Морфофизиологические особенности и продуктивность редьки масличной (raphanus sativus l. var. oleifera metzg) при инокуляции семян ассоциативными ризобактериями в условиях нормального увлажнения и почв

На правах рукописи

ЮРГИНА

Вера Семновна

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И

ПРОДУКТИВНОСТЬ РЕДЬКИ МАСЛИЧНОЙ (Raphanus sativus L. var.

oleifera Metzg) ПРИ ИНОКУЛЯЦИИ СЕМЯН АССОЦИАТИВНЫМИ

РИЗОБАКТЕРИЯМИ В УСЛОВИЯХ НОРМАЛЬНОГО УВЛАЖНЕНИЯ И

ПОЧВЕННОЙ ЗАСУХИ

03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2011 2

Работа выполнена на кафедре ботаники федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский государственный педагогический университет им.

А.И. Герцена».

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Воробейков Геннадий Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Шишова Мария Федоровна (Санкт-Петербургский государственный университет) доктор биологических наук, профессор Вишнякова Маргарита Афанасьевна (Всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН)

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

Защита состоится «_»2011 г. в «_» ч на заседании объединенного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого почвенный факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М. Горького Санкт Петербургского государственного университета.

Факс для отзывов: +7 (812) 328 08 52.

Автореферат разослан «»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Стимулирующие рост растений ассоциативные ризобактерии (plant growth-promoting rhizobacteria, или PGPR) оказывают полифункциональное влияние на физиологические процессы растений, урожайность и качество растительной продукции (Кожемяков и др., 2004;

Завалин, 2005;

Кацы, 2007;

Белимов, 2008), поэтому они все шире применяются в отечественном и мировом земледелии. Вместе с тем, эффективность микробно-растительного взаимодействия требует тщательного подбора сорта и штамма, позволяющего в наибольшей степени реализовать их генетическое соответствие и проявление физиолого-биохимических процессов, определяющих более высокую продуктивность растений (Тихонович, Круглов, 2005;

Кондрат, 2007;

Лебедев, 2008). Важную практическую ценность представляет выявление перспективы применения ассоциативных ризобактерий для повышения устойчивости растений к почвенной засухе, особенно в критический период онтогенеза растений. Данная проблема в настоящее время еще только начинает изучаться. Сказанное полностью относится к редьке масличной (Raphanus ценной sativus L. var. oleifera Metzg), сельскохозяйственной культуре, приобретающей все более широкое распространение в силу ее кормовых, сидеральных и медоносных качеств.

В связи с этим была поставлена следующая цель: изучить влияние ассоциативных штаммов ризобактерий на морфофизиологические характеристики и продуктивность редьки масличной при нормальном увлажнении и почвенной засухе в критический период развития.

Гипотеза: для установления эффективных растительно-микробных ассоциаций, наряду с выявлением перспективного штамма, необходимо создание благоприятного азотного фона, особенно на начальных этапах роста и развития растений, так как только при этом растение может сформировать хорошо развитую листовую поверхность и, благодаря этому, увеличить количество органических корневых выделений, являющихся энергетическим субстратом для ризосферной микрофлоры и интродуцируемого штамма ризобактерий. В результате ростстимулирующей и протекторной активности ассоциативного штамма, включая улучшение водного режима, минерального питания, фотосинтетической способности и усиление роста корневой системы, повышается продуктивность растений в условиях нормального водоснабжения и меньше нарушаются физиологические процессы в условиях кратковременной почвенной засухи.

В соответствии с поставленной целью и сформулированной гипотезой были определены следующие задачи:

- выявить ассоциативные штаммы ризобактерий, проявляющие стимулирующий эффект на всхожесть семян и рост проростков редьки масличной;

- установить оптимальную дозу минерального азота для формирования эффективных растительно-микробных взаимоотношений;

- определить в вегетационных и полевых опытах влияние отобранных штаммов бактерий на некоторые физиолого-биохимические процессы редьки масличной (рост, водный режим, минеральное питание и др.);

- исследовать изменение ряда физиологических процессов, являющихся критериями засухоустойчивости, в зависимости от применяемого биопрепарата в условиях почвенной засухи;

- изучить особенности формирования продуктивности редьки масличной при инокуляции бактериальными препаратами в условиях нормального увлажнения и почвенной засухи.

Научная новизна. В условиях Северо-Западного региона впервые показано, что бактериальные препараты – 5С-2 (Variovorax paradoxus, штамм 5С-2), мизорин (Arthrobacter mysorens, штамм 7) и флавобактерин (Flavobacterium sp., штамм Л 30) – при рациональном их сочетании с минеральными удобрениями, особенно азотом, перспективны для повышения продуктивности редьки масличной в условиях как нормального увлажнения, так и почвенной засухи. Данные штаммы в условиях кратковременной почвенной засухи стабилизируют ростовые процессы растений, способствуют меньшему сокращению листовой поверхности, незначительному снижению содержания фотосинтетических пигментов, а также препятствуют нарушению работы фотосинтетического аппарата и целостности мембран, поддерживая тем самым на более высоком уровне продукционные процессы растений редьки масличной.

