминовых веществ требует дальнейшего внимания и новых подходов.
Рассмотрены наиболее распространенные биотесты, строение и принципы функционирования бактериальных биолюминесцентных систем. Описаны возможные механизмы воздействия поллютантов на биолюминесценцию.
Показаны преимущества использования биолюминесцентных биотестов, основанных на люминесцентных бактериях, для мониторинга состояния водной среды и оценки эффективности детоксикации сточных и природных вод.
Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. В работе использовали три биолюминесцентные системы: (1) Комплект Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ), который включает лиофилизированные препараты люциферазы Photobacterium leiognathi (0,5 мг/мл) и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазы из Vibrio fischeri (0, ед. активности), изготовленные в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института Биофизики СО РАН (Красноярск);
(2) биолюминесцентный «Микробиосенсор–677Ф», основанный на лиофильно высушенных люминесцентных бактериях Photobacterium phosphoreum, производимый в Институте Биофизики СО РАН (Красноярск), (3) интактные бактерии – клеточная суспензия культуры бактерий Photobacterum phosphoreum 1883 IBSO из коллекции Института биофизики СО РАН [3].
В качестве модельных поллютантов использовался ряд солей металлов CuSO4, Pb(NO3)2, K3[Fe(CN)6], CoCl2, CrCl3, Eu(NO3)3 марки «ч» (Химреактив, Россия), a также 1,4-гидрохинон и 1,4-бензохинон (Aldrich, США).
В качестве источника гуминовых веществ использовали препарат Гумат- (ООО «Гумат», Иркутск, Россия). Препарат получен механохимической реакцией бурого окисленного угля (Черемховское месторождение, Россия) со щелочью (КОН, NaOH) [4]. Характеристики препарата: гуминовые кислоты 85%, растворимый калий (K2О) – 9%, Fe – 1%, вода – 5%, pH 8-9 в 1% водном растворе.
Регистрировали максимальную интенсивность свечения ферментативной и бактериальной систем контрольных (без токсичных соединений – (Io)) и опытных (I) растворов. Отношение Irel = I / Io использовали для характеристики воздействия солей металлов, органических поллютантов и гуминовых веществ на биолюминесценцию. Снижение интенсивности биолюминесценции (I / Io) определяет общую токсичность раствора. Определяли эффективные концентрации модельных поллютантов, ингибирующие биолюминесценцию до 50%-го остаточного свечения, EС50.
Окислительную токсичность растворов характеризовали величиной задержки свечения, Т, которая соответствует перегибу S-образной кинетической кривой. Эту величину определяли по методу второй производной.
Рис. 1 схематически демонстрирует особенности биолюминесцентной кинетики ферментативной системы в растворах окислителей [5].
Рис. 1. Кинетика биолюминесценции ферментативной системы в отсутствии (1) и присутствии (2) окислителя [5].
Изменение общей токсичности растворов под действием гуминовых веществ оценивали с помощью коэффициентов детоксикации К:
K = Irel(Т+ГВ) /IrelТ, (1) rel rel где I (Т+ГВ) и I Т – относительная интенсивность биолюминесценции в растворе модельного поллютанта (соли металла, 1,4-бензохинона или 1,4-гидрохинона) в присутствии и отсутствии гуминовых веществ соответственно.
Изменение окислительной токсичности растворов под действием гуминовых веществ оценивали с помощью коэффициентов детоксикации КOxT:
КOxT = ТТ / Т(Т+ГВ), (2) где ТТ – период задержки свечения в растворе модельного поллютанта без гуматов, Т(Т+ГВ) – в присутствии гуматов.
Величины коэффициентов К 1 и КOxT 1 соответствуют детоксикации раствора, К = 1, КOxT = 1 – отсутствию эффекта, К 1, КOxT 1 – увеличению токсичности. Погрешность измерения К и КOxT не превышает 0,04.
Скорости окисления НАДН определяли по изменению оптической плотности раствора, D, на длине волны 340 нм в спектре поглощения НАДН на спектрофотометре UVIKON-943 (KONTRON Instruments, Italy). Погрешность измерения V равна 10–8 М/мин.
