Разработка способа получения жидкофазных биологически активных средств
На правах рукописи
Фомичева Наталья Викторовна
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ
ЖИДКОФАЗНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СРЕДСТВ
Специальность 03.00.07 – Микробиология
03.00.23 – Биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Тверь – 2007
2
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственного использования мелиорированных земель (ВНИИМЗ)
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Архипченко Ирина Александровна кандидат биологических наук Чугунова Марина Валентиновна
Ведущая организация: ГОУВПО Тверской государственный технический университет (ТГТУ)
Защита состоится « 8 » ноября 2007 г. в часов на заседании диссерта ционного совета К.006.028.01 во Всероссийском научно-исследовательском ин ституте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 196608, Санкт Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИСХМ и на сайте [email protected] Автореферат разослан « 8 » октября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Алисова С.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из важных задач современной биотехноло гии является разработка технологий по созданию и применению биологически активных средств, способствующих росту и развитию растений, улучшению почвенного плодородия и используемых в других сферах человеческой жизни.
Наиболее актуальным направлением, обеспечивающим одновременно с созда нием биосредств разумную утилизацию возобновляемых отходов (навоза, по мета, торфа, соломы, лигнина, отходов пищевых и лесоперерабатывающих предприятий), является создание высокоэффективных технологий, целесооб разных для внедрения в Российской Федерации, оказавшейся в крайне сложной экономической ситуации к началу ХХI века.
В настоящее время известно большое количество биологически активных средств, которые преимущественно классифицируют как биопрепараты. Наи более перспективными из них являются те, которые имеют множество областей применения и обладают широким спектром воздействия на объекты окружаю щей среды.
На фоне большого количества биосредств, представленных на россий ском рынке, особо выделяется группа биопрепаратов, технологии получения которых позволяют максимально сохранять и извлекать биологически активные вещества из исходных субстратов, изначально обеспеченных разнообразной микрофлорой, элементами питания, физиологически активными веществами.
Большинство наиболее эффективных биосредств – микробные препараты, представляющие собою сообщества специально подобранных отселектирован ных микроорганизмов или содержащие строго определенный штамм микроор ганизмов какого-то одного вида. Наряду с ними, биологически активные сред ства, получаемые из органического сырья (биоудобрения, биостимуляторы, биопрепараты), содержат присущие исходному сырью микробоценозы, накап ливающиеся в конечных продуктах при использовании эффективных техноло гических приемов и обеспечивающие в конечном итоге их высокую биологиче скую активность. Органические субстраты служат источником получения как твердофазных, так и жидкофазных биосредств. Последние отличаются доступ ностью элементов питания, возможностью минимизации дозировки и при не обходимости корректировки состава. Поэтому в последние годы большое вни мание уделяется разработкам технологий, связанных с получением именно жидкофазных биосредств.
Целью настоящей работы являлась разработка технологической линии по лучения жидкофазных биологически активных средств на основе ферментацион но-экстракционного процесса с последующим определением состава конечных продуктов и прогнозной оценкой их применения в народном хозяйстве.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
– предложить высокоэффективные стимуляторы процесса аэробно-анаэробной ферментации путем изучения их влияния на жизнедеятельность микрофлоры и оценки качества конечных продуктов;
– разработать технологическую линию получения жидкофазных биологически ак тивных средств, основывающуюся на ферментационно-экстракционном подходе;
– изучить состав и свойства жидкофазных биологически активных средств и оце нить спектр их возможного применения;
– изучить влияние жидкофазных биологически активных средств на жизнедея тельность почвенной микрофлоры и развитие растений в лабораторных экспери ментах.
Научная новизна. Показано влияние и осуществлен выбор оптимальных концентраций стимуляторов процесса аэробно-анаэробной ферментации путем тестирования жизнедеятельности микрофлоры и качества конечных продуктов.
Впервые разработана технологическая линия получения жидкофазных биологиче ски активных средств и предложена ее модернизация, позволяющая корректиро вать состав получаемых жидкофазных биосредств по содержанию необходимых элементов в зависимости от их назначения. Впервые исследован состав получае мых жидкофазных биосредств, определяющий их масштабное внедрение. Уста новлено влияние жидкофазных биологически активных средств на микрофлору почвы и растения.
Практическая значимость. Разработан двухступенчатый способ получе ния жидкофазных биологически активных средств и предложена производствен ная модель технологической линии. Предлагаемый способ получения жидкофаз ных биологически активных средств может быть реализован сельскохозяйствен ными предприятиями различных форм собственности.
Рекомендованы дозы внесения жидкофазных биосредств под яровую пше ницу и редис. Жидкофазные биосредства предлагается использовать в растение водстве (для ускорения прорастания семян, улучшения роста и развития растений, в целом, способствуя повышению урожайности), в земледелии (для активизации почвенно-микробиологических процессов, участвующих в формировании уровня плодородия почвы), при решении вопросов, связанных с оптимизацией компости рования органических субстратов и рекультивацией нарушенных земель.