Практическая значимость. Результаты исследования показали, что при инокуляции семян редьки масличной ассоциативными ризобактериями необходимо внесение при посеве оптимальных доз минеральных удобрений (N60P60K60), что важно для установления эффективных взаимоотношений в системе «растение-бактериальный штамм». Биопрепараты на основе ассоциативных ризобактерий (5С-2, мизорин, флавобактерин) могут внести существенный вклад в решение проблемы повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, в частности к засухе, что позволит расширить границы ее выращивания за счет засушливых регионов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для установления эффективных растительно-микробных ассоциаций, наряду с выявлением перспективного штамма, необходимо создание благоприятного азотного фона, особенно на начальных этапах роста и развития растений.

2. Совместное применение оптимальных доз минеральных удобрений и определенных бактериальных препаратов приводит к повышению эффективности растительно-бактериального взаимодействия, что сопровождается усилением физиологических процессов и увеличением продуктивности растений редьки масличной.

3. Применение подобранных бактериальных препаратов препятствует необратимому нарушению основных физиологических процессов при почвенной засухе (роста, водного режима, минерального питания, развития листовой поверхности, пигментного состава и работы фотосинтетического аппарата), что уменьшает падение семенной и биологический продуктивности редьки масличной в этих условиях.

Апробация результатов исследования. Часть работы выполнена при поддержке гранта Правительства Санкт-Петербурга 2009 года № 2.6./29-04/033.

Результаты исследований докладывались на IX и Х окружных конференциях молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2008, 2009), VIII Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2009), межвузовской конференции молодых ученых «Герценовские чтения» (Санкт-Петербург, 2009, 2010, 2011), Международном агропромышленном конгрессе (Санкт-Петербург, 2009, 2010), 14 Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт Петербург, 2009), Международной научной конференции, посвященной 80 летию со дня рождения академика РАСХН В.Н. Ефимова (Санкт-Петербург Пушкин, 2010), IX Международной научно-практической конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений» (Мичуринск, 2010), XI Всероссийской выставке НТТМ (Москва, 2011), VII Съезде общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам опубликовано 19 работ, из них 3 в ведущих рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, методов и условий проведения исследований, экспериментальной части, состоящей из 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, включая 11 рисунков, 28 таблиц, 21 приложение. Список литературы содержит 214 наименований, в том числе 56 – на иностранном языке.

Объекты, методы и условия проведения исследований Для решения поставленных задач были проведены исследования по инокуляции семян редьки масличной (сорт Радуга) ризобактериями в 2008- гг. на биостанции РГПУ им. А.И. Герцена в поселке Вырица Гатчинского района Ленинградской области.

В лабораторных опытах были исследованы 10 бактериальных препаратов.

Для последующего изучения были отобраны: препарат на основе Variovorax paradoxus, штамм 5С-2 (далее 5С-2), мизорин (Arthrobacter mysorens, штамм 7), флавобактерин (Flavobacterium sp., штамм Л30).

В вегетационных сосудах опытные растения подвергали почвенной засухе (ПЗ) в фазу бутонизации в течение 10 дней. Контрольные растения находились в течение всего периода вегетации при нормальном увлажнении (НУ).

В полевых опытах растения выращивались с применением возрастающих доз минерального азота, а также при инокуляции семян отобранными штаммами ризобактерий на фоне полного минерального удобрения и с исключением минерального азота.

На протяжении всего периода вегетации в полевых и вегетационных опытах проводились измерения высоты растений, подсчеты количества листьев, побегов ветвления, соцветий по фазам развития растений. Площадь листьев определяли методом высечек (Третьяков и др., 1990).

По окончании почвенной засухи были проанализированы некоторые физиологические процессы, используемые в качестве критериев засухоустойчивости: содержание воды (Dhanda, Sethi, 1998;

Гунес и др., 2008), водный дефицит (Удовенко, 1988;

Гончарова, 2005), водоудерживающая способность (Удовенко, 1988;

Полевой и др., 2001), водопоглощающая способность (Кожушко, 1982;

Полевой и др., 2001), содержание свободного пролина по методике L.S. Bates et al. (1973), в модификации В.Н. Андрющенко и др. (1981) (Курьянович, Кожушко, 1990). Проницаемость мембран (Cekic, Paulsen, 2001) и относительную степень их повреждения (Чиркова и др., 1991;

Полевой и др., 2001) оценивали по выходу электролитов с помощью портативного кондуктометра Cond 315i. Содержание хлорофилла учитывали с помощью спектрофотометра СФ 46 (Гавриленко и др., 1975). Индекс чувствительности растений к засухе рассчитывали на основе изменения сухой массы (Dencic et al., 2000;

Гунес и др., 2008). Исследования отражающей способности поверхности листьев исследуемых растений в видимом свете (400 750 нм) выполнены с помощью регистрирующего спектрофотометра СФ- (ЛОМО) (Авраменко, Есельсон, 1979) на базе Санкт-Петербургского университета низкотемпературных и пищевых технологий. С помощью портативного флуорометра Junior PAM (Walz, Германия) были записаны индукционные кривые флуоресценции хлорофилла, на основании которых с помощью компьютерной программы WinControl 3 рассчитаны показатели, характеризующие работу фотосистемы II (ФСII). Содержание элементов минерального питания определяли в сухой массе после мокрого озоления по Гинзбургу: фосфор – молибдатным методом на фотоэлектроколориметре КФК 2УХЛ 4.2, калий – на пламенном фотометре ПАЖ-3 (Ефимов и др., 1988).

