Мукред повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров
На правах рукописи
Отман Садек Ахмед Мукред
Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода
биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в
присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров
03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель:
кандидат химических наук, доцент Пшеничникова Анна Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева Градова Нина Борисовна кандидат химических наук, ассистент кафедры химии и технологии биологически активных соединений имени Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова Гроза Наталья Викторовна
Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН
Защита состоится «23» апреля 2012 г. в 15 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу: 119571, г.Москва, пр. Вернадского, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.
Автореферат диссертации разослан « » марта 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Поиск компонентов питательных сред, ускоряющих рост бактерий – продуцентов биомассы и внеклеточных метаболитов – актуальная задача биотехнологии.
Перспективными для управления метаболическими процессами у бактерий являются ауторегуляторные вещества, относящиеся по химической природе к свободным жирным кислотам (ЖК) и выполняющие регуляторную функцию по поддержанию жидкостности клеточных мембран (Светличный В.А. и др., 1983;
Бабусенко Е.С. и др., 1991). ЖК с длиной цепи от С14 до С20 представляют собой уникальные природные вещества, которые в составе липидов являются структурными компонентами клеточных мембран, выполняют энергетические и регуляторные функции. Кроме этого, свободные ЖК обладают разнообразной биологической активностью и прежде всего – антимикробной (активны против вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших) и цитотоксической (Nieman C. 1954, Desbois A.P. et al., 2010).
Благодаря своей бактерицидной активности свободные ЖК являются компонентами врожденного неспецифического иммунитета и присутствуют на коже, в грудном молоке и кровотоке человека и животных (Nicolaides N., 1974), где выполняют защитные функции. В концентрациях, не вызывающих цитотоксического действия, ЖК, например олеиновая, разрушают клеточные стенки и приводят к гибели таких патогенов, как стрептококки и стафилококки (Chen C.H. et al., 2011). Использование ЖК рассматривают в качестве элемента новой антимикробной стратегии как альтернативу традиционным антибиотикам, применение которых часто приводит к формированию лекарственной устойчивости у патогенных бактерий (Huang C.M. et al., 2011).
Наличие свободных жирных кислот в составе модельных мембран, состоящих из и ЖК, способствуют образованию 1,2-диэлаидоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина участков небислойной обращенной гексагональной структуры наряду с ламеллярной в широком интервале температур. Молекула жирной кислоты встраивается в мембрану, образует водородные связи с молекулами воды и соседними аминогруппами молекул фосфатидилэтаноламина и влияет на свойства бислоя (Cordomi A. et al., 2010).
_ Список сокращений: БКЖ – бесклеточная культуральная жидкость;
ВБ – высушенная биомасса;
ДФГ - 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен;
ЖК – жирные кислоты;
КОЕ – колониеобразующие единицы;
МЭЖК – метиловые эфиры жирных кислот;
ОК – олеиновая кислота;
ОD – оптическая плотность;
СК – стеариновая кислота;
ФЛ – фосфолипиды;
ЭПС – экзополисахарид.
Способность свободных жирных кислот влиять на структуру биологических мембран используется в новом направлении фармакологии - мембрано-липидной терапии.
Так, олеиновая кислота (ОК), увеличивая отрицательную кривизну мембраны, активирует ряд важных белков, способных ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз: G-белков, протеинкиназы С, белков теплового шока. Возможно, этот механизм объясняет ускорение роста бактерий - лактобацилл, коринебактерий (Corcoran B.M. et al., 2007), а также индукцию реактивации покоящихся форм микобактерий в присутствии олеиновой кислоты (Назарова Е.В. и др., 2011). Однако, несмотря на большой научный интерес к функциям свободных ЖК в последнее время, механизм их биологической активности изучен не достаточно.
Перспективной моделью для такого рода исследований являются метилотрофные бактерии, не использующие ЖК в качестве субстрата. Работа с такими моделями исключает вероятность стимулирования роста за счет возможности метаболизировать ЖК.
Многие облигатные метилотрофные бактерии, использующие в качестве единственного источника углерода доступный метанол, характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды или экзополисахариды (ЭПС) и являются перспективными продуцентами биомассы и ЭПС (Schrader J. et al., 2009;
Троценко Ю.А. и др., 2010).