Апробация работы. Диссертационная работа выполнялась в рамках Про граммы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научно му обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ Россельхозакаде мии на 2001 – 2005 гг. по заданию «Разработать научные основы и технологии по лучения новых видов и форм органических удобрений, мелиорантов и кормовых добавок на основе биоферментации разнообразного растительного сырья, органи ческих отходов и природных агроруд»;
на 2006 – 2010 гг. по заданию «Разрабо тать технологии производства и применения биомелиорантов широкого спектра воздействия на свойства почв осушаемых земель с целью повышения продуктив ности и экологической устойчивости агроландшафтов»;
в Государственном кон тракте с Минсельхозом России (ГК № 774/26, 2003 г.) по теме: «Проведение ис следований и разработка технологии получения физиологически активных препа ратов на основе продуктов ферментации органического сырья, обеспечивающих повышение прорастания семян зерновых культур и картофеля».
Основные теоретические положения и практические результаты диссерта ции доложены на заседаниях методической комиссии ГНИУ ВНИИМЗ в 2002 – 2004 гг., 2006 – 2007 гг.
Результаты работы докладывались на следующих конференциях: 3-й Все российской научной конференции "Перспективы развития Волжского региона" (Тверь, 2001 г.), Международной научно-практической конференции "Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных От ложений" (Томск, 2003 г.), Международной научно-практической конференции "Научно-производственное обеспечение развития сельского социума" (Москва, 2005 г.), 2-й, 3-й и 4-й Всероссийских конференциях молодых ученых "Новые технологии и экологическая безопасность в мелиорации" (Коломна, 2005 г., г., 2007 г.), Международной научно-практической конференции «Научно производственное обеспечение развития комплексных мелиораций Прикаспия»
(Соленое Займище, 2005 г., 2006 г.), областной научно-технической конференции молодых ученых “Физика, химия и новые технологии” в рамках ХIV Региональ ных Каргинских чтений, (Тверь, 2007 г.), Международной научно-практической конференции «Стабилизация производства и развитие агропромышленного ком плекса региона на основе внедрения инновационных технологий» (Тверь, 2007 г.).
По результатам выполненных исследований опубликовано 18 печатных ра бот, в том числе 2 в центральной печати, 2 Патента РФ на полезную модель и Патент РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка использо ванной литературы и приложений. Работа содержит 24 рисунка, 31 таблицу и приложений. Список литературы включает 154 наименования, в том числе 31 на иностранных языках.
Автор приносит глубокую признательность научному руководителю за пред ложенную интересную тему научной работы, за помощь и поддержку в написании диссертации, а также сотрудникам лаборатории биомелиорантов и микробиологи ческих исследований ВНИИМЗ за помощь в проведении экспериментов. Отдель ная благодарность сотрудникам лаборатории массовых анализов ВНИИМЗ за уча стие в получении результатов по характеристике объектов исследования.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, изложены цель, научная новизна и практическая значимость проведенных ис следований.
В главе 1 «Значение биологически активных средств в растениеводстве и земледелии» обобщены имеющиеся в литературе сведения о современных био средствах (биопрепаратах, стимуляторах) для роста и развития растений и улучшения почвенного плодородия, кратко представлены их свойства и назна чение. Отмечено, что наибольшую ценность представляют комплексные био средства с широким спектром применения. Рассмотрено значение основных со ставляющих комплексных биосредств: элементов питания, физиологически ак тивных веществ, микроорганизмов.
В главе 2 «Новые технологические решения в создании биологически ак тивных средств» описаны известные отечественные и зарубежные технологии получения биопрепаратов для почвы и растений с указанием основных стадий производства.
Показано, что продукты аэробно-анаэробной твердофазной ферментации, полученные путем переработки отходов животноводства, торфа и различных стимуляторов, можно использовать в качестве основы получения жидкофазных биологически активных средств (БАС).
В главе 3 «Объекты и методы исследований» представлены схемы полу чения жидкофазных биологически активных средств и лабораторной установки для проведения аэробно-анаэробной ферментации. Дана характеристика исход ного сырья и стимуляторов процесса, приводятся микробиологические и био химические методы анализа различных органических субстратов. Статобработ ку полученных данных проводили с помощью программ STATGRAPHICS Plus версия 2.1 и Microsoft Excel;
обработку ИК спектров – программами OPUS вер сия 2.06 и Origin версия 6.0.
В главе 4 «Разработка технологической линии получения жидкофазных биологически активных средств для растениеводства и земледелия» на первом этапе работа была направлена на выбор эффективных стимуляторов процесса ферментации. В качестве теста была использована ответная реакция углерод трансформирующих микроорганизмов, развивающихся в течение процесса фер ментации. В качестве стимуляторов рассматривались отходы предприятий Тверской области: мясоперерабатывающей промышленности (ОМПП), муко мольного производства (ОММП) и молочной промышленности (ОМП), исполь зуемые в количестве 5 % (масс.) от исходной смеси. Процессы трансформации углеродсодержащих соединений в процессе аэробно-анаэробной ферментации под влиянием стимулирующей деятельности пищевых отходов существенно различались между собой. Это, безусловно, связано с изначально различными питательной ценностью отходов, содержанием микрофлоры и ее функциональ ной активностью. Статистическая обработка результатов показала тесную, но варьирующую при использовании различных стимуляторов, связь исследуемых микроорганизмов, потребляющих в качестве единственного источника углеро да различные виды моно- и дисахаров, с динамикой общих сахаров, а также за висимость между развитием грибов и актиномицетов (R = 0,86). По совокупно сти полученных данных, к наиболее эффективному виду рассмотренных био стимуляторов были отнесены отходы мукомольного производства (ОММП).