Общий азот определяли на автоматическом устройстве Kjeltec 2003 Analyzer Unit на базе Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Количество нитратов измеряли с помощью ионоселективного нитратного электрода ионометрическим методом согласно ГОСТ 29270-95 (Банкин и др., 2005).

Продуктивность зеленой массы учитывали укосным методом в начале плодообразования. В вегетационном опыте в фазу полной спелости учитывали семенную продуктивность растений разных вариантов, а также мощность корневой системы путем отмывки и последующего взвешивания корней.

Статистическую обработку результатов проводили методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1985) с использованием Microsoft Excel, а также программы Statistica 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг наиболее эффективных штаммов ризобактерий, проявляющих стимулирующий эффект на всхожесть семян и рост проростков редьки масличной От энергии прорастания и всхожести семян зависит активность формирующихся проростков и дальнейшее развитие растений. Действие микроорганизмов и их метаболитов на биохимические процессы прорастающего семени происходит в тот период, когда проросток еще использует питательные вещества эндосперма. Причинами положительного действия бактерий в отношении прорастающих семян следует считать выделение ими биологически активных веществ (витаминов и соединений гормональной природы), а также ингибирующее влияние самих бактерий на фитопатогены, вследствие синтеза ими антибиотических веществ (Кравченко, 2000;

Макаров, 2002).

В ходе лабораторных опытов выявлено, что все используемые в исследованиях биопрепараты оказали существенное влияние на энергию прорастания и всхожесть семян редьки масличной (рис. 1). Наилучшие результаты отмечены в вариантах с 5С-2 (69%), мизорином (66%), флавобактерином (57%) и 17-1 (54%).

НСР05=7,3 НСР05=4, Рис. 1. Энергия прорастания и всхожесть семян редьки масличной в лабораторном опыте в зависимости от штамма PGPR Измерение проростков на 7 сутки показало, что под влиянием ассоциативных ризобактерий увеличилась длина зародышевого корня и гипокотиля. При этом у проростков, инокулированных 5С-2, мизорином, флавобактерином и 17-1, длина корня в 2-3 раза превышала контрольный показатель (рис. 2).

Рис. 2. Внешний вид проростков редьки масличной при инокуляции семян PGPR (на 7-е сутки после инокуляции).

Обозначения: 1 – контроль, 2 – мобилин, 3 – ризоагрин, 4 – азоризин, 5 – агрофил, 6 – бактосан, 7 – 17-1, 8 – флавобактерин, 9 – мизорин, 10 – 5С-2.

Таким образом, стимулирующее действие ассоциативных ризобактерий проявляется уже на этапе прорастания семян, что дает формирующимся растениям «стартовые» преимущества в освоении доступной площади произрастания.

Определение оптимальной дозы минерального азота при выращивании редьки масличной Редька масличная отзывчива на внесение минеральных удобрений, что проявляется в повышении семенной и биологической продуктивности, улучшении качества зеленой массы. Однако рациональная доза минеральных удобрений, особенно азота, должна быть установлена для конкретных почвенно-климатических условий. В результате выполненных нами полевых опытов было установлено, что с увеличением дозы минерального азота у опытных растений возрастала продуктивность зеленой массы и содержание абсолютно сухого вещества (табл. 1).

При проведении полевых опытов с возрастающими дозами азота важно было определить не только величину урожайности, но и качество растительной продукции. Одним из ее показателей является содержание нитратов в зеленой массе. Избыточное накопление нитратной формы азота (ПДК составляет 500 мг NO3-/кг сырой массы растений) делает опасным использование ее в качестве корма для животных. При определении в исследуемых растениях содержания нитратов была отмечена следующая закономерность. При внесении небольших доз азотных удобрений содержание нитратов не превышало установленной нормы ПДК. Применение флавобактерина на фоне возрастающих доз минерального азота способствовало снижению концентрации нитратов, особенно на высоких дозах. Однако в варианте с N150 даже при обработке семян бактериальным препаратом количество нитратов превышало ПДК на 28%.

Таблица 1.