Бактериальные ЭПС – биополимеры, обладающие уникальными реологическими свойствами, эмульгирующей активностью и способностью формировать гели. Сферы применения микробных экзополисахаридов чрезвычайно разнообразны: нефте- и горнодобывающая, текстильная, пищевая, фармацевтическая, химическая промышленности и медицина. Потребность в этих полимерах постоянно растет, однако спрос на них удовлетворяется не полностью.
Цели и задачи работы Изучение влияния экзогенных жирных кислот на выход биомассы и повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei, а также оптимизация условий его получения и выделения.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- исследование влияния экзогенных ЖК и их метиловых эфиров на рост и продукцию внеклеточного полисахарида M. quaylei;
- фракционирование клеточных липидов из биомассы, полученной в присутствии олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (СК), а также определение жирнокислотного состава фракций свободных ЖК и фосфолипидов;
- исследование физико-химических свойств интактных клеток M. quaylei, выращенных в стандартных условиях и в присутствии экзогенной ОК - величины потенциала (методом электрофоретического рассеяния) и текучести мембран (по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ);
- оптимизация условий биосинтеза, методы выделения и очистки ЭПС, изучение углеводного и фракционного состава ЭПС M. quaylei;
- изучение реологических и эмульгирующих свойств растворов и эмульсий, содержащих ЭПС.
Научная новизна работы Обнаружено ускорение роста и увеличение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии M. quaylei в присутствии жирных кислот С12-C18 и их метиловых эфиров, экзогенно добавленных в питательную среду.
Наилучшим ростовым фактором оказался олеат натрия. На основании данных о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин -потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток высказано предположение о включении жирных кислот в наружную мембрану бактерии M. quaylei.
Оптимизирован состав среды культивирования M. quaylei для повышения продукции экзополисахарида (отношение C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция). Отработаны условия выделения, определены углеводный и фракционный состав экзополисахарида M. quaylei. Изучены эмульгирующие и реологические свойства ЭПС в составе косметических композиций.
Практическая значимость работы В результате проведенных исследований с использованием в качестве ростовых факторов экзогенных жирных кислот и их метиловых эфиров удалось повысить выход биомассы и ЭПС M. quaylei более чем в 2 и 1,5 раза соответственно. Разработаны две альтернативные схемы выделения внеклеточного полисахарида. Было показано, что ЭПС M. quaylei является повышающим вязкость водных растворов компонентом, обладает эмульгирующей активностью и является стабилизатором эмульсий типа «масло/вода» и по реологическим свойствам не уступает ксантану и другим полимерам, использующимся в косметических и фармацевтических композициях.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Ускорение роста и продукции внеклеточного полисахарида M. quaylei в присутствии экзогенных ЖК и их метиловых эфиров. Использование олеата натрия в качестве ростового фактора M. quaylei.
2. Ряд гидрофобных добавок по способности стимулировать рост бактерии M. quaylei:
С18:1 C18:0 С16:0 метилолеат метилстеарат без добавок С14:0 С12:0.
3. Механизм взаимодействия экзогенных ЖК с клетками M. quaylei путем включения их в состав наружной мембраны и изменения физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.
5. Углеводный состав ЭПС M. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1, фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет молекулярную массу от 6.8 105 до 7.9 107 г/моль, а высокомолекулярная (13%) – 2.6·108.
6. Внеклеточный полисахарид M. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью и стабилизирует эмульсии типа «масло/вода».
Апробация работы Основные положения диссертационной работы докладывались на IV и VI Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития»
(Москва, Россия, 2007 и 2011 гг).
Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 3 оригинальные статьи, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, а также 2 тезисов на международных конференциях.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждении результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 166 источника. Работа содержит 45 рисунков и таблиц.
Работа поддержана грантом № 3.1.1/9247 АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, научная новизна и практическая значимость, указан личный вклад соискателя. Сформулированы цели и задачи исследования.
Глава 1. Функции свободных жирных кислот у бактерий (обзор литературы) Обзор литературы посвящен вопросам биосинтеза и функционирования свободных жирных кислот в бактериальной клетке. Рассмотрен метаболизм ЖК у бактерий:
биосинтез и -окисление ЖК, регуляция экспрессии бактериальных десатураз, транспорт ЖК через мембрану бактерий, ингибирующее и ростостимулирующее действие экзогенных жирных кислот и их производных на бактерии.
