Особенности свободнорадикального окисления при травме опорно-двигательного аппарата в условиях экспериментальной гипергомоцистеинемии
На правах рукописи
Кураян Кристина Макаровна
ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
ПРИ ТРАВМЕ ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА В
УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону
2013
Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону)
Научный руководитель: доктор биологических наук Корниенко Игорь Валериевич
Официальные оппоненты: Колмакова Татьяна Сергеевна, доктор биологических наук, доцент, зав. кафедрой медицинской биологии и генетики ВПО ГБОУ «РостГМУ» МЗ РФ (г. Ростов-на Дону) Келина Нина Юрьевна, доктор биологических наук, профессор, зав.
кафедрой биологии, биохимии и экологии ПензГТУ (г. Пенза)
Ведущая организация: Ставропольский государственный медицинский университет (г. Ставрополь)
Защита диссертации состоится «20» ноября 2013 г. в «1300» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (344090, г. Ростов-на Дону, пр. Стачки 194/1, актовый зал).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул.
Пушкинская, 148.
Автореферат разослан «_» 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совет, канд. биол. наук, с.н.с. Е.В. Асланян
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. В современной флебологической практике проблема венозных тромбозов и тромбоэмболизма занимает лидирующее положение в развитых странах. Актуальность данной патологии обусловлена ее высокой частотой и тяжелыми последствиями, приводящими либо к смерти, либо к инвалидизации населения (Варданян А.В. и др., 2006;
Фалеева Т.Г., 2012).
Тромбоз глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) являются важнейшим звеном в структуре послеоперационных осложнений и смертности в лечебных учреждениях хирургического профиля, в частности, у пациентов с травмой опорно двигательного аппарата при оперативных методах лечения (Task force report.
Guidelines on diagnosis and management of acute pulmonary embolisms, 2000;
Котельников М.В., 2002;
Румянцева А.Г., 2006). Нарушения целостности крупных костей, влекущие за собой длительную иммобилизацию, являются основным фактором повышенной опасности возникновения венозных тромбозов. Диагностика, профилактика и лечение этих опасных осложнений представляются актуальными проблемами современной медицины (Флебология. Руководство для врачей, 2001).
Актуальность проблемы во многом определяется тем, что в последние годы отмечается значительное увеличение частоты послеоперационных и посттравматических тромбоэмболий, чаще возникающих после сложных и обширных хирургических вмешательств (Arcasoy S.M., Kreit J.W., 1999).
Травма и оперативное вмешательство приводят к сдвигу системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции, что увеличивает вероятность тромбоэмболических осложнений (Wilson D. et al., 2001). Одним из независимых факторов тромбофилии принято считать повышенное содержание гомоцистеина (ГЦ) в плазме крови. Длительно выраженная гипергомоцистеинемия (ГГЦ) запускает механизм дисфункции эндотелия за счет активации окислительного стресса (Kolling J., Scherer E., da Cunha A., 2011). В литературе имеются сведения, что окислительный стресс ассоциируется с повышенным уровнем ГЦ в плазме крови (Tousoulis D., Bouras G., Antoniades C., 2010). Так, в экспериментах на животных было установлено, что ГГЦ приводит к увеличению интенсивности перекисного окисления липидов в печени (Sauls D.L., Arnold E.K., Bell C.W., 2007).
ГГЦ может быть обусловлена многими причинами, среди которых выделяют генетические, метаболические, алиментарные и прочие факторы. К самым часто встречающимся наследственным причинам относят мутации генов, кодирующих цистатионин--синтетазу, 5 метилентетрагидрофолатредуктазу. К алиментарным причинам относят дефицит фолиевой кислоты, витаминов группы В, поступающих с пищей. В литературе приводятся сведения о том, что при обследовании добровольцев, находившихся в условиях «вегетарианской» и «всеядной» диет, не было выявлено увеличения концентрации ГЦ, однако общая антиоксидантная активность была снижена у «вегетарианцев» (Chechowska M., Ambroszkiewicz J., Klemarczyk W., 2010).
В то же время, особенности морфологии органов и тканей, в частности, при травматическом воздействии или при развитии травматической болезни, не освещены в полном объеме. Знание этих особенностей позволит клиницистам предвидеть возможные тромбоокклюзивные осложнения, а морфологам – констатировать причину этих осложнений.
В научной литературе имеются противоречивые данные в отношении ассоциации между уровнем ГЦ и активностью ферментов антиоксидантной защиты. Не сформировано четкое представление о состоянии системы перекисного окисления липидов в условиях ГГЦ и при травме опорно двигательного аппарата, что определяет актуальность данного исследования.
Цель настоящей работы состояла в изучении особенностей свободнорадикального окисления у лабораторных животных при травме опорно-двигательного аппарата и в условиях ГГЦ.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:
1. Разработать экспериментальную модель травмы опорно двигательного аппарата в условиях ГГЦ.
2. Изучить особенности свободнорадикальных процессов методом люминол-Н2О2-хемилюминесценции (ХЛ), интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также уровень антиоксидантной защиты (АОЗ) в крови крыс при травме опорно двигательного аппарата, в условии ГГЦ и при ее сочетании с травмой.