Зеленая масса, масса абсолютно сухого вещества и содержание нитратов в зависимости от дозы азотных удобрений и применения флавобактерина Абсолютно Нитраты, сухое вещество, мг NO3-/кг сырой Зеленая масса, ц/га Вариант ц/га массы 1 2 1 2 1 Контроль 158,0±18,1 216,0±21,1 23,9±4,3 42,6±5,3 318±9,7 200±8, P60K60 (РК) 198,8±16,8 240,0±28,1 30,2±3,7 51,7±7,3 375±10,4 217±10, N30PK 257,8±15,8 293,5±28,5 37,7±2,6 59,1±6,2 425±13,4 252±15, N45PK 268,0±12,4 339,5±28,4 41,1±2,4 64,0±4,2 436±18,7 262±22, N60PK 285,8±15,7 348,0±31,2 44,4±3,1 72,0±5,3 476±20,8 332±24, N90PK 306,8±15,6 353,5±36,5 49,9±6,2 81,6±6,2 579±20,2 383±30, N120PK 339,8±23,7 398,0±37,1 54,3±2,7 92,3±7,2 726±22,4 415±38, N150PK 354,3±32,3 426,5±32,3 61,4±6,6 96,4±7,6 858±23,6 638±39, НСР05 18,1 27,1 4,8 12,7 59,6 89, Примечание: 1 – без инокуляции, 2 – инокулированные флавобактерином Таким образом, инокуляция семян редьки масличной подобранными штаммами ризобактерий может нивелировать неблагоприятное последействие высоких доз азотных удобрений, способствуя повышению качества зеленой массы. В связи с этим, на дерново-подзолистых почвах рациональной дозой азотных удобрений, вносимых при инокуляции семян, следует считать N60Р60К60 из расчета в кг/га. Более высокие дозы азотных удобрений способствуют накоплению в зеленой массе избыточного содержания нитратов, значительно превышающих ПДК.

Роль минерального азота в интенсификации роста и развития редьки масличной при инокуляции семян ассоциативными ризобактериями Для повышения эффективности бактериальных препаратов необходимо знать особенности микробно-растительного взаимодействия и их роль в интенсификации роста и развития растений в разных экологических условиях.

В связи с этим нами были проведены сравнительные исследования по инокуляции семян редьки масличной ризобактериями на фоне рациональной дозы минеральных удобрений, установленной в результате полевых опытов (N60P60K60), и с исключением азота из полного минерального удобрения (P60K60).

При исключении минерального азота стимулирующий эффект ризобактерий не наблюдался. Возможная причина такого явления заключается в следующем. В связи с тем, что первоначальное питание проростка происходит только за счет эндосперма, то выделение продуктов метаболизма, являющихся основными питательными веществами для бактериального компонента, невелико. Микроорганизмы, неспособные усваивать азот воздуха в процессе азотфиксации, должны иметь альтернативный источник азотного питания в почве. При его отсутствии бактерии могут конкурировать с проростком за минеральные вещества почвы. В результате проростки оказываются ослабленными, что сказывается на их дальнейшем развитии и формировании урожая.

Внесение при посеве полного удобрения, включающего минеральный азот (N60), на дерново-подзолистых супесчаных почвах позволяет более полно реализовать в полевых условиях возможности микробно-растительной ассоциации. Вследствие этого, увеличивается полевая всхожесть семян, растения быстрее выходят на поверхность, начиная синтезировать органические вещества в процессе фотосинтеза. Количество корневых выделений при этом увеличивается, что создает преимущество для интродуцируемой микрофлоры перед аборигенными микроорганизмами ризосферы и позволяет им активно колонизировать растущие корни, снабжая растения стимуляторами роста и минеральными элементами.

В связи с этим, у инокулированных растений увеличилась площадь листьев, а также содержание общего хлорофилла по сравнению с контрольным вариантом (без инокуляции), что по-видимому, способствовало интенсификации фотосинтетических процессов у опытных растений. Этот факт подтверждается тем, что урожай зеленой массы у растений на фоне полного минерального удобрения вырос на 12-20% относительно контроля.

Кроме того, под влиянием эффективных штаммов ризобактерий на фоне полного минерального удобрения в надземных органах редьки масличной происходит увеличение накопления азота, фосфора и калия (табл. 2).

Содержание азота в сухой массе обработанных растений было на 10-32% больше по сравнению с контрольным вариантом. Количество фосфора у инокулированных растений увеличилось на 25-47%, калия – на 15-50%.

Таблица 2.

Влияние инокуляции семян PGPR на накопление азота, фосфора и калия в надземной массе редьки масличной (%/сухое вещество) на фоне Р60К60 на фоне N60Р60К Вариант Р2О5 К2 О Р2О5 К2 О N N Контроль 1,55±0,17 0,55±0,08 2,99±0,56 1,73±0,18 0,57±0,06 3,13±0, 5С-2 (V. paradoxus) 1,41±0,20 0,47±0,07 2,39±0,29 2,29±0,19 0,84±0,08 4,69±0, Мизорин 1,33±0,20 0,43±0,05 2,14±0,36 2,10±0,28 0,76±0,04 4,17±0, Флавобактерин 1,22±0,31 0,35±0,09 1,65±0,26 1,91±0,24 0,71±0,06 3,59±0, НСР05 0,05 0,08 0,28 0,07 0,08 0, Таким образом, совместное применение минеральных и бактериальных удобрений при оптимальном их сочетании приводит к интенсификации основных физиологических процессов и увеличению продуктивности растений редьки масличной.

Перспективы использования ассоциативных ризобактерий для повышения засухоустойчивости редьки масличной В ответ на стресс, вызванный засухой, в растениях происходит ряд морфофизиологических изменений. В первую очередь снижается содержание воды, что приводит к нарушениям основных физиологических процессов и уменьшению продуктивности.