Электронно-микроскопические исследования проводились в Лимнологическом институте СО РАН г. Иркутска.
Третья глава диссертации посвящена оценке изменения общей токсичности растворов солей металлов Pb(NO3)2, СоСl2, CuSO4, Eu(NO3)3, СrСl3, К3[Fe(СN)6] при воздействии гуминовых веществ.
Как было показано в работе [6], тип неорганического аниона (Cl-, SO42-, и NO3-) не влияет на интенсивность биолюминесценции. По этой причине мы учитывали только свойства катионов.
Предварительно с помощью биолюминесцентных тестовых систем бактериальной) были определены эффективные (ферментативной, концентрации растворов солей металлов, EC50, М, которые использовали далее в экспериментах с гуминовыми веществами.
Изучено действие растворов гуминовых веществ различных концентраций на биолюминесцентные системы. Для дальнейших исследований были выбраны концентрации гуминовых веществ, не приводящие к ингибированию свечения тестовых систем.
По изменению общей токсичности растворов солей металлов под действием гуминовых веществ определены коэффициенты детоксикации К. Измерения проводились при различных концентрациях гуминовых веществ и временах предварительного инкубирования гуматов с солями металлов.
На рис. 2, в качестве примера, представлена зависимость К от концентрации гуминовых веществ в растворах CoCl2, полученная с помощью ферментативной тестовой системы.
Подобные кривые были получены для всех исследуемых солей металлов.
Рис. 2. Зависимость коэффициента детоксикации K от концентрации гуминовых веществ CГВ в растворе CoCl2 (ЕС50 = 5·10-5М). Ферментативная система. Время инкубирования: 1 – минут, 2 – 50 минут.
Определены верхние границы детоксицирующих концентраций гуматов, C‘ГВ, т.е. концентрации гуминовых веществ, при которых К = 1, и максимальные коэффициенты детоксикации гуминовыми веществами, Km.
Использовали ферментативную и бактериальную тестовые системы при различных временах инкубирования солей металлов с гуматами (табл. 1).
Таблица m Коэффициенты детоксикации, K, растворов солей металлов гуминовыми веществами, определенные с использованием ферментативной и бактериальной тестовых систем при различных временах предварительного инкубирования.
Km Соль Ферментативная система Бактериальная система металла 0 15 25 50 0 15 25 C’ГВ, г/л мин мин мин мин C’ГВ, г/л мин мин мин мин - 3,010-3 0,91 1,04 1,06 1, СоСl2 2,010 1,07 1,12 1,15 1, 2,010-3 1,28 1,80 2,16 2,010-2 1,12 1,72 2,76 1, Eu(NO3)3 2, 2,010-3 1,26 1,32 1,66 3,010-3 0,89 1,13 1,24 1, CrCl3 1, 1,310-3 1,22 1,69 1,76 1,510-3 0,91 1,42 1,72 1, Pb(NO3)2 1, 6,210-4 0,81 1,40 1,62 2,010-3 0,96 1,02 1,04 1, CuSO4 1, 2,010-4 1,00 1,14 1,14 1,14 3,010-3 0,93 1,06 1,21 1, К3[Fe(СN)6] Как следует из данных, представленных в табл. 1, предварительное инкубирование вызывает увеличение Km, то есть приводит к увеличению эффективности детоксикации. Исключением является 50-минутное инкубирование растворов CuSO4 (ферментативная система) и Pb(NO3) (бактериальная система).
Образование комплексов металл – гуминовые вещества может быть одной из причин снижения общей токсичности растворов.
Рост коэффициентов детоксикации во времени объясняется, вероятно, длительностью образования комплексов при наличии диффузионных затруднений в растворах полимерных молекул – гуминовых веществ [4], а также в процессах взаимодействия гуматов с ферментативными и бактериальными системами.
В четвертой главе экспериментально исследовано влияние гуминовых веществ на окислительную токсичность растворов редокс-активных соединений. На начальном этапе были исследованы изменения кинетики биолюминесценции ферментативной системы сопряженных реакций в растворах органического (1,4-бензохинона) и неорганического (феррицианида калия – K3[Fe(CN)6]) окислителей.