3. Оценить состояние стабильности мембран по суммарной пероксидазной активности (СПА) и содержанию внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови крыс при травме опорно-двигательного аппарата, в условии ГГЦ и в сочетании травмы и ГГЦ.
4. Исследовать зависимость изменений биохимических показателей от давности причинения механической травмы.
5. Оценить состояние сосудистой системы в зоне механического воздействия в условии ГГЦ и при нормальных показателях уровня ГЦ в плазме.
Научная новизна работы. В работе впервые разработана экспериментальная модель механической травмы опорно-двигательного аппарата, основанная на формировании закрытых переломов сегментов задней конечности и модель гипергомоцистеинемии лабораторных животных (Rattus norvegicus).
Впервые установлено, что ГГЦ приводит к возрастанию трипептида – восстановленного глутатиона (GSH) и снижению концентрации первичных и конечных продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных.
Проведено исследование активности ферментных систем утилизации активных кислородных метаболитов в крови экспериментальных животных при травме опорно-двигательного аппарата в условиях ГГЦ. Впервые полученные данные свидетельствуют об интенсификации свободнорадикальных процессов в крови животных через 24 часа после механической травмы с последующей нормализацией показателей через две недели после формирования перелома задней конечности.
В работе впервые проведена комплексная биохимическая оценка про- и антиоксидантных факторов крови при травме опорно-двигательного аппарата. Установлено, что первые сутки после травмы характеризуются увеличением активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в крови экспериментальных животных, снижением стабильности мембран с последующей нормализацией показателей через две недели. При этом впервые показано, что формирование перелома на фоне гипергомоцистеинемии приводит к резкому снижению активности СОД в крови экспериментальных животных.
На экспериментальной модели установлены морфологические маркеры ГГЦ в виде изменения толщины эндотелия и диаметра сосудов (артерий, вен и капилляров) в зоне травмированной конечности.
По результатам проведенных исследований на защиту выносятся следующие основные положения.
1. Первые сутки после механической травмы характеризуются резким повышением диеновых коньюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО) в крови экспериментальных животных, активизацией антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза), а также глутатионредуктазы (ГР) с последующей нормализацией показателей спустя две недели после травмы.
Таким образом, содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ (ДК и ШО) является критерием давности травмы.
2. Сочетание ГГЦ и травмы опорно-двигательного аппарата как через сутки, так и через две недели после механической травмы приводит к снижению показателей продуктов ПОЛ (ДК и ШО) в крови, по сравнению с аналогичными группами животных без гипергомоцистеинемии.
3. В условиях ГГЦ в плазме экспериментальных животных наряду с увеличением концентрации гомоцистеина происходит увеличение содержания восстановленного глутатиона.
4. Один из механизмов токсичного действия избытка гомоцистеина на эндотелий сосудов связан с повреждением клеточных мембран.
5. ГГЦ в сочетании с травмой опорно-двигательного аппарата характеризуется повышением толщины эндотелия в венах за счет увеличения стенки сосуда.
Теоретическая и практическая значимость работы. С целью унификации воздействия травмирующего агента впервые было разработано уникальное механическое устройство для формирования переломов сегментов задней конечности крысы. Данный аппарат может быть использован для испытания различных фармпрепаратов в условиях экспериментальной травмы.
В основе разработанной экспериментальной модели лежит шестинедельная метиониновая диета, в результате которой у крыс развивалась гипергомоцистеинемия (показатели гомоцистеина в плазме крови повышались в 1,5 раза).
Установлены критерии прогнозирования давности травмы содержанию первичных и конечных продуктов ПОЛ (ДК и ШО) в крови.
Установлено, что в условиях ГГЦ происходит увеличение уровня GSH.
Учитывая, что содержание GSH в крови отражает уровень ГЦ, определение концентрации GSH может служить в качестве косвенного биохимического теста для оценки состояния ГГЦ.
Результаты исследований внедрены в практику работы судебно биохимического, судебно-гистологического отделений Государственного бюджетного учреждения Ростовской области "Бюро судебно-медицинской экспертизы". Данные результаты также используются при чтении курсов:
«Судебная медицина» (кафедра судебной медицины с курсом правоведения, Ростовский государственный медицинский университет), «Свободные радикалы в биологических системах» и «Основы патобиохимии» (кафедра биохимии и микробиологии факультета биологических наук, Южный федеральный университет).
Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации были представлены на 64-ой итоговой научной конференции молодых ученых РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2010 г.);
на IX, XI межвузовских конференциях с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении»
(Ростов-на-Дону, 2010, 2012 гг.);
на Всероссийской молодежной научной школе «Эффективная работа над диссертацией» (Ростов-на-Дону, 2012 г.);
на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии» (Ростов-на-Дону, 2012 г.);
на II Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых (Екатеринбург, 2012 г.);
на научно-практической конференции на базе Южного федерального университета «Миссия молодежи в науке» (Ростов на-Дону, 2012 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК – 5 статей. Личный вклад – 81%, общий объем – 1,44 п.л.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 23 таблицы, иллюстрирована 40 рисунками. Список литературы включает 268 литературных источников, в том числе 164 на иностранных языках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили 106 беспородных половозрелых белых крыс (самцы) Rattus norvegicus массой 250 – 300 г.
