Морфофункциональная характеристика тучных клеток различных компартментов потомства самок крыс с хроническим поражением печени
На правах рукописи
Леонов
Николай Викторович
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ТУЧНЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНЫХ КОМПАРТМЕНТОВ
ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ
ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ
03.00.13 – «Физиология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Челябинск-2008 2
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет»
доктор медицинских наук, профессор
Научный руководитель Брюхин Геннадий Васильевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Лихачев Сергей Федорович доктор медицинских наук, профессор Попов Геннадий Константинович
Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН (г. Екатеринбург)
Защита состоится « » октября 2008 г., в « » на заседании диссертационного совета Д 212.295.03 при ГОУ ВПО «Челябинский государственный педагогический университет» по адресу: 454080, г. Челябинск, пр. им. Ленина, д. 69, ауд. 116.
С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Челябинского государственного педагогического университета Автореферат разослан « » сентября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент Ефимова Н.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Здоровье и благополучие детей – главная забота семьи, государства и общества в целом. Один из основных факторов неблагополучия в состоянии здоровья детей – ухудшение здоровья женщин репродуктивного возраста. При этом отмечается увеличение употребления женщинами алкоголя, никотина, наркотиков (Скосырева А.М. с соавт., 1993;
Авдеева Т.Г. с соавт., 1994;
Кошкина Е.А., 2002;
Раздовский Ю.Е., 2002;
Григорович И.Н. с соавт., 2006). Многие беременные страдают хроническими заболеваниями (Вельтишев Ю.Е., 2000).
В структуре экстрагенитальных заболеваний женщин детородного возраста особое место занимают болезни гепатобилиарной системы:
хронические гепатиты, холециститы, холангиты, желчнокаменная болезнь, дискинезии желчевыводящих путей (Шехтман М.М., 2000). Многочисленные клинические наблюдения и экспериментальные исследования указывают на задержку структурно-функционального становления системы жизнеспособности у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы (Брюхин Г.В., 1990, 1993, 1994, 1999, 2004;
Грачев А.Ю., 1994;
Пивень Г.В., 1995;
Бояков А.А., 1999, 2001;
Николина О.В., 2000;
Евченко Е.В., 2001;
Вторушина Е.В., 2003;
Пашнина Е.Н., 2003;
Учаев Д.А. с соавт., 2004;
Федосов А.А. с соавт., 2004;
Кузнецова А.Б., 2006;
Сизоненко М.Л., 2005;
Ильиных М.А., 2006).
Анализ работ современных ученых (Подымова С.Д., 1998, 2005;
Брюхин Г.В., 2002, 2006) показывает, что на сегодняшний день недостаточно изучены вопросы влияния поражения печени матери различной этиологии на организм потомства, в частности на тучные клетки. Тучные клетки являются мультифункциональными эффекторными клетками соединительной ткани, широко распространенными по всему организму, синтезирующими широкий спектр биологически активных веществ, обеспечивающими поддержание внутритканевого гомеостаза, интегрирующими на тканевом уровне деятельность нервной, эндокринной и иммунной систем и участвующими тем самым во всех физиологических и патологических процессах (Проценко В.А.
с соавт., 1987;
Зуга М.В. с соавт., 1998, 1999;
Фрейдлин И.С. с соавт., 2001;
Бережная Н.М. с соавт., 2003;
Попов Г.К. с соавт., 2005;
Юшков Б.Г. с соавт., 2006).
Цель исследования заключается в определении морфофункционального состояния тучноклеточной популяции различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени в процессе постнатального развития.
Указанная цель обусловила постановку следующих основных задач:
1. Исследовать морфофункциональное состояние тучных клеток различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени.
2. Выявить морфофункциональные особенности тучных клеток различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени в условиях острой стрессовой реакции.
3. Провести сравнительный анализ морфофункционального состояния тучноклеточной популяции у потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени.
Наиболее существенные научные результаты, полученные автором и их научная новизна:
Впервые произведена комплексная оценка нарушений морфофункционального состояния тучных клеток различных компартментов потомства самок крыс с хроническим экспериментальным алкогольным и токсическим (четыреххлористый углерод) поражением печени в различные сроки постнатального развития. Установлено, что у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза имеет место перераспределение содержания тучных клеток в различных компартментах, происходящее на фоне статистически значимого увеличения их функциональной активности: увеличение уровня дегрануляции и содержания триптазы, снижение содержания гепарина и экспрессии CD117.
