Технико-технологические основы биосинтеза резервных полигидроксиалканоатов водородными бактериями
На правах рукописи
Киселев Евгений Геннадьевич
ТЕХНИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА
РЕЗЕРВНЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ
ВОДОРОДНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнология)
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
технических наук
Красноярск-2012
2
Работа выполнена в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Институ та биофизики СО РАН и базовой кафедре биотехнологии ФГАОУ ВПО «Си бирский федеральный университет»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Волова Татьяна Григорьевна
Официальные оппоненты:
Величко Надежда Александровна, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», инсти тут пищевых производств, директор Литовка Юлия Александровна, кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», доцент кафедры химической технологии древесины и биотехнологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учре ждение науки «Институт химии и химической технологии Сибирского отделе ния Российской академии наук»
Защита состоится «» 2012 года в ч на заседании диссер тационного совета Д 212.253.01 при ФГБОУ ВПО «Сибирский государствен ный технологический университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82, аудитория Ц-110 (зал заседаний).
Отзывы на автореферат в двух экземплярах с подписями, заверенными печатью, просим направлять по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира 82, Си бирский государственный технологический университет, учёному секретарю.
E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государ ственного технологического университета.
Автореферат разослан «_» 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук, профессор Исаева Елена Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Биотехнологические процессы обеспечивают производ ство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолеку лы запасной природы – полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигид роксиалканоаты) – термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся спо собностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы свя зана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн.
тонн в год;
основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему. Острота проблемы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов произво дится из невозобновляемого ископаемого сырья – нефти и газа, запасы которых исто щаются.
В настоящее время все большее значение приобретают экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиоло гического синтеза (так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосистем, ориентированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материа лов - актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Освоение биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследо ваний, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров;
получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, эф фективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.
Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушающихся полимеров, наряду с полилактидами, полигидроксиалканоаты (ПГА). Эти полимеры активно исследуются за рубежом;
в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компании («Монсанто К°», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др.). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана;
исследования, направленные на разработку биотехнологических процессов синтеза собственно ПГА – в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт биофизики СО РАН).
Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на до лю исходного углеродного сырья и до 18-20 % на процесс экстракции и очистки по лимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию про мышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой ба зы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эф фективных биотехнологий синтеза.
Одними из перспективных продуцентов ПГА являются водородокисляющие бактерии, обладающие способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях СО2 и Н2 и также на органических субстратах (Завар зин, 1979;
Шабанов с соавт., 2005). Исследование закономерностей синтеза ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценка эффективности технологи ческих режимов необходимы для разработки эффективных технологий получения этих ценных макромолекул. Это определило тематику настоящей работы, направлен ной на разработку технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.
Цель и задачи исследования: Разработка технико-технологических характери стик процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов водородными бактериями на раз личных субстратах в качестве основы для разработки технологии их получения.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
- изучение кинетических и продукционных показателей бактерий Сupriavidus eutrophus в лабораторных условиях с использованием автотрофного (смеси Н2, СО2 и О2) и гетеротрофного (глюкоза) субстратов;
- исследование и отработка режимов (хемостатного, периодического, проточно периодического) выращивания бактерий на смеси Н2, СО2 и О2 для повышения выхо дов ПГА и сокращения длительности процесса;
- изучение влияния физиологической активности инокулята, исходной концен трации клеток в инокуляте на продуктивность синтеза ПГА культурой С. eutrophus на глюкозе;
- разработка и реализация режимов культивирования бактерий С. eutrophus для получения ПГА, различающихся составом мономеров;
- сравнительный анализ методов экстракции ПГА с применением различных реагентов - технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах;
- получение исходных данных и разработка технологии производства ПГА.
Научная новизна: Исследована культура бактерии С. eutrophus в различных режимах выращивания;
получены новые данные о закономерностях синтеза полигид роксиалканоатов, составившие основу для разработки технологии их получения. Изу чены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотроф ного (смеси Н2, СО2 и О2) и гетеротрофного (глюкоза) питания;
определены затраты субстратов на образование ПГА и эффективность их использования. Установлены оп тимальные для условия биосинтеза: исходная концентрация и физиологическая ак тивность инокулята, режимы подачи лимитирующего субстрата (азота), стимулирую щего внутриклеточную аккумуляцию ПГА. Это позволило разработать хемостатно периодические режимы синтеза ПГА в автотрофном и гетеротрофном, режимах. Из менение режима углеродного питания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, -бутиролактона), позволило разработать и реализовать технологию получения полимеров, различаю щихся физико-химическими свойствами. На основании сравнительного исследования режимов экстракции ПГА из биомассы с применением растворителей и поверхностно активных веществ предложены методы, обеспечивающие полноту извлечения поли мера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристик различной чистоты.
Практическая значимость: Выполнен сравнительный технико-экономичес кий анализ лабораторных процессов синтеза ПГА культурой С. eutrophus при различ ных субстратных сценариях. На основе полученных экспериментальных результатов культивирования бактерий на глюкозе разработана технология, позволяющая повы сить выход продукта более, чем в два раза. Технология опытного производства поли меров (ПГА) реализована в проекте «Лаборатория биотехнологии новых биоматериа лов».