На втором этапе работы оценивалось влияние двух видов стимуляторов комплексного состава органической и неорганической природы (отходов муко мольного производства и древесной золы) на формирование продуктов фермен тации с высокой физиологической активностью, обусловленной, наряду с угле родтрансформирующими микроорганизмами, деятельностью микроорганизмов, обеспечивающих трансформацию азота в ферментируемой смеси. Биостимуля торы использовались в различных концентрациях: ОММП – 1, 3, 5 и 10 %;
зола – 1, 3 и 5 %.
Исследование ферментативной активности позволило установить направлен ность происходящих в органической массе ферментера преобразований. В качест ве критерия оценки был выбран условный окислительно-восстановительный ко эффициент (ОВК), который находят путем отношения каталазной активности к дегидрогеназной активности, взятых в условных единицах. ОВК наглядно демон стрируют изменения, происходящие в процессе ферментации – преобладание ли бо процессов распада (ОВК 1), либо процессов синтеза (ОВК 1).
При использовании в каче ОВК 2, стве стимуляторов и ОММП, 2 и золы (рис. 1, 2) к концу про 1,5 цессов ферментации наблюда ется преобладание синтези рующих реакций, то есть в те 0, чение 120 часов ферментации активные процессы минерали Исходн. 24 ч 48 ч 72 ч 120 ч Время зации близки к завершению.
Рис. 1 Динамика ОВК в процессах В случае использования ферментации под воздействием ОММП ОММП в процессе фермен 1% 3% 5% 10% тации ОВК изменялся волно образно – происходили активные процессы преобразований, чему способство вала органическая природа стимулятора. При использовании 1;
5 и 10% ОММП к концу процесса ферментации ОВК достаточно резко снижался (в случае вне сения 1 % ОММП ОВК оказался равным 0,005), что свидетельствовало о близ ких к завершению процессах трансформации.
Помимо ферментативной ОВК 1, активности в ходе процессов 1 ферментации была определена численность микроорганизмов, 0, использующих минеральные и органические формы азота, микроорганизмов, выделяю Исходн. 24 ч 48 ч 72 ч 120 ч щих свободные аминокислоты, Время а также энтеробактерий, Рис. 2 Динамика ОВК в процессах являющихся продуцентами ферментации под воздействием золы витаминов группы В.
1% 3% 5% Отмечено, что как при использовании золы, так и ОММП после пастеризационного периода наблюда ется снижение указанных микроорганизмов практически во всех случаях. Од нако синтезированные ими метаболиты могли быть либо использованы други ми микроорганизмами, либо должны принимать непосредственное участие в процессах трансформации ферментируемой смеси.
В течение процесса ферментации было определено содержание аромати ческой аминокислоты триптофана, являющейся предшественником ИУК. В це лом, использование древесной золы в качестве стимулятора процесса фермен тации (особенно в количестве 1 – 3 %) способствовало большему накоплению триптофана в течение процесса по сравнению с применением отходов муко мольного производства.
В качестве критерия физиологической активности продуктов фермента ции использовали определение содержания общих сахаров, поскольку послед ние необходимы для роста и развития растений. Максимальное содержание са харов во всех вариантах приходилось на разные периоды течения процесса и не подчинялось каким-либо определенным закономерностям, так как на протя жении всего процесса углеводы активно включаются в метаболизм превраще ний, осуществляемых микрофлорой. Конечные продукты ферментации харак теризовались содержанием сахаров от 30,63 мг/г а.с.в. до 89,74 мг/г а.с.в., опре деленным при использовании различных концентраций исследуемых стимуля торов.
Продукты ферментации и исходные смеси для их получения были впер вые протестированы на содержание водорастворимых и жирорастворимых ви таминов и афлатоксина В1 с помощью прибора Флюорат 02-2М с приставкой ВЭЖХ 01 в лаборатории массовых анализов ВНИИМЗ. Поскольку витамины и афлатоксин В1 могут быть использованы микроорганизмами в обменных про цессах, вполне закономерным является факт снижения тех и других в продук тах ферментации. Так, в исходной смеси с использованием 5 % ОММП количе ство витамина Е снизилось с 10,7068 мг/кг до 8,6229, витамина В2 с 0, мг/100г до 0,329, афлатоксина В1 с 0,007733 мг/кг до 0,000830. В этой связи, несмотря на снижение содержания некоторых витаминов, наиболее важным яв ляется понижение содержания афлатоксинов (практически на порядок). В це лом, по содержанию афлатоксина В1 продукты ферментации можно отнести к категории экологически чистых, так как в различных проанализированных про дуктах количество афлатоксинов уступает их содержанию в приготовленном из различных трав сене (0,015…1,26 мг/кг).
Благодаря анализу результатов микробиологических и биохимических исследований течения процессов ферментации к оптимальным концентрациям рассмотренных стимуляторов были отнесены 5 % ОММП и 3 % золы. Эти кон центрации стимуляторов способствовали активным преобразованиям фермен тируемой смеси и накоплению физиологически активных веществ в конечных продуктах, поэтому и были рекомендованы в этом качестве при получении жидкофазных биологически активных средств.
Следующий этап работы был посвящен отладке ферментационно-экст ракционного способа получения жидкофазных биологически активных средств.
Качество жидкофазных биосредств, полученных при отработке технологии, оценивали микробиологическим тестом – определением содержания обычно доминирующих в таких процессах N-трансформаторов – аммонифицирующих (на мясопептонном агаре) и амилолитических (на крахмало-аммиачном агаре) микроорганизмов. В различных типах реализации ферментационно-экстракци онного процесса были выявлены оптимальные режимы ферментации и экстрак ции, способствующие появлению максимальной суммарной численности выше указанных микроорганизмов-доминантов (рис. 3).