Новыми являются данные, свидетельствующие о том, что экспериментальное хроническое поражение печени самок крыс алкогольного и токсического генеза обусловливает более выраженные изменения морфофункционального состояния соединительнотканной субпопуляции тучных клеток у потомства по сравнению с таковыми мастоцитами слизистых оболочек.
Впервые показано, что в условиях острого стрессового воздействия функциональная активность тучных клеток алкогольной группы животных выше по сравнению с мастоцитами крысят токсической группы.
Впервые установлено, что экспериментальное хроническое алкогольное поражение печени у самок крыс сопровождается повышенной функциональной активностью тучных клеток большинства компартментов их потомства, по сравнению с крысятами токсической группы в процессе постнатального онтогенеза.
Систематизирован и уточнен понятийный аппарат, позволивший внести коррективы в содержание понятия «тучные клетки», касающиеся бинаправленных кооперационных связей тучных клеток с нервной, эндокринной и иммунной системами.
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные результаты содержат новые сведения об особенностях структурно-функционального состояния тучных клеток различных компартментов у потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза (алкогольного, токсического) в постнатальном периоде развития, что расширяет современные представления о нарушениях процессов внутриутробного развития при воздействии экстремальных факторов окружающей среды.
Проведенное исследование, выявившее общие механизмы влияния патологии печени самок крыс на морфофункциональное становление тучноклеточной популяции различных компартментов у потомства, может быть использовано для разработки мер профилактики и фармакологической коррекции последствий влияния заболеваний печени матери на организм потомства. Современное представление о тучных клетках, как о регуляторах иммунного и тканевого гомеостаза, позволяет результаты проведенного исследования использовать для обоснования необходимости выделения потомства матерей с патологией печени в группу риска, в связи с возможностью развития заболеваемости внутренних органов у потомства.
Результаты проведенного исследования используются в курсе лекционных и лабораторных занятий по дисциплинам «Физиология человека и животных», «Основы патофизиологии» биологического факультета ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет» и в научно исследовательском и учебном процессах кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
(разделы «Ткани внутренней среды. Соединительная ткань», «Нарушения внутриутробного развития человека»).
Положения, выносимые на защиту:
1. Хроническое экспериментальное поражение печени самок крыс обусловливает перераспределение и увеличение функциональной активности тучных клеток различных компартментов потомства в процессе постнатального развития.
2. Острый иммобилизационный стресс вызывает у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различной этиологии менее выраженные функциональные изменения тучных клеток различных компартментов, по сравнению с интактными животными.
3. Наиболее выраженные изменения структурно-функционального состояния тучных клеток различных компартментов имеют место у потомства самок крыс с хроническим алкогольным поражением печени по сравнению с животными токсической группы.
Апробация работы Результаты исследования были доложены и обсуждены на I Международной научно-практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды»
(Челябинск, 2006);
на IV итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2006);
на Международной конференции «Человеческий фактор в условиях экстремальных воздействий окружающей среды» (Челябинск, 2008);
на VI итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2008).
Публикации По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 публикации в изданиях рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации Основное содержание работы
изложено на 218 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, 67 рисунков, из которых микрофотографий. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), результатов собственного исследования (глава 3), заключения, списка использованных источников, включающего 225 наименований, в том числе 63 работы зарубежных авторов, 2 приложений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В эксперименте были использованы лабораторные крысы (самки) «Вистар» (284 животных, в том числе 87 взрослых крыс-самок и их разнополое потомство - 197 животных из 87 пометов, в равном соотношении полов) в различные сроки постнатального онтогенеза (на 1-й, 15-й, 30-й, 45-й и 60-й дни). Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрастных периодов у данной группы животных (Лабораторные животные…, 1983): период новорожденности (1-5 день), подсосный период (6-21день), период полового созревания (22-50 день) и период половой зрелости (с 60 дня).
Исходя из задач исследования, все экспериментальные животные были разделены на 3 группы. В первую группу были выделены животные от интактных родителей (контрольная группа) – «К» (65 животных из пометов). Во вторую группу вошли животные от матерей с хроническим алкогольным поражением печени (алкогольная группа) – «А» (67 животных из 27 пометов). К третьей группе отнесены животные от матерей с хроническим токсическим поражением печени (токсическая группа) – «Т» (65 животных из 30 пометов).