Положения, выносимые на защиту: В рамках специальности 03.01.06 – Био технология (в том числе бионанотехнология) (п.3 – изучение и разработка тех нологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов направ ленного биосинтеза биоразрушаемых полимеров, изучение их состава, технико экономических критериев оценки;
п.4 – изучение и разработка процессов сгу щения биомассы, экстракции выделения, фракционирования, очистки контроля целевых продуктов) на защиту выносится:
- кинетические и продукционные характеристики хемостатной и периодиче ской культуры Сupriavidus eutrophus, выращиваемой в автотрофных (СО2:О2:Н2) и ге теротрофных (глюкоза) условиях питания, на основе которых разработаны режимы культивирования с содержанием ПГА, соответственно, (75±5) и (85±5) % при достиг нутых урожаях биомассы до 50 и 110 г/л;
- результаты сравнительного исследования методов экстракции ПГА из био массы бактерий и предложенные методы, обеспечивающие более полное извлечение полимера из биомассы бактерий (96 %) для различных областей применения;
- технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах;
технология синтеза полимеров на глюкозе.
Работа выполнена в рамках плановой тематики ИБФ СО РАН (государственная регистрация № 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии СФУ в рамках инно вационного проекта «Организация производства разрушаемых биополимеров и изде лий из них на новых субстратах, продуктах переработки низкосортных углей» (проект № 31 2008 г.);
Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенци ала высшей школы» (2008-2011 г.г. проект РНП-11);
проекта ККФНПДиНД «Созда ние GMP пилотного производства разрушаемых биопластиков «Биопластотан» ( г.);
мега-грантов по Постановлению Правительства РФ от 9.04.2010 г., № 219 «Разви тие системы инфраструктурной поддержки исследовательской, инновационной и об разовательной деятельности, а так же инновационных проектов и комплексных про грамм на приоритетных направлениях научно-технического развития, реализуемых по инициативе СФУ на базе технологических платформ» (договор № 13.G38.31. 0009) и № 220 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под ру ководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор № 11G34.31.0013).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Междуна родном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, 2012);
«Лесной и химический комплексы – про блемы и решения» (Красноярск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в т.ч. 1 статья в спе циализированном журнале перечня ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов по исследованию кинетических и продукционных характеристик культуры, способам экстракции поли меров;
обработка и анализ результатов, выполнение ТЭО процесса, участие в проек тировании опытного производства полимеров;
подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц, 31 рисунок, 3 приложения;
включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и их обсуждение (5 глав), за ключение, выводы. Список цитируемой литературы включает 149 источников, в т.ч.
114 зарубежных.
Содержание работы Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в решение проблемы создания научной основы для биотехнологического производства материалов нового поколения – разрушаемых полиэфиров гидрокисалкановых кислот (полигидроксиал каноатов).
В первой главе – литературном обзоре – представлен анализ литературы по проблеме поиска альтернативных экологически безопасных технологий синтеза эко логически чистых материалов нового поколения взамен аккумулируемым в природе синтетическим полимерам. Рассмотрены продуценты, субстраты и биотехнологиче ские способы синтеза ПГА продуцентами различных таксонов на индивидуальных со единениях и отходах;
свойства и потенциал этих биополимеров. Охарактеризованы современные масштабы производства ПГА и области применения. Проанализированы и выделены ключевые факторы, влияющие на технико-экономические показатели производства и стоимость полимеров этого класса. В заключительном разделе пред ставлен анализ потенциала водородокисляющих микроорганизмов, способных к син тезу ПГА на различных субстратах.
Во второй главе описаны объекты и методы исследования. Исследован штамм водородокисляющих бактерий, зарегистрированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов: Cupriavidus eutrophus В-10646 (прежнее система тическое название Ralstonia eutrophus), обладающий устойчивостью к -буторолак тону, солям алкановых кислот и характеризующийся способностью к синтезу ПГА различного химического строения в автотрофных и гетеротрофных условиях. Для вы ращивания бактерий за основу принята солевая среда Шлегеля (Schlegel, 1961). При автотрофном культивировании в качестве основного ростового субстрата использова ли газовую смесь в соотношении CO2 : O2: H2 = 1 : 2 : 7 по объёму;
при гетеротрофном – глюкозу.
Для процессов культивирования использовалось следующие оборудование:
шейкер-инкубатор Innova 44, автоматизированные ферментационные комплексы Bio Flo 115 «New Brunswick Scientific» (США), самостерилизуемый ферментером NLF фирмы «Bioengineering» (Швейцария). Внутриклеточную концентрацию ПГА, оста точных липидов и жирных кислот определяли на хромато-масс-спектрометре «Agilent 7820»;
молекулярную массу ПГА – с использованием системы гель-проникающей хроматографии «Agilent 1200». Рентгеноструктурный анализ и определение степени кристалличности образцов ПГА выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE «Bruker» (Германия). Термические свойства исследованы методом ДСК с использова нием прибора фирмы «NETZCH» (Германия).