Всесторонне рассмотрены различные литературные источники, описывающие механизм бактерицидной активности жирных кислот. Показано, что основной мишенью является клеточная мембрана и процессы, в ней протекающие – функционирование электронтранспортной цепи, окислительное фосфорилирование, ферментативные процессы, транспорт питательных веществ, перекисное окисление липидов. Было уделено внимание жирным кислотам как ауторегуляторным метаболитам, необходимым для межклеточной коммуникации. Также были рассмотрены адаптационные изменения мембранных липидов бактерий при изменении температуры, давления, концентрации солей, добавлении мембраноактивных веществ.
Глава 2. Методы исследования В качестве объекта исследования использовали облигатные метилотрофные бактерии Methylophilus quaylei, штамм МТ (ВКМ В-2338Т) (Doronina et al., 2005).
Культивирование проводили в минеральной среде, содержащей 1.0 % об. метанола (Нево и др., 2004). Бактерии выращивали на шейкере («Labline», США) при 100 об./мин и 28 оС.
Концентрацию бактерий в КЖ определяли по величине оптической плотности при 600 нм и величине КОЕ/мл. Концентрацию ЭПС определяли фенольным методом (Dubois et al., 1983). Уроновые кислоты определяли модифицированным карбазольным методом (Filisetti-Cozzi et al., 1991).
Липиды экстрагировали по методу Блайя-Дайэра (Bligh et al., 1959). Липидные экстракты фракционировали методом колоночной хроматографии на силикагеле. Для выделения фракции фосфолипидов из фракции суммарных липидов использовали низкотемпературное осаждение (Кейтс, 1975). Метиловые эфиры жирных кислот получали реакцией с ацетилхлоридом (6 % об.) в метаноле (Christie, 1993).
Жирнокислотный состав фракций свободных жирных кислот и фосфолипидов (ФЛ) определяли методом хромато-масс-спектрометрии. Хромато-масс спектры были получены на газовом хроматографе 6890N «Agilent Technologies» (США), масс-детекторе 5973N «Agilent Technologies» (США), с колонкой НР-1 (США). Спектры 1Н-ЯМР были получены на импульсном Фурье спектрометре Bruker DPX-300 с рабочей частотой 300 МГц.
Измерение -потенциала интактных клеток бактерий проводили на анализаторе частиц Delsa™ Nano («Beckman Coulter, Inc.», США) методом электрофоретического рассеяния.
Текучесть мембран целых клеток M. quaylei оценивали по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5 гексатриена. Анизотропию флуоресценции ДФГ-меченных клеток определяли на флуоресцентном спектрофотометре Varian Cary Eclipse (Walnut Creek, CA, Австралия).
Клетки продуцента отделяли от бесклеточной культуральной жидкости (БКЖ) центрифугированием. ЭПС осаждали а) ацетоном или 2-пропанолом;
б) в виде цетавлоновых солей. Выпавшие хлопья полисахаридов (или их цетавлоновых солей) отделяли центрифугированием.
Очистку ЭПС от примесей органической природы проводили непрерывной экстракцией диэтиловым эфиром 48 ч, используя экстрактор Сокслета.
Молекулярную массу ЭПС определяли методом гель-фильтрации на колонке TOYOPEARL HW-65 (Япония) (600х20 мм) при элюировании 0.15 М хлоридом натрия.
Глава 3. Основные результаты и их обсуждение 3.1. Влияние экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров на рост и продукцию ЭПС M. quaylei Бактерия Methylophilus quaylei является облигатным метилотрофом и, поэтому удобной моделью для изучения влияния экзогенных мембраноактивных веществ.
Экзогенные ЖК включали в состав питательной среды в концентрациях в интервале от 10 до 10-3 М. Добавки ЖК вводили в питательную среду в виде растворов в метаноле. Для определения скорости роста и построения кинетических кривых находили зависимость концентрации высушенной биомассы (ВБ) от времени. Кривые роста M. quaylei в присутствии экзогенно добавленных жирных кислот и их метиловых эфиров в концентрации 50 мкМ представлены на Рис. 1.