Показано, что кинетика биолюминесценции в растворах данных окислителей отличается от кинетики в растворах Pb(NO3)2, СоСl2, CuSO4, Eu(NO3)3, и СrСl3 и 1,4-гидрохинона, а именно: в присутствии окислителей, помимо снижения максимума люминесценции, появляется период задержки свечения. Подобные результаты ранее были получены другими исследователями [2]. Известно, что это явление связано со способностью окислителей конкурировать с ФМН в процессах восстановления (присоединения водорода). Показано, что эффективность этой конкуренции определялась стандартным окислительно-восстановительным потенциалом окислителя и его концентрацией. Подобные специфические изменения кинетики биолюминесценции ферментативной системы придают этой системе особые свойства – специфичность к группе окислителей и возможность оценивать окислительную токсичность.
По изменению окислительной токсичности под действием гуминовых веществ были рассчитаны коэффициенты детоксикации КОхТ растворов 1,4 бензохинона и феррицианида калия;
при этом варьировали концентрации гуминовых веществ и время инкубирования растворов окислителей с гуматами от 0 до 50 минут.
На рис. 3 в качестве примера представлены зависимости КОхТ от концентрации гуминовых веществ в растворах феррицианида калия при временах инкубирования 0 и 50 минут.
Рис. 3. Зависимость коэффициента детоксикации КОхТ от концентрации гуминовых веществ СГВ в растворах феррицианида калия (ЕС50 = 8·10-5 М). Время инкубирования 0 и минут.
Данные, представленные на рис. 3, показывают, что воздействие гуминовых веществ в отсутствие предварительного инкубирования (0 минут) приводит к увеличению окислительной токсичности растворов (КОхТ 1) при СГВ 2·10- г/л. В то же время, меньшие концентрации гуминовых веществ не оказывали заметного влияния на окислительную токсичность растворов (КОхТ 1).
Инкубирование феррицианида калия с гуминовыми веществами (50 минут, рис. 3) приводит к снижению окислительной токсичности раствора феррицианида калия (КОхТ 1) при всех исследуемых концентрациях гуматов.
Подобные результаты были получены и для 1,4-бензохинона.
Сравнивали действие гуминовых веществ на органический и неорганический окислители (рис. 4).
Рис. 4. Зависимость коэффициента детоксикации КОхТ от времени инкубирования 1,4 бензохинона и К3[Fe(СN)6] с гуминовыми веществами. Ферментативная система.
Данные рисунка 4 указывают на сходство результатов предварительного инкубирования органического и неорганического окислителей с гуминовыми веществами.
Т.о, коэффициенты детоксикации КОхТ, рассчитанные по изменению окислительной токсичности растворов, увеличиваются со временем инкубирования, аналогично коэффициентам для общей токсичности (см.
табл.1).
Причиной снижения токсичности растворов окислителей, вероятно, является образование комплексов окислитель – гумат, с последующей нейтрализацией окислителя. Ранее была показана связь детоксицирующего эффекта гуминовых веществ с окислительной способностью молекул хинонов и их гидрофобностью [2, 7]. За восстановительную активность гуматов в процессах детоксикации окислителей отвечают гидрохиноновые, фенольные, спиртовые, а также некоторые азотсодержащие группы макромолекул гуминовых веществ.
Таким образом, согласно общепринятым представлениям, описанные эффекты детоксикации можно объяснить химическими процессами, уменьшающими содержание токсичных соединений в растворах вне тестового организма. Так как гуминовые вещества являются полифункциональными, они могут образовывать координационные комплексы с металлами, участвовать в гидрофобном связывании амфифильных молекул, а так же в восстановлении окислителей.
Кроме того, гуминовые вещества могут участвовать и в биологических процессах, определяющих защитные реакции тестовых организмов.
Пятая глава посвящена изучению активной роли биолюминесцентных тестовых систем в процессах детоксикации солей металлов гуминовыми веществами.