В третьей, четвертой и пятой главах – обсуждение результатов.
1 Кинетические и продукционные характеристики автотрофной культуры водородокисляющих бактерий Cupriavidus eutrophus в режиме синтеза резервных полигидроксилаканоатов В связи с тем, что ПГА синтезируются при несбалансированном росте и исполь зуются клетками в качестве эндогенного депо энергии и углерода, получение высоких выходов по биомассе с высоким внутриклеточным содержанием полимера проблема тично. Факторы, обеспечивающие суперпродукцию ПГА, видо- и штаммоспецифич ны, поэтому основополагающей задачей для биотехнологии этих биомолекул является исследование и нахождение условий, максимизирующих выходы ПГА у конкретных штаммов.
Характеристики автотрофной культуры бактерий C. eutrophus В- в режиме аккумуляции ПГА в хемостате.
Ограничение роста бактерий, вызванное дефицитом минеральных элементов, изменяло соотношение внутриклеточных макромолекул в сторону аккумуляции ре зервных соединений, ПГА представленных гомополимером 3-гидроксимасляной кис лоты - поли-3-гидроксибутиратом (П3ГБ). Содержание полимера составило макси мально (около 40 %) при азотном лимите;
до 20-25 % при лимитировании роста бакте рий по сере и фосфору;
наименьшее содержание полимера наблюдалось при лимити ровании калием и магнием. Наиболее высокие значения внутриклеточной концентра ции ПГА на моноуглеродном субстрате (СО2), были получены при снижение удельной скорости роста бактерий () до 0,1 ч-1.
Положительным моментом хемостатного режима является возможность полу чения целевого продукта неограниченно во времени, негативным – весьма низкое со держание биомассы в культуре (не более 5 %) и полимера в клетках (около 40 %). При этом возникает необходимость введения в технологическую цепочку непрерывно ра ботающего энергоемкого блока разделения низкоплотной (не выше 0,05 %) культу ральной среды. Дальнейшее углубление лимита по элементам и вытекающее из этого снижение скорости протока среды повышает вероятность контаминации.
Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В-10646 при гетеротрофных условиях питания. Продукционные характеристики автотрофной культуры C. eutrophus В-10646 сопоставимы с характеристиками культуры R.eutropha В-5786, поэтому изучение различных режимов выращивания проводилось на бактери ях C. eutrophus В-10646. Отличие режимов заключалось в варьировании входного по тока лимитирующего элемента (азот) и длительности процесса (рисунок 1).
Первый режим при отсутствии лимитирования по азоту, обеспечил накопление биомассы до 30 г/л за 70 ч, содержание П3ГБ составило 55 % (рисунок 1а).
Второй режим осуществлялся в два этапа;
первый - 35 ч на полной питательной среде с непрерывной подачей азота в культуру (120 мг/г биомассы);
второй - в беза зотной среде. В конце первого этапа содержание полимера в клетках не превышало %. Второй этап – 45 ч обеспечил увеличение внутриклеточного содержания П3ГБ в клетках до 70 % (рисунок 1б).
На рисунке 1в приведены результа ты третьего режима периодического куль тивирования бактерий, при котором на первом этапе подача азота в культуру бы ла снижена до 50 мг/г биомассы. На пер вом этапе (30-35 ч) на фоне снижения удельной скорости роста бактерий от 0, до 0,1 ч-1, концентрация биомассы достиг ла 15 г/л, содержание П3ГБ (45 ± 5) %.
При этом удельная скорость синтеза П3ГБ увеличивалась от 0,09 до 0,27 ч-1.
а) полная среда На втором этапе процесса, в ходе выращивания бактерий на среде без азота, концентрация полимера в клетках возрас тала на фоне падения удельной скорости синтеза. Концентрация биомассы соста вила (45±2) г/л, содержание полимера (70±5) %. Общая продуктивность по био массе и П3ГБ: 0,7 и 0,55 г/лч соответ ственно, время ферментации – 70 ч.
Полный цикл процесса, включая этап получения инокулята в колбочной культуре (20-24 ч), составляет (90±5) ч.
Синтез ПГА C. eutrophus В-10646 в хемостатно-периодическом процессе кул б) I – полная среда;
II – без азота ьтивирования. На основании полученных результатов предложен и исследован но вый автотрофный двустадийный хемо статно-периодический процесс культиви рования бактерий C. eutrophus для полу чения ПГА. На первом этапе осуществля ли проточный хемостатный режим с по дачей полной солевой среды и азота на уровне 80-90 % от полной физиологиче ской потребности при скорости протока 0,2 ч-1. Это позволило получить посевной материал с концентрацией биомассы в культуре и внутриклеточном содержании в) I – 50 % лимит по азоту;
II – без азота полимера (4±1) г/л и (8±2) %, соответ – удельная скорость роста, ч-1;
ственно. Далее проточный режим пре П3ГБ – концентрация, %;
Х – концентраци биомассы, г/л;
кращали и переходили на лимитирован П3ГБ – удельная скорость синтеза П3ГБ, % ную подачу азота (50 мг/г биомассы).
Рисунок 1 – Исследованные режимы выращива- Спустя 25 ч подачу азота в культуру оста навливали.