Вода является основным компонентом живого, составляя в среднем 70 90% от общей массы растений. Растения редьки масличной, растущие при нормальном увлажнении (НУ), в фазу начала цветения содержали в среднем 73 85% воды (табл. 3). После почвенной засухи (ПЗ) содержание воды в растениях в среднем составляло 44-64%. Применение ризобактерий привело к сохранению оводненности растений, но в конце засушливого периода растения все же испытывали значительный водный дефицит. Уменьшению водного дефицита у обработанных растений способствовало развитие более мощной корневой системы, которая в условиях засухи может лучше обеспечивать растения влагой. Кроме того, у инокулированных растений редьки масличной отмечено повышение водоудерживающей способности. Наибольшая водоудерживающая способность при ПЗ наблюдалась в варианте с 5С-2.

Таблица 3.

Изменение показателей водного режима растений в зависимости от используемого штамма ризобактерий и увлажнения почвы Содержание воды, % Водный дефицит, % Вариант НУ ПЗ ПЗ/НУ НУ ПЗ Контроль 73±5,0 44±5,0 0,60 28±5,0 57±1, 5С-2 (V. paradoxus) 85±15,0 64±10,0 0,76 16±3,0 36±9, Мизорин 81±10,0 61±10,0 0,75 19±2,0 41±8, Флавобактерин 78±15,0 61±10,0 0,79 23±2,5 39±7, НСР05 2,8 1,9 2,8 2, После завядания листья растений данного варианта теряли 15% от общего содержания воды, тогда как необработанные растения в тех же условиях теряли 22% воды. Использование мизорина и флавобактерина также сокращало потери воды, которые составляли в этих же условиях 17% и 18% соответственно.

Известно, что клетки засухоустойчивых растений способны снижать свой водный потенциал за счет повышения внутриклеточного осмотического давления – процесса, получившего название осморегуляции, осуществляемой преимущественно за счет накопления низкомолекулярных органических соединений – осморегуляторов или осмолитов (Taylor, 1996;

Кузнецов, Шевякова, 1999). В качестве осморегуляторов могут рассматриваться сахара и аминокислоты. Одной из таких аминокислот является пролин, содержание которого сильно возрастает при засухе. Накопление при стрессе свободного пролина рассматривают как один из механизмов биохимической адаптации.

Нашими исследованиями установлено, что у растений редьки масличной содержание свободного пролина после 10-дневной почвенной засухи увеличилось в среднем на 21,5 мг по сравнению с растениями, растущими в нормальных условиях увлажнения (табл. 4). Наибольшее содержание данной аминокислоты после ПЗ отмечено в варианте со штаммом 5С-2, превышающее значение контроля в тех же условиях на 52%. Применение мизорина и флавобактерина также способствовало повышению концентрации пролина на 32% относительно контроля.

Таблица 4.

Изменение содержания свободного пролина и проницаемости мембран в условиях кратковременной почвенной засухи в зависимости от штамма PGPR Содержание пролина, Проницаемость мг/100 г сырой массы мембран, % Вариант НУ ПЗ НУ ПЗ Контроль 1,3±0,26 18,0±0,31 8±0,5 24±1, 5С-2 (V. paradoxus) 2,0±0,33 27,4±0,40 5±0,3 9±1, Мизорин 2,0±0,11 23,9±0,56 6±0,4 13±1, Флавобактерин 1,9±0,11 23,8±0,44 7±0,5 14±1, НСР05 0,2 2,0 1,0 2, Наряду с определением содержания пролина, нами проанализирована проницаемость мембран, являющаяся интегральным показателем функционального состояния растительных тканей. Выявлено, что в условиях засухи увеличение проницаемости мембран отмечается у растений всех вариантов, но в меньшей степени у инокулированных растений (табл. 4). В частности, при бактеризации семян ризобактериями проницаемость мембран после ПЗ увеличилась в 1,8-2,0 раза относительно соответствующих вариантов при НУ, тогда как у неинокулированных растений после ПЗ данный показатель вырос в 3 раза.

При недостатке влаги происходит торможение роста растений.

Установлено, что при инокуляции семян бактериальными препаратами происходит меньшее угнетение роста растений в высоту. По окончании периода почвенной засухи неинокулированные растения были на 8% ниже аналогичного варианта, оставленного при нормальном увлажнении. При бактеризации семян ризобактериями после окончания бесполивного периода разница между растениями, подвергнутыми засухе и находящимися в нормальных условиях увлажнения, составляла в среднем около 7% по вариантам опыта. При этом обработанные растения после ПЗ были до 10% выше необработанных растений в тех же условиях. Лучшие результаты получены в вариантах с применением препаратов на основе 5С-2 и мизорина.

Важная роль в формировании продуктивности растений при засухе связана с сохранением их листового аппарата. Количество листьев у разных вариантов практически не отличалось и составляло 6-7 шт./растение, но их линейные размеры были больше у инокулированных растений. Кроме того, отмирание нижних листьев у обработанных растений начиналось позже, чем у контрольных, что также приводило к более продолжительному функционированию листового аппарата опытных растений.