Варианты ферментационно экстракционных процессов:
1 – Ф = 120 ч при 37 0С, Э = 72 ч при 37 0С;
млн. клеток/г а.с.в.
2 – Ф = 120 ч при 55 0С, 200 Э = 24 ч при 37 0С;
150 3 – Ф = 72 ч при 37 0С + 48 ч при 55 0С, Э = 72 ч при 22 С;
4 – Ф = 72 ч при 37 0С + 48 ч при 75 0С, 1 2 3 4 5 Э = 48 ч при 22 0С;
Варианты Рис. 3 Суммарная численность 5 – Ф = 48 ч при 37 0С + 24 ч при микроорганизмов-доминантов в жидкофазных 55 0С + 48 ч при 37 0С, биосредствах, приготовленных при различных Э = 48 ч при 22 0С;
режимах ферментации (Ф) и экстракции (Э):
6 – Ф = 48 ч при 37 0С + 24 ч при 75 0С + 48 ч при 37 0С, Э = 24 ч при 22 0С.
В результате выбор был остановлен на ферментационно-экстракционном процессе, включающем два основных этапа:
– первый этап – ферментация, которая длится 48 ч при 37 0С, далее 24 ч при 55 0С и в завершении 48 ч при 37 0С;
– второй этап – стационарное экстрагирование 1 %-ным раствором К2НРО4 продолжительностью 48 ч при температуре 22 0С.
В целом, схему получения жидкофазных биологически активных средств можно представить следующим образом:
Исходное сырье для ферментации Навоз КРС – 50 % Торф – 50 % ОММП – 5 % (масс.) или зола – 3 % (масс.) ФЕРМЕНТАЦИЯ 2 сут при 37 0С + 1 сут при 55 0С + 2 сут при 37 0С Твердофазный продукт ферментации = исходное сырье для экстракции ЭКСТРАКЦИЯ Настаивание 2 сут при 22 0С в растворе К2НРО4 (1 %) Настой продукта ферментации в экстрагенте ФИЛЬТРАЦИЯ, РОЗЛИВ Жидкофазное биологически активное средство На основании проведенных лабораторных экспериментов была создана полезная модель получения жидкофазных биологически активных средств для промышленного производства (рис. 4) с учетом корректировки состава конеч ного продукта по мере необходимости. Приведен оценочный расчет материаль ных потоков ферментационно-экстракционного процесса для случая использо вания 100 кг навоза, 100 кг торфа и 10 кг отходов мукомольного производства.
На выходе, из 210 кг исходной смеси и 580 литров экстрагента с учетом потерь должно получиться не менее 665 литров 10 %-ного жикофазного биосредства.
Рис. 4 Производственная модель технологической линии получения жидкофазных биологически активных средств 1 – ферментер, 2 – транспортер, 3 – экстрактор, 4 – накопительная емкость, 5 – фильтр, 6 – смеситель В главе 5 «Обоснование целесообразности использования новых жидко фазных биологически активных средств в земледелии и растениеводстве» пред ставлена характеристика состава и свойств получаемых жидкофазных биологи чески активных средств и на лабораторном уровне проверена эффективность их действия на биологические и агрохимические свойства почвы и растения. Пока зано, что жидкофазные биологически активные средства, приготовленные фер ментационно-экстракционным способом, внешне представляют собою раство ры (табл. 1).
Количество сухого вещества в биосредствах не превышает 3 %;
при от стаивании они почти не дают осадка. Кислотность очень благоприятная – сла бощелочная, не превышающая величину 8,0. Такой уровень кислотности при использовании биосредств в земледелии и растениеводстве должен положи тельно влиять на развитие бактериальной микрофлоры, предпочитающей нейт ральный или слабощелочной рН и тормозить развитие грибов, в том числе па тогенной микрофлоры.
Таблица Характеристика жидкофазных биологически активных средств Наименование показателя Результаты 1. Вид, цвет, консистенция Жидкость темно коричневого цвета 2. Массовая доля сухого остатка, %, не более 3, 3. Кислотность (рН) 7,5 – 8, 4. Массовая доля общего азота (N), г/л 0,2 – 0, 5. Массовая доля углерода гумусовых кислот, 1, г/л/, не более 6. Массовая доля общего фосфора (P2O5), г/л 10,0 – 15, 7. Массовая доля общего калия (K2O), г/л 9,0 – 12, 8. Массовая доля кальция (СаО), г/л, не более 0, 9. Массовая доля магния (MgO), г/л, не более 0, 2,5х109…2х 10. Количество аммонифицирующих микроорганизмов, КОЕ/мл 3х108…7х 11. Количество амилолитических микроорганизмов, КОЕ/мл 9х108…1,5х 12. Количество микроорганизмов, выделяющих свобод ные аминокислоты, КОЕ/мл 1х109…2х 13. Количество фосфатмобилизующих микроорганизмов, КОЕ/мл 7х108…2х 14. Количество микроорганизмов, потребляющих глюкозу в качестве единственного источника углерода, КОЕ/мл 6х108…1,5х 15. Количество микроорганизмов, потребляющих сорбит в качестве единственного источника углерода, КОЕ/мл 1,5х109…2х 16. Количество микроорганизмов, потребляющих сахаро зу в качестве единственного источника углерода, КОЕ/мл 1х105 …3х 17. Количество энтеробактерий, КОЕ/мл, не более 18. Массовая доля общих сахаров, мг/л, не менее 300, 19. Массовая доля триптофана, мг/л, не более 3, 20. Активность каталазы, см3О2/мл/мин 0,15 – 0, 21. Активность НАДН2-дегидрогеназы, мгТФФ/мл/сут 1,5 – 2, 22. Активность уреазы, мг NН3/мл/сут 1,5 – 8, 23. Активность инвертазы, мг глюкозы/мл/сут 0,15 – 0, Формированию БАС с высоким содержанием подвижного фосфора спо собствует 1 %-ная соль К2НРО4, что подтверждено данными ИК спектроскопи ческого исследования готовых биологически активных средств и калия фос форнокислого (чда). При сравнении их ИК спектров, записанных на Фурье-ИК спектрометре «Equinox 55» фирмы «Bruker», наблюдалось совпадение основ ных полос поглощения в области деформационных колебаний – 1160 - 500 см-1, соответствующих К2НРО4 (рис. 5).