Работа с экспериментальными животными проводилась с учетом суточных и сезонных колебаний, все животные содержались в стандартных условиях вивария с идентичным пищевым рационом. Работа с экспериментальными животными проводилась в полном соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Модель хронического алкогольного поражения печени у взрослых половозрелых самок крыс создавалась путем ежедневного зондового введения в желудок 40%-го водного раствора этанола в дозе 4 г/кг массы на протяжении 4 недель (Кругликов Р.И. и соавт., 1990).
Модель хронического токсического поражения печени у крыс созда валась путем подкожного введения 0,1 мл 40%-го раствора четыреххлористого углерода (CCL4) на растительном масле дважды в неделю в течение двух месяцев (Саркисов Д.С. с соавт., 1960).
После затравки подопытных крыс-самок подсаживали к здоровым самцам.
Поражение печени у экспериментальных животных верифицировали с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов.
Модель иммобилизационного стресса формировалась путем однократной 30-минутной иммобилизации посредством привязывания к столику экспериментальных 45-ти дневных животных интактной и подопытных групп (Шапиро Ф.Б. с соавт., 1998). Забор материала производился через 30 мин, 60 мин и 120 мин после окончания иммобилизации.
Исходя из поставленных задач, нами использовались морфологические, морфометрические, гистохимические, иммуногистохимические и статистические методы исследования.
Среднее количество тучных клеток в паренхиматозных органах (тимус, селезенка, сердце, печень, почка) определяли на единицу площади – 1мм2, в перитонеальном экссудате на единицу объема – 1 мл, в тонком кишечнике на ворсину.
Для оценки площади тучных клеток использовали программу ImageJ v 1.37 (National Institutes of Health, USA) при увеличении 600. Съемка гистологических препаратов осуществлялась с применением микроскопа Axiostar plus (Garl Zeiss SMT) с тринокулярной насадкой, оснащенной оптическим адаптером для цифровой фотокамеры Sony (7,2 mega pixels).
Конечное увеличение на цифровой фотокамере определялось с помощью стандартного объектмикрометра.
Синтетическую активность тучных клеток различных компартментов экспериментальных животных оценивали на основе анализа субпопуляционного состава по степени гранулярного насыщения, степени выраженности экспрессии триптазы и CD117.
Оценка содержания гепарина в секреторных гранулах тучных клеток осуществлялась на серийных гистологических срезах толщиной 6-7 мкм и мазках перитонеального экссудата, окрашенных 0,1% водным раствором толуидинового синего (ph 4,9) при увеличении 600. По степени метахромазии и количеству гранул всю популяцию тучных клеток делили на группы: 1 группа – очень темные клетки (1 степень);
2 группа – темные клетки (2 степень);
3 группа – светлые клетки (3 степень);
4 группа – очень светлые клетки (4 степень). Индекс гранулярного насыщения рассчитывался в условных единицах как отношение суммы всех темных клеток к сумме всех светлых клеток (Линднер Д.П. с соавт., 1980).
Иммуногистохимические исследования уровня экспрессии триптазы и CD117 осуществлялись на срезах, фиксированных формалином и залитых в парафин. Анализ экспрессии триптазы проводился при инкубации срезов с антителами против триптазы (мышиные моноклональные, разведение 1:150, Novocastra, UK). Определение уровня экспрессии CD117 осуществлялось у 45 ти дневных экспериментальных животных путем инкубации срезов с антителами против CD117 (поликлональные мышиные против крысиные, разведение 1:500, DakoCytomation, USA). Окрашивание срезов тимуса проходило при применении полимерной системы детекции (Криволапов А.Ю.
с соавт., 2006). Отсутствие реактивности обозначалось как «-»;
минимальная (слабая) реактивность как «+» (1 степень);
средняя (умеренная) как «++» ( степень);
максимальная (сильная) как «+++» (3 степень) (Руководство по иммуногистохимической..., 2000, 2004). Возможность судить об уровне содержания триптазы в секреторных гранулах тучных клеток, а также о содержании CD117 в цитоплазме и на цитоплазматической мембране мастоцитов дает расчет среднего иммуногистохимического показателя (СИГХП) в условных единицах по следующей формуле:
А 1 + В 2 + С (1), СИГХП = n где А – количество клеток со слабой степенью выраженности экспрессии антигена;
В - количество клеток с умеренной степенью выраженности экспрессии антигена;
С - количество клеток с сильной степенью выраженности экспрессии антигена;
n – общее количество клеток.