ния C. eutrophus в режиме синтеза П3ГБ Далее процесс проводили на среде без подачи азота в течение 35-40 ч. К концу опыта содержание полимера в клетках составило (70±5) %, концентрация биомассы (45±2) г/л.
Предложенный режим сократил стадию получения инокулята и первый этап периодического процесса и позволил в течение 70 ч получить высокие выходы про дукта при общей концентрации биомассы до (45±2) г/л. Продуктивность процесса со ставила: по биомассе 0,7 г/лч, по полимеру 0,55 г/лч.
2 Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В- при гетеротрофных условиях питания Ранее процесс культивирования на глюкозе не был реализован, так как штамм R.eutropha B5786 из сахаров утилизировал только фруктозу, а R.eutropha B8562 имел небольшой интервал границ физиологической устойчивости (концентрация глюкозы – 10 г/л), что приводило к неустойчивому росту. Бактерии исследуемого штамма C.
eutrophus В-10646 способны к росту на сахарах (фруктоза, глюкоза), органиче ских кислотах, аминокислотах спиртах и др.
Установлено, что концентрация глюкозы для данного штамма в периодической культуре не должна быть ниже 5 и выше 35 г/л, последнее значительно выше, чем у ранее полученного штамма R.eutropha B8562 (15 г/л).
Влияние физиологической активности посевного материала на длитель ность лаг-фазы, удельную скорость бактерий, выходы ПГА и урожай биомас сы. Результаты исследования влияния внутриклеточного пула ПГА на длительность лаг-фазы и последующую динамику накопления биомассы и П3ГБ в куль туре показаны на рисунке 2.
В зависимости от исходной концентрации полимера в клетках (5, 10, 25 и 40 %) длительность лаг-фазы составляла от 2-4 до 8-10 ч и более.
Если исходная концентрация полиме ра в посевном материале была равной 5 и 10 %, через 2-4 ч регистрировали увеличение концентрации биомассы.
Конечная концентрация биомассы за висела от показателей первой фазы процесса, на которую влияла исходная Рисунок 2 - Влияние исходной концентрации П3ГБ в концентрация полимера в инокуляте.
посевном материале C. eutrophus на длительность лаг При содержании полимера фазы и динамику накопления биомассы (кривые 1,2,3 и свыше 10 % (25 и 40 %) физиологиче 4 соответственно) и выходы полимера (5, 6, 7) ская активность инокулята снижена, длительность лаг-фазы составила, соответственно 6 и 8 ч, что негативно сказывалось на продукционных показателях культуры. В первые часы отмечено снижение внутри клеточной концентрации полимера в результате его эндогенной утилизации, и только после снижения концентрации полимера в клетках до 10 % начинался рост клеток. В целом за процесс ферментации (60 ч) концентрация биомассы в зависимости от со держания П3ГБ в инокуляте составила от 45 до 65 г/л.
Влияние концентрации клеток в посевном мате X,г/л риале на кинетические и продукционные характеристи ки культуры C. eutrophus. Применение более концентри рованного инокулята, наращивание которого в условиях колбочной культуры на качалке неизбежно сопровожда ется увеличением содержания полимера, приводит к 1 увеличению длительности лаг-фазы и снижению про дукционных показателей культуры. Для повышения продуктивности процесса инокулят выращивали до по лучения концентрации клеток не выше (1,0±0,2) г/л и со держанием полимера в них (8±2) %. Далее в стерильных условиях инокулят концентрировали и переносили в ферментёр.
На рисунке 3 представлено влияние исходной концентрации клеток в инокуляте на конечную концен трацию биомассы. Использование более концентриро ванного посевного материала позволило увеличить ко 10 30 40 50 60,ч 1 - 15 г/л;
2 - 8,3 г/л;
3 - 4,8 г/л нечную концентрацию биомассы до 120 г/л.
Рисунок 3 - Влияние концентра Продуктивность процесса при стартовой концен ции клеток в инокуляте на дина трации инокулята 4,8;
8,3 и 15,0 г/л составила: по био мику накопления биомассы массе 1,13;
1,46;
2,00 г/лч;
по ПГА 0,87;
1,20;
1,70 г/лч, соответственно. Затраты глюкозы – (2,7±0,1) г/г биомассы и (2,9±0,1) г/г полимера.
Таким образом, исследованы процессы синтеза ПГА в различных условиях пи тания в культуре C. eutrophus В-10646 и показано, что автотрофный процесс позволяет получать концентрацию биомассы (45±2) г/л с содержанием полимера до (75±5) %. В гетеротрофном процессе на глюкозе возможно получение до 120 г/л биомассы с со держание полимера 90 % и выше.
3 Технология культивирования водородных бактерий для получения ПГА различного химического строения Специфичность биосинтеза сополимерных ПГА, связанная с необходимостью внесения в культуру дополнительных С-субстратов, токсичных для бактерий, нега тивно сказывается на урожае биомассы и общем выходе полимера, потери которых, в зависимости от типа синтезируемого второго мономера и величины его включения в сополимер, могут достигать 30 %.