а) б) Рис. 5 а) ИК спектры жидкофазного биосредства с использованием ОММП (1) и К2НРО4 (2);
б) ИК спектры жидкофазного биосредства с использованием золы (1) и К2НРО4 (2) Сравнение состава получаемого жидкофазного биосредства (табл. 1) с жидким гуминовым удобрением "ЭдагумR СМ " (производство группы компа ний "СМ"), а также с экстрактом сапропеля (производство ООО «Гера», Мос ковская обл., г. Лыткарино) свидетельствует, что жидкофазное биосредство, полученное во ВНИИМЗ, не относится к гуминовым удобрениям, но сравнимо с ними по отдельным показателям. К наиболее благоприятным факторам, сви детельствующим о хорошем качестве жидкофазного биосредства ВНИИМЗ, относятся: высокая численность агрономически полезной микрофлоры (3х108…2х1010 КОЕ/мл), высокое содержание подвижных форм фосфора (10 – 15 г/л) и калия (9 – 12,5 г/л), благоприятный уровень кислотности (рН 7,5 – 8,0).
Для сравнения в экстракте сапропеля (массовая доля сухого остатка 5 %) ос новных физиологических групп микроорганизмов содержится 3х105…9х КОЕ/мл;
Р2О5 – 2 г/л;
К2О – 3,5 г/л;
рН = 10.
Следует подчеркнуть, что в случае необходимости предусмотрено обога щение жидкофазного биологически активного средства элементами питания в зависимости от потребности растений (Патент 2006 г. на полезную модель № 57276). При этом желательна некоторая консервация деятельности микроорга низмов в случае длительного хранения биосредств, что может быть достигнуто добавлением веществ-консерваторов и стабилизаторов, а также регулированием температуры хранения.
Высокая численность микроорганизмов, обнаруженных в жидкофазных биосредствах, предопределяет их высокую биологическую активность, о кото рой частично можно судить по активности окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов.
При получении жидкофазных биосредств, процессы ферментации и по следующая экстракция способствуют поэтапному существенному снижению активности практически всех ферментов, свидетельствуя о стабилизации их свойств. Так, активность каталазы в одном из экспериментов изменялась сле дующим образом:
– в исходной торфонавозной смеси с использованием биостимулятора ОММП в количестве 5 % (перед ферментацией) – 14,3 см3О2/г/мин;
– в продукте ферментации – 3,9 см3О2/г/мин;
– в жидкофазном биологически активном средстве – 0,3 см3О2/мл/мин.
Об уровне физиологичности жидкофазных биологически активных средств можно судить по наличию триптофана и доступных сахаров. В био средствах содержится довольно большое количество сахаров (не менее мг/л), что предопределяет их использование в качестве биостимулятора для проращивания семенного материала, а также будет полезным для подкормки растений и формирования высокопитательного почвенного раствора.
В жидкофазном биологически активном средстве в количестве до 3,0 мг/л обнаруживается ароматическая аминокислота триптофан. В процессе своей жизнедеятельности растения используют ростовые вещества, как ими же синте зированные, так и находящиеся в почвенном растворе. В силу разных причин растения могут испытывать недостаток в физиологически активных веществах, поэтому использование биосредств, имеющих в своем составе триптофан, мо жет принести ощутимую пользу.
По данным производителей экстракта сапропеля, используемого в произ водстве биоудобрений «ФлорГумат», общее количество аминокислот в нем со ставляет 235 мг/л. Жидкофазные биосредства, получаемые во ВНИИМЗ, ~ в раза менее концентрированные. По аналогии с экстрактом сапропеля содержа ние аминокислот в нем должно быть меньше. В этой связи, обнаружение пред шественника ИУК – триптофана в количестве 3,0 мг/л – достаточно неплохой результат, так как триптофан в ряду других аминокислот обычно не занимает лидирующих позиций, но обладает высокой активностью.
Содержание триптофана в жидкофазных биосредствах можно сравнить с его содержанием в твердофазных удобрениях, в частности Бамила, разработан ного во ВНИИСХМ. В составе Бамила, полученного из продуктов аэробной пе реработки отходов свинокомплексов (активного ила и осадка сточных вод), об наруживается 130 – 240 мкг/г L-триптофана. В жидкофазных биосредствах ВНИИМЗ при перерасчете на сухое вещество содержится ~ 375 мкг/г трипто фана.