Дегранулярная активность тучноклеточной популяции оценивалась по способности клеток к дегрануляции. Клеткам с неактивной степенью дегрануляции присваивалась 0 степень, мастоцитам с 1-2 гранулами за пределами клетки - 1 степень, с количеством гранул от 3 до 10 - 2 степень, при сильной (тотальной) дегрануляции – 3 степень. Индекс дегрануляции рассчитывался в условных единицах по формуле:
А 0 + Б 1 + В 2 + Г (2), ИДГ = n где А – неактивные клетки;
Б – слабо дегранулирующие клетки;
В – клетки с умеренной дегрануляцией;
Г – клетки с сильной дегрануляцией;
n – общее количество тучных клеток (Линднер Д.П. с соавт., 1980).
Исходя из задач исследования и типа полученных данных, в работе применялись параметрические и непараметрические методы статистического анализа. С помощью параметрических методов выполнялась описательная статистика с целью расчета средних значений (М) и средних квадратичных отклонений (s). Учитывая небольшой количественный состав групп экспериментальных животных, сравнение их результатов проводилось с использованием непараметрических методов на основе критерия Манна Уитни. При этом во внимание принимались результаты, где уровень статистической значимости (p) обнаруженных различий был 0,05 (95%) (Применение методов…, 2006;
Реброва О.Ю., 2003).
Все полученные результаты обрабатывались с применением пакета прикладных статистических программ Statistica v 6.0.
С целью проведения сравнительного анализа степени последствий воздействия алкогольного и токсического поражений печени самок крыс на морфофункциональное состояние тучных клеток различных компартментов у потомства был применен ранговый метод исследования (Гринчель Б.М. с соавт., 2003;
Медик В.А. с соавт., 2003).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Содержание тучных клеток в различных компартментах экспериментальных животных Оценка содержания мастоцитов в различных компартментах позволила выявить, что в процессе постнатального развития с периода новорожденности и до периода половой зрелости у экспериментальных животных контрольной и подопытных групп имеет место количественное перераспределение тучных клеток.
А Б 0,3 0, 0, 1 15 30 45 15 сутки 30 сутки 45 сутки 60 сутки сутки сутки сутки сутки сутки Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис.1. Содержание тучных клеток в слизистой оболочке тонкого кишечника (А) (в расчете на 1 ворсинку) и сердце (Б) (в расчете на 1 мм2) экспериментальных животных Примечание: х – статистически значимое различие результатов по сравнению с контролем (p0,05) Так, в частности, выявлено постепенное увеличение количества гепаринпродуцирующих атипичных тучных клеток слизистой оболочки тонкого кишечника (рис. 1А). Также происходит рост числа соединительнотканных мастоцитов в миокарде (рис. 1Б), печени, почке, перитонеальном экссудате. В органах иммунной системы (тимус, селезенка), напротив, отмечается постепенное снижение содержания типичных мастоцитов. У потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени в процессе постнатального онтогенеза имеет место изменение содержания тучных клеток, что в конечном итоге приводит в период половой зрелости к увеличению числа мастоцитов тимуса, сердца, тучных клеток слизистой оболочки тощей кишки и уменьшению их количества в печени, перитонеальном экссудате и почке.
Анализ функционального состояния соединительнотканных и слизистых тучных клеток различных компартментов осуществлялся на основе расчетов значений площади мастоцитов, уровня гранулярного насыщения (содержания гепарина), уровня экспрессии триптазы и CD117, уровня дегрануляции.
Результаты анализа величины мастоцитов различных компартментов экспериментальных животных контрольной и подопытных групп свидетельствуют, что в процессе постнатального онтогенеза с момента рождения и до периода половой зрелости отмечается постепенное увеличение площади соединительнотканных тучных клеток (рис. 2А).
А Б 60 50 40 30 20 10 0 15 30 45 1 15 30 45 60 сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис.2. Площадь тучных клеток в тимусе (А) и слизистой оболочке тонкого кишечника (Б) экспериментальных животных, мкм2 (p0,05) Площадь мастоцитов слизистой оболочки в процессе постнатального онтогенеза изменяется незначительно (рис. 2Б). При этом в период новорожденности и подсосный период размеры типичных тучных клеток большинства компартментов у подопытных животных обеих групп превышают таковые в контроле, а на более поздних стадиях постнатального развития, напротив, уменьшаются.