Площадь листьев контрольных растений редьки масличной после 10 дневной почвенной засухи снизилась в среднем в 2 раза. Инокуляция семян штаммами ризобактерий способствовала сохранению листовой поверхности после ПЗ, которая в сравнении с необработанными растениями в аналогичных условиях была больше в 2-2,5 раза. Наилучшие результаты отмечены в варианте с применением штамма 5С-2. Размеры листовой поверхности растений данного варианта были всего на 27% меньше чем, у растений соответствующего варианта, выросших при НУ.

Одним из показателей устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды является содержание хлорофилла a и b в листьях. Проведенные исследования показали, что после ПЗ в листьях растений снижается как содержание общего хлорофилла, так и хлорофилла а (табл. 5). Причем содержание хлорофилла у инокулированных растений в условиях недостатка влаги было больше и приближалось к аналогичному показателю у растений при НУ. Так, разница по данному параметру в разных условиях увлажнения в вариантах с 5С-2 и мизорином составляла 23%, флавобактерином – 25%, в то время как в контроле эта разница приближалась к 34%. Содержание хлорофилла b практически не изменялось по вариантам опыта. В связи с чем отношение Хл а/Хл b существенно повышалось у инокулированных растений по сравнению с контрольным вариантом.

Таблица 5.

Изменение содержания хлорофилла при разных условиях увлажнения в зависимости от применяемого препарата Общий хлорофилл Хлорофилл а Хлорофилл b Хл а Вариант / %к %к %к Хл b мг/г мг/г мг/г контролю контролю контролю Нормальное увлажнение Контроль 0,25±0,03 100 0,19±0,02 100 0,06±0,01 100 3, 5С- 0,33±0,05 132 0,27±0,04 142 0,06±0,01 100 4, (V. paradoxus) Мизорин 0,28±0,02 112 0,22±0,02 116 0,06±0,01 100 3, Флавобактерин 0,27±0,05 108 0,21±0,03 111 0,06±0,01 100 3, НСР05 0,02 0,02 0,01 0, Засуха Контроль 0,17±0,05 100 0,11±0,04 100 0,05±0,01 100 2, 5С- 0,26±0,04 153 0,20±0,03 182 0,05±0,01 100 3, (V. paradoxus) Мизорин 0,21±0,01 124 0,16±0,01 145 0,05±0,01 100 3, Флавобактерин 0,20±0,01 118 0,15±0,01 136 0,06±0,01 120 2, НСР05 0,04 0,03 0,01 0, Одно из свойств молекулы хлорофилла – способность флуоресцировать.

В настоящее время флуоресценция хлорофилла является важным параметром, который позволяет исследовать фотохимические реакции в клетках мезофилла и может служить индикатором структурных и функциональных свойств хлоропластов. В результате анализа параметров, полученных с помощью индукции флуоресценции хлорофилла, у растений в адаптированном к темноте состоянии было установлено, что после ПЗ уровень фоновой флуоресценции (F0) был в среднем на 7% выше, чем у растений в нормальных условиях увлажнения. При этом достоверных различий между опытными вариантами как при ПЗ, так и при НУ отмечено не было. Однако наблюдается тенденция к снижению данного показателя при внесении штаммов ризобактерий. Уровень максимальной флуоресценции (Fm) также повышается при ПЗ по сравнению с соответствующими вариантами при НУ. Причем инокуляция семян бактериальными препаратами привела к незначительному снижению данного параметра относительно необработанных вариантов.

Полученные данные по фотохимическому тушению флуоресценции свидетельствуют о том, что под влиянием ризобактерий при кратковременной ПЗ происходит меньшее снижение количества комплексов ФСII, находящихся в «открытом» состоянии, способных участвовать в разделении зарядов и передаче энергии на темновые реакции фотосинтеза. Так, в контрольном варианте количество таких комплексов при ПЗ уменьшилось на 25% по сравнению с НУ, тогда как в варианте с 5С-2 доля «открытых» комплексов снизилась только на 8%.

Поскольку флуоресценция хлорофилла является конкурентным процессом по отношению к другим путям реализации энергии возбуждения, ее уровень отражает изменение эффективности альтернативных путей использования энергии поглощенных квантов света, которая может быть реализована в процессе электронного транспорта (Р), рассеяна в виде тепла (D), а также накоплена в виде избыточной энергии (Ех), повреждающей ФСII.

Установлено, что после кратковременной почвенной засухи в листьях опытных образцов доля энергии, рассеиваемой в виде тепла, практически не изменилась и составляла около 42-46% при НУ и 42-43% при ПЗ (рис. 3). У растений, выросших в неблагоприятных условиях водоснабжения, отмечено значительное снижение энергии, используемой в процессе фотосинтеза и соответствующее увеличение доли избыточной энергии. В контрольном варианте (без инокуляции) параметр Р снизился с 30% (НУ) до 17% (ПЗ). В связи с этим Ех вырос с 25% (НУ) до 40% (ПЗ). Аналогичная ситуация наблюдалась в варианте с флавобактерином. Использование при посеве штамма 5С-2 и мизорина позволило снизить потери фотосинтетически активной энергии до 5%, тогда как у неинокулированных растений разница по данному параметру между растениями, находящимися в нормальных условиях увлажнения и перенесших засуху, составляла 13%. Доля избыточной энергии в вариантах с 5С-2 и мизорином повысилась на 5% и 6% соответственно, что на 15% меньше, чем в контрольном варианте.