Разработан процесс для получения сополимерных ПГА за счёт изменения ис точника углеродного питания. При введении в культуру бактерий добавок солей алка новых кислот, которые являются предшественниками для образования мономеров различного строения С-цепи, синтезирована линейка ПГА различного химического строения. Величина и режим дозированного введения в культуру второго углеродного субстрата реализованы с учётом их предельно допустимых концентраций для бакте рий С-субстратов.
Культивирование C. eutrophus В10646 на смешанном углеродном субстрате (глюкоза+валерат калия), который вносили в конце первого этапа (25-30 ч), обеспечил получение сополимеров 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ) [ C (C2H5) C 2 C ]n. Синтез сополимеров 3-гидроксибутирата/3 гидроксигексаноата (П3ГБ/3ГГ) [ O C (C3H7) C 2 C ]n вследствие более высокой токсичности для бактерий гексаноата – трудно реализуемая задача. В автотрофной культуре при добавлении гексаноата в среду получены образцы П3ГБ/ГГ с включени ем 3ГГ до 5-10 мол.%. Гетеротрофный режим на глюкозе с добавлением в культуру, помимо гексаноата калия, акрилата – ингибитора кетотиолазы, фермента, расщепля ющего С-цепи мономеров, в частности гексаноата, позволил получить более широкую линейку сополимеров П3ГБ/3ГГ. Четвертым синтезированным типом ПГА стали со полимеры 3-гидрокисмасляной и 4-гидроксимасляной кислот (П3ГБ/4ГБ) [ O C 2 CH2 C 2 C ]n.
С использованием разработанных режимов культивирования штамма C. eu trophus В10646, в условиях автотрофного и гетеротрофного роста на средах, содержа щих в качестве источника углерод различные субстраты (CO2, глюкоза, масляная кис лота и -бутиролактон), синтезированы образцы сополимеров 3ГБ/4ГБ с включением мономеров 4ГБ от 6 до 28 мол %. Результаты сравнительного исследования физико химических свойств ПГА различного химического состава показаны на рисунок 4.
Содержание второго мономера, мол % Рисунок 4 - Зависимость температуры плавления (а) и степени кристалличности (б) сополи мерных ПГА от типа и величины фракции второго мономера Включение в цепь П3ГБ звеньев 4ГБ, 3ГВ или 3ГГ снижает температуры плав ления и термической деградации, относительно этих величин у гомогенного П3ГБ, с сохранением термостабильности. Степень кристалличности сополимерных ПГА в це лом ниже, чем у П3ГБ (75±5) %. Выраженность влияния на соотношение аморфной и кристаллических фаз у сополимерных образцов усиливается в ряду:
3-гидроксивалерат3-гидроксигексаноат4-гидроксибутират.
Самые низкие значения степени кристалличности (ниже 20 %) зарегистрированы у сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом.
Таким образом, используя разработанный двустадийный периодический режим культивирования бактерий, без существенной перестройки технологического процесса в целом, варьируя условия углеродного питания C. eutrophus В10646, реализованы способы получения образцов ПГА с различным соотношением мономеров, суще ственно различающиеся физико-химическими свойствами.
4 Сравнительное исследование методов экстракции ПГА из биомассы клеток с применением различных методов и экстрагентов Вторым по значимости и затратности элементом технологии производства ПГА является способ выделения полимера из биомассы клеток. Известные методы экстрак ции ПГА не отвечают всем необходимым требованиям (экологичность, невысокие за траты на реагенты, полнота извлечения и чистота полимера), это актуализирует со вершенствование методов экстракции как необходимое условие повышения эффек тивности процесса в целом и снижения стоимости полимера как конечного продукта биотехнологии.
Экстракция ПГА органическими растворителями. Исследовано влияние на вы ход и чистоту ПГА таких факторов как: соотношение биомасса : растворитель, темпе ратура, кратность экстракции.
Экстракция ПГА из биомассы клеток растворителями, при варьировании соста ва экстрагентов, позволяет достичь полноты извлечения полимера (87±5) % и мини мизировать примеси (таблица 1).
Добавление к хлороформу или дихлорметану этилового спирта и проведение трёхкратной экстракции с нагреванием повышает выход П3ГБ до 92 %, однако при последующем добавлении гексана для осаждения полимера, образуется азеотропная смесь гексан - этанол. Полученные образцы содержали остаточные липиды и жирные кислоты в количестве 2 %. Моле кулярная масса (Мв) образцов со ставила 5,8 - 6,4 г/моль, коэффи циент полидисперсности (ПД) (3,3±0,5).
Применение предваритель ной обработки биомассы щелоч ным спиртом с последующей об работкой ацетоном позволило по высить выход и чистоту полимера, однако имело значительное паде Рисунок 5 – Молекулярно-массовое распределение ние молекулярной массы полиме П3ГБ выделенного модифицированным методом ра от 6,2105 до 3,4105 г/моль (ри сунок 5).
Для получения высокоочищенного полимера необходима вторая стадия очист ки, которая заключается в повторном растворении и осаждении, что приводи к двой ному расходу растворителей. Образование азеотропных смесей делает невозможным возврат растворителей в процесс и сопряжено с образованием больших объёмов орга нических отходов.