(а) (б) 2, 4 2,5 3 2 7 2 Концентрация ВБ, г/л Концентрация ВБ, г/л 1, 1, 0, 0, 0 10 20 0 10 20 Время, ч Время, ч Рис. 1. Влияние длины цепи и степени ненасыщенности экзогенных ЖК (а) и их метиловых эфиров (б) на рост M.quaylei: 1 – С12:0, 2 – С14:0, 3 – С16:0, 4 – С18:0, 5 – С18:1, 6 – С18:2, 7 – без добавок, 8 – МЭ С18:0, 9 – МЭ С18:1. Концентрация ЖК 50 мкМ.
В присутствии ЖК С14-С18 наблюдали ускорение роста и сокращение лаг-фазы, причем с увеличением длины цепи способность ЖК стимулировать рост увеличивалась.
Наибольший эффект наблюдали в присутствии ОК. При этом наблюдалось наиболее сильное сокращение лаг-фазы. Добавки МЭЖК приводили к стимуляции роста M. quaylei, причем стимулирующее действие метилолеата было сильнее стимулирующего действия метилстеарата. Метилирование карбоксильной группы молекулы ЖК приводило к ослаблению, но не снятию стимулирующего действия добавки по сравнению с действием соответствующей ЖК, что подтверждает важную, но не решающую роль свободной карбоксильной группы.
Увеличение выхода биомассы в присутствии ОК достигало 25%, что позволило ее рассматривать в качестве ростового фактора. Однако для практического использования ОК, имеющая вязкую консистенцию, крайне неудобна, предпочтительнее олеат натрия, хорошо растворяющийся в воде и метаноле. Нами было изучено влияние концентрации олеата натрия на выход биомассы и экзополисахарида M. quaylei (рис. 2). Важно отметить, что олеат натрия дозозависимо ускорял выход биомассы (рис. 2а), однако характер этой зависимости довольно сложный. Сначала наблюдалось резкое ускорение роста, затем через плато - переход к более медленному росту. Тот же характер наблюдался для зависимости выхода ЭПС от концентрации олеата натрия (рис. 2б).
Поскольку питательные среды с олеатом натрия в концентрации выше 0.1 мМ до добавления инокулята были мутными, было изучено влияние концентрации олеата натрия на оптическую плотность питательных сред (рис. 3). Кривая 1 (рис. 3) позволяет предположить наличие как минимум двух критических концентраций, соответствующих образованию различных мицеллярных структур. Но самое интересное – это повторение формы кривых, соответствующих изменению выхода биомассы и ЭПС от концентрации олеата натрия в среде (рис. 2). Чисто арифметический вклад мицелл олеата натрия в светорассеяние культуральной жидкости можно исключить ввиду низких значений оптической плотности при = 600 нм (рис. 3, кривая 2). Возможно, различные мицеллярные структуры с разной эффективностью взаимодействуют с клетками бактерии.
Однако этот вывод требует дополнительного подтверждения.
При включении олеата натрия в питательную среду в концентрации выше 1 мМ использование метода определения концентрации биомассы в КЖ по величине светорассеяния является некорректным. Для оценки влияния содержания олеата натрия в питательной среде выше 1 мМ на рост и выход ЭПС использовали другую методологию.
Выход биомассы оценивали по величине КОЕ/мл (на твердой минеральной метанолсодержащей среде), продукцию ЭПС определяли в БКЖ, подвергнутой диализу против дистиллированной воды при рН 7.0.
а) б) 1, 3, Концентрация ЭПС, г/л 2, D 2 1, 0, 0, 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Концентрация олеата натрия, мМ Концентрация олеата натрия, мМ Рис. 2. Влияние экзогенного олеата натрия в культуральной жидкости на рост (а) и продукцию ЭПС (б) M.quaylei: D600 и концентрация ЭПС при 24 (2, 4) и 48 (1, 3) ч роста соответственно.
Кроме этого, содержание ЭПС подтверждали взвешиванием осадка после выделения ЭПС из БКЖ после осаждения двумя объемами ацетона. Зависимость секреции ЭПС от содержания олеата натрия в КЖ в диапазоне концентраций от 0 до 10 мМ представлена на рис.4. Наибольший выход наблюдали при концентрации олеата натрия мМ.