Изменение скоростей окисления НАДН в растворах солей металлов в присутствии гуминовых веществ.
НАДН является органическим восстановителем и одним из компонентов биолюминесцентной ферментативной тестовой системы двух сопряженных реакций:
ФМН + НАДH НАД(Ф)H:ФМН-оксидоредуктазаФМНH– + НАД+, (1) ФМНH– + R1COH + O2 люцифераза ФМН + R1COO– + H2O + hn (490 nm). (2) Величина скорости окисления НАДН служит индикатором ускорения (или замедления) окислительно-восстановительных процессов в ферментативной системе.
Скорости окисления НАДН в ферментативных и неферментативных процессах были определены в растворах трех солей металлов: CuSO4, K3[Fe(CN)6] и CoCl2. Использованы эффективные концентрации солей металлов EС50;
измерения проводили в присутствии и отсутствии гуминовых веществ (табл. 2).
Таблица Скорости окисления НАДН в отсутствии (V) и присутствии (VГВ) гуминовых веществ.
V107, М/мин № Компоненты растворов DV=VГВ - V V VГВ Неферментативные процессы НАДН (автоокисление) 1 0,4 1,0 0, НАДН + ФМН 2 3,9 5,1 1, НАДН + CuSO 3 1,8 1,8 0, НАДН + K3[Fe(CN)6] 4 7,8 7,6 -0, НАДН + CoCl 5 0,6 0,5 -0, Ферментативные процессы 1Е НАДН +E 0,4 0,9 0, 2E НАДН + ФМН +E 7,0 8,0 1, 3E НАДН + CuSO4 +E 0,6 0,6 0, 4Е НАДН + K3[Fe(CN)6] + E 1,9 2,1 0, 5Е НАДН + CoCl2 + E –2,2 –2,6 -0, –4 –5 – = 1,610 М, СГВ = 8·10 г/л. CФМН = 5,410 М, СCoCl2 = 5·10 M, СCuSO4 = 10-6 М, - СНАДH СK3[Fe(CN)6]= 8·10–5 М. E – препарат ферментов.
Данные табл. 2 демонстрируют, что скорости автоокисления НАДН в отсутствии (№1) и в присутствии (№1Е) ферментов близки. Добавление гуминовых веществ в растворы НАДН приводит к росту скорости его автоокисления соответственно на 0,6·10-7 и 0,5·10-7 М/мин (см. DV в табл. 2).
Таким образом, гуминовые вещества увеличивают скорость расходования эндогенного восстановителя НАДН, удаляя его из системы и снижая интенсивность биолюминесценции (в соответствии с уравнениями 1 и 2).
Ускорение автоокислительных процессов можно рассматривать как причину увеличения токсичности растворов под действием гуминовых веществ.
Добавление гуминовых веществ к системе НАДН+ФМН в неферментативном (№2) и ферментативном (№2Е) процессах дополнительно увеличивает скорости окисления НАДН (DV = 1,2·10-7 и 1,0·10-7 М/мин соответственно).
Изучены скорости окисления НАДН в растворах неорганических экзогенных окислителей CuSO4 и K3[Fe(СN)6]. Стандартные окислительно восстановительные потенциалы полуреакций Cu2+ / Cu+ равны 0,15 В, а [Fe(СN)6]3– / [Fe(СN)6]4– = 0,36 В, они превышают потенциал ФМН (-0,22 В, для полуреакции ФМН / ФМН·H2 [8], эндогенного окислителя ферментативной тестовой системы (реакция 1), что указывает на возможность конкуренции данных экзогенных окислителей с ФМН в реакции окисления НАДН (реакция 1) в стандартных условиях. Скорости окисления НАДН экзогенными окислителями CuSO4 и K3[Fe(СN)6] приведены в табл. 2 (№ 3, 4, 3Е, 4Е).