Таким образом, в условиях недостаточного водоснабжения происходит перераспределение энергии возбуждения, улавливаемой молекулой хлорофилла, в сторону снижения доли энергии, используемой в процессе фотосинтеза, и увеличения потенциально опасной избыточной энергии.

Инокуляция семян эффективными штаммами ризобактерий Variovorax paradoxus и Arthrobacter mysorens способствует стабилизации работы ФСII за счет меньшего снижения P и увеличения Ех. Кроме того, после ПЗ у растительных образцов данных вариантов отмечено достоверное повышение Р и снижение Ех относительно необработанных вариантов, находящихся в таких же условиях.

Рис. 3. Распределение энергии возбуждения в зависимости от штамма PGPR при различных условиях увлажнения Таким образом, незначительное снижение оводненности тканей у инокулированных растений привело при засухе к меньшему нарушению ростовых процессов, фотосинтетической активности, минерального питания и, в конечном итоге, к меньшему снижению семенной продуктивности.

Анализ продуктивности показал, что после ПЗ количество и масса семян во всех вариантах значительно снизились (табл. 6).

Таблица 6.

Урожай семян в зависимости от штамма PGPR при разных условиях увлажнения (на 1 сосуд) Количество семян, шт. Масса семян, г Вариант НУ ПЗ ПЗ/НУ НУ ПЗ ПЗ/НУ Контроль 554±58,5 372±39,0 0,67 3,14±0,03 1,67±0,02 0, 5С-2 (V. paradoxus) 580±64,0 516±57,0 0,89 3,77±0,08 2,49±0,05 0, Мизорин 556±62,5 489±55,0 0,88 3,72±0,04 2,31±0,03 0, Флавобактерин 602±44,5 452±33,5 0,75 3,45±0,06 2,00±0,04 0, НСР05 49,0 50,8 0,30 0, Однако внесение ризобактерий привело к сохранению количества семян и их массы. В общем итоге ассоциативные ризобактерии способствовали повышению числа семян на 22-39% и их массы на 20-49% относительно контрольного варианта в условиях ПЗ.

Таким образом, растения, семена которых были инокулированы при посеве 5С-2 и мизорином, оказались более устойчивы к засухе, по сравнению с контрольным вариантом. Эти штаммы и изготовленные на их основе препараты могут быть перспективными для разработки технологий по повышению засухоустойчивости редьки масличной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выявление тонких механизмов и закономерностей функционирования микробно-растительных ассоциаций в различных экологических условиях представляет большой теоретический интерес и практическую значимость. При нормальных условиях ростстимулирующая деятельность бактериальных препаратов у растений редьки масличной наиболее заметна на этапе прорастания семян, а также в фазу начала плодообразования. На начальных этапах это проявляется в повышении энергии прорастания и всхожести семян, а также усилении роста проростков, в частности удлинении зародышевого корня и гипокотиля. На более поздних стадиях ризобактерии способствуют интенсификации побегообразования и увеличению накопления органического вещества и основных биогенных элементов. Более ярко действие бактериальных препаратов проявляется в стрессовых условиях, в том числе при недостатке влаги. При почвенной засухе деятельность ассоциативных ризобактерий препятствует глубокому и необратимому нарушению водного режима и минерального питания, что приводит к стабилизации в стрессовых условиях роста растений, формирования листовой поверхности, стабилизации пигментного состава и работы фотосинтетического аппарата. Кроме того, у инокулированных растений происходит усиление защитных реакций за счет снижения доли избыточной энергии возбуждения и повышения содержания осмолитов, в частности пролина. Все это в условиях засухи приводит к меньшему снижению семенной и биологической продуктивности. Таким образом, проведенные исследования показали, что отобранные нами бактериальные препараты 5С-2 (Variovorax paradoxus, штамм 5С-2) и мизорин (Arthrobacter mysorens, штамм 7) оказывают заметное влияние на протекание физиологических процессов (рост, водный режим, фотосинтез, минеральное питание), приводя к увеличению продуктивности редьки масличной в условиях нормального увлажнения и повышению ее засухоустойчивости в условиях нехватки влаги в почве.

ВЫВОДЫ 1. В лабораторных, вегетационных и полевых опытах отобраны наиболее эффективные бактериальные препараты (мизорин, флавобактерин, а также препараты на основе Variovorax paradoxus, штамм 5С-2, и Pseudomonas fluorescens, штамм 17-1), проявляющие стимулирующий эффект на прорастание семян и рост проростков редьки масличной, обеспечивая «стартовые»

преимущества растений в протекании их физиолого-биохимических процессов в ходе вегетации.