0,15 Концентрация ЭПС, г/л 1, 0, D 0, 0, 0 0 0,05 0,1 0 2 4 6 8 Концентрация олеата натрия, мМ Концентрация олеата натрия, мМ Рис. 3. Влияние концентрации олеата Рис. 4. Влияние экзогенного олеата натрия на оптическую плотность натрия в КЖ на выход ЭПС M. quaylei стерильной питательной среды при (содержание ЭПС в опытах с добавкой =450 нм (1) и = 600 нм (2). олеата натрия в концентрациях 1 мМ определяли после диализа БКЖ против дистиллированной воды, рН 7.0).
Взаимодействие ЖК с клетками бактерии M. quaylei может осуществляться на поверхности или в результате проникновения в наружную мембрану. Нами были выделены и фракционированы клеточные липиды из биомассы, полученной в присутствии ОК и стеариновой кислоты, а также изучен жирнокислотный состав фракций свободных ЖК и ФЛ методом хромато-масс-спектрометрии (рис. 5). При добавлении в питательную среду ОК и СК доля этих ЖК в составе фракции свободных ЖК существенно увеличивалась, тогда как состав фракции ФЛ изменялся незначительно (табл.1).
Рис. 5. Хромато-масс-спектрометрический анализ фракции свободных жирных кислот M. quaylei МТ, культивированных в стандартных условиях, без добавок ЖК. Газовый хроматограф 6890N «Agilent Technologies» (США), масс-детектор 5973N «Agilent Technologies» (США), колонкой НР-1 (США). Отнесение пиков с временами удерживания, мин: 16.17- метиловый эфир тетрадекановой кислоты;
17.50 – метиловый эфир 9 гексадеценовой кислоты;
17.65 - метиловый эфир гексадекановой кислоты;
19.28 метиловый эфир 9-октадеценовой кислоты;
19.54 - метиловый эфир октадекановой кислоты.
Таблица Влияние экзогенных ОК и СК на жирнокислотный состав фракций липидов M. quaylei Добавки Фракция С14:0 С16:0 С16:1 С18:0 С18: Свободные ЖК 2.0 42.3 45.1 7.4 3. Без добавок ФЛ - 33.5 66.5 - ОК, 50 Свободные ЖК - 26.3 17.7 - 56. мкмоль/л ФЛ - 46.8 53.2 - СК, 50 Свободные ЖК - 14.4 6.9 78.7 мкмоль/л ФЛ - 40.8 40.8 18.4 При включении ЖК в состав наружной мембраны, вероятно, должно происходить уменьшение заряда поверхности при нейтральных значениях рН благодаря наличию карбоксильных групп. Действительно, величина -потенциала бактерий, выращенных в присутствии экзогенной ОК, ниже, чем в стандартных условиях (табл. 2). Промывка клеток буфером, содержащим 1% БСА, связывающего не включившиеся в мембрану ЖК, привела лишь к незначительному повышению -потенциала.
Таблица Влияние экзогенной ОК на физико-химические свойства клеток M. quaylei Условия культивирования стандартные в присутствии ОК, 50 мкМ после промывки после промывки после промывки после промывки Параметр трис буфером, буфером, трис буфером, буфером, рН 7.5 содержащим 1% рН 7.5 содержащим 1% БСА БСА -потенциал целых клеток -40.77 -40.09 -43.06 -43. бактерий, мВ анизотропия флуоресценции 0.0111 - 0.0087 целых клеток* * - флуоресцентный зонд 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен Была проведена оценка текучести мембран целых клеток M. quaylei по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда ДФГ.
Значение анизотропии клеток, выращенных в присутствии ОК, было ниже, чем в стандартных условиях, что коррелирует с повышением текучести мембран в присутствии ОК (табл. 2). Таким образом, эффект ускорения роста метилотрофной бактерии M. quaylei экзогенными ЖК достигался за счет включения их в состав наружной мембраны и изменения физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.
3.2. Получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава ЭПС M. quaylei Оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Дерффель К., 1994). Варьируемые параметры выбирали из условия наибольшей чувствительности культуры к их изменению.
Интервалы варьирования параметров выбирали таким образом, чтобы значения параметров были как меньше, так и больше значений, оптимальных для роста бактерии. В качестве факторов варьирования взяли: соотношение концентраций источников углерода и азота – метанола и нитрата натрия C/N (Х1), концентрацию хлорида кальция (Х2), концентрацию гидро- и дигидрофосфатов калия (Х3), (табл. 3), содержание остальных компонентов ферментационной среды зафиксировали (полный факторный эксперимент третьего порядка ПФЭ 23).