Добавление гуминовых веществ в растворы CuSO4 и K3[Fe(CN)6] не изменяет или изменяет незначительно скорости окисления НАДН в неферментативных (№3 и №4, табл. 2) и ферментативных (№3Е и №4Е, табл. 2) реакциях. Однако, как уже было сказано выше, гуминовые вещества увеличивают скорость расходования НАДН в присутствии эндогенного окислителя ФМН (№2 и №2Е, DV = 1,2·10-7 и 1,0·10-7 М/мин для неферментативных и ферментативных процессов, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о том, что гуминовые вещества делают эндогенные процессы более конкурентоспособными в растворах CuSO4 и K3[Fe(CN)6]. Вероятно, амфифильность молекул ФМН благоприятствует их взаимодействию с НАДН в присутствии гуминовых веществ, которые также являются амфифильными структурами.
Исследовали скорости окисления НАДН в растворах CoCl2. Было показано, что при добавлении CoCl2 скорость окисления НАДН увеличилась незначительно (V = 0,410-7 против 0,510-7 М/мин в процессе №1 против №5) или уменьшилась (V = 0,410-7 против -2,210-7 М/мин в процессе №1Е против №5Е), табл. 2. Воздействие гуминовых веществ привело к еще более выраженному снижению скорости окисления НАДН: VГВ = 1,010-7 против 0,610-7 М/мин (в процессе №1 против №5), или 0,910-7 против -2,610-7 М/мин (в процессе №1Е против №5Е), табл. 2.
Так как ион кобальта Со2+ взят нами не в максимальной степени окисления, то он может проявлять свойства слабого восстановителя, окисляясь до Co3+ (при этом окислительно-восстановительный потенциал для пары ионов кобальта, связанных гуматами, будет отличаться от потенциала несвязанных ионов). В этом случае возможно увеличение содержания НАДН за счет восстановления НАД+ с последующим увеличением скоростей реакций 1 и 2 в ферментативной тестовой системе. Отрицательные значения V и VГВ в процессе №5Е (табл.2) введены нами именно для того, чтобы указать на рост концентрации НАДН.
Сочетание вышеперечисленных процессов (т.е. увеличение и/или уменьшение скоростей окисления НАДН гуминовыми веществами) определяет общее изменение интенсивности биолюминесценции.
Таким образом, показано, что увеличение токсичности водных растворов солей металлов под действием гуминовых веществ может происходить за счет ускорения автоокисления НАДН. Снижение токсичности может быть связано с ускорением эндогенных НАДН-зависимых биохимических процессов гуминовыми веществами в растворах экзогенных окислителей (K3[Fe(CN)6], CuSO4), а также в растворе CoCl2.
Ультраструктура бактериальных клеток в растворах CrCl3 и гуминовых веществ.
Для выявления возможных изменений в ультраструктуре бактерий в процессе детоксикации, было проведено электронно-микроскопическое исследование ультратонких срезов P.phosphoreum, подвергшихся воздействию СrCl3 (С = 10-4 М) в присутствии гуминовых веществ и без них.
Ультраструктуры клеток в контрольном образце и в присутствии СrCl представлены на рис. 5 А, Б соответственно.
А) Б) Рис. 5. Ультраструктура клеток P.phosphoreum. Масштаб 1 µм. А – контроль;
Б – в присутствии СrCl3 (С = 10-4 М).
Результаты исследования образцов, подвергшихся воздействию СrCl3 (рис.
5 Б) показали, что клетки были неправильной (плеоморфной) формы.
Клеточная стенка имела сглаженный профиль, внешние слизистые слои не выявлялись. В отличие от контрольного образца (рис. 5 А), в нуклеоплазме видны конденсированные нити ДНК. В клетках имеются электронно-плотные образования неправильной формы, расположенные в цитоплазме у полюсов клетки.
Следует отметить, что в отсутствии СrCl3 гуминовые вещества не оказывают влияния на структуру клеток.
После обработки культуры СrCl3 и гуминовыми веществами, клетки также имели плеоморфную (неправильную) форму (рис. 6). При этом наблюдали изменения в строении клеточной оболочки: она становилась более плотной, внешняя мембрана клеточной стенки приобретала волнистый профиль. У большинства клеток на поверхности клеточных стенок наблюдалось аморфное вещество средней электронной плотности (показано стрелками на рис. 6).