В ходе исследования были использованы две экспериментальные модели:
1) модель травмы опорно-двигательного аппарата. С целью унификации воздействия травмирующего агента было разработано механическое устройство для формирования переломов сегментов задней конечности;
2) метиониновая модель, которая заключалась во внутрижелудочковом введении водного раствора метионина (Met) в концентрации 24,6 г/кг в течение разного промежутка времени, что способствовало увеличению аминокислоты ГЦ в плазме крови (Sanjana D., et al., 2008).
Животные были рандомизированы в одну из восьми групп (Табл.).
Таблица Распределение животных по экспериментальным группам Группы животных I II III IV V VI VII VIII Контроль 1 сутки 2 недели Met Met Met Met Met после после 24,6 г/кг 24,6 г/кг 4 недели 4 недели 2 недели (n=16) травмы травмы 4 недели 6 недель травма травма травма (n=8) (n=17) (n=16) (n=8) Met Met Met 1 сутки 2 недели 2 недели (n=8) (n=16) (n=17) I группа – контрольная (интактные животные), с которой сравнивали все экспериментальные группы;
II группа – формировался закрытый перелом костей голени и через сутки выводили из эксперимента;
III группа – формировался закрытый перелом костей голени и выводили из эксперимента через две недели;
IV группа – в течение 4-х недель вводили метионин (24, г/кг);
V группа – в течение 6-ти недель вводили метионин (24,6 г/кг);
VI группа – в течение 4-х недель вводили метионин, после чего формировали закрытый перелом костей голени и через сутки после сформированного перелома выводили из эксперимента;
VII группа – в течение месяца вводили метионин, затем формировали закрытый перелом костей голени, продолжая внутрижелудочно вводить метионин, и выводили из эксперимента через две недели после сформированного перелома;
VIII группа – в течение двух недели вводили внутрижелудочно метионин, затем формировали перелом костей голени, продолжая вводить метионин, и через две недели после сформированного перелома выводили из эксперимента После окончания эксперимента забор крови у крыс производился путем декапитации, которую осуществляли в соответствии с биоэтической концепцией (Копаладзе Р.А., 2003;
Морданова Г.В., 2004;
Montague P., 2003).
Материалом для биохимических исследований служили плазма крови и эритроциты (гемолизат). Для гистологического исследования в опытных группах изымались мягкие ткани животных из зоны сформированного перелома;
у животных контрольной группы исследовали интактную конечность.
Микроскопию изготовленных препаратов осуществляли с использованием микроскопа Motic BA300 (Hong Kong) с тринокулярной насадкой с использованием окуляр-микрометра МОВ-1-16.
При микроскопии полученных срезов оценивались следующие показатели: 1) диаметр капилляра (мкм);
2) толщина стенки капилляра (мкм);
3) толщина эндотелиальной выстилки капилляра (мкм);
4) диаметр вены малого калибра (мкм);
5) толщина стенки вены (мкм);
6) толщина эндотелиальной выстилки вены (мкм);
7) диаметр артерии малого калибра (мкм);
8) толщина стенки артерии (мкм);
9) толщина эндотелиального слоя артерии (мкм);
10) визуальное наличие или отсутствие тромбов в исследуемом материале (+/-).
Морфометрическое исследование вышеперечисленных показателей осуществлялось как на травмированной конечности у животных опытных групп (III, V и VIII), так и на интактной конечности контрольной группы (I).
Н2О2-инициированную люминол-зависимую ХЛ плазмы крови регистрировали при помощи хемилюминесцентного анализатора ХЛ-003, г.
Уфа (Россия) (Шестаков В.А. и др., 1979). Получение хлороформных липидных экстрактов проводили по методу Блая и Дайера (Вligh E., Dyer W.J., 1959). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению света при длине волны 233 нм (Стальная И.Д., 1977). Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с 2-тио-барбитуровой кислотой (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Концентрацию шиффовых оснований (ШО) определяли в хлороформном экстракте флуориметрическим методом при длине волны возбуждения 360 нм и длине волны эмиссии 440 нм (Bidlack W.R., Tappel Активность супероксиддисмутазы (СОД) и A.L., 1973).
супероксидустраняющую активность плазмы крови (СУА) оценивали по ингибированию восстановления нитросинего тетразолия супероксидом (Сирота Т.В., 1999). Активность каталазы определяли по убыли субстрата перекиси водорода (H2O2), способного образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс (Королюк М.А. и др., 1988). Содержание GSH определяли по реакции с дитио-бис-нитробензойной кислотой (Ellman G.L., 1959). Об активности глутатионпероксидазы (ГПО) судили по реакции с гидроперекисью трет-бутила (Моин В.М., 1986), об активности глутатионредуктазы (ГР) судили по скорости окисления НАДФ•Н (Юсупова Л.Б., 1989). Определение концентрации гомоцистеина в плазме крови проводили с помощью коммерческого набора фирмы DyaSis (Германия).