Выбирали время культивирования, соответствующее стационарной фазе роста - ч. В качестве откликов использовали: а) Y1 – оценку концентрации биомассы по оптической плотности культуры, при длине волны 600 нм;
б) Y2 – оценку концентрации экзополисахарида, определяемой фенольным методом – по оптической плотности при длине волны 490 нм. Ошибку эксперимента рассчитывали для каждой серии и использовали полученное значение для оценки значимости коэффициентов регрессионных уравнений (Дерффель К., 1994).
Таблица 3.
Интервалы варьирования параметров культивирования M. quaylei Соотношение С/N Фосфаты CaCl Х1 Х2 Х 3 г/л K2HPO4, 2 % CH3OH, 4. 0.03 г/л + 4: г/л 1.5 г/л KH2PO 0.5 % NaNO 0.01г/ 1 г/л K2HPO4, 0.5 % CH3OH, 1. – 1: л г/л 0.5 г/л KH2PO 0.5 % NaNO Были получены следующие регрессионные уравнения:
а) для высушенной биомассы: СВБ=14.59+0.34 Х1+0.15 Х2–0.45 Х3+0.02 Х1 Х +0.15 Х1 Х3 –0.72 Х2 Х3–0.58 Х1 Х2 Х3;
б) для ЭПС: СЭПС=1.72–0.12 Х1+0.04 Х2+0.02 Х3–0.05 Х1 Х2 +0.03 Х1 Х +0.125 Х2 Х3+0.04 Х1 Х2 Х3.
Была проведена проверка значимости коэффициентов регрессии. Значимыми коэффициентами в регрессионном уравнении для ЭПС, в связи с условием bi 0.074, являются b1э= – 0.12 и b2,3э = 0.125. Проверка показала, что уравнения адекватны. Анализ полученного регрессионного уравнения позволяет сделать следующий вывод: наибольшее влияние на конечную концентрацию экзополисахарида оказывает соотношение C/N и совместное влияние хлорида кальция и фосфатов. На основании полученного регрессионного уравнения проводили оптимизацию питательной среды по направлению градиента для биосинтеза ЭПС. Для этого проводили крутое восхождение, изменяя значения коэффициентов b2 и b3, предполагая линейную зависимость отклика от факторов Х2 и Х3. Оптимальными для биосинтеза ЭПС (2.88 г ЭПС/л) концентрациями хлорида кальция и суммарных фосфатов (K2HPO4 и KH2PO4 в соотношении 2:1) оказались 0. и 4.31 г/л соответственно.
Для получения ЭПС бактерии культивировали в питательной среде, состав которой был определен методом математического планирования эксперимента. Для выделения ЭПС из БКЖ использовали осаждение органическими растворителями или осаждение в виде цетавлоновых солей. Полного осаждения ЭПС достигали при добавлении двух объемов ацетона или изопропанола к одному объему БКЖ. Выпавшие хлопья ЭПС отделяли центрифугированием, лиофилизовали. Добавление в БКЖ цетавлона в массовых соотношениях ЭПС - цетавлон: 1:10, 1:2, 1:1, 2:1, 3,33:1 соответственно показало, что происходит полное осаждение ЭПС в виде цетавлоновых солей. Это, очевидно, обусловлено кислой природой ЭПС. Цетавлоновые соли ЭПС растворяли в 1М растворе NaCl, цетавлон удаляли диализом против 1М раствора NaCl, получая ЭПС в виде натриевой соли.
Анализ состава полученных препаратов ЭПС обнаружил наличие гидрофобных примесей жирных кислот и липидов, присутствующих, как было ранее показано (Терехова Е.А. и др., 2010), в культуральной жидкости M. quaylei. Очистку ЭПС от гидрофобных веществ проводили методом непрерывной экстракции диэтиловым эфиром. Последующая обработка ЭПС в условиях дезацилирования (щелочного гидролиза) показала, что он не содержит остатков жирных кислот.