Возможно, это вещество – остатки слизистой оболочки, которая была стабилизирована макромолекулами гуминовых веществ.
Рис. 6. Ультраструктура клетки P.phosphoreum в присутствии CrCl3 (С = 10-4 М) и гуминовых веществ (CГВ = 0,9·10-2 г/л). Масштаб 1 µм.
Известно, что полисахаридная слизистая капсула защищает бактерию от антимикробных агентов [10], и она всегда присутствует на поверхности клеток, растущих в природных условиях (противоположно бактериям, выращенным в лаборатории). Как правило, при подготовке образцов для электронной микроскопии слизистый слой капсулы частично или полностью смывается.
Предполагается [7, 10], что бактерии усиливают синтез внеклеточного матрикса, в ответ на неблагоприятное влияние СrCl3. Вероятно, полимерные молекулы гуминовых веществ стабилизируют полисахаридный слой, и тем самым активизируют защитную функцию тестовой системы, т.е. бактериальных клеток. Подобные образования, то есть остатки слизистых капсул на внешней стороне клеточной стенки, были обнаружены в предыдущих исследованиях при добавлении гуминовых веществ в растворы органических окислителей – хинонов [2].
Таким образом, на основе анализа скоростей окисления НАДН в биолюминесцентной ферментативной системе и изучения изменений ультраструктуры бактерий в присутствии гуминовых веществ в растворе модельного неорганического токсиканта, показано, что биолюминесцентные тестовые системы играют активную роль в процессах детоксикации растворов солей металлов гуминовыми веществами. Выявлены два типа отклика биолюминесцентных систем на воздействие гуминовых веществ в токсичных растворах: на уровне биохимических реакций и уровне клеток в целом. Эти процессы демонстрируют механизмы стимулирования защитной реакции бактерий гуминовыми веществами в растворах солей металлов, используемых нами в качестве модельных токсикантов.
ВЫВОДЫ 1. На примере растворов модельных токсикантов Pb(NO3)2, СоСl2, CuSO4, Eu(NO3)3, СrСl3, К3[Fe(СN)6] и редокс-пары 1,4-бензохинон – гидрохинон продемонстрирована применимость биолюминесцентных тестовых систем (ферментативной системы реакций и лиофилизированных бактерий Photobacterium phosphoreum) для оценки изменений общей и окислительной токсичности при воздействии гуминовых веществ в качестве детоксицирующих агентов. Рассчитаны коэффициенты детоксикации гуминовыми веществами растворов модельных токсикантов.
2. Показано, что гуминовые вещества могут как увеличивать, так и снижать общую и окислительную токсичность растворов токсикантов. С использованием бактериального теста подобраны условия для более эффективной детоксикации гуминовыми веществами водных экосистем, а именно:
· для солей металлов – интервал концентраций гуминовых веществ 10-5 2·10-2 г/л, время предварительного инкубирования с гуматами – не менее 10 минут;
· для 1,4-бензохинона – интервал концентраций гуминовых веществ 10-5 2·10-4 г/л, время предварительного инкубирования с гуматами – не менее 15 минут.
3. Показано, что присутствие гуминовых веществ в модельных растворах неорганических токсикантов стимулирует защитную функцию тестовой системы в результате:
а) увеличения скоростей биохимических НАДН-зависимых процессов в биолюминесцентной тестовой системе;
б) стабилизации слизистого слоя капсулы на внешней поверхности клеточной стенки, возникающего в качестве реакции клеток на воздействие токсикантов.
4. Увеличение токсичности растворов модельных токсикантов в присутствии гуминовых веществ связано с увеличением скорости автоокисления эндогенного восстановителя НАДН.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналахВАК 1. Tarasova, A.S. Bioluminescence as a tool for studying detoxification processes in metal salt solutions involving humic substances / A.S. Tarasova, S.L. Kislan, E.S.
Fedorova, A.M. Kuznetsov, O.A. Mogilnaya, D.I. Stom, N.S. Kudryasheva // Journal of photochemistry and photobiology. B – 2012. – V. 117. – N. 5. – P. 164–170.