2. Для оптимизации отношений в растительно-микробной системе и увеличения продуктивности редьки масличной необходимо обеспечение растений на ранних этапах развития оптимальными дозами минеральных удобрений (N60P60K60). Без внесения азотных удобрений на дерново подзолистой супесчаной почве не выявлено положительного эффекта штаммов ассоциативных ризобактерий на всхожесть семян и интенсивность физиологических процессов растений.

3. Использование эффективных штаммов ризобактерий на оптимальном азотном фоне приводит к изменению физиологических параметров редьки масличной, включая усиление фотосинтетической активности, приводящей к интенсификации ростовых процессов.

4. Инокулированные растения лучше обеспечиваются элементами минерального питания, в результате чего содержание азота в надземных органах увеличивается в среднем на 21%, фосфора (Р2О5) – на 35% и калия (К2О) – на 33% по сравнению с контрольными растениями. Опытные растения имели более высокую нитратвосстанавливающую активность, поэтому концентрация нитратов в зеленой массе была на 45-80% меньше, чем у необработанных растений.

5. Применение бактериальных препаратов при почвенной засухе снижает нарушение основных физиологических процессов (роста, водного режима, минерального питания, развития листовой поверхности и работы фотосинтетического аппарата), поддерживая весь ход метаболизма на более высоком уровне.

6. Предпосевная обработка семян редьки масличной эффективными штаммами ризобактерий приводит к усилению защитных реакций растений в условиях почвенной засухи в результате снижения доли избыточной энергии возбуждения в фотосистеме II на 2-17%, а также повышения концентрации свободного пролина на 32-52%, участвующего в осморегуляции.

7. Растения редьки масличной, инокулированные при посеве штаммом 5С-2 и мизорином, более устойчивы к действию кратковременной почвенной засухи и лучше сохраняли семенную продуктивность (120-149%).

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Воробейков Г.А., Юргина В.С. Использование ассоциативных 1.

ризобактерий для повышения засухоустойчивости редьки масличной // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета – 2010. – №18. – С. 53-56. Степень участия – 70% Юргина В.С. Роль минерального азота и ассоциативных ризобактерий в 2.

формировании продуктивности редьки масличной // АгроXXI. – 2010. – №4-6. – С. 20-21. Степень участия – 100%.

Киселев М.В., Юргина В.С. Оптимизация азотного питания редьки 3.

масличной при инокуляции семян флавобактерином // Известия Санкт Петербургского государственного аграрного университета. – 2010. – № 19. – С.

79-84. Степень участия – 50% Публикации в других изданиях Юргина В.С. Роль минерального азота в повышении продуктивности 1.

редьки масличной при использовании штаммов ассоциативных ризобактерий в условия ХМАО и Ленинградской области // Наука и инновации XXI века: мат лы IX окружной конференции молодых ученых: в 2 т. – Т. 1. – Сургут: 2009. – С. 93-94.

Юргина В.С. Эффективность инокуляции семян редьки масличной 2.

ассоциативными ризобактериями на разном фоне минерального питания // Материалы VIII Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования»: в 3 т. – Т. 3. – М.: 2009. – С. 311 314.

Юргина В.С. Использование ассоциативных ризобактерий для 3.

повышения засухоустойчивости редьки масличной // Четырнадцатая Санкт Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов. Аннотации работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2009 года для студентов, аспирантов, молодых ученых и молодых кандидатов наук. – СПб.:

Издательство политехнического университета, 2009. – С. 65.

Воробейков Г.А., Царенко В.П., Юргина В.С., Киселев М.В. Влияние 4.

возрастающих доз азотных удобрений на продуктивность и качество капустных сидеральных культур // Крупный и малый бизнес в АПК: роль, механизмы взаимодействия, перспективы. Материалы международного агропромышленного конгресса. – СПб.: 2010. – С. 56-58.

Воробейков Г.А., Юргина В.С. Повышение засухоустойчивости редьки 5.

масличной путем инокуляции семян ассоциативными ризобактериями // Интродукция нетрадиционных и редких растении. Материалы IX Международной научно-методической конференции 21-25 июня 2010. В 2 т. – Т.2. – Мичуринск–наукоград РФ, 2010. – С. 187-190.

Юргина В.С. Перспективы применения бактериальных препаратов для 6.

повышения продуктивности редьки масличной в различных условиях увлажнения // Наука и инновации XXI века: материалы X Юбилейной окружной конференции молодых ученых: в 2 т. – Т. 1. – Сургут: 2010. – С. 79 80.

Воробейков Г.А., Павлова Т.К., Лебедев В.Н., Юргина В.С.

7.

Эффективность применения бактериальных удобрений при выращивании полевых капустных культур // Международный агропромышленный конгресс.

Инновации – основа развития агропромышленного комплекса (материалы для обсуждения). – СПб.: 2010. – С. 156-157.

Муратова Р.Р., Юргина В.С., Воробейков Г.А. Ассоциативные 8.

ризобактерии повышают устойчивость растений к почвенной засухе // Материалы докладов VII Съезда Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (в двух частях). Часть II. – Н. Новгород, 2011. – С.490-491.