Потенциально полезные для применения свойства ЭПС - реологические свойства, эмульгирующая активность и способность формировать гели - зависят от молекулярной массы полимера и углеводного состава. Углеводный состав ЭПС определяли после его полного кислотного гидролиза в растворе 2М трифторуксусной кислоты при 100 оС с последующим восстановлением до полиолов и ацетилированием (Blakeney A.B. et al., 1983). Методом хромато-масс-спектрометрии было показано, что в составе углеводов ЭПС M. quaylei присутствуют остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1 и не содержит остатков уроновых кислот. Это было подтверждено нами модифицированным карбазольным методом (Filisetti-Cozzi T.M. et al., 1991). Однако образование нерастворимых цетавлоновых солей ЭПС свидетельствует о присутствии в его структуре кислотных групп. Определение содержания пирувата (Sloneker J.H. et al., 1962) показало, что ЭПС M. quaylei аналогично бактериальному полисахариду ксантану содержит кислотные пирувилиденовые остатки (8,73%).
Молекулярную массу ЭПС M. quaylei определяли методом гель-фильтрации.
Продуцируемый бактерией полисахарид выходит с колонки в виде трех фракций:
основной (70%), ограниченной значениями молекулярных масс от 6.8 105 до 7.9 2.6 г/моль, высокомолекулярной (13%) с молекулярной массой г/моль и низкомолекулярной (17%) с молекулярной массой 40000 г/моль (рис. 6).
3.3. Изучение реологических свойств растворов и эмульсий, содержащих ЭПС M. quaylei Перспективы практического использования ЭПС в составе косметических и лекарственных средств определяются реологическими и эмульгирующими свойствами их растворов, способностью ЭПС выполнять функции загустителей и стабилизировать дисперсии и эмульсии.
1, С, мг/мл 0, 0 20 40 60 80 Элюируемый объем, мл Рис. 6. Гель-хроматограмма ЭПС Рис. 7. Хромато-масс M. quaylei на колонке TOYOPEARL HW- спектрометрический анализ 65 (Япония) (600х20 мм) при ацетилированного гидролизата ЭПС элюировании 0.15 М хлоридом натрия M. quaylei.
В качестве загустителей применяют полимеры синтетического и природного происхождения. Наряду с ЭПС M. quaylei для сравнительных исследований нами были использованы распространенные в парфюмерно-косметических и фармацевтических композициях полимеры: бактериальный ЭПС ксантан (Keltrol RD «CP Kelco UK Limited», Великобритания), модифицированный растительный полисахарид гидроксипропилгуар (Jaguar HP 60, Rhodia, Франция) и синтетический гидрофобно-модифицированный полиакриловый полимер, INCI-наименование: Acrylates/Vinyl Isodecanoate Crosspolymer (Stabylen 30, «Sigma», США). Реологические измерения проводили на ротационном программируемом вискозиметре «Brookfield RVDV II+», США.
Реологическое поведение полимерных систем характеризовали реологическими кривыми, к которым относятся кривые течения (зависимости скорости сдвига от напряжения сдвига) и кривые эффективной вязкости (зависимости вязкости от напряжения сдвига). Вид реологических кривых течения и вязкости водно-глицериновых растворов ЭПС M. quaylei свидетельствует, что при концентрациях выше 0,1% масс. эти растворы проявляют неньютоновское поведение, причем структурообразование, а, следовательно, прочность системы, усиливается по мере роста концентрации полимера, что сопровождается увеличением вязкости (рис. 8). Характер течения водно глицериновых растворов ЭПС M. quaylei псевдопластический аналогично другим коммерческим загустителям.
Возможность использования ЭПС M. quaylei в качестве стабилизатора эмульсий типа «Масло/Вода» была показана на примере косметической композиции следующего состава, % масс: глицерин 5.0;
полиглицерил-3-метилгликоздистеарат 3.0;
цетеариловый спирт 1.0;
глицерилстеарат 2.0;
вазелиновое масло 8.0;
смесь: метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, изобутилпарабен, феноксиэтанол («Phenonip») 0.7.
а) б) 3 2 Р и с Т.
е Рис. 8. Кривые а) течения;
б) вязкости водно-глицериновых растворов ЭПС M. quaylei. Содержание компонентов, % масс:лглицерина 3;
ЭПС – 0.05 (1);
0.1 (2);
0.15.
ь (3);
0.2 (4);
0.3 (5).