Суммарную пероксидазную активность (СПА) оценивали по бензидиновому методу (Покровский А.А., 1969;
Лукаш А.И. и др., 1996). Концентрацию белка в плазме крови определяли методом Lowry в модификации Shacterle Pollack (Shacterle G.R., Pollack R.L., 1973). Содержание общих липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью стандартного коммерческого набора производства «La Chema» (Чехия). Концентрацию гемоглобина в гемолизате эритроцитов и внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) определяли с помощью стандартного коммерческого набора «La Chema» (Чехия).
Исследования проводились с использованием сертифицированного оборудования. Спектрофотометрические исследования проводились на DU 800 Beckman Coulter (США), спектрофлуориметрические исследования – на RF-5301 C «Shimadzu» (Япония).
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Office 2007 (MS Excel 2007) и STATISTICA 6.0. Для каждой серии опытов при помощи опции «Summary:Descriptive statistics» STATISTICA 6.0 рассчитывали среднюю арифметическую Mean (M), стандартную ошибку средней SEM (±m). Анализ выпадающих значений в ранжированных рядах проводили с использованием критерия Шовене при помощи MS Excel 2007. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали параметрический критерий Стьюдента. Оценку соответствия типа распределения выборки нормальному проводили с использованием метода трех сигм. Разницу средних величин считали достоверной при р 0,05 и стремящейся к достоверности (тенденция) при 0,05 р 0,1.
Все изменения показателей (в %) рассчитывались относительно контрольной группы.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ биохимических показателей крови у групп животных с травмой опорно-двигательного аппарата (II и III группы).
Для оценки активности свободнорадикальных процессов использовался метод регистрации люминол-зависимой хемилюминисценции плазмы крови крыс.
Спустя сутки после травмы (II группа) отмечено незначительное (на 4%) снижение tg. Спустя две недели после травмы (III группа) показатели ХЛ были на уровне контрольных величин за исключением незначительного повышения амплитуды быстрой вспышки (на 11%), высоты медленной вспышки (на 9%) и tg (на 8%). Несомненно, травматическое воздействие формирует воспалительную реакцию.
Умеренная активизация свободнорадикального окисления (СРО) у животных спустя две недели после травмы подтверждается повышенным уровнем гидроперекисей липидов.
Следует отметить, что о глубине протекания окислительного стресса при травме опорно-двигательного аппарата можно судить по накоплению продуктов ПОЛ (ДК и ШО) и по состоянию антиоксидантной системы.
Через сутки после травмы наблюдалось накопление первичных и конечных продуктов ПОЛ в гемолизате (уровень ДК в крови увеличивался в 2 раза, ШО – в 3,5 раза) и снижение концентрации промежуточного продукта ПОЛ (МДА) – на 26% (Рис. 1). Это может быть связано с высокой скоростью взаимодействия МДА с сульфгидрильными и аминогруппами белков и образованием шиффовых оснований, о чем свидетельствует высокий уровень ШО.
Аналогичная динамика показателей СРО отмечалась в плазме крови экспериментальных животных. Во II группе животных содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ интенсивно возрастало в плазме крови (уровень ДК – в 5 раз, ШО – в 7,4 раза) относительно контроля. В III группе уровень ДК в плазме крови был снижен на 38%, а ШО – на 26%, что может свидетельствовать о нормализации процессов ПОЛ (Рис. 1).
Спустя сутки после травмы антиоксидантная система крови находилась в активизированном состоянии (Рис. 2). Было отмечено повышение активности сопряженных ферментов как в гемолизате (СОД – на 54% и каталаза – на 48%), так и в плазме крови (СУА в 2 раза и скорость утилизации Н2О2 на 70%) относительно контроля. Наряду с этим антиокислительная система глутатионовых ферментов эритроцитов спустя сутки после травмы была разбалансирована. Так уровень GSH не отличался от контрольных величин, тогда как активность ГР возрастала в 3,4 раза (Рис.
2).
Важным событием для клетки является нарушение структуры мембраны. Спустя сутки после травмы в плазме крови наблюдалось увеличение показателей СПА на 54 % и ВЭГ – на 43 % относительно контрольных значений, что может отражать снижение стабильности (целостности) мембран. Через две недели после травмы было отмечено статистически значимое снижение уровня СПА на 26 %, что возможно связано с повышением уровня низкомолекулярных метаболитов (цистеин), снижающих пероксидазную активность крови (Лукаш А.И. и др., 1996) (Рис.
2).
Рис. 1. Динамика показателей продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных при травме опорно-двигательного аппарата.
Обозначения: **- достоверные отличия относительно контроля (р 0,05);
* тенденция к достоверным отличиям относительно контроля (0,05 р 0,1).
Рис. 2. Динамика показателей антиоксидантной системы и прооксидантных факторов в крови экспериментальных животных при травме опорно-двигательного аппарата. Обозначения как на Рис. 1.