Синтетическая активность тучных клеток различных компартментов экспериментальных животных Секреторный процесс условно подразделяется на два основных периода:
стадию синтеза и накопления секретируемых веществ в клетке и стадию выделения секрета во внеклеточный матрикс. Стадия синтеза оценивалась по степени гранулярного насыщения тучных клеток, уровню экспрессии триптазы и CD117, а стадия выделения секрета – по степени дегрануляции.
Анализ уровня синтетической активности позволяет заключить, что у экспериментальных животных с момента рождения и до периода половой зрелости происходит постепенное увеличение содержания гепарина в секреторных гранулах в большинстве соединительнотканных и слизистых тучных клеток (рис. 3). При этом у потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражениями печени значения индекса гранулярного насыщения обеих субпопуляций мастоцитов на большинстве сроков наблюдения снижены по сравнению с аналогичным контролем.
А Б 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 15 30 45 60 1 сутки 15 сутки 30 сутки 45 сутки сутки сутки сутки сутки сутки Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 3. Индекс гранулярного насыщения тучных клеток в сердце (А) и селезенки (Б) экспериментальных животных (p0,05) В постнатальном периоде также фиксируется изменение уровня содержания триптазы в секреторных гранулах мастоцитов экспериментальных животных.
А Б 3,5 3, 3 2,5 2, 2 1,5 1, 1 0,5 0, 0 1 15 30 45 60 1 15 30 45 сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 4. Средний иммуногистохимический показатель уровня экспрессии триптазы тучных клеток в сердце (А) и селезенке (Б) экспериментальных животных (p0,05) На большинстве сроков наблюдения у подопытных животных алкогольной и токсической групп значения исследуемого показателя миокардиальных (рис. 4А) и печеночных тучных клеток превышают таковые в контроле, а в мастоцитах селезенки (рис. 4Б), напротив, снижены. В тимусных тучных клетках крысят обеих подопытных групп уровень экспрессии триптазы с 1-го дня постнатальной жизни и до начала периода полового созревания выше по сравнению с аналогичным контролем. С периода завершения полового созревания и до периода половой зрелости исследуемый показатель данной популяции мастоцитов снижается.
Анализ субпопуляционного состава мастоцитов различных компартментов 45-ти дневных экспериментальных животных по степени выраженности экспрессии CD117 позволил установить, что в большинстве компартментов подопытных животных алкогольной и токсической групп содержание тучных клеток с выраженным уровнем экспрессии CD117 ниже, чем в соответствующем контроле (рис. 5).
Значения индекса дегрануляции соединительнотканных мастоцитов различных компартментов у подопытных крысят токсической и алкогольной групп превышают таковые в контроле (рис. 6А).
тимус 2, 1, тонкий кишечник селезенка 0, печень сердце Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 5. Средний иммуногистохимический показатель уровня экспрессии CD117 в тучных клеток различных компартментов экспериментальных животных, у.е. (p0,05) Уровень дегрануляции тучных клеток слизистой оболочки тонкого кишечника подопытных животных на большинстве сроков исследования, напротив, снижен по сравнению с контролем (рис. 6Б). Исключение составили 45-ти и 60-ти дневные крысята алкогольной группы, у которых значения индекса дегрануляции, напротив, превышают таковые в контроле.
А Б 1,8 0, 1, 0, 1, 1,2 0, 0, 0, 0,6 0, 0, 0, 0, 0 1 сутки 15 30 45 60 15 сутки 30 сутки 45 сутки 60 сутки сутки сутки сутки сутки Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 6. Индекс дегрануляции тучных клеток в тимусе (А) и слизистой оболочке тонкого кишечника (Б) экспериментальных животных (p0,05) Морфофункциональная характеристика тучных клеток различных компартментов в условиях острого стрессового воздействия Проведенный анализ содержания типичных и атипичных мастоцитов в различных компартментах экспериментальных животных интактной и подопытных групп в условиях острого стрессового воздействия на всех сроках проводимого исследования не позволил выявить статистически значимых изменений значений данного показателя по сравнению с исходным уровнем.
Иммобилизация экспериментальных животных контрольной, алкогольной и токсической групп сопровождается изменениями функциональной активности тучных клеток различных компартментов, что выражается в изменении их площади и субпопуляционного состава по степени гранулярного насыщения и уровню дегрануляции.