С ц Эмульсию получали механическим перемешиванием компонентов с последующей т а гомогенизацией предварительно полученной дисперсии. Стабильность эмульсии р в о к определяли помощью следующих тестов: 1) колебательный температурный тест - 3 цикла е л н 0 (5 ч при -18 С, 5 ч при комнатной температуре, 14 ч при 40 С);
2) термостатирование ю А ч при 400С 3 месяца;
3) проверка коллоидной стабильности методом центрифугирования Т ( е е мин, 6000 об/мин). Оптимизация состава базовой композиции не привела к стабилизации н л и системы. Только включение полимеров (ЭПС M. quaylei, ксантан, гидроксипропилгуар, ь я ц полиакрилат) до 0,1%масс. стабилизировало эмульсию, придавая ей устойчивость не а А только к циклам замораживания-оттаивания, но и в течение срока хранения как при в ) к комнатной, так и при повышенной температуре. Способность полимеров к связыванию л Б воды и загущению эмульсии предотвращает сепарацию на фазы. ю ) ч При введении ЭПС M. quaylei в состав эмульсии происходит формирование е В структурной гелевой сетки, о чем свидетельствует наличие зон гистерезиса при прямомн и ) и обратном ходе и максимумов на кривых течения при увеличении напряжения сдвига я (Рис. 9). Т.е. эмульсии, содержащие ЭПС M. quaylei, также как и другие исследованные а А полисахариды, показывают псевдопластическое течение с тиксотропией – реологические ) свойства, обязательные для загустителей и стабилизаторов эмульсий.
Б ь ) ц а В в ) к л ю я ч е н и я Рис. 9. Кривые течения косметических эмульсий, содержащих ЭПС M. quaylei:
1 – контроль (без ЭПС);
2 – 0.02% масс;
3 – 0.1% масс.
ВЫВОДЫ 1. Показано, что ЖК и их метиловые эфиры ускоряют рост и продукцию ЭПС M. quaylei.
По способности стимулировать рост бактерии M. quaylei гидрофобные добавки в концентрации 50 мМ располагаются в ряду С18:1 C18:0 С16:0 метилолеат метилстеарат без добавок С14:0 С12:0.
2. По данным о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток установлено, что эффект ускорения роста метилотрофной бактерии M. quaylei экзогенными ЖК обусловлен включением их в состав наружной мембраны и изменением физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.
3. Оптимизированы условия получения (концентрация экзогенного олеата натрия, отношение источников углерода и азота C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция), выделения и очистки ЭПС M. quaylei.
4. Определен углеводный состав ЭПС M. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D галактозы в соотношении 5:2:1, а также фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет молекулярную массу от 6.8 105 до 7.9 107 г/моль, а высокомолекулярная (13%) - 2,6·108. ЭПС M. quaylei аналогично бактериальному полисахариду ксантану содержит кислотные пирувилиденовые остатки (8,73%).
5. Установлено, что ЭПС M. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью, стабилизирует эмульсии типа «масло в воде». ЭПС M. quaylei может быть использован для создания препаратов стабильных косметических и лекарственных эмульсий, а также в составе буровых растворов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Отман С.А.М., Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Влияние экзогенных жирных кислот на рост и продукцию экзополисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei. // Прикл. биохимия и микробиология. 2012. Т.48. №2. С.226-231.
2. Отман С.А.М., Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Экзополисахарид облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei: получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава. // Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №6. С.84-87.
3. Степичева Н.А., Качегин С.А., Отман С.А.М., Пшеничникова А.Б. Швец В.И. Текучесть биологических мембран как фактор адаптации метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei к стрессовым условиям. // Тезисы докладов IV Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 12-16 марта 2007 г. Т.2. С.89.
4. Степичева Н.А., Качегин С.А., Отман С.А.М., Пшеничникова А.Б. Влияние экзогенных жирных кислот на ростовые характеристики облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в условиях осмотического и окислительного стрессов. // Аспирант и соискатель. 2007. №2. С.114-116.
5. Отман С.А.М., Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Влияние экзогенных жирных кислот на продукцию и состав экзополисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei. // Тезисы VI Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 21-25 марта 2011 г. Москва. Т.1. С.360-361.
Подписано в печать 20.03. Заказ № Формат 60х90/16. Усл. печ. л. Тираж 100 экз.
ООО «Генезис»
119571, г. Москва, пр-т Вернадского, (495) 936-88- (494) 434-83-