2. Анализ биохимических показателей крови у групп животных с ГГЦ (IV и V группы).
Исследования, проведенные за последние годы, показывают, что гомоцистеин является независимым фактором риска развития тромбоокклюзивных заболеваний. Для изучения влияния ГГЦ на клеточном и тканевом уровнях в работе использовалась экспериментальная модель, провоцирующая ГГЦ за счет специальной диеты, способствуюшей увеличению метаболизма ГЦ путем введения аминокислоты Met.
Введение аминокислоты Met в течение 4 недель (IV группа) приводило к снижению уровня первичных продуктов ПОЛ (ДК) как в гемолизате (на 56%), так и в плазме крови (на 42%) относительно контроля (Рис. 3).
Концентрация промежуточных продуктов (МДА) в данной группе животных достоверно возрастала в гемолизате на 57%, в плазме крови – на 71%. У животных, получавших метионин в течение 6-ти недель (V группа), содержание МДА в гемолизате достоверно снизилось на 30%, тогда как в плазме была выявлена тенденция к увеличению данного показателя на 39% (Рис. 3).
У животных IV группы наблюдалось статистически значимое снижение содержания ШО в гемолизате на 74%. В гемолизате животных V группы данный показатель снизился на 72%, а в плазме, напротив, была выявлена тенденция к его увеличению на 19% относительно контроля (Рис. 3).
Метиониновая диета привела к разнонаправленным изменениям в антиоксидантной системе эритроцитов и плазмы крови. Так у животных V группы относительно контрольных значений активность СОД в гемолизате снизилась на 58%, а в плазме крови СУА интенсивно возросла в 3,4 раза (Рис.
4).
У животных, находившихся в условии метиониновой диеты в течение 4-х недель, активность каталазы в гемолизате была увеличена (прирост составил 15%), а 6-ти недельная диета не привела к значительным изменениям данного показателя.
Гипергомоцистеинемия, развившаяся вследствие метиониновой диеты, приводила к увеличению содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах (после 4-х недель диеты – почти в 2 раза, после 6-ти недель – на 42%) и, соответственно, к изменению интенсивности процессов свободнорадикального окисления (Рис. 4). Данные изменения носили ожидаемый характер, так как механизм образования глутатиона тесно связан с фолатным циклом через образование аминокислоты цистеина (Рис. 10).
У животных, находившихся в условиях метиониновой диеты в течение 6-ти недель, активность ГПО в гемолизате достоверно превышала контрольные значения на 19%, а активность ГР была увеличена в 2,4 раза.
Возрастающая активность ГР может свидетельствовать о высокой степени затрат восстановленного глутатиона, который также может расходоваться на поддержание активности ГПО (Рис. 4).
Рис. 3. Изменения показателей продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных в условии гипергомоцистеинемии.
Обозначения как на Рис. 1.
Рис. 4. Изменения антиоксидантной системы, прооксидантных факторов и уровеня гомоцистеина в крови экспериментальных животных в условии гипергомоцистеинемии. Обозначения как на Рис. 1.
У животных, находившихся в условиях метиониновой диеты в течение 4-х недель, наблюдалось статистически значимое снижение уровня СПА на 31%. Содержание показателей СПА и ВЭГ в плазме крови животных, получавших метионин в течение 6-ти недель, интенсивно возрастало: СПА возросла в 2 раза, уровень ВЭГ – в 1,8. Содержание ГЦ в плазме крови крыс, находившихся в условиях метиониновой диеты в течение 6-ти недель превысило контрольные значения на 47% (Рис. 4).
3. Анализ биохимических показателей крови у групп животных с травмой опорно-двигательного аппарата в условии ГГЦ (VI, VII и VIII группы).
Результатом действия избыточной концентрации метионина при травме опорно-двигательного аппарата явилось достоверное снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме крови экспериментальных групп, о чем свидетельствовало снижение величины спонтанной светимости. Интенсивность спонтанной светимости плазмы крови резко снижалась по отношению к контрольным значениям: у группы животных, получавших метионин в течение 4-х недель до травмирования и одного дня после (VI группа) – на 92%, у животных, находившихся в условии метиониновой диеты в течение 4-х недель до травмы и 2-х недель после(VII группа) – на 90%, а также у животных, получавших метионин в течение 2-х недель до травмы и 2-х недель после (VIII группа) – на 88%. Данное снижение может быть обусловлено протекторным действие метионина, который является специфической ловушкой активных форм кислорода (АФК) (Козлов Ю.Н., Воробьева Т.П., Пурмаль А.П., 1981;
Aruoma, O.I., Halliwell, B., 1987).
Содержание ДК у животных VI группы интенсивно снижалось как в гемолизате (на 81%), так и в плазме (на 60%) по сравнению с контролем (Рис.
5). В гемолизате животных VII группы также наблюдалось снижение данного показателя на 58%, а у животных VIII группы в плазме крови данный показатель снижался на 32%.
Концентрация МДА в гемолизате достоверно отличалась от контроля только у VII группы животных, в которой наблюдался ее рост на 40% (Рис.