Прежде всего, обращает на себя внимание, что иммобилизационный стресс обусловливает увеличение площади соединительнотканных мастоцитов (рис. 7А) и ее уменьшение у слизистых тучных клеток (рис. 7Б), наиболее выраженное у интактных крысят по сравнению с животными алкогольной и токсической групп.
А Б 90 80 20 10 Исходный 30 мин 60 мин 120 мин Исходный 30 мин 60 мин 120 мин уров ень уров ень Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 7. Площадь тучных клеток в тимусе (А) и слизистой оболочке тонкого кишечника (Б) экспериментальных животных в условиях острого стрессового воздействия, мкм2 (p0,05) Иммобилизационный стресс сопровождается у интактных крысят выраженным снижением уровня гранулярного насыщения типичных тучных клеток (рис. 8А). В тоже время у подопытных крысят стресс первоначально обусловливает увеличение значений данного показателя по сравнению с исходным уровнем. Затем имеет место снижение значений индекса гранулярного насыщения до уровня незначительно отличающегося от исходного. Уровень дегрануляции соединительнотканных тучных клеток у интактных крысят при стрессовом воздействии увеличивается (рис. 8Б).
А Б 9 1, 8 1, 7 1, 6 1, 0, 0, 0, 0, 0 Исходный 30 мин 60 мин 120 мин Исходный 30 мин 60 мин 120 мин уровень уровень Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 8. Индексы гранулярного насыщения (А) и дегрануляции (Б) тучных клеток сердца экспериментальных животных в условиях острого стрессового воздействия (p0,05) У подопытных животных алкогольной и токсической групп значения данного показателя первоначально несколько снижаются, а затем увеличиваются, но не превышают таковые в контроле.
Слизистые мастоциты оказались менее чувствительными к действию стрессового фактора. Как видно из рис. 9А, при иммобилизационном стрессе значения индекса гранулярного насыщения данной субпопуляции клеток у интактных крысят и животных алкогольной группы меняется незначительно.
В тоже время у животных токсической группы первоначально иммобилизационный стресс обусловливает увеличение значений данного показателя, а затем – снижение, до уровня более низкого, чем в контроле.
Значения индекса дегрануляции атипичных тучных клеток интактных крысят и животных токсической группы в условиях острого стрессового воздействия меняются слабо (рис. 9Б). Исключение составили животные алкогольной группы, у которых иммобилизация привела к снижению уровня дегрануляции до значений, более сниженных по сравнению с контролем.
Таким образом, у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным алкогольным и токсическим поражениями печени имеет место менее выраженная ответная реакция тучных клеток обеих субпопуляций различных компартментов на воздействие стрессора, о чем свидетельствуют меньший уровень изменения площади клеток, более высокое содержание гепарина и более низкий уровень дегранулярной активности.
А Б 0,5 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Исходный 30 мин 60 мин 120 мин Исходный 30 мин 60 мин 120 мин уровень уровень Контрольная группа Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 9. Индексы гранулярного насыщения (А) и дегрануляции (Б) тучных клеток слизистой оболочки тонкого кишечника экспериментальных животных в условиях острого стрессового воздействия (p0,05) Для сравнительной оценки влияния алкогольного и токсического поражения печени самок крыс на морфофункциональное состояние тучных клеток различных компартментов у потомства был применен ранговый метод исследования.
Сравнительный анализ значений средней суммы баллов, приходящейся на одну популяцию клеток, показал, что большие изменения значений количественных и функциональных показателей тучных клеток различных компартментов происходят в период полового созревания особенно у животных алкогольной группы (рис. 10А), по сравнению с крысятами токсической группы. При этом наиболее выраженные изменения имеют место в субпопуляции соединительнотканных миокардиальных, тимусных и печеночных мастоцитов подопытных групп животных (рис. 11).
Сравнительный анализ морфофункционального состояния мастоцитов различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различной этиологии в условиях острого стрессового воздействия позволяет констатировать, что ответная реакция тучных клеток развивается с опозданием и «затухает» значительно ранее, чем в соответствующем контроле, о чем свидетельствуют значения средней суммы баллов, приходящейся на одну популяцию клеток (рис. 10Б).
А Б 90 40 1 15 30 45 30 мин 60 мин 120 мин сутки сутки сутки сутки сутки Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 10. Средняя сумма баллов на одну популяцию тучных клеток подопытных животных алкогольной и токсической групп в различные периоды постнатального развития (А) и в условиях острой стрессовой реакции (Б) При этом более выраженные изменения значений функциональных параметров мастоцитов имеет место у крысят токсической группы по сравнению с алкогольной группой.