Таблица 1 – Результаты экстракции П3ГБ органическими растворителями различными способами Способ экстракции, Время Выход Чистота Используемые Расход реагентов, кг/кг П3ГБ экстрагенты экстракции, ч П3ГБ, % П3ГБ, % реагенты:
без с учётом экстрагент, регенерации регенерации осадитель Экстракция настаиванием 24 74 97,0 Хлороформ 24,5 24, 49,0* Хлороформ 1:20 Гексан 49, Экстракция настаиванием 24 76 97,5 Дихлорметан 21,5 2, Дихлорметан 1:20 Гексан 43,0 4, Трёхкратная экстракция нагреванием 6 82 97,8 Хлороформ 33,1 33, Хлороформ Гексан 66,0 66, Трёхкратная экстракция нагреванием 6 83,5 97,6 Дихлорметан 29,4 3, Дихлорметан Гексан 58,7 4, Трёхкратная экстракция нагреванием 6 92,3 98,0 Дихлорметан 17,7 2, 10,1** Дихлорметан - этанол Этанол 10, (52,8)*** Гексан 52, Модифицированный метод: предвари- 8 94,8 100 Этанол 10,2 3, 2,04**** тельная обработка биомассы спиртом Ацетон 2, при рН 10 - 11 и ацетоном Дихлорметан 12,9 2, Дихлорметан NaOH 0,01 0, Гексан 22,6 4, * - азеотропная смесь хлороформ гексан (72:28);
** - азеотропная смесь этиловый спирт-дихлорметан (3,5:96,5);
*** - азеотропная смесь гексан-этанол (79:21);
**** - азеотропная смесь ацетон-вода (88:12) «Безреагентный» метод экстракции. Исследован метод выделения полимера с применением поверхностно-активных веществ, обработкой клеточной массы различ ными концентрациями додецилсульфата натрия (ДДС-Na) при различных температу рах и времени обработки (таблица 2).
Таблица 2 - Выход полимера П3ГБ после обработки биомассы ДДС-Na Мв Номер Концентра- Температура, Выход Содержа- Содержа- ПД образ- ция ДДС-Na, С полимера, % ние при- ние липи- г/моль ца % месей, % дов, % 16,65 7,5 3,4 7, 1 1 20 96, 14,37 5,3 3,5 6, 2 2,5 20 94, 12,92 4,8 3,9 4, 3 5 20 93, 14,91 4,8 4,2 4, 4 1 40 95, 12,94 2,1 4,9 3, 5 2,5 40 92, 9,91 1,9 5,8 3, 6 5 40 90, 12,78 1,1 5,1 2, 7 1 60 93, 9,30 0,8 6,2 2, 8 2,5 60 89, 7,07 0,4 6,3 2, 9 5 60 87, Данный метод позволил получить образцы полимера с низким остаточным со держанием липидов (0,4 – 0,6 %), однако в полимере помимо липидов и жирных кис лот, зафиксировано наличие белковых веществ в концентрации до 6 %.
С целью повышения полноты извлечения полимера и снижения количества примесей в нем исследован комбинированный метод, при котором биомассу предва рительно обрабатывали раствором 5 %-го ДДС-Na в течение часа при 60 0С, затем центрифугировали и отмывали водой. Далее проводили очистку дихлорметаном с по следующим осаждением П3ГБ гексаном. Для этого полимер, полученный на первой стадии, трёхкратно экстрагировали равными порциями дихлорметана в соотношении 1:10 при нагревании.
В полученных образцах примеси отсутствовали. Степень извлечения П3ГБ со ставила 98 – 99 %. Молекулярная масса составила от 6,2105 - 6,8105 г/моль, коэффи циент полидисперсности для образцов лежал в пределах 2,9 – 3,2.
Учитывая сложность процесса экстракции ПГА из биомассы бактерий, выпол нена оптимизация технологии, основанная на регрессионном анализе многофакторно го эксперимента. Найдены оптимальные параметры процесса: концентрация ДДС-Na 5 %;
температура 60 0С, время обработки 40 мин.
5 Технология синтеза ПГА и её технико-экономическое обоснование Технология опытного производства ПГА. Получены исходные данные для про ектирования опытного производства, основанные на экспериментально достигнутых показателях синтеза ПГА культурой C. eutrophus В-10646 на глюкозе, которые вклю чают: хемостатно-периодический, двустадийный процесс (лимит азота/среды без азо та);
стартовая концентрация инокулята (10±2) г/л;
время культивирования 65 ч;
выход биомассы (110±10) г/л;
содержание ПГА (85±5) %;
расход глюкозы (2,9±0,1) кг/кг ПГА;
расход воздуха 20 м3/кг ПГА;
способ экстракции комбинированный, продуктив ности процесса по биомассе и ПГА, соответственно, 1,7 и 1,4 г/лч;
расход ДДС-Na 0,61 кг/кг ПГА;
расход органических растворителей 4,4 кг/кг ПГА.
На основании анализа полученных результатов и выполненного технико экономического анализа лабораторных процессов синтеза ПГА для масштабирования выбран вариант процесса, реализуемый на глюкозе. Разработана технологическая схе ма процесса (рисунок 6).