Консистенция жидкофазных биосредств и наличие необходимых расте ниям физиологически активных веществ позволяет рекомендовать их прежде всего для внекорневой подкормки, для опрыскивания зеленой массы на разных стадиях развития растений, для проращивания семян.
Кроме того, отмечено, что осадки, образующиеся после экстрагирования, отличаются высокой физиологической активностью и могут быть использованы в качестве подкормки под различные сельскохозяйственные культуры. В соста ве осадков обнаружена большая численность агрономически полезной микро флоры (аммонифицирующие микроорганизмы – 9,2х108…1х109 КОЕ/г;
амило литические – 4,7х108…5,0х108 КОЕ/г;
фосфатмобилизующие – 4,7х108…9,2х КОЕ/г;
выделяющие свободные аминокислоты – 8,4х107…1,9х108 КОЕ/г), а ис следование содержания основных элементов (N – 0,98…1,0 %;
Р2О5 – 1,17…2,01 %;
К2О – 1,83…2,33 %) свидетельствует об их определенной пита тельной ценности. Таким образом, процесс получения жидкофазных биологи чески активных средств является безотходным производством, так как сопро вождается одновременным получением другого биологически активного сред ства.
В модельных лабораторных экспериментах была выявлена реакция се мян, растений и почв на жидкофазные биологически активные средства. Пока зано, что для предпосевной обработки семян яровой пшеницы в случае исполь зования биосредства, приготовленного с добавлением 3 % золы, наиболее эф фективной является 0,5 %-ная концентрация, а в случае использования био средства, приготовленного с добавлением 5 % ОММП, – 0,3 %-ная концентра ция. Установленные концентрации жидкофазных биосредств могут служить руководством при их использовании на семенах других культур.
Показана ответная реакция почвенных микроорганизмов (использующих минеральный и органический азот, фосфатмобилизующих, выделяющих сво бодные аминокислоты и др.) на способы, концентрации и объемы применяемых жидкофазных биосредств, приготовленных с использованием ОММП (5 %) и золы (3 %). Наибольшая суммарная численность микроорганизмов, выраженная в процентах к максимуму, при поливе в рядки была выявлена при применении обоих видов биосредств при концентрации 0,3 %. При опрыскивании почвы лучшие условия для развития микрофлоры формировались при применении биосредства на основе ОММП в концентрации 0,45 %, а при применении био средства на основе золы – при 0,3 % и 0,45 %.
Дополнительно был проведен модельный эксперимент с яровой пшени цей, связанный с изучением влияния на микрофлору почвы жидкофазного био средства на основе золы, используемого в различных концентрациях. Было об наружено развитие практически всех физиологических групп исследуемых микроорганизмов. Наибольшего количества достигали фосфатмобилизующие микроорганизмы (5,8х106…1,3х107 КОЕ/г) и микроорганизмы, способные ис пользовать минеральные формы азота (1,0х107…2,2х107 КОЕ/г), численность которых была максимальной при концентрации биосредства 0,3 % и составляла величину вдвое большую, чем в контрольном варианте. Кроме того, при 0,3 % ной концентрации биосредства наблюдалось увеличение ~ в 3 раза (до 4,1х КОЕ/г) по сравнению с контролем численности микроорганизмов, потребляю щих глюкозу в качестве единственного источника углерода. Во всех вариантах почвы с применением жидкофазного биосредства по сравнению с контрольным вариантом снижалось содержание грибной флоры. Вероятнее всего это про изошло в результате изменения уровня кислотности у большинства вариантов с применением биосредства по сравнению с контролем (рН контроля =5,3, рН ва риантов с биосредством варьировал от 5,50 до 5,66).
Максимальная активность окислительно-восстановительной пары фер ментов каталазы и дегидрогеназы в данном модельном эксперименте наблюда лась также при концентрации жидкофазного биосредства 0,3 % – соответствен но 1,18 см3О2/г/мин и 3,32 ТФФ/г/сут.
Были проведены модельные эксперименты по изучению действия раз личных объемов тестируемых жидкофазных биосредств на развитие микрофло ры и биометрические показатели растений. В одном из экспериментов было ус тановлено эффективное влияние жидкофазного биосредства, приготовленного с использованием ОММП, на развитие различных физиологических групп мик рофлоры почвы под редисом: аммонифицирующих, фосфатмобилизующих, по требляющих различные моносахара (в качестве единственного источника угле рода) и выделяющих свободные аминокислоты. Оптимум их развития преиму щественно наблюдался при использовании жидкофазного биосредства в объеме 0,4 л/м2. Кроме того, установлено, что этот же объем оказался оптимальным и для развития самого редиса.
Влияние различных объемов и концентраций жидкофазного биосредства на основе золы было изучено в модельном эксперименте с яровой пшеницей.
Анализ полученных биометрических показателей яровой пшеницы, показал, что 0,3 %-ная концентрация жидкофазного биологически активного средства наиболее эффективна в объеме 0,4 л/м2, а 0,5 %-ная концентрация – в объеме 0,2 л/м2.
Резюмируя результаты, полученные в серии модельных экспериментов по изучению доз и концентраций жидкофазных биосредств, следует отметить различную потребность растений в биологически активных веществах. В част ности, под редис рекомендуется вносить 0,4 л/м2 0,3 %-ного биосредства, а под яровую пшеницу – 0,4 л/м2 0,3 %-ного или 0,2 л/м2 0,5 %-ного биосредства, то есть при увеличении концентрации жидкофазного биосредства его дозу следует уменьшать.