перитонеальные мастоциты тонкий кишечник тимус почка селезенка печень сердце Алкогольная группа Токсическая группа Рис. 11. Общая сумма баллов тучных клеток различных компартментов 30-ти дневных подопытных животных алкогольной и токсической групп Полученные результаты свидетельствуют о том, что перманентно высокий уровень функциональной активности тучноклеточной популяции различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим поражением печени имеет место на фоне нарушения содержания мастоцитов в различных компартментах, обусловливая тем самым, развитие состояния напряженности клеток в условиях относительного функционального покоя. В итоге, состояние функциональной напряженности не позволяет тучным клеткам в условиях стрессового воздействия дать «полноценный» ответ на действие стрессора и вернуть физиологические параметры среды в норму. При этом наиболее выраженные изменения отмечаются в тучных клетках различных компартментов у крысят алкогольной группы, по сравнению с мастоцитами животных токсической группы, особенно в субпопуляции соединительнотканных клеток.
Результаты собственного исследования и данные литературы позволяют представить патогенез нарушения морфофункционального состояния тучных клеток различных компартментов у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза следующим образом (рис. 12).
Производственные облигатные гепатотоксиканты (этанол, четыреххлористый углерод) приводят к сбою целого ряда гомеостатических систем, опосредованному угнетением основных функциональных систем печени. Происходит изменение всех обменных процессов. В связи с нарушением дезинтоксикационной функции печени развивается эндотоксинемия. Патология печени матери обусловливает поражение центрального и периферического звеньев эндокринной системы, нервной системы, нарушение механизмов клеточного и гуморального иммунитетов, запуск аутоиммунных реакций (Куценко С.А. 2002;
Шерлок Ш. с соавт., 2002;
Подымова С.Д., 2005;
Болезни печени…, 2008). Опираясь на мультипараметрический принцип (Судаков К.В., 2001, 2002), можно предположить, что патология гепатобилиарной системы приводит к структурно-функциональным нарушениям большинства функциональных систем организма матери.
В силу повышения проницаемости плацентарного барьера (Савченков Ю.И. с соавт., 1980), накапливающиеся патологические продукты метаболизма из крови матери поступают в кровь плода. При этом через гематоплацентарный барьер в кровь плода поступают печеночные аутоантитела, циркулирующие иммунные комплексы и другие гуморальные факторы иммунной системы, а также сенсибилизированные CD4- и CD8 лимфоциты (Шерлок Ш. с соавт., 2002;
Подымова С.Д. 2005;
Болезни печени…, 2008). Массированное поступление из организма матери в кровь плода вышеперечисленных соединений приводит к изменению условий внутриутробного развития, что обусловливает нарушение процессов морфогенеза различных органов и функциональных систем. При этом плод испытывает антигенную агрессию и развивается в условиях постоянно действующего стресса, приводя тем самым к первоначальной активации ряда жизненноважных систем.
Рис. 12. Схема влияния алкогольного и токсического экспериментального поражения печени матери на морфофункциональное состояние тучных клеток различных компартментов потомства (по результатам собственных исследований и данных литературы) Стимуляция продукции активных форм кислорода и оксида азота, вызываемая гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, поступающих из организма матери, вызывает полиорганную недостаточность, накопление различных неоаутоантигенов, создавая условия для развития аутоиммунных процессов. Исходя из мультипараметрического принципа теории функциональных систем (Анохин П.К., 1970, 1980), у потомства матерей с хронической патологией печени развивается комплексная морфофункциональная недостаточность большинства физиологических систем их организма.
Резюмируя все вышеизложенное, можно заключить, что у самок крыс с хроническим экспериментальным алкогольным и токсическим поражением печени рождается потомство с нарушением структурно-функционального состояния мастоцитов различных компартментов, что является одним из патогенетических звеньев развития физиологической незрелости.
Исходя из анализа и систематизации литературных данных под тучными клетками понимается специализированная, высокодифференцированная, долгоживущая, радиорезистентная популяция гемопоэтических клеток соединительной ткани, синтезирующая широкий спектр биологически активных веществ, что обусловливает их участие во всех физиологических и патологических процессах, происходящих в организме.
Результаты собственного исследования позволили дополнить определение понятия «тучные клетки» тем, что мастоциты образуют бинаправленные кооперационные связи с нервной, эндокринной и иммунной системами.