2. Тarasova, Anna S. Bioluminescent toxicity monitoring of oxidizer solutions: effect of humic substances / Anna S. Tarasova, Devard I. Stom, Nadezhda S. Kydryasheva // Environmental toxicology and chemistry. – 2011. – V.30. – N.5. – P.1013–1017.
3. Tarasova, A.S. Bioluminescent monitoring: detoxification of phenol solutions by humic substances and UV-irradiation / A.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva, E.S.
Fedorova, D. I. Stom // Journal of Siberian federal university. Biology. – 2008. – V.1. – N.2. – P.136-144.
Тезисы докладов наиболее значимых конференций 1. Tarasova, Аnna S. Reaction rates in enzymatic assay system in solutions of metal salts and humic substances / Аnna S. Tarasova, Nadezhda S. Kudryasheva //
Abstract
of the 16-th Meeting of humic substances society, September 9-14, 2012, Hangzhou, China.
Functions of natural organic matter in changing environment, Springer, Ed. by J. Xu, J.
Wu, Y. He. – P.315-317.
2. Kudryasheva, N.S. Mechanisms of detoxification by humic substances / N.S.
Kudryasheva, А.S. Tarasova // Abstract of the 16-th Meeting of humic substances society, September 9-14, 2012, Hangzhou, China. Functions of natural organic matter in changing environment, Springer, Ed. by J. Xu, J. Wu, Y. He. – P. 296-298.
3. Tarasova, А. S. Use of bioluminescence assay to verify mechanisms of detoxifying effects of humic substances in heavy metal solutions / А.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva // Abstract of the 17th International symposium on bioluminescence and chemi luminescence, 2012. – Guelph, Canada. Luminescence. – V.27. – N.2. – P.163-164.
4. Kislan, S.L. General toxicity of heavy metal solutions in the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring / S.L. Kislan, А.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva // Abstract of the 17th International symposium on bioluminescence and chemiluminescence, 2012. – Guelph, Canada. Luminescence. – V.27. – N.2. – P.127.
5. Kudryasheva, N.S. Detoxification of model toxic solutions by humic substances / N.S.
Kudryasheva, А.S. Tarasova // Abstracts of 3-d International symposium on green chemistry for environment, Health and development, 3-5 October 2012, Skiathos, Greece. – P. 21.
6. Кислан, С.Л. Изменение токсичности тяжелых металлов в присутствии гуминовых веществ / С.Л. Кислан, А.С. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Сборник статей Двенадцатой международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологих в промышленности», 8-10 декабря 2011, г. Санкт-Петербург, Россия. – С. 247-249.
Тарасова, А.С. Применение биолюминесцентного метода для оценки 7.
детоксицирующей способности гуминовых веществ в растворах солей металлов / А.С. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы VI Съезда Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября 2011, пос. Шепси, Россия. – С.139.
Tarasova, А.S. Bioluminescent monitoring of general and oxidative toxicity under 8.
effect of humic substances / А.S. Tarasova, N.S. Kudryasheva // Abstract of 13th International conference on chemistry and the environment, 11-15 September 2011, Zurich, Switzerland. – P.380.
9. Tarasova, A.S. General and oxidative toxicity of oxidizer in the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring / A.S. Tarasova, E.S. Fedorova, N.S.
Kudryasheva // Abstract of the XVI International symposium on bioluminescence and chemiluminescence, 2010, Lyon, France. Luminescence. – V.25 – N.2. – P.136-137.
Тарасова, А.С. Детоксикация солей металлов гуминовыми веществами.
10.
Биолюминесцентный мониторинг / А.С. Тарасова, Е.С. Федорова, М.А.
Александрова // Тезисы всероссийской конференции с международным участием «Почвы Сибири: прошлое, настоящее, будущее», 30 ноября - 3 декабря 2010, г.
Новосибирск, Россия. – С. 143-145.
Тарасова, А.С. Биолюминесцентный мониторинг детоксикации гуминовыми 11.