Влияние жидкофазных биосредств на состояние почвенного раствора бы ло оценено в модельном эксперименте, длившемся 3 месяца. Использовались дерново-подзолистые почвы с содержанием гумуса 1,41 и 2,57 %. Обработка почв разной степени гумусированности жидкофазными биосредствами показа ла, что за период проведения эксперимента гумусное состояние почв практиче ски не изменилось (отсутствовала деструкция). Вместе с тем под действием жидкофазных биосредств обнаружен переход основных питательных элементов (N, Р, К) в подвижное состояние (Р2О5, К2О, NО-3, NН+4). По сути, благодаря вы раженному биомелиорирующему эффекту жидкофазных биосредств, произош ла оптимальная подготовка почв к их сельскохозяйственному использованию.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработанный ферментационно-экстракционный способ позволяет полу чать многофункциональные жидкофазные биологически активные средства для нужд сельского хозяйства. Основываясь на данных модельных экспериментов по изучению влияния жидкофазных биосредств на почву и растения, следует вывод об их высоком биомелиорирующем эффекте и благоприятном прогнозе использования в земледелии и растениеводстве.
Семеноводство Растениеводство (предпосевная (подкормка) обработка семян) ЖИДКОФАЗНОЕ БИОСРЕДСТВО Земледелие (активизация Компостирование трансформации субстратов высокомолекулярных соединений) Рис. 6 Прогноз применения жидкофазных биосредств Общая совокупность свойств и особенно высокий уровень микробной об семененности жидкофазных биосредств, получаемых на основе возобновляе мых сырьевых ресурсов, позволяет предположить их эффективное воздействие на трансформацию веществ в любом субстрате. В связи с этим, область приме нения жидкофазных биологически активных средств может быть значительно расширена.
ВЫВОДЫ 1. Процесс аэробно-анаэробной ферментации торфонавозной смеси обес печивается развитием первичных деструкторов – грибов и актиномицетов, свя занных высокой корреляционной связью (R = 0,86), аммонифицирующих мик роорганизмов и микроорганизмов, способных к потреблению минеральных форм азота, микроорганизмов, выделяющих свободные аминокислоты.
2. Благодаря жизнедеятельности микрофлоры в конечных продуктах про цесса ферментации происходит накопление физиологически активных веществ.
Наилучшим накоплением характеризовались продукты, получаемые при ис пользовании оптимальных концентраций двух видов стимуляторов процесса ферментации: 5 % ОММП и 3 % золы. Продукты ферментации, полученные с использованием 5 % ОММП, характеризовались высоким содержанием общих сахаров – 89,74 мг/г а.с.в.;
витаминов группы В, в частности В2 – 0,3290 мг/ г;
триптофана – 0,403 мг/г а.с.в;
жиров – 1,53 %. По аналогичным показателям тестировались продукты ферментации, полученные с использованием 3 % золы:
общие сахара – 69,67 мг/г а.с.в.;
витамин В2 – 0,2320 мг/100 г;
триптофан – 0,790 мг/г а.с.в;
жир – 1,84 %.
3. При использовании микробиологического теста (оценка содержания микроорганизмов-доминантов – аммонифицирующих и амилолитических) вы явлены оптимальные параметры проведения ферментационно-экстракционного процесса получения жидкофазных биологически активных средств:
– этап ферментации – 48 ч (37 0С) + 24 ч (55 0С) + 48 ч (37 0С);
– этап экстрагирования – стационарная экстракция 1 %-ным раствором К2НРО4 продолжительностью 48 ч при температуре 22 0С.
4. Выявлены благоприятные факторы, отличающие жидкофазные био средства от известных аналогов: высокая численность агрономически полезной микрофлоры (3х108…2х1010 КОЕ/мл), высокое содержание подвижных форм фосфора (10 – 15 г/л) и калия (9 – 12,5 г/л), благоприятный уровень кислотно сти (рН 7,5 – 8,0).
5. Установлено, что 0,3 %-ная концентрация жидкофазных биосредств достаточна и оптимальна для активизации почвенной микрофлоры: фосфатмо билизующих микроорганизмов (1,3х107 КОЕ/г), микроорганизмов, использую щих минеральные (2,2х107 КОЕ/г) и органические (4х106 КОЕ/г) формы азота, выделяющих свободные аминокислоты (4,6х106 КОЕ/г), потребляющих глюко зу в качестве единственного источника углерода (4,1х106 КОЕ/г).
6. В модельных экспериментах по компостированию почв с жидкофаз ными биологически активными средствами на фоне отсутствия видимой дест рукции гумуса обнаружен переход основных питательных элементов (N, Р, К) в подвижное состояние, что обеспечивает их доступность растениям.
7. Показана перспективность применения получаемых жидкофазных био логически активных средств: в семеноводстве – для проращивания семян;
в растениеводстве – для подкормки растений;
в земледелии – в качестве земле удобрительных препаратов;
а также при решении вопросов, связанных с оптими зацией компостирования органических субстратов.
РЕКОМЕНДАЦИИ Для предпосевной обработки семян яровой пшеницы рекомендуется ис пользовать 0,5 %-ную концентрацию жидкофазного биосредства на основе зо лы и 0,3 %-ную концентрацию жидкофазного биосредства на основе отходов мукомольного производства.