ВЫВОДЫ 1. Экстрагенитальная патология самок крыс в виде хронического экспериментального поражения печени алкогольной и токсической природы приводит к нарушениям морфофункционального состояния тучных клеток различных компартментов потомства в процессе постнатального развития.
2. Хроническое поражение печени самок крыс обусловливает перераспределение мастоцитов различных компартментов потомства, происходящее на фоне повышения их функциональной активности:
увеличение уровня дегрануляции и содержания триптазы, снижение содержания гепарина.
3. Выраженные изменения содержания и функциональной активности тучных клеток различных компартментов имеют место в период полового созревания потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза.
4. Сравнительный анализ значений количественных и функциональных показателей тучных клеток различных компартментов потомства выявил более выраженные изменения при экспериментальном хроническом алкогольном поражении печени самок крыс, по сравнению с крысятами токсической группы.
5. Острая иммобилизация экспериментальных животных сопровождается стереотипным повышением функциональной активности тучных клеток различных компартментов (увеличение площади клеток и уровня дегрануляции, снижение содержания гепарина) без изменения их содержания.
6. У потомства самок крыс с хроническим алкогольным и токсическим поражением печени отмечается снижение ответной реакции мастоцитов различных компартментов в условиях острого иммобилизационного стресса, по сравнению с контролем. При этом функциональная активность тучных клеток различных компартментов у животных алкогольной группы превышает таковую у крысят токсической группы.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Леонов, Н.В. Характеристика тучных клеток перитонеального экссудата у потомства самок крыс с хронической алкогольной интоксикацией [Текст] / Н.В. Леонов // Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды : материалы I Междунар. науч.-практ. конф., 9-11 октября 2006 г. / науч. ред. Д.З. Шибкова. – Челябинск : Изд-во Челяб.
гос. пед. ун-та, 2006. – С. 367-370.
2. Леонов, Н.В. Иммуногистохимическое исследование триптазы тучных клеток селезенки у потомства самок крыс с хронической алкогольной интоксикацией [Текст] / Н.В. Леонов // Материалы IV итоговой научно практической конференции молодых ученых ЧелГМА. – Челябинск : изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2006. – С. 58-60.
3. Леонов, Н.В. Экспрессия триптазы в тучных клетках тимуса у потомства самок крыс с хронической алкогольной интоксикацией [Текст] / Н.В. Леонов // Материалы IV итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии. – Челябинск : изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2006. – С. 60– 61.
4. Леонов, Н.В. Уровень содержания триптазы в секреторных гранулах тучных клеток в различных компартментах у потомства самок крыс с хронической алкогольной интоксикацией [Текст] / Н.В. Леонов // Новые технологии в здравоохранении : сб. науч. тр. Выпуск V ;
под ред. проф. В.Р.
Телесенко. – Челябинск : Изд-во «Пирс», 2006. – С. 260-261. – 0,24 п.л.
5. Леонов, Н.В. Морфофункциональная характеристика тучных клеток печени потомства самок крыс с хроническим алкогольным поражением гепатобилиарной системы [Текст] / Н.В. Леонов, Г.В. Брюхин // Естествознание и гуманизм : сб. науч. тр. Т.4, №2. – Томск, 2007. – С. 24-25.
6. Леонов, Н.В. Влияние хронического алкогольного поражения печени матери на морфофункциональное состояние тучных клеток тимуса у потомства [Текст] / Н.В. Леонов, Г.В. Брюхин // Морфологические ведомости.
– 2007. - №3-4. – С. 43-45. (издание, рекомендованное ВАК РФ) 7. Леонов, Н.В. Характеристика тучных клеток сердца у потомства матерей хроническим экспериментальным алкогольным поражением печени [Текст] / Н.В. Леонов, Г.В. Брюхин // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». – 2008. – вып.14, №4 (104). – С. 73-74. (издание, рекомендованное ВАК РФ) 8. Леонов, Н.В. Влияние хронического экспериментального поражения гепатобилиарной системы матери на морфофункциональное состояние тучных клеток селезенки у потомства [Текст] / Н.В. Леонов // Материалы VI итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии. – Челябинск : изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2008. – С. 72-74.
Подписано в печать 25.09.2008 г.
Формат 60 х 90/16. Объем 1,0. уч.-изд. л.
Тираж 120 экз. Заказ №260.
Бумага офсетная.
Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ЧГПУ.
454080, г. Челябинск, пр. Ленина, 69.