5).
Содержание ШО у животных, получавших метионин в течение четырех недель до травмирования и одного дня после, интенсивно снижалось в гемолизате (на 85%) относительно контрольных значений. У животных, получавших Met в течение 4-х недель до травмирования и 2-х недель после, содержание данного показателя в гемолизате также интенсивно снижалось (на 68%), а в плазме крови содержание возрастало двукратно. Содержание ШО у животных, получивших метионин в течение 2-х недель до травмы и 2-х недель после, статистически значимо снижалось как в гемолизате – на 57%, так и в плазме – на 32% по отношению к контролю (Рис. 5).
В зависимости от длительности приема Met после травмы, полученной на фоне ГГЦ, в гемолизате наблюдались разнонаправленные изменения в активности СОД. Так активность СОД в гемолизате VI группы животных была ниже контрольных значений на 54%, а у животных VII группы данный показатель возрастал на 56% относительно контрольной группы (Рис. 6).
Рис. 5. Изменения показателей продуктов ПОЛ в крови экспериментальных животных при травме опорно-двигательного аппарата в условии ГГЦ. Обозначения как на Рис. 1.
Рис. 6. Изменения антиоксидантной системы, прооксидантных факторов и уровня гомоцистеина в крови экспериментальных животных при травме опорно-двигательного аппарата в условии ГГЦ. Обозначения как на Рис. 1.
У животных, находившихся в условии метиониновой диеты в течение 4-х недель до травмы и 2-х недель после травмы (VII группа), относительно контрольных значений наблюдался прирост GSH (на 54%), а у животных, получивших метионин в течение 2-х недель до травмы и 2-х недель после, показатель имел лишь тенденцию к возрастанию (на 33%) (Рис. 6).
Активность фермента ГПО в гемолизате животных, получавших метионин в течение 2-х недель до травмы и 2-х недель после, превышала контрольные значения на 51%, а активность другого глататион-зависимого фермента – ГР – этой же группы увеличилась в 2,5 раза (Рис. 6).
В VI группе животных была выявлена тенденция к увеличению уровня СПА в плазме крови на 28%, тогда как уровень ВЭГ статистически значимо снижался на 75%. Уровень СПА достоверно снижался на 42% у животных VII группы, а у животных VIII группы уровень ВЭГ в плазме крови был ниже контрольных значений на 34% (Рис. 6).
У животных, получавших метионин в течение 4-х недель до травмирования и 2-х недель после травмы, уровень ГЦ в плазме крови возрастал в 2,8 раз по отношению к контрольным величинам. Изменение содержания данного показателя у животных, получивших метионин в течение 2-х недель до травмирования и 2-х недель после, были менее выражены по отношению к контрольным животным (прирост 16%, Рис. 6).
Активность каталазы, СУА и скорость утилизации Н2О2 у животных с травмой на фоне предварительной ГГЦ не отличались от контроля, независимо от длительности повторного приема Met.
4. Морфологические исследования (III, V и VIII группы).
Механизмы тромбообразования при воздействии независимого фактора (ГЦ) до конца не изучены. Тем не менее, установленный в ходе эксперимента оксидативный стресс позволяет предположить наличие определенного морфологического субстрата (маркера) в крови. Поэтому в работе была дана оценка морфологическим изменениям сосудистого русла.
Толщина эндотелия сосудов животных, находившихся в условиях 6-ти недельной метиониновой диеты (V группа), по сравнению с интактной конечностью контрольной группы, была увеличена в венах на 47%. У животных, получавших метионин в течение 2-х недель до травмирования и 2-х недель после травмы (VIII группа), толщина эндотелия вен была увеличена на 71%, а толщина эндотелия артерий возрастала в 2 раза по сравнению с нормой (Рис. 7). Спустя 2 недели после травмы диаметр вен был увеличен на 17%.
Диаметр капилляров у животных V группы превышал контрольные величины на 46%, тогда как диаметр артерий был уменьшен на 15%. Диаметр капилляров VIII группы животных, получавших метионин в течение двух недель до травмирования и двух недель после, превышал контрольные показатели на 38% (Рис. 8).
Толщина стенок вен у животных III группы была увеличена на 45%, а толщина стенок артерий снизилась на 27%, что можно расценить как ответную реакцию на механическое воздействие (Рис. 9).
Рис. 7. Изменения толщины эндотелия сосудов экспериментальных животных по сравнению с интактными: III - травма 2 недели;
V - Met недель;
VIII - 2 недели Met-травма-2 недели Met.
Рис. 8. Изменения диаметра сосудов экспериментальных животных по сравнению с интактными: III - травма 2 недели;
V - Met 6 недель;
VIII - недели Met-травма-2 недели Met Рис. 9. Изменения толщины стенки сосудов экспериментальных животных по сравнению с интактными: III - травма 2 недели;
V - Met недель;
VIII - 2 недели Met-травма-2 недели Met Полученные результаты указывают на то, что спустя 2 недели после травмы морфологические изменения в сосудах (артериях, венах и капиллярах) носили слабо выраженный характер. Тем не менее, в условиях ГГЦ отмечалось резкое увеличение толщины эндотелия в венах. Это может служить одним из морфологических маркеров высокого уровня ГЦ и не исключает наличие дисфункции эндотелия, что, в свою очередь, может стать отправной точкой в процессах гиперкоагуляции с образованием тромба в просвете сосуда.