Для активизации почвенных процессов под редисом, а также улучшения биометрических показателей самого редиса на 1 м2 почвенной поверхности ре комендуется вносить 0,4 л 0,3 %-ного жидкофазного биосредства (в результате перерасчета с данных модельных экспериментов). Аналогичную дозу 0,3 % ного биосредства рекомендуется вносить и под яровую пшеницу, однако, при увеличении концентрации биосредства до 0,5 % оптимальную дозу необходимо снизить до 0,2 л/м2.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Процессы биоконверсии: микробиологический анализ и поиск путей интенсификации / Молчанов В.П., Тактаров Э.А., Сульман Э.М., Фомичева Н.В., Ковалев Н.Г., Рабинович Г.Ю. // Всероссийская заочная конференция «Перспективы развития Волжского региона», выпуск 3, Тверь: ТГТУ, 2001. – С.
89-91.
2. Перспективы использования биологически активных продуктов, полу чаемых в процессе углубленной переработки торфонавозных смесей / Рабино вич Г.Ю., Ковалев Н.Г., Рабинович Р.М., Фомичева Н.В. // Международная на учно-практическая конференция «Высокие технологии добычи, глубокой пере работки и использования озерно-болотных отложений». Томск, 2003. – С. 160 161.
3. Процессы и качество продуктов твердофазной ферментации: Методи ческое пособие / Рабинович Г.Ю., Ковалев Н.Г., Фомичева Н.В., Рабинович Р.М.
– Москва-Тверь, 2003. – 54 с.
4. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В., Ковалев Н.Г. Технология получения биологически активного средства на основе продуктов ферментации органиче ского сырья: Технологические решения и рекомендации. – Тверь: ЧуДо, 2005. – 14 с.
5. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В. Биопрепараты на основе продуктов ферментации и их апробация в семеноводстве // Международная научно практическая конференция «Научно-производственное обеспечение развития сельского социума». – М.: Изд-во "Современные тетради", 2005. – С. 367-371.
6. Фомичева Н.В. Разработка технологической линии производства био мелиорантов (биоактивного средства) для растениеводства в гумидной зоне РФ // 2-ая Всероссийская конференция молодых ученых "Новые технологии и эко логическая безопасность в мелиорации". Коломна, 2005. -С. 130-135.
7. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В. Тестирование продуктов ферментации органического сырья на содержание физиологически активных веществ // Все российская научная конференция "Почвоведение и агрохимия ХХI века". С. Петербург, 2006. – С. 178-179.
8. Фомичева Н.В. Влияние биологически активного средства на улучше ние жизнедеятельности почвенной микрофлоры мелиорированных земель // 3-я Всероссийская конференция молодых ученых «Новые технологии и экологиче ская безопасность в мелиорации». Коломна, 2006. – С. 225-229.
9. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В. Ферментационно-экстракционный способ получения биологически активных средств // Международная научно практическая конференция «Научно-производственное обеспечение развития комплексных мелиораций Прикаспия». – М.: Изд-во "Современные тетради", 2006. – С. 392-395.
10. Рабинович Г.Ю., Ковалев Н.Г., Фомичева Н.В. Экспериментальные данные для разработки способов использования биологически активных средств. – Тверь, 2006. – 20 с.
11. Фомичева Н.В., Смирнова Ю.Д. Создание новых жидкофазных био средств и тестирование их состава методом ИК спектроскопии // ХIV Регио нальные Каргинские чтения, областная научно-техническая конференция моло дых ученых “Физика, химия и новые технологии”. Тверь, 2007 – С. 66.
12. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В., Барановский И.Н. Разработка новых видов жидкофазных биологически активных средств // Международная научно практическая конференция «Стабилизация производства и развитие агропро мышленного комплекса региона на основе внедрения инновационных техноло гий». – Тверь, 2007. – С. 108-111.
13. Рабинович Г.Ю., Ковалев Н.Г., Фомичева Н.В. Новый вид биологиче ски активных средств: получение, состав, перспективы использования // Вест ник Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2007. – № 3. – С. 71-72.
14. Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В. Развитие углеродтрансформирующих микроорганизмов в процессах экспрессной ферментации при использовании пищевых отходов // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.
– 2007. – № 3. – С. 25-27.
15. Фомичева Н.В., Рабинович Г.Ю. Перспектива использования жидко фазных биологически активных средств в системе комплексных мелиораций // 4-я Всероссийская конференция молодых ученых «Новые технологии и эколо гическая безопасность в мелиорации». Коломна, 2007. – С. 320-324.
16. Патент № 2264460 РФ. Способ получения биологически активного средства для роста и развития растений / Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В., Ко валев Н.Г., Рабинович Р.М., Сульман Э.М. (31.12.2003).
17. Патент на полезную модель № 50530 РФ. Поточная линия для полу чения биологически активного средства в концентрированном виде / Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В., Ковалев Н.Г. (01.08.2005).
18. Патент на полезную модель № 57276 РФ. Поточная линия для полу чения концентрированного биологически активного средства, обогащенного микроэлементами / Рабинович Г.Ю., Фомичева Н.В., Ковалев Н.Г. (25.04.2006).
Подписано в печать 3.10.2007 г.
Гарнитура Times New Roman Тираж 100 экземпляров Заказ № 29;
1,3 усл.печ.л.
Изготовлено «ЧуДо», г.Тверь