На предферментационной стадии осуществляется подготовка и стерилизация оборудования водяным паром в течение 60 мин при давлении 0,12 МПа. Для получе ния пара используется электрический парогенератор (2), производительностью 50 кг/ч.
Стеклянные колбы, а также маточные растворы стерилизуются в автоклаве (3). Для приготовления среды используют пять растворов А, Б, В, Г, Д (Раствор А – К3РО4, Na3РО4, MgSO4;
Раствор Б - C6H5O7FenH2O;
H3BO3;
Раствор В - CuSO4;
ZnSO4;
NiCl2;
CoCl2;
MnCl2;
NaMoO4;
Раствор Г - (NH2)2CO;
Раствор Д - C6 H12O6 или синтез-газ) После стерилизации в колбах (ёмкость 2 л) готовят среду и вносят культуру C. eu trophus В10646. После чего колбы устанавливают в шейкер-инкубатор (4) и инкуби руют в течение 20 – 22 ч при 30 0С. Затем полученный инокулят переносят в фермен тёр-инокулятор (5), в котором уже находится приготовленная среда в количестве 10 л.
Процесс выращивания биомассы в ферментёре-инокуляторе длится 4 – 6 ч в режиме хемостата. Это позволяет получить необходимое для засева производственного аппа рата количество инокулята, который концентрируют на центрифуге (8). Полученный инокулят в количестве 100 л по стерильной посевной линии поступает в производ ственный ферментёр (10). Культивирование происходит в две стадии. На первой ста дии происходит накопление биомассы в течение 24 ч до концентрации 40 – 50 г/л. На данном этапе используются подпитывающие растворы карбамида и глюкозы. На вто рой стадии лимитируют подачу азота (подпитывающий раствор карбамида). В этот момент концентрация биомассы перестаёт увеличиваться, а содержание полимера в клетках растёт. Длительность стадии составляет 30 ч.
После процесса ферментации полученная культуральная жидкость сливается в сборник (11), откуда далее поступает в вакуум-выпарную установку (12), где концен трируется до 300 – 350 г/л, а затем перистальтическим насосом (6) подается в сборник упаренной суспензии (18). Упареную суспензию подвергают дальнейшему концен трированию в центрифуге (17). Полученная паста с влажностью 50 % подаётся в экс трактор (15);
туда же из сборника чистого растворителя (13) подаётся 5 %-й раствор додецилсульфата натрия в количестве 4 – 5 л/кг пасты. Процесс экстракции ведут при температуре 60 0С в течение часа, с постоянным перемешиванием.
Затем полимер отделяют от экстракта в центрифуге (17), полученный фугат направляют на очистку, а полимер подаётся в сборник (16), оснащенный мешалкой, где промывается дистиллированной водой. От промывной жидкости готовый полимер отделяется в центрифуге (17), затем сушится и стерильно упаковывается. Для получе ния высокоочищенного полимера, производят его доочистку при растворении в ди хлорметане с последующим осаждением гексаном.
Оборудование: 1 – компрессор;
2 – парогенератор;
3 – автоклав вертикальный 4 – шейкер-инкубатор;
5 – ферментёр-иннокулятор;
6 – насос перисталь тический;
7, 9, 11, 13, 14 – ёмкости;
8, 17 – центрифуга;
10 – производственный ферментёр;
12 – вакуум-выпарная установка;
15 – экстрактор с мешал кой;
16 – ёмкость с мешалкой;
20 – аквадистиллятор электрический.
Раствор А – К3РО4, Na3РО4, MgSO4;
Раствор Б - C6H5O7FenH2O;
H3BO3;
Раствор В - CuSO4;
ZnSO4;
NiCl2;
CoCl2;
MnCl2;
NaMoO4;
Раствор Г - (NH2)2CO Рисунок 6 – Технологическая схема процесса производства ПГА Технико-экономическое обоснование. Реализация устойчивых и регламентиро ванных процессов синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В10646 в масштабированном варианте (в биореакторах объемом от 12 до 60 л) позволило определить материальные затраты и выполнить предварительную технико-экономическую оценку способов по лучения полимеров при использовании различных субстратов.
Расчеты выполнены с учетом достигнутых продукционных показателей при различных субстратных сценариях, прогнозируемый объем производства 100 000 т/г (таблица 3).
Таблица 3 - Технико-экономические показатели производства ПГА Экономический показатель Глюкоза Фруктоза Газовый субстрат Капитальные затраты, руб./кг ПГА 45,44 45,44 50, Оплата труда, руб./кг ПГА 7,36 7,36 7, Административные расходы, руб./кг ПГА 2,88 2,88 2, Стоимость сырья, руб./кг ПГА 148,4 208,4 635, Коммунальные платежи, руб./кг ПГА 13,44 13,44 13, Утилизация отходов, руб./кг ПГА 11,2 11,2 11, Себестоимость, руб./ кг ПГА 228,7 288,7 721, Платежи по налогам, руб./кг ПГА 26,9 18,1 Рентабельность при цене реализации 350 руб./кг, % 47 18 Срок окупаемости, год 3,1 8,0 Прогнозная себестоимость продукта по выполненным расчетам может составить в зависимости от типа субстрата от 229 до 290 руб./кг ПГА. Вариант производства на газовом субстрате при использовании модельных газов приводит к высокой себестоимости продукта и оказывается не рентабельным. Наиболее перспективным субстратом из сахаров является глюкоза, фруктоза имеет более высокую стоимость.