Толщина стенок сосудов животных, находившихся в условиях 6-ти недельной метиониновой диеты, была увеличена в капиллярах на 40%, в венах была увеличена почти в 2 раза (106%), а в артериях была снижена на 14% (Рис. 9). Увеличение толщины стенок вен, вероятнее всего, происходит за счет влияния уровня ГЦ на пролиферацию гладкомышечных клеток стенки сосуда.
Подобная динамика изменения толщины стенки сосудов наблюдалась также в группе животных, получавших метионин в течение 2-х недель до травмы и 2-х недель после травмы. Толщина стенок вен возрастала на 74%, а толщина стенок артерий снижалась на 29% по отношению к контрольным значениям.
Согласно широкому представлению наличие ГГЦ ведет к увеличению риска развития венозных тромбозов. И действительно, в эксперименте было установлено, что возникновение венозного тромбоза у животных, перенесших перелом задней конечности, или находящихся на метиониновой диете, оценивалось с одинаковой частотой – 9%. Сочетание факторов тупого травмирования и повышенного уровня ГЦ приводило к риску возникновения тромбоза с частотой 30%.
В двух случаях из десяти можно говорить о том, что возникновение травмы влечет фатальные тромботические осложнения. Это прямая причинная связь. В одном случае из десяти причина была обусловлена предшествовавшим токсическим воздействием ГЦ на эндотелий вен. Т.о., необходимо выявление критериев для разграничения прямого воздействия травмы либо токсического действия ГЦ. Не исключено, что такие критерии можно будет обосновать при дальнейшем морфометрическом исследовании сосудов в зоне травмы, сравнивая их с сосудами интактной конечности.
Выявленные критерии могут использоваться в теории и практике судебной медицины.
Рис. 10. Роль избытка ГЦ в синтезе восстановленного глутатиона и дисфункции эндотелия При нарушении фолатного цикла (мутация генов, кодирующих ключевые ферменты, дефицит фолиевой кислоты, витаминов группы В, поступающих с пищей и т.д.) возникает состояние ГГЦ, при котором избыток ГЦ негативно влияет на эндотелий сосудов, приводя к его дисфункции. В то же время увеличение уровня ГЦ приводит к нарастанию концентрации цистеина, являющегося одной из составляющих трипептида глутатиона (Рис.
10).
Таким образом, в ходе ГГЦ на фоне дисфункции эндотелия происходит повышение концентрации GSH, который может быть использован как один из биохимических маркеров ГГЦ.
ВЫВОДЫ 1. В крови экспериментальных животных через сутки после механической травмы резко возрастало содержание ДК (в гемолизате – в раза, а в плазме крови – более чем в 4 раза), ШО (в гемолизате – в 2,5 раза, а в плазме крови более чем в 6 раз), а также активизировались антиоксидантные ферменты – СОД, каталаза, ГР. Активность как СОД, так и каталазы в гемолизате увеличивалась в 1,5 раза. ГР гемолизата проявляла резкое увеличение активности (более чем в 2 раза). Наблюдалось увеличение концентрации СПА – в 1,5 раза и ВЭГ – в 1,4 раза в плазме крови. Через две недели после травмы эти показатели приближались к нормальным значениям.
2. У животных с ГГЦ, сформированной четырехнедельной метиониновой диетой, через сутки после механической травмы содержание продуктов ПОЛ (ДК и ШО) в крови резко уменьшалось. Подобная динамика была также характерна для животных, находившихся 4 недели на метиновой диете с последующим формированием перелома и продолжением двухнедельной метиониновой диеты, в гемолизате содержание продуктов ПОЛ было снижено по сравнению с контролем. В данной группе животных наблюдалось резкое увеличение концентрации ГЦ в плазме крови.
3. ГГЦ, развившаяся через 6-ть недель метиониновой диеты, приводила, наряду с увеличением концентрации ГЦ (на 47%) к увеличению содержания GSH (на 42%). В этой ситуации у животных происходило 2 кратное увеличение уровня СПА и 1,8-кратное увеличение концентрации ВЭГ в плазме крови, что может свидетельствовать о развившейся в процессе ГГЦ нестабильности клеточных мембран. Таким образом, можно предположить, что влияние одного из механизмов повреждающего действия ГЦ на эндотелий сосудов связан с повреждением клеточных мембан, что впоследствии приводит к их дестабилизации.
4. В группе животных, находившихся на метиновой диете 4 недели с последующим формированием перелома и продолжением двухнедельной метиониновой диеты, происходило увеличение ГЦ (на 184%) и GSH (на 54%). У животных, находившихся на метиновой диете 2 недели с последующим формированием перелома и продолжением двухнедельной метиониновой диеты, концентрации ГЦ и GSH также возрастали (на 16% и 33%, соответственно).