веществами растворов неорганического окислителя / А.С. Тарасова, Н.С.
Кудряшева // Тезисы международной научной конференции «Проблемы экологии», 20-25сентября 2010, г. Иркутск, Россия. – С. 472.
Тарасова, А.С. Изучение процессов детоксикации гуминовыми веществами 12.
растворов металлов переменной валентности на примере феррицианида калия / А.С. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере», 1-4марта 2010, г.
Санкт-Петербург, Россия. – С. 350-355.
Тарасова, А.С. Детоксикация раствора неорганического окислителя гуминовыми 13.
веществами, биолюминесцентный мониторинг / А.С. Тарасова // Тезисы XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2009», 13-18 апреля 2009, г.Москва, Россия. – С.142 – 143.
Тарасова, А.С. Детоксикация фенолов гуминовыми веществами.
14.
Биолюминесцентный мониторинг / А.С. Тарасова, Н.С. Кудряшева // Тезисы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008», 8-11 апреля 2008, Москва, Россия. ISBN 978-5-91579- 003-1.
Тарасова, А.С. Мониторинг токсичности фенолов биолюминесцентными 15.
методами / А.С. Тарасова, Е.В. Ветрова, Н.С. Кудряшева, Е.С. Федорова // Тезисы XVIII менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 23-28 сентября 2007, г. Москва, Россия. – С.2192.
ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Perminova, I. Quantifcation and prediction of the detoxifying properties of humic substances related to their chemical binding to polycyclic aromatic hydrocarbons / I.
Perminova, N. Grechishcheva, D. Kovalevskii, A. Kudryavtsev, V. Petrosyan, D.
Matorin // Environmental science and technology. – 2001. – V.35 – N.19. – P. 3841 3848.
2. Fedorova, E. Bioluminescent monitoring of detoxification processes: Activity of humic substances in quinone solutions / E. Fedorova, N. Kudryasheva, A. Kuznetsov, O.
Mogil’naya, D. Stom // Journal of photochemistry and photobiology B: Biology. – 2007. – V. 88. – I. 2-3. – P. 131-136.
3. Tyulkova, N.A. Purification of bacterial luciferase from Photobacterium Leiognathi with the use of FPLC-system. In: B. Jezowska-Trzebiatowska, B. Kochel, J. Stawinski, W. Strek, editors. Bacterial Luminescence. Singapore: World Scient, 1990. – P.369 374.
Левинский, Б.В. Все о гуматах / Б.В. Левинский // Иркутск: Корф-Полиграф. – 4.
2000. – 75 с.
5. Kudryasheva, N. Bioluminescent assays: effects of quinones and phenols / N.
Kudryasheva, E. Vetrova, A. Kuznetsov, V. Kratasyuk, D. Stom // Ecotoxicology and environmental safety. – 2002. – N.53. – P. 221-225.
Кудряшева, Н.С. Действие солей металлов на бактериальные биолюминесцентные 6.
системы различной сложности / Н.С. Кудряшева, Л.В. Зюзикова, Т.В. Гутник, А.В. Кузнецов // Биофизика. – 1996. –Т.41. – №6. – C.1264-1269.
Федорова, Е.С. Биолюминесцентный мониторинг процессов детоксикации 7.
растворов органических соединений.: Автореф. … дис. канд. биологических наук.
– Пущино, 2011. – 21 с.
8. Champe, P.C. Lippincott's illustrated reviews: Biochemistry / P.C, Champe, R.A.
Harvey, D. R. Ferrier // Lippincott Williams & Wilkins Publishers. – 2005.
Глинка, Н. Л. Задачи и упражнения по общей химии: Учебное пособие для вузов / 9.
Глинка Н. Л. Под ред. В.А. Рабиновича и Х.М. Рубиной. – 24-е изд., испр. – Л.:
Химия, 1986. – 272 с.
10. Costerton, J. Structure and plasticity at various organization levels in the bacterial cell / J. Costerton // Canadian Journal of microbiology. – 1988. – V.34. – P. 513-521.