ВЫВОДЫ 1. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры Сupriavi dus eutrophus В10646 и при автотрофных и гетеротрофных условиях питания в режиме синтеза резервных полигидроксиалканоатов;
показано, что максимальные выходы по лимеров на газовом субстрате (смеси Н2, СО2 и О2) составляют (75 5) % при экономи ческих коэффициентах по H2, O2, CO2= 1,1;
0,25;
0,36;
на глюкозе – (90 5) % при эко номическом коэффициенте 0,3.
2. На основе сравнительного исследования проточного и периодического спо собов выращивания С.eutrophus в автотрофной культуре в ферментере с коэффициен том массопереноса по кислороду 460 ч-1, различающихся режимом подачи в культуру потока лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего аккумуляцию полигид роксиалканоатов, предложен хемостатно-периодический процесс, обеспечивающий продуктивность процесса по биомассе и полимеру до 0,71 и 0,57 г/лч при длительно сти ферментационного цикла не более 70 ч.
3. Реализован и исследован периодический процесс синтеза полигидроксиалка ноатов культурой С.eutrophus на глюкозе при изменении внутриклеточного пула по лимера, физиологической активности и плотности инокулята. Установлено, что при текущей концентрации глюкозы от 5 до 35 г/л и исходном содержании полимера в инокуляте не выше 10 %, концентрация биомассы и содержание полимера достигают (110 10) г/л и (90 5) % при продуктивности процесса 1,7 и 1,45 г/л ч, соответственно, что в 2 раза выше ранее достигнутых показателей R. eutophus B5786 на фруктозе.
4. Разработаны режимы синтеза полигидроксиалканоатов различного химиче ского состава, включающие дозированную подачу в культуру второго углеродного субстрата – солей алкановых кислот (валерата, гексаноата) и -бутиролактона, в пре делах установленных допустимых концентраций. Синтезированы образцы, различа ющиеся степенью кристалличности (от 12 до 76 %) и термостабильностью.
5. На основании проведённых исследований процессов экстракции полигидрок сиалканоатов из биомассы клеток разработан метод, обеспечивающие выход высоко очищенного полимера более 96 % без существенного изменения молекулярно массовых характеристик.
6. Выполнено технико-экономическое обоснование производства при различ ных субстратных сценариях. Показано, что в зависимости от типа ростового субстрата (электролизный водород+СО2+О2), синтез-газ+О2, глюкоза или фруктоза затраты на получение полимера варьируют от 230 до 730 руб./кг.
7. На основании экспериментальных данных и их анализа разработана техноло гия эффективного синтеза ПГА на глюкозе с использованием водородных бактерий C. eutrophus. Технология реализована в проекте опытного производства «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов». Проект прошел государственную экспертизу (положительное заключение экспертизы № 24-1-50196-12).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Fundamental basis of production and application of biodegradable polyhydroxyal kanoates / T.G. Volova, E.I. Shishatskaya, N.O. Zhila, E.G. Kiselev, P.V. Mironov, A.D. Va siliev, I.V. Peterson, A.J. Sinskey // Journal Siberian Federal university. ser. Biol. – 2012. – Т.5. – № 3. – С. 280-299, автора – 0,15 п.л.
2. Киселев, Е.Г. Технико-технологические основы производства разрушаемых полигидроксиалканоатов / Е.Г. Киселев, О.Н. Шишацкий, Э.Дж. Сински // Журнал Сибирского федерального университета. сер. Биол. -2012.-Т.5. - № 3. – С.300-310, ав тора – 0,21 п.л.
3. Киселев, Е.Г. Оптимизация процесса экстракции ПГА из биомассы / Е.Г. Ки селев // Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы II-го науч.
семинара. – Красноярск: СФУ, 2012. – С. 21-23, автора – 0,19 п.л.
4. Физико-химические свойства полигидроксиалканоатов различного химиче ского строения / Н.О. Жила, Е.И. Шишацкая, Е.Г. Киселев, А.Д. Васильев, П.В. Миро нов, A.J. Sinskey // Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы II-го науч. семинара. – Красноярск: СФУ, 2012. – С. 24-25, автора – 0,02.
5. Киселев, Е.Г Разработка процессов экстракции поли-3-гидроксибутирата из биомассы Ralstonia Eutropha / Е.Г Киселев // Лесной и химический комплексы проблемы и решения: материалы всерос. науч.-практ. конф. – Красноярск: СибГТУ, 2012. – С. 153-155, автора – 0,19 п.л.
Подписано в печать « ».. Формат 60 х 84/ Усл. п.л. Тираж 100 экз.
Типография «ДарМа-печать»
660036 Красноярск, Академгород, 50/28, оф. тел. 290-72-