5. В условии сочетания ГГЦ с травмой опорно-двигательного аппарата происходило увеличение толщины эндотелия в венах за счет увеличения стенки сосуда. Данная особенность может использоваться в качестве морфологического маркера.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК 1. Кураян К.М. Морфометрические показатели сосудов в зоне перелома длинной трубчатой кости в условиях модели гипергомоцистеинемии. / Мажугин В.Ю., Березовский Д.П. // Медицинский вестник Северного Кавказа, 2011. № 2. С.
61-64 (0,16 п.л., личн. вк. 70%).
2. Кураян К.М. Экспериментальная модель умеренной гипергомоцистеинемии для изучения патогенеза тромботических осложнений при травме опорно-двигательного аппарата. / Березовский Д.П., Мажугин В.Ю., Кураян М.Б., Крайнова Н.Н., Хабарова О.В., Варавва Т.А., Корниенко И.В. // Кубанский научный медицинский вестник, 2011. № 5. С. 21-24 (0,16 п.л., личн. вк.
65%).
3. Кураян К.М. Уровень гомоцистеина при травме опорно-двигательного аппарата (экспериментальная модель на лабораторных животных в условиях метиониновой диеты). / Березовский Д.П., Мажугин В.Ю., Фалеева Т.Г., Кураян М.Б., Крайнова Н.Н., Хабарова О.В., Волошина Г.Л., Варавва Т.А., Корниенко И.В.
// Кубанский научный медицинский вестник, 2011. № 5. С. 24-29 (0,24 п.л., личн.
вк. 75%).
4. Кураян К.М. Особенности окислительного стресса и морфометрические показатели сосудов микроциркуляторного русла при экспериментальной умеренной гомоцистеинемии. / Березовский Д.П., Микашинович З.И., Фалеева Т.Г., Корниенко И.В. // Валеология, 2012. № 3. С. 7-12 (0,24 п.л., личн. вк. 70%).
5. Кураян К.М. Динамика показателей перекисного окисления липидов при экспериментальной травме опорно-двигательного аппарата. / Березовский Д.П., Фалеева Т.Г., Корниенко И.В. // Фундаментальные исследования, 2012. № 11. Часть 4. С. 842-845 (0,16 п.л., личн. вк. 80%).
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации 6. Кураян К.М. Экспериментальная модель тромбоза при травме опорно двигательного аппарата. / Березовский Д.П., Додохова М.А., Мажугин В.Ю., Корниенко И.В. // Материалы IХ межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2010.
С. 73-74 (0,08 п.л., личн. вк. 70%).
7. Кураян К.М. Уровень гомоцистеина и каталазы при травме опорно двигательного аппарата (экспериментальная модель на лабораторных животных в условиях метиониновой диеты). / Фалеева Т.Г., Долгов В.В., Киркин И.А., Березовский Д.П., Корниенко И.В. // Материалы ХI межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении».
Ростов-на-Дону, 2012. С. 60-61 (0,08 п.л., личн. вк. 65%).
8. Кураян К.М. Изменение содержания восстановленного глутатиона в крови крыс при умеренной гипергомоцистеинемии. // Материалы Всероссийской молодежной научной школы «Эффективная работа над диссертацией». Ростов-на-Дону, 2012. С. 124-125 (0,08 п.л., личн. вк. 90%).
9. Кураян К.М. Особенности окислительного стресса при экспериментальной травме опорно-двигательного аппарата. // Материалы Всероссийской молодежной конференции «Актуальные вопросы биомедицинской инженерии». Ростов-на-Дону, 2012. С. 61-62 (0,08 п.л., личн. вк. 85%).
10. Кураян К.М. Особенности свободно-радикального окисления в крови крыс при гипергомоцистеинемии. // Материалы II Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации». Екатеринбург, 2012. С. 253-254 (0,08 п.л., личн.
вк. 95%).
11. Кураян К.М. Показатели перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы при экспериментальной травме опорно двигательного аппарата у крыс. / Леонова А.В., Корниенко И.В. // Материалы научно-практической конференции на базе Южного федерального университета «Миссия молодежи в науке». Ростов-на-Дону, 2012. С. 95-96 (0,08 п.л., личн. вк.
85%).
Список принятых сокращений АОЗ – антиоксидантная защита АФК – активные формы кислорода ВЭГ - внеэритроцитарный гемоглобин ГГЦ – гипергомоцистеинемия ГПО — глутатионпероксидаза ГР — глутатионредуктаза ГЦ – гомоцистеин ДК – диеновые коньюгаты МДА - малоновый диальдегид ПОЛ - перекисное окисление липидов СОД — супероксиддисмутаза СПА - суммарная пероксидазная активность СРО – свободнорадикальное окисление СУА – супероксидустраняющая активность ТГВНК – тромбоз глубоких вен нижних конечностей ТЭЛА – тромбоэмболия легочной артерии ХЛ – хемилюминисценция ШО – шиффовы основания GSH - восстановленный глутатион Н2О2 – пероксид водорода